JP2001500379A

JP2001500379A - テロメア長およびテロメア活性を調節するための方法および試薬

Info

Publication number: JP2001500379A
Application number: JP10513591A
Authority: JP
Inventors: ビレポンテュー，ブライアント; フェン，ジュンリ; エイチ．アンドリュース，ウィリアム; アール．アダムス，ロバート
Original assignee: ジェロンコーポレイション
Priority date: 1996-09-13
Filing date: 1996-09-13
Publication date: 2001-01-16
Also published as: EP0953042A1; CA2265913A1; AU7158896A; WO1998011204A1

Abstract

(57)【要約】精製タンパク質TPC2および組換えタンパク質TPC2ならびに精製タンパク質TPC3および組換えタンパク質TPC3、ならびにそれらのタンパク質またはそれらのフラグメントに対応する組換えオリゴヌクレオチドまたは合成オリゴヌクレチオチドは、哺乳動物細胞におけるテロメア長およびテロメラーゼ活性の制御因子を検出するために、および種々の関連する診断目的および治療目的のために使用され得る。

Description

【発明の詳細な説明】テロメア長およびテロメア活性を調節するための方法および試薬発明の分野本発明は、哺乳動物細胞におけるテロメア長の調節およびテロメラーゼ活性の調節のための、ならびにヒトおよび他の哺乳動物における関連する疾患および状態の検出、診断、および処置のための方法および試薬を提供する。重要な実施態様において、本発明は、哺乳動物細胞におけるテロメア長およびテロメラーゼ活性を調節する遺伝子および遺伝子産物に関するオリゴヌクレオチドプローブおよびオリゴヌクレオチドプライマー、ポリヌクレオチドプラスミド、ペプチド、タンパク質、抗体、ならびに酵素を提供する。本発明は、分子生物学、化学、薬理学、および医学的治療技術および医学的診断技術の分野において種々の適用を有し、そして重要な進歩を提供する。発明の背景哺乳動物細胞における染色体のテロメアの末端のDNAは、テロメア繰り返し配列として言及される単純なヌクレオチド配列の多くの直列型の反復から構成される２本鎖核酸および１本鎖核酸からなる。テロメアは染色体構造および機能を維持することを助け；そしてテロメアDNAの消失は、DNA損傷を検出および制御し、そして細胞増殖および細胞老化をモニターおよび制御する細胞性プロセスを活性化し得る。テロメアの維持およびテロメア長の調節は、世代から世代へと遺伝情報を伝達すること、加齢、細胞増殖の制御、および癌に関与する重要な細胞性機能である。Harley、1991、Mutation Research 256:271-282；およびBlackburn， 1992，Annu．Rev．Biochem．61:113-129（これらの各々は本明細書中で参考として援用される（留意：本明細書中で引用される参考文献は、便宜上提供される；このような引用は先行発明の容認として解釈されるべきではない）を参照のこと。多成分テロメラーゼリボ核タンパク質酵素は、鋳型として酵素のRNA成分を使用して、テロメア延伸の間合成されるテロメアDNAの最初の鎖の合成を触媒する。ヒトテロメラーゼ（hTR）および他の哺乳動物のテロメラーゼ酵素のRNA成分は、同定され、単離され、特徴づけられ、そして科学文献に記載されているが、テロメラーゼ酵素のタンパク質成分ならびに哺乳動物細胞においてテロメア維持ならびにテロメア長およびテロメラーゼ活性の調節に関与する他のほとんどの細胞性巨大分子はそうではない。Fengら、1995、Sclence 269:1236-1241およびPCT特許公開第96/01835号（これらの各々は本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。テロメアおよびテロメラーゼ生物学に関する多くの有用な方法および試薬は記載されている。例えば、米国特許第5,489,508号；PCT特許公開第95/23572、同第 95/13381号、同第95/13382号、および同第95/13383号（これらの各々は本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。しかし、哺乳動物のテロメア維持ならびにテロメア長およびテロメラーゼ活性の調節に関与するさらなる細胞性巨大分子が同定され、特徴づけられ、そして純粋な形態または単離可能な形態で利用可能であるならば、テロメア媒介治療およびテロメラーゼ媒介治療ならびに関連するアッセイ、スクリーニング、診断方法、および試薬に重要な改善およびそれらについての新たな機会が認識され、そして得られ得る。詳細には、このような巨大分子のヌクレオチドおよび対応するアミノ酸配列の特徴づけは、新しく、そして有用な組換え発現ベクターおよびプラスミド、ならびに医学的治療技術および医学的診断技術に有用な関連する試薬を提供し得る。発明の要旨本発明は、哺乳動物細胞におけるテロメア長の調節およびテロメラーゼ活性の調節のための、ならびにヒトおよび他の哺乳動物における関連する疾患および状態の検出、診断、および処置のための方法および試薬を提供する。１つの実施態様において、本発明は以下を含む組換え哺乳動物宿主細胞を提供する：（ｉ）プラスミドpGRNl09（受託番号ATCC97708の下でアメリカンタイプカルチャーコレクションに寄託された）の約3.5kbのNotI-BstEII制限フラグメントのヒト DNA挿入物に含まれるヒト遺伝子TPC2のオープンリーディングフレーム配列に対応する少なくとも約10〜15〜25〜100以上の連続したヌクレオチドを含む組換え核酸または合成核酸；または上記オープンリーディングフレーム配列によってコードされるアミノ酸配列に対応する少なくとも約６、10、15、25、100以上の連続したアミノ酸を含む合成ペプチドもしくは合成ペプチドまたは組換えタンパク質もしくは組換えタンパク質；および（ii）プラスミドpGRN92（ATCC97707）の約1.4kbのEcoRI-BamHIの制限フラグメントに含まれるヒト遺伝子TPC3のオープンリーディングフレーム配列に対応する少なくとも約10〜15〜25〜100以上の連続したヌクレオチドを含む組換え核酸または合成核酸；または遺伝子TPC3上記オープンリーディングフレーム配列によってコードされるアミノ酸配列に対応する少なくとも約６〜10〜15〜25〜100以上の連続したアミノ酸を含む合成ペプチドもしくは組換えペプチドまたは合成タンパク質もしくは組換えタンパク質。上記TPC2およびTPC3遺伝子は、テロメア長を調節するか、またはテロメラーゼ活性を調節し、そしてテロメラーゼ活性を表すヒト細胞または他の哺乳動物細胞に存在するタンパク質をコードすることに特徴づけられる。本発明によって提供される他の哺乳動物宿主細胞は、TPC2およびTPC3のいずれかまたは両方由来の組換え核酸もしくは合成核酸、組換えペプチドもしくは合成ペプチド、または組換えタンパク質もしくは合成タンパク質を含む咄乳動物宿主細胞を含む。さらに、本発明はまた、pGRN33（ATCC75926）の約2.5kb HindIII-S acI制限フラグメントに位置するヒトhTRの連続したヌクレオチド配列に対応する少なくとも約10、15、25、100以上の連続したヌクレオチドを含む合成核酸、または組換え核酸を含むようにさらに改変された細胞を提供する。本発明の組換え宿主細胞は、本発明によってさらに提供される多くの有用な方法において適用を有する。例えば、本発明はヒトTPC2またはTPC3遺伝子および必要に応じて組み換えhTR遺伝子によってコードされるアミノ酸配列と実質的に同一の配列におけるアミノ酸をコードするヌクレオチド配列に作動性に連結された発現制御配列を有する新規な発現ベクターを含む組換え宿主細胞を提供する。これらの組換え宿主細胞は、組換えヒトテロメラーゼを生成するに、テロメラーゼ活性を調節するか、またはテロメア長を調節する薬剤を同定するスクリーニングにおける使用に、ならびに以下により十分に記載される種々の他の目的に有用である。本発明の組換え宿主細胞はまた、非ヒトトランスジェニック哺乳動物の生殖系列および／または体細胞性組織に組み込まれ得、そして治療目的のために哺乳動物に投与され得る。別の実施態様において、本発明は、種々の形態（すなわち、単離可能な形態、単離された形態、精製された形態、または実質的に純粋な形態）および種々の目的（すなわち、プローブまたはプライマーとして、哺乳動物宿主細胞においてテロメア長を調節するか、またはテロメラーゼ活性を調節する組換え遺伝子産物を導入するためのポリヌクレオチドプラスミドおよびベクターとして、有用な核酸を作製するための制限フラグメントとして、ならびに治療的適用、診断的適用、および他の適用のための試薬として）のために合成オリゴヌクレオチドおよび組換えオリゴヌクレオチドならびに合成核酸および組換え核酸を提供する。詳細には、本発明は、以下のいずれか：（ｉ）プラスミドpGRNl09の約3.5kbのNotI-BstEII制限フラグメントのヒトDNA 挿入物に含まれるヒト遺伝子TPC2のオープンリーディングフレーム配列；または（ii）プラスミドpGRN92の約1.4kb(7)EcoRI-BamHI制限フラグメントのヒトDNA 挿入物に含まれるヒト遺伝子TPC3のオープンリーディングフレーム配列；に位置する連続したヌクレオチド配列に対して実質的に同一または配列において相補的である少なくとも約10〜15〜25〜100以上の連続したヌクレオチドを含む、組換え核酸または合成核酸を提供する。本発明の新規なオリゴヌクレオチドプローブおよびプライマーは、代表的には、核酸の複合混合物においてそれらへの特異的なハイブリダイゼーションを可能にする、TPC2またはTPC3遺伝子または遺伝子産物におけるヌクレオチドの配列に実質的に同一または相補的な配列のヌクレオチドを含む。従って、このようなプローブおよびプライマーは、種々の診断的適用、治療的適用、および他の適用における有用な適用を有する。本発明の発現ベクターは、代表的には、TPC2もしくはTPC3タンパク質遺伝子産物におけるアミノ酸配列に同一の配列中のアミノ酸をコードするヌクレオチド配列に作動性に連結された発現制御配列を含む。このような発現ベクターは、多くの有用な適用を有する。これは、本発明の治療的方法における、標的細胞または組織において、テロメラーゼ活性を活性化するか、もしくは阻害するかのいずれかのためにテロメラーゼ活性を調節するための、またはテロメア長を増大させるか、もしくは減少させるかいずれかのためにテロメア長を調節するための遺伝子治療ベクターとしての適用を含む。本発明の遺伝子治療発現ベクターはまた、TPC2および／またはTPC3タンパク質の改変体または「変異タンパク質」をコードする（すなわち、１つ以上のアミノ酸の欠失、置換、および／または付加によってTPC2および／またはTPC3タンパク質とは異なるタンパク質を発現する）遺伝子治療発現ベクターを含む。しかし、本発明の遺伝子治療ベクターはまた、有用な核酸（例えば、hTR、またはTPC2、T PC3、および／もしくはhTR遺伝子産物（すなわち、mRNAおよびテロメラーゼRNA ）を標的化するアンチセンス核酸またはリボザイム）をコードし得る。このようなベクターは、テロメラーゼ活性またはテロメア長の調節が有利であり得る疾患または状態を処置するか、または予防するための本発明の治療的方法において有用である。例えば、テロメラーゼポジティブ癌細胞において、テロメラーゼ活性の阻害は、これらの細胞におけるテロメア維持を阻止し得る。これは、連続した増殖に際して、テロメア消失、細胞危機、および死を誘導する。このような目的のために、例えば、RNA成分またはタンパク質成分についての競合、内在性遺伝子発現の阻害、または他の手段によって、細胞におけるテロメラーゼ形成またはテロメラーゼ活性によるテロメア延伸を阻害し得る非機能的なTPC2またはTPC3変異タンパク質、または改変体タンパク質または他の核酸を発現する本発明の遺伝子治療ベクターが好ましい。別の実施態様において、本発明は、哺乳動物細胞において、テロメア長およびテロメラーゼ活性を調節する遺伝子および遺伝子産物に関する、ペプチド、タンパク質、抗体、および酵素を提供する。詳細には、本発明は、以下のいずれか：（ｉ）プラスミドpGRN109の約3.5kbのNotI-BstEII制限フラグメント；または（ii）プラスミドpGRN92の約1.4kbのEcoRI-BamHI制限フラグメント、に位置するヒト遺伝子のオープンリーディングフレーム配列によってコードされるアミノ酸配列と、配列において同一な少なくとも約６、10、15、25、100以上の連続したアミノ酸を含む合成ペプチドもしくは組換えペプチドまたは合成タンパク質もしくは組換えタンパク質を提供する。本発明は、組換えTPC2および／またはTPC3タンパク質を発現する宿主細胞から単離可能な形態で、ならびにインビトロ合成由来の精製形熊および実質的に純粋な形態で、または組換え宿主細胞からの精製によって、または本発明の抗体または他の試薬を使用する天然に存在するタンパク質の精製によって、TPC2遺伝子およびTPC3遺伝子によってコードされるタンパク質を提供する。このようなタンパク質は、テロメラーゼ、またはテロメアを維持し、そしてテロメア長を調節する他の酵素活性をインビトロで再構成するための方法における適用を有する。次いで、これらの方法は、治療的薬剤のための、診断的試験のための、および他の適用のためのスクリーニングにおいて適用を有する。さらに、TPC2またはTPC3タンパク質のアミノ酸配列に対応するペプチドはまた、哺乳動物細胞におけるテロメア長およびテロメラーゼ活性を調節するために使用され得る。本発明のタンパク質およびペプチドはまた、TPC2もしくはTPC3タンパク質またはこれらのタンパク質上の特定のエピトープに対して特異的な抗体を作製するために使用され得る。従って、本発明は、TPC2またはTPC3タンパク質に特異的に結合するポリクロナール抗体およびモノクロナール抗体を提供する。次いで、これらの抗体は、正常な細胞または組換え細胞からTPC2またはTPC3タンパク質を単離するために使用され得、そしてそのタンパク質ならびにそのタンパク質に結合した他のタンパク質を精製するために使用され得る。これらの抗体はまた、細胞の複合混合物におけるTPC2またはTPC3タンパク質を含む細胞の検出において重要な適用を有する。このような検出方法は、癌、妊娠、または受精能のような疾患および他の状態のスクリーニング、診断、およびモニタリングにおける適用を有する。なぜならば、TPC2およびTPC3タンパク質はテロメアDNAの延伸およびテロメアーゼ活性の発現の可能なほとんどの細胞において存在するからである。本発明の免疫原性ペプチドおよびタンパク質はまた、治療的免疫化およびワクチン接種手順において使用され得る。本発明は、免疫刺激量の本発明のこのようなペプチドまたはタンパク質を投与する工程を包含する、テロメアを維持しそしてテロメラーゼ活性を発現する細胞に対して、被験体を免疫化する方法、ならびにこの方法において有用なワクチンを提供する。別の実施態様において、本発明は、稀なタンパク質（例えば、テロメア延伸およびテロメア長およびテロメラーゼ活性の調節に関与するタンパク質）をコードするmRNAの発現配列タグ（EST）を同定し、単離し、そしてクローン化するためのサブトラクションハイブリダイゼーション示差的表示方法を提供する。本方法は以下の工程を含む：（i）上記の稀なタンパク質、すなわちテロメラーゼのタンパク質成分を含む哺乳動物細胞の第一の集団からおよび上記の稀なタンパク質を含まない哺乳動物の第二の集団からmRNAを得ること；（ii）このような・RNAを逆転写および第二鎖合成に供して第一および第二のc DNA調製物を形成することであって、上記第一および第二のcDNA調製物は上記の稀なタンパク質をコードするcDNA分子の存在または非存在、ならびに該第一および第二のcDNA調製物のうちの１つに取り込まれた標識に関して互いに異なり；（iii）上記cDNA調製物を、上記第一および第二のcDNA調製物からのcDNAの相補鎖がアニールして二本鎖および一本鎖cDNAの混合物を形成するような条件下で組み合わせること：および（iv）上記標識を含むcDNAを含まないcDNAから分離して、それにより上記第二の集団における相補cDNAから枯渇され、そして上記稀なタンパク質をコードする cDNAについて富化されている第一の集団からのcDNAの単離された調製物を形成すること。上記方法の工程（iii）および(iv)は、所望である限り頻繁に反復され得、そして工程（iv）の完了後に単離されたcDNAは、PCRにより増幅され得、所望のcDN Aについて非常に富化されたcDNA調製物を提供する。本発明のこれらのおよび他の実施態様は、以下に詳細に記載される。図面の簡単な説明図１は、部分Ａ、Ｂ、およびＣにおいて、TPC2（図1A）またはTPC3（図1B）cD NAについて特異的なプライマーを使用するRT-PCR分析の結果を示す棒グラフである。この棒グラフおよび他の棒グラフにおいて、各棒にわたる数値は、得られた数値結果である；RT-PCR結果について、この数値は、ゲル電気泳動後のRT-PCR産物のオートラジオグラムまたはPhosphorImager^TMスクリーン（Molecular Dynami cs）をスキャンすることにより生成した。これらの試験条件下で、TPC2およびTP C3mRNAは、試験されたテロメラーゼネガティブ細胞株（図において「死すべき」と標識される）において存在しないか、または非常に低いレベルでのみ検出可能であり、そして試験されたすべての（そのほとんどが明らかに検出可能なレベルである）テロメラーゼポジティブ細胞株（図において「」と標識される）において検出可能である。図1Cは、GAPDHレベルに対して正規化したTPC3 mRNAレベルを示し、そして死すべき細胞と不死の細胞との間のTPC3 mRNAレベルにおける差異を示す（「0.0」と記されるスペースは、単にグラフ化データ中の間隙として提供される）。GAPDH mRNAは、コントロールとして使用された；そのより多い存在度に起因して、GAPDHサンプルのRT-PCRは、TPC2またはTPC3サンプルについて使用されるよりも少ないPCRサイクルで完了することが可能であった。図２は、部分Ａ，Ｂ，およびＣにおいて、hTR RNAのRT-PCR分析の結果、ならびにTPC2およびTPC3 mRNAレベル、ならびに種々の細胞株のおけるテロメラーゼ活性を示す棒グラフである。図2Aは、種々の細胞株おけるGADPH mRNAレベルに対して正規化したTPC2およびTPC3 mRNAレベルを示す。これらの全ては、IMR-90を除いてテロメラーゼポジティブであり、そしてこれら２つのテロメラーゼ長およびテロメラーゼ活性調節タンパク質のレベルにおいて相関することを示す。図2B は、TPC3 mRNAレベルが、どのように種々の細胞株においてテロメラーゼ活性（T RAPアッセイを用いて測定される場合）と相関するかを示す。IMR90、HTB-153、W I-38、VA13、KMSF、およびT0（不活化Ｔ細胞；T7は活性化Ｔ細胞を示すことに留意されい）は、テロメラーゼ活性を示さないか、または非常に低く示すのみである。図2Cは、hTR RNAレベルが、種々の細胞株おいてどのようにテロメラーゼ活性と相関するかを示す。以上総合すると、これらの結果は、種々の死すべき細胞株および不死の細胞株におけるTPC2およびTPC3 mRNAレベルがhTRレベルおよびテロメラーゼ活性と相関することを示す。図３は、約7.2kbのプラスミドpGRN109の制限部位および機能マッピングを示す。このプラスミドは、TPC2タンパク質をコードする約3.3kbのオープンリーディングフレームを含む約3.5kbNotI-BstEII制限フラグメントを含む（「ORF」および「TPC2」と標識される）。図４は、ヒトTPC2遺伝子、mRNA、およびタンパク質産物に対応するTPC2オープンリーディングフレームのヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列の部分を列挙する。図において、ならびに明細書および図を通して、ヌクレオチドおよびアミノ酸は、標準的な略号および命名を用いて表される；しかし、曖昧ヌクレオチドは、図の４の下の鍵において示されるように表される。開始メチオニンコドンは、配列のヌクレオチド16〜18に存在すると考えられる；終止コドンは「---」で印される。図５は、約8kbのプラスミドpGRN92の制限部位および機能マッピングを示す。これは、TPC3タンパク質をコードする約1.1kbのオープンリーディングフレームを含む約1.4kbのEcoRI-BamHI制限フラグメントを含む（「ORF」および「TPC3」と標識される）。図６は、ヒトTPC3遺伝子、mRNA、およびタンパク質産物に対応するTPC3オープンリーディングフレームのヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を列挙する。開始メチオニンコドンは「***」、および終止コドンは「---」で印される。図７は、遺伝子TPC3またはコントロールベクターのセンスまたはアンチセンス mRNAを発現する安定な組換えHeTe7クローンにおけるテロメラーゼ活性レベルの分析の結果を示す。組換えセンスTPC3 mRNAは、これらの細胞においてテロメラーゼ活性を顕著に低減させた。図８は、遺伝子TPC3またはコントロールベクターのセンスもしくはアンチセンスのmRNAを発現する安定組換えHeTe7クローンにおけるテロメア長の分析の結果を示す。組換えTPC3センスmRNAは、細胞でテロメア長（中間のTRF）を減少させた。図９は、hTR遺伝子および対応するRNA転写物のヌクレオチド配列を列挙する；示される配列は、約１kbのPstI制限フラグメントの一方の鎖の配列であり、これは、プラスミドpGRN33から単離され得る。テロメラーゼリボヌクレオタンパク質におけるテンプレートとして役立つ成熟hTR転写物の配列は、アスタリスクで標識され−−転写物の3'末端は、「＞」で標識される。これらの図は、以下により詳細に議論されるが、ここでは、本発明の種々の好ましい実施態様が記載される。好ましい実施態様の説明本発明は、哺乳動物細胞におけるテロメア長を調節し、そしてテロメラーゼ活性を調節するため、ならびにヒトおよび他の哺乳動物における関連疾患および状態を検出し、診断し、および処置するための方法および試薬を提供する。その多くのおよび多様な適用における発明の理解および実施を容易にするために、この記載は以下に示すように整理する。Ｉ. 定義 II. TPC2 およびTPC3遺伝子のクローニングおよび特徴付け III. 組換え宿主細胞 IV. オリゴヌクレオチドおよび核酸 V. ペプチドおよびタンパク質 VI. 抗体 VII. 方法 VIII. 実施例Ｉ．定義他に定義されない限り、本明細書中において使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者により通常理解されるのと同一の意味を有する。本明細書中に記載される方法および材料と同様または等価の任意の方法および材料が、本発明の実施または試験において使用され得るが、好ましい方法および材料が記載される。本発明の目的のために、以下の用語が、下記に定義される。「抗体」は、分析物すなわち「抗原」に、特異的に結合し、すなわち「認識する」イムノグロブリン遺伝子またはそのフラグメントによりコードされる、天然に存在する、および組換えのポリペプチドおよびタンパク質をいう。イムノグロブリンは、κ、λ、α、γ、δ、ε、およびμ定常領域遺伝子、ならびに無数のイムノグロブリン可変領域遺伝子を含む。抗体は、種々の手段（組換え方法論および種々のペプチダーゼでの消化を含む）により産生されるインタクトなイムノグロブリンまたは多数の十分に特徴付けされたフラグメント（例えば、Fab'およびF(ab)'₂フラグメント）のいずれか１つとして存在し得る「cDNA」は、逆転写および代表的には遺伝子により産生されるmRNAまたは他の RNAの第二の鎖の合成により産生されるデオキシリボ核酸をいい；二本鎖の場合、cDNA分子は、コードもしくはセンス鎖および非コードもしくはアンチセンス鎖の両方を有する。「〜に相補的」とは、別のポリペプチド配列に特異的にハイブリダイズし得るポリヌクレオチド配列をいう。例えば、配列「5'-TATAC」におけるヌクレオチドを含む核酸は、配列「5'-GTATA」におけるヌクレオチドを含む核酸に相補的である。「〜に対応する（動詞）」または「対応している（修飾語）」とは、（i）参照ポリヌクレオチド配列の全部または一部と実質的に同一または相補的であるヌクレオチド配列を有するか、またはペプチドまたはタンパク質におけるアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド；あるいは（ii）参照ペプチドまたはタンパク質におけるアミノ酸の配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を有するペプチドまたはタンパク質、をいう。「コード（する）」とは、ヌクレオチド（すなわち、rRNA、tRNA、他のRNA分子）またはアミノ酸の規定された配列を有する生物学的プロセスにおける他のポリマーまたは高分子の合成のためのテンプレートとして役立つ、核酸におけるヌクレオチドの特定の配列（例えば、染色体またはmRNAにおける遺伝子）の固有の特性、およびそれらから生じる生物学的特定をいう。従って、遺伝子は、その遺伝子によって生成されるmRNAの転写物または翻訳物が細胞または他の生物学的系においてタンパク質を生産する場合、タンパク質をコードする。遺伝子またはcD NAのコード鎖（mRNA配列に同一であり、そして通常配列表に提供されるヌクレオチド配列）および非コード鎖（転写のためのテンプレートとして使用される）の両方は、その遺伝子またはcDNAのタンパク質または他の産物をコードするものとして言及され得る。タンパク質をコードする核酸は、異なるヌクレオチド配列を有するが、遺伝コードの縮重に起因して同一のタンパク質のアミノ酸配列をコードする任意の核酸を含む、タンパク質をコードする核酸およびヌクレオチド配列は、イントロンを含み得る。「発現制御配列」とは、それらに作動可能に連結されるヌクレオチド配列の発現（転写および／または翻訳）を調節する核酸におけるヌクレオチド配列をいう。発現制御配列は、例えば、そして限定されることなく、プロモーター、エンハンサー、転写終結因子、開始コドン（すなわち、ATG）、イントロンのためのスプライシングシグナル、および終止コドンを含む。「イムノアッセイ」とは、分析物に特異的に結合する抗体を利用するアッセイをいう。イムノアッセイは、分析物を単離、標的化および／または、その量を定量する特定の抗体の特異的結合特性の使用により特徴づけられる。「標識する（名詞、動詞）」または「標識された（修飾語）」は、検出可能なマーカーをいい、そしてこのようなマーカーの核酸、タンパク質、または他の分子への組込みをいう。標識は、直接（すなわち、標識は、放射性同位体（例えば、³H、¹⁴C、³⁵S、¹²⁵I、¹³¹I）または蛍光分子もしくはリン光分子であり得る）、または間接、すなわち、酵素活性（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β −ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）または別の分子（例えば、ストレプトアビジン、ビオチン、エピトープ）に結合する能力により検出可能であり得る。標識の組込みは、種々の手段（すなわち、ポリメラーゼ媒介プライマー延伸反応、エピトープタグ化、または抗体への結合における放射標識ヌクレオチドまたはビオチン化ヌクレオチドの使用）により達成され得る。標識は、直接または種々の長さのスペーサーアームを介して結合させて立体障害を低減し得る。「天然に存在する」とは、ヒトの介在なくして天然に存在する物質（代表的には、アミノ酸、ヌクレオチド、核酸、またはタンパク質）についていう。例えば、デオキシリボヌクレオチドすなわちDNAは、天然に存在する。「オリゴヌクレオチド」とは、リン酸ジエズテル結合によって結合した複数のヌクレオチド単位（リボヌクレオチドもしくはデオキシヌクレオチドまたは構造的に関連する変異体あるいはそれらの合成アナログ）からなるポリマーをいう。従って、用語「オリゴヌクレオチド」が代表的には、ヌクレオチドとその間の連結部が天然に存在するヌクレオチドポリマーをいう一方、この用語はまた、種々のアナログ（例えば、ペプチド核酸（PNA）、ホスホロアミデート、ホスホロチオネート、メチルホスホネート、2-0-メチルリボ核酸などで、これらに限定されない）もいう。オリゴヌクレオチドは、代表的に、長さが若干短く、一般的に約 10〜30ヌクレオチドであるが、この用語は、任意の長さの分子をいい得る。しかし、用語「ポリヌクレオチド」または「核酸」もまた、代表的に、大型のオリゴヌクレオチドについて使用され得る。「オープンリーディングフレーム」とは、ポリペプチドまたはタンパク質をコードするヌクレオチド配列をいい、そして5'末端で開始コドン（ATG）または終止コドンをコードしない別のコドンおよび3'末端で終止コドンで囲まれるが、それ以外は、5'-末端と3'-末端との間のコドンにはインフレームの終止コドンを全く含まない。「薬学的組成物」とは、哺乳動物における薬学的使用について適切な組成物をいう。薬学的組成物は、薬理学的に効果のある量の活性薬剤および薬学的に受容可能なキャリアを含む。「薬理学的に効果のある量」とは、意図される薬理学的結果を生じるのに有効な薬剤の量をいう。「薬学的に受容可能なキャリア」とは、任意の標準的な薬学的キャリア、緩衝液、および賦形剤（例えば、リン酸緩衝化生理食塩水、５％ブドウ糖水溶液）、およびエマルジョン（例えば、油／水または水／油エマルジョン）および種々の湿潤剤ならびに／またはアジュバントをいう。適切な薬学的キャリアおよび処方物は、Remington's Pharmaceutical Sci ences、第19版(Mark Publishing Co.Easton、1995)に記載されている。好ましい薬学的キャリアは、活性薬剤の意図される投与形態に依存する。代表的な投与形態は、腸管的（すなわち、経口）、あるいは非経口的（すなわち、皮下、筋肉内、または静脈内、腹腔内注射；または局所的投与、経皮投与、もしくは経粘膜投与）を含む。「生理学的条件」とは、生存生物に適合し、かつ／または代表的には生存可能な哺乳細胞において細胞内に存在する温度、pH、イオン強度、粘度、および類似の生化学的パラメーターをいう。例えば、代表的な研究室培養条件下の哺乳動物細胞増殖における細胞内条件は、生理学的条件である。PCRのための適切なインビトロ反応条件ならびに多くのポリペプチド酵素反応および操作は、一般に、生理学的条件である。一般に、インビトロ生理的条件は、50-200mM NaClまたはKCl 、pH6.5〜8.5、20〜45℃、および0.001〜10mM二価のカチオン（例えば、Mg⁺⁺,Ca⁺⁺ ）；好ましくは、約150mMのNaClまたはKCl、pH7.2〜7.6、5mM二価のカチオン、そしてしばしば、0.01〜1.0％の非特異的タンパク質（例えば、BSA）を含む。非イオン性界面活性剤（Tween,NP-40,Triton X-100）もまた、通常、0.001〜２％で、代表的には0.05〜0.2％（v/v）で、存在し得る。特定の水性条件は、従来の方法に従って実施者により選択され得る。一般的な指針として、以下の緩衝水性条件が適用可能であり得る：10〜250mM NaCl、５〜50mM Tris HCl、pH５〜８、必要に応じて二価のカチオンおよび／または金属キレート剤および／または非イオン性界面活性剤および／または膜画分および／または消泡剤および／またはシンチレーション剤を添加し得る。「ポリヌクレオチド」または「核酸」とは、オリゴヌクレオチドをいい、そして代表的には、長さが30ヌクレオチドを超えるオリゴヌクレオチドをいうために使用される。本明細書中において、従来の表記を使用してポリヌクレオチド配列を示す：二本鎖ポリヌクレオチド配列の左側の末端は、5'末端である；。新生の RNA転写物へのヌクレオチドの5'から3'への添加の方向は、転写方向といい；mRN Aと同一の配列を有するDNA鎖は、「コード鎖」といい、；そのDNAから転写されたmRNAと同一の配列を有し、かつRNA転写物の5'末端に対して5 'に位置するDN A上の配列は、「上流配列」といい；このRNAと同一の配列を有し、かつコードRN A転写物の3'末端に対して3'であるDNA鎖の配列を「下流配列」という。ポリヌクレオチドおよび組換え産生タンパク質、ならびにそれらのフラグメントまたアナログは、当該分野で公知の方法に従って調製され得、そしてManiatisら、Molecu lar Cloning:A Laoratory Manual、第２版（1989）、Cold Spring Harbor,N.Y. 、ならびにBergerおよびKimmel、Methods in Enzymology、第152巻、Guide to M olecular Cloning Techniques(1987)、Academic Press，Inc.，San Diego，CAに記載される。これらは、本明細書中で参考として援用される。「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、本明細書中において、交換可能に用いられ、アミノ酸残基のポリマーならびにそれらの変異体および合成アナログをいう。従って、これらの用語は、アミノ酸ポリマー（ここで、１つ以上のアミノ酸残基は、合成の非天然のアミノ酸（例えば、対応する天然に存在するアミノ酸に対応する化学的アナログ））、ならびに天然に存在するアミノ酸ポリマーに適用される。本明細書中において、従来の表記を使用して、ポリペプチド配列を示す：ポリペプチド配列の左側末端はアミノ末端であり；ポリペプチド配列の右側の末端は、カルボキシ末端である。用語「組換えタンパク質」とは、このタンパク質のアミノ酸配列をコードする組換えDNA分子の発現により産生されるタンパク質をいう。２つ以上のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの間の配列の関係を記載するのに使用される用語は、「参照配列」、「比較ウインドウ」、「配列同一性」、「配列同一性の百分率」、および「実質的な同一性」を含む。「参照配列」とは、配列比較のための基礎として使用される規定された配列であり、より大きな配列のサブセット（すなわち、完全cDNA、タンパク質、または遺伝子配列）であり得る。一般に、参照配列は、長さが少なくとも12 であるが、しばしば15〜18、および頻繁には少なくとも25ヌクレオチド（または他のモノマー単位）である。２つのポリヌクレオチドは、各々、（1）２つのポリヌクレオチドの間で同様である配列（すなわち、完全ポリヌクレオチド配列の部分のみ）、ならびに（2）２つのポリヌクレオチドの間で異なる配列を含み得るので、２つ（またはそれを超える）ポリヌクレオチドの間の配列比較は、代表的に、２つのポリヌクレオチドの配列を「比較ウインドウ」にわたって比較することにより実施されて配列類似性の局所的領域を同定し、そして比較する。「比較ウインドウ」とは、参照配列と比較される、代表的には少なくとも12の連続する残基の概念的セグメントをいう；比較ウインドウは、２つの配列の最適な整列のために、参照配列（これは、付加または欠失を含まない）と比較して、約20％以下の付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。比較ウインドウを整列させるための配列の最適な整列は、アルゴリズム（Wisonsin Genetics Softwa re Package Release 7.0，Genetics Computer Group，575 Science Dr．Madison ， WIのGAP、BESTFIT、FASTA、およびTFASTA）のコンピューターによる実行または、任意の種々の方法により生成される点検、または最良整列（すなわち、比較ウインドウに対して最高の百分率の相同性を生じること）が選択される。「プライマー」は、核酸鎖（「テンプレート」）に相補的なプライマー伸長産物の合成が誘導される（すなわち、ヌクレオチドおよびDNAポリメラーゼのような重合化のための因子の存在下、ならびに適切な温度およびpHで）条件下におかれた場合、合成の開始点として作用し得るオリゴヌクレオチド（すなわち精製された制限フラグメントまたは合成オリゴヌクレオチド）をいう。プライマーは、好ましくは、増幅において最大の効率で一本鎖化されるが、あるいは二本鎖化されてもよい。二本鎖化される場合、プライマーは、伸長産物を調製するために使用される前に、その鎖を分離するために処理される必要があり得る。プライマーは代表的にはオリゴデオキシリボヌクレオチドであるが、広範な種々の合成的および天然に存在しないオリゴヌクレオチドプライマーが、種々の適用のために使用され得る。プライマーは、重合化因子の存在下で、伸長産物の合成をプライムするに充分な長さでなければならない。プライマーの長さは、多くの要因（適用、使用される温度、テンプレート、反応条件、他の試薬、およびプライマーの供給源を含む）に依存する。例えば、標的配列の複雑さに依存して、オリゴヌクレオチドプライマーは、代表的には15〜25より多いヌクレオチドを含むが、より少ないヌクレオチドを含み得る。短いプライマー分子は、一般的に、テンプレートと安定なハイブリッド複合体を形成するためにより低い温度を必要とする。プライマーは、例えば約200ヌクレオチドから数キロベース以上の大きなポリヌクレオチドであり得る。プライマーは、テンプレート状の配列に実質的に相補的でなければならず、それは合成の開始のための部位として役立つようにハイブリダイズするように設計されるが、テンプレートの正確な配列を反映する必要はない。例えば、非相補的なヌクレオチドは、テンプレートに相補的であるプライマー配列の残りとともにプライマーの5'末端へ付着され得る。あるいは、非相補的なヌクレオチドまたはより長い配列は、プライマー内に分散され得るが、ただし、プライマー配列はそれらとハイブリダイズするテンプレートの配列を充分な相補性を有し、それによってプライマーの伸長産物の合成のためのテンプレートを形成する。「プローブ」は、特定の配列もしくはサブ配列または別の分子の他の部分に結合する分子をいう。他に示されない限り、用語「プローブ」は、代表的に、別の核酸（しばしば「標的核酸」と呼ばれる）相補的塩基対を介して結合するオリゴヌクレオチドプローブをいう。プローブは、ハイブリダイゼーション条件に依存してプローブと完全な配列相補性を欠いた標的核酸に結合し得る。プローブは、直接的または間接的に標識され得る。「組換え」は、合成されたか、またはそうでなければインビトロで操作された核酸を使用して、細胞内のこれらの核酸または他の生物学的系によってコードされる遺伝子産物を産生するために使用される。例えば、増幅されたか、または構築された産物ポリヌクレオチドは、適切なDNAベクター（例えば、細菌性プラスミド）に挿入され得、そしてこのプラスミドは適切な宿主細胞を形質転換するために使用され得る。次いで、遺伝子は、宿主細胞中で発現されて組み換えタンパク質を産生する。形質転換宿主細胞は、原核生物または真核生物であり得、それには細菌細胞、咄乳動物細胞、酵母細胞、Aspergillus細胞、および昆虫細胞が含まれる。組換えポリヌクレオチドは、非コーディング機能（例えば、プロモーター、複製の起点、リボゾーム結合部位など）を同様に与え得る。「組換え宿主細胞」は、組換え核酸分子、代表的には組換えプラスミドまたは他の発現ベクターを含む細胞をいう。従って、例えば、組み換え宿主細胞は、細胞の天然の（組換え体でない）形態中に見出されない遺伝子を発現し得る。配列との関連では、「から選択された」は、別の配列と同一性を共有する１つの配列をいう。「配列同一性」は、比較ウィンドウを通して同一（すなわち、ヌクレオチド対ヌクレオチドまたはアミノ酸対アミノ酸の基準で）である配列をいう。用語「配列同一性の百分率」は、比較ウィンドウを通して２つの最適に整列された配列を比較することによって計算され、同一な核酸塩基（Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、またはＩ）が両配列において一致した位置の数を生じる位置の数を決定し、比較ウィンドウ（すなわちウィンドウのサイズ）内の全位置の数によって一致した位置の数を除算し、そして結果を100で乗算して配列同一性の百分率を生じる。「特異的に結合する」は、１つの分子（代表的には、抗体またはオリゴヌクレオチドのような高分子）が多くの他の様々な分子の存在下でさえ別の特異的分子と接触し、そして会合する能力をいう。例えば、一本鎖核酸は、配列において相補的な一本鎖オリゴヌクレオチドに「特異的に結合し」得、そして抗体はその対応する抗原「に特異的に結合する」か、または「と特異的な免疫反応性である」。従って、免疫アッセイを示す条件下で、抗体は特定のタンパク質に優先的に結合し、そしてサンプル内に存在する有意な量では他のタンパク質には結合しない。このような条件下でのタンパク質への特異的結合は、特定のタンパク質にその特異性が選択される抗体を必要とする。特定のタンパク質と特異的な免疫反応性の抗体を選択するために、種々の手段（すなわち、固相ELISA免疫アッセイはタンパク質と特異的な免疫反応性のモノクローナル抗体選択するために日常的に使用される）を用い得る。HarlowおよびLane(1988)、Antibodies，A Laboratory M anual，Cold Spring Harbor Publications，New Yorkを参照のこと。「特異的ハイブリダイゼーション」は、プローブポリヌクレオチド（例えば、置換、欠失および／または付加を含み得る本発明のポリヌクレオチド）と特定の標的ポリヌクレオチド（例えば、TPC2もしくはTPC3遺伝子または遺伝子産物の配列を有するポリヌクレオチド）との間のハイブリッドの形成をいい、ここでプローブは、特定の配列に優先的にハイブリダイズし、そして標的と配列同一性を共有しない混合物中の他のポリヌクレオチドには結合しない。「実質的同一」または「実質的に同一な」は、少なくとも20ヌクレオチド位の比較ウィンドウにわたって、しばしば少なくとも25〜50ヌクレオチドのウィンドウにわたり、参照配列に対して、少なくとも80％同一、好ましくは少なくとも85 ％、およびしばしば90〜95％同一、より通常には少なくとも99％同一であるポリヌクレオチドまたはポリペプチドの特徴を示し、ここで配列同一性の百分率は、ポリヌクレオチド配列に対する参照配列の比較によって計算され、比較ウインドウにわたって参照配列の全20％未満の欠失または付加を含み得る。参照配列は、より大きな配列のサブ集団であり得る。「ストリンジェントな条件」とは、核酸ハイブリダイゼーションにおいて使用される温度およびイオン条件をいう。必要とされるストリンジェンシーはヌクレオチド配列依存性であり、そしてまたハイブリダイゼーションの間に存在する種々の成分に依存する。一般的に、ストリンジェントな条件は、規定されたイオン強度およびpHで特定の配列についての温度的融点(T_m)より約５〜20℃低い温度で選択される。T_mは、（規定されたイオン強度およびpH下で）50％の標的配列が相補的プローブとハイブリダイズする温度である。「実質的に純粋」は、目的の種が存在する主要な種（すなわち、モル基準で、組成物中の任意の他の独立した高分子より豊富である）であることを意味し、そして実質的に純粋な画分は、目的の種が、存在する全ての高分子種の少なくとも約50％（モル基準で）を含む組成物である。一般的に、実質的に純粋な組成物は、組成物中に存在する約80〜90％以上の高分子種が、目的の精製された種であることを意味する。目的の種は、本質的に組成物が単一の高分子種からなる場合、本質的に均一（夾雑物種が従来の検出法によって組成物中に検出され得ない）まで精製される。溶媒種、小分子（＜500ダルトン）、安定剤(例えば、BSA)、およびイオン元素種は、この定義のための高分子種とは考えられない。「適切な反応条件」とは、市販の試薬を用いて特定の反応を行うに適切な条件である。このような条件は、種々の反応について当業者に公知であるか、または当業者によって容易に確立される。例えば、適切なポリメラーゼ連鎖反応(PCR) 条件は、米国特許第4,683,202号;第4,683,195号;第4,800,159号;および第4,965, 188号（これらの各々は本明細書中に参考として援用される）に特定される条件m を含む。１例であり本発明を限定しない例として、適切な反応条件は以下を含み得る：0.2mM各dNTP、2.2mM MgCl₂、50mM KCl、10mM Tris-HCl(pH9.0)、および0. 1％ TritonX-100。「テロメア長調節タンパク質」および「テロメア調節タンパク質」とは、テロメア代謝およびテロメラーゼ活性に関与するポリペプチドをいう。このようなタンパク質は、テロメラーゼ、テロメラーゼのタンパク質成分、テロメア反復配列またはテロメア末端を含む核酸に選択的に結合するタンパク質、テロメア修復、維持、および／または伸長に必要なタンパク質、ならびに活性なテロメラーゼ酵素の発現もしくは形成に必要なタンパク質を含む。本発明は、一般的にこのようなタンパク質、噛乳動物テロメラーゼ、および特にヒトテロメラーゼに関するが、関連したタンパク質が、好ましい実施態様として提供される。「テロメラーゼ活性」とは、テロメアDNAを伸長し得る多成分酵素中に、インビボまたはインビトロのいずれかで相互およびテロメラーゼのRNA成分に会合するテロメラーゼタンパク質成分の能力をいう。テロメラーゼ活性を検出する好ましいアッセイ方法は、TRAPアッセイである。PCT特許公開番号95/13381、前出を参照のこと。このアッセイは、伸長産物であるポリヌクレオチド（テロメラーゼ基質またはプライマーのヌクレオチド付加によって形成される）にとりこまれる放射活性ヌクレオチドの量を測定する。放射活性は、放射活性産物が分離されたゲル上へ曝露されたPhosphorImager^TMスクリーン上のバンドの強度の関数として、測定され得る。試験実験およびコントロール実験は、PhosphorImager^TMスクリーンを用いて視覚的に比較され得る。市販のTRAP-eze^TMテロメラーゼアッセイキット(Oncor)；および情orin，1989，Cell 59:521-529もまた参照のこと。 II.TPC2 遺伝子およびTPC3遺伝子のクローニングならびに特徴づけ本発明は、哺乳動物細胞においてテロメラーゼ長を調節し、そしてテロメラーゼ活性を調整し、ならびにヒトおよび他の哺乳動物において関連する疾患および条件を検出し、診断し、そして処置する方法および試薬を提供する。本発明は、部分的にヒトおよび他の哺乳動物において、テロメアーゼのタンパク質成分ならびにテロメアーゼ長およびテロメアーゼ活性を調節する高分子のタンパク質成分のクローン化のための努力から生じた。これらの稀なタンパク質およびこれらのタンパク質をコードするmRNAは、哺乳動物細胞において非常に低い豊富さで存在し、それは新規のmRNAの単離および「サブトラクションハイブリダイゼーションディファレンシャルディスプレー」と呼ばれる同定方法の使用を必要とする。簡単には、この方法は、目的のタンパク質をほとんど含まないかまたは低い量で含む第１の哺乳動物細胞の集団、および10倍〜100倍低いレベルの稀なタンパク質を含む第２の哺乳物細胞の集団から得ることを含む。次いで、この２つのmR NA集団は、別々に使用されて、逆転写、ならびに第１および第２のcDNA調製物を形成する第二鎖合成によってcDNA調製物を作成する。検出可能な標識が、第２の cDNA調製物に同様に取り込まれる。次いで、２つのcDNA調製物は、２つのcDNA調製物由来のcDNAの相補鎖がアニールして二本鎖cDNAおよび一本鎖cDNAの混合物を形成するような条件下で変性および組み合わされる。次いで、一方は標識を含み、もう一方は含まないcDNAの２つの異なる集団に分離され、それによって目的の稀なタンパク質をコードするcDNAを富化されたcDNAの単離された非標識集団を形成する。ハイブリダイゼーションおよび分離の工程は、所望であればしばしば繰り返され得、そして分離工程後の単離されたcDNAは、PCRによって増幅されて所望のcDNAが非常に富化されたcDNA調製物を提供する。代表的には、２サイクルのサブトラクション後、豊富な転写物に対応するcDNAは、100倍以上に枯渇され、そして低い量の転写物は、サブトラクトされたcDNAライブラリーにおいて富化される。この方法の再現性は素晴らしく、そしてこの方法は、テロメア長およびテロメラーゼ制御タンパク質をコードするような低い量の遺伝子産物を同定するために使用され得る。テロメア長およびテロメラーゼ調節タンパク質に対応するcDNAを単離するために、cDNAライブラリーが、6つの異なる細胞株または組織から調製され、そのうちの３つは「テロメラーゼポジティブ」であり（すなわち、細胞がテロメラーゼ活性を発現する；IDH4および293細胞株、ならびに精巣組織）、そしてそのうち３つは「テロメラーゼネガティブ」であった（すなわち、細胞がテロメラーゼ活性を発現しない；HUVEC、BJ、およびIMR-90細胞株）。これらのcDNAライブラリーを、テロメラーゼネガティブのHUVEC cDNAライブラリーに対してサブトラクションハイブリダイゼーションに供した。次いで、ディファレンシャルディスプレーを、単一の5'任意プライマーか、またはPCRにおける5'任意プライマーおよび3'ポリdTプライマーのいずれかを用いて、６つのサブトラクションcDNAライブラリーのそれぞれに第１の複製し、ゲル電気泳動によって複製産物を分離し、そして差次的に発現された産物（ゲル上のバンドとして視覚的に同定された）を同定および単離することによって実施した。この工程は、多数の差次的発現cDNAを生成した。テロメラーゼポジテイブ細胞株において作製されたcDNAライブラリー中には存在したが、テロメラーゼネガティブ細胞株においては存在しなかった（または非常に低いレベルで存在した）、そしてTPC2およびTPC3遺伝子によって産生された・RNAの3'末端由来するとして後に同定されたこれらのcDNAの２つを単離し、クローン化し、そしてDNA配列分析によって特徴づけた。DNA配列分析用いてオリゴヌクレオチドプライマーを設計し、次いで、サブトラクションcDNAライブラリーを調製するために用いた６つの細胞株の同じパネルのそれぞれから調製されたmRNAに対して逆転写およびPCR(RT -PCR)を実施するために用いた。このRT-PCR実験を設計して、推定差次的発現cDN Aに対応するmRNAがテロメラーゼポジティブ細胞株において非常に高いレベルで発現していることを確認した。この結果は、以下のように予想された：予想されたサイズのRT-PCR生成産物；TPC2 mRNAに特異的なプライマーについて、相当量の産物がIDH4 mRNAを用いて生成されたが、少量の産物が、293および精巣を用いて生成され、そしてHUVEC、BJ、およびIMR-90細胞から調製されたmRNAにおいて産物はほとんど検出されなかった；TPC3 mRNAに特異的なプライマーについては、テロメラーゼポジティブ細胞株由来のmRNAを用いてのみ、産物が生成された。種々の細胞株および組織におけるTPC2およびTPC3の発現パターンの分析を拡大するために、差次的に発現されたTPC2およびTPC3 mRNAに対応するcDNA内のヌクレオチド配列に特異的なプライマーを用いたPCRを、種々の細胞株について実施した。コントロールとして、GAPDH mRNA（GAPDHは、テロメラーゼポジティブ細胞株およびテロメラーゼネガティブ細胞株の両方に存在する「ハウスキーピング」酵素である）中のヌクレオチド配列に特異的なプライマーを用いてRT-PCRを同様に実施した。簡単には、TPC2について用いたプライマーは以下であった： tpc-p1 5'-ATGGGGATTCCAGGGTGGAGCT-3'、および tpc-p4 5'-ACCTGCTCTCAGGGCCCACAAGT-3'；および、TPC3について用いたプライマーは以下であった： tpc-p13 5'-TAAGACAAAGAACAGGTCACAACA-3'、および tpc-p14 5'-ATTTGTGCTTAGAGGTCGTGCCAG-3'。 RT-PCRを、ランダムヘキサマーを用いた全RNAから作製された第１鎖cDNAを作製することによって実施し、次いで上記の２つのプライマーセットの１つを用いて一本鎖cDNAをPCR増幅し、次いで、94℃45秒、65℃45秒、72℃90秒の工程からなる各サイクルで、PCR増幅の16〜28サイクルのプロトコル（代表的には、GAPDH m RNAについては16サイクル、TPC2 mRNAについては25サイクル、TPC3 mRNAについては27サイクル）。他の例示的なRT-PCRプライマーおよび条件は、以下の実施例のＣ部およびＤ部に示す。図１は（Ａ、Ｂ、およびＣ部において）、TPC2(図1A)またはTPC3(図1B)cDNAに特異的なプライマーを用いたRT-PCR分析の結果を示す。これらの試験条件下で、 TPC2およびTPC3 mRNAは、試験されたテロメラーゼネガティブ細胞株（図では「死すべき」とラベリングされる）において存在しないか、または非常に低いレベルでのみ検出可能であり、そして試験されたテロメラーゼボジティブ細胞株（図では「不死の」とラベリングされる）の全てにおいて（ほとんどが明白に検出可能なレベルで）検出可能であった。TCP2およびTCP3 mRNAが精巣組織ならびにほとんどの腫瘍細胞株に存在するが、正常細胞株においては存在しないかまたは非常に少ない量のレベルで存在するというこれらの結果は、TCP2ならびに/またはT CP3遺伝子産物を検出および定量するための本発明の方法が、如何に使用されて、不死化細胞（特に、テロメラーゼポジティブ癌細胞）を検出し得るか、そしてヒトおよび他の哺乳動物における癌および他の疾患ならびに条件を診断し得るかを示す。図１Ｃは、GAPDHレベルに対して標準化されたTPC3 mRNAレベルを示し、そして死すべき細胞と不死化細胞との間のTPC3 mRNAレベルにおける明らかな差異を例証する。このRT-PCR分析はまた、予想されるように、TCP2およびTCP3 mRN Aが、テロメラーゼポジティブ細胞においてさえ非常に低い量で存在することを示した（TCP2またはTCP3 mRNA増幅産物は約25サイクル後に検出され；GAPDHまたはHPRTは、それぞれ約15サイクルまたは約20サイクル後に検出された）。テロメラーゼポジティブ細胞における少ない量のTCP2 mRNAの認証的証拠は、半分の全長TCP2 mRNAに対応するcDNAのクローニングにおいて得られたが、テロメラーゼポジティブ293細胞由来のλGT11 cDNAライブラリーの１次スクリーニングは、約 140万のプラークのうち１つのみがポジティブであることを示し、このことは非常に稀な転写物であることを示した。図２は、Ａ部、Ｂ部、およびＣ部で、種々の細胞株におけるhTR RNAのRT-PCR 分析の結果、TPC2およびTPC3 mRNAレベル、ならびにテロメラーゼ活性を示す棒グラフである。図２Ａは、種々の細胞株におけるGAPDH mRNAレベルに標準化されたTPC2およびTPC3 mRNAレベル（これらは、全てIMR-90を除いてポジティブであるテロメラーゼである）を示し、そしてこれらの２つのテロメア長およびテロメラーゼ活性調節タンパク質のレベルにおける相関を示す。図２Ｂは、TPC3 mRNA レベルが、種々の細胞株においてテロメラーゼ活性レベルとどのように相関するかを示す。IMR90、HTB-153、WI-38、VA13、KMSF、およびT0（非活性化Ｔ細胞；T 7が活性化Ｔ細胞を表すことに留意されたい）が、テロメラーゼ活性を全く示さないか、または非常に低いレベルでしか示さない。図２Ｃは、hTR RNAレベルが、種々の細胞株においてテロメラーゼ活性レベルとどのように相関するかを示す。hTRRNAのためのRT-PCRプロトコルが実施例のＤ部において記載されている；hT R遺伝子および転写されたRNAのヌクレオチド配列を図９に示す。まとめると、これらの図は、TPC2およびTPC3 mRNAレベルならびにhTRレベルが、種々の死すべき細胞株および不死の細胞株においてテロメラーゼ活性レベルと相関することを示す。これらの結果は、TPC2またはTPC3遺伝子産物を検出するための本発明の方法が、不死の細胞、特にテロメラーゼポジティブ癌細胞を検出するため、そしてヒトおよび他の哺乳動物における癌ならびに他の疾患および症状を診断するために使用され得る。これらの結果はまた、本発明の方法の有用性を示す。本発明の方法では、TPC2またはTPC3遺伝子産物の検出または定量は、他の要因（例えば、テロメア長、テロメラーゼ活性、またはhTRレベル）の測定と共に、不死の細胞（例えば、癌細胞）を同定するか、または細胞の増殖能を評価するために用いられ得る。テロメラーゼネガティブの死すべき細胞におけるTPC2またはTPC3遺伝子産物の不在または非常に低い量での存在、およびテロメラーゼポジティブ不死の細胞におけるこれらの遺伝子産物の低いが明らかに検出可能な量は、哺乳動物細胞におけるテロメア長およびテロメラーゼ活性を調節するテロメラーゼのタンパク質成分および他のタンパク質のようなタンパク質をコードする遺伝子産物の存在を検出することについての、本発明の方法および試薬の有用性を示す。不死の細胞株の平均末端制限フラグメント（平均TRF）の分析によるテロメア長と、TPC2 mRNA レベルとの比較は、TPC2 mRNAレベルが、テロメア長と反比例することを示す。１つの試験では、比較的高いTPC2 mRNAレベルを有する10の不死の細胞株は、約2 .5〜5.0kbの平均TRFを有したが、非常に低いTPC2 mRNAレベルを有する２つの不死の細胞株は、約17.5〜35kbの平均TRFを有した（偶然にこの差異を生じる確率は１％未満である）。一般に、TPC2 mRNAレベルはまた、試験したほとんどの細胞株においてテロメラーゼ活性レベルと充分に相関する。上記の試験のような試験はまた、TPC2およびTPC3遺伝子産物がテロメア長およびテロメラーゼ活性を調節するように働く作用機構を決定するために用いられ得る。TPC2における試験は、TPC2遺伝子産物が、少なくとも部分的に、酵母EST1タンパク質と同様にテロメア長の指標として作用することにより機能するといういくらかの示唆を提供する。TPC2は、ほとんどの腫瘍細胞株および精巣細胞ではアップレギュレートされ、そして正常細胞株ではダウンレギュレートされる。しかし、明らかに高いレベルのテロメラーゼ活性を有するいくつの細胞株および非常に長いテロメアは、低レベルのTPC2 mRNAを有する。しかし、上述のように、比較的低いTPC2レベルを有するテロメラーゼポジティブ細胞株はまた、比較的高い平均TRFを有する（すなわち、皮膚黒色腫細胞LOX（約35.2kbのTRF）、精巣胚癌腫細胞Tera-1（約27.0kb）および肺癌腫細胞NCI-H23(約17.5kb)）。対して、皮膚黒色肺細胞株SK MEL2（約2.3kb）、SK MEL28（約15.7kb）、SK MEL5（約4.0kb ）、および精巣組織（約15kb）は、比較的低い平均TRFおよび比較的高いTPC2 mR NAを有する。これらの細胞株の全ては、比較的高いテロメラーゼ活性および高い hTRレベルを有するので、試験は、一般に、比較的長いテロメアを有する細胞株が低いTPC2 mRNAレベルを有することを示す。このことは、TPC2タンパク質がテロメア検出機能を有するタンパク質をコードし得ることを示唆する。同じ細胞株におけるTPC3 mRNAレベルおよびテロメラーゼ活性の分析は、TPC3遺伝子産物がテロメラーゼ酵素のコア成分として作用し得ることを示す。テロメア長およびテロメラーゼ活性の調節におけるTPC2およびTPC3遺伝子産物の作用機構に関する有意なさらなる情報は、対応する遺伝子のヌクレオチド配列およびオープンリーディングフレームの対応するアミノ酸配列の分析により推定され得る。サブトラクションハイブリダイゼーションディフアレンシャルデイスプレイ同定およびクローン化は、TPC2およびTPC3 mRNA遺伝子産物の3'末端に対応するcDNAのみを生成したが、これらのcDNAから作成されたヌクレオチド配列情報は、mRNAの付加部分を含むテロメラーゼポジティブ細胞株から調製されたcDNA ライブラリーにおいてクローンを同定および単離することを試みる手段を提供した。 TPC2およびTPC3遺伝子産物の全長cDNAを、種々の方法により得た。このような方法には、サブトラクトされたライブラリーおよび他の特別なライブラリーのスクリーニング、および5'-RACEの使用が含まれる。まず、293細胞（ATCCから入手可能なテロメラーゼポジティブヒト形質転換腎臓細胞株）由来のヒトcDNAを含有するλGT11 cDNAライブラリーをスクリーニングし、サブトラクションハイブリダイゼーションディファレンシャルディスプレイにより得られた短いTPC2および TPC3 cDNAにハイブリダイズしたλクローンを同定した。次いで、さらなるcDNA ライブラリーをスクリーニングし、そして種々のサブクローンからのフラグメントを組み合わせた後、全長オープンリーディングフレームおよび遺伝子を、プラスミドpGRN92（TPC3遺伝子のオープンリーディングフレームを含む）およびpGRN 109（TPC2遺伝子のオープンリーディングフレームを含む）に構築した。例えば、TPC2について、TPC2特異的プローブでのスクリーニングによりλクローンにおけるcDNA挿入物を同定し、そしてプラスミドpGEXおよび誘導ベクター（ Pharmacia）にサブクローン化して、発現産物を試験するために種々のリーディングフレームにTPC2 cDNAを含有するプラスミドを生成し、TPC2 mRNAのオープンリーディングフレームから部分ヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列情報を入手した。TPC3の場合、例えば、cDNAフラグメントをpBluescript IIskベクター（Stratagene）にクローン化し、配列決定および分析用のベクターを生成した。図３は、約7.2kbプラスミドpGRN109の制限部位および機能地図を示す。これは、TPC2タンパク質をコードする約3.3kbのオープンリーディングフレームを含む約3.5kbのNotI-BstEII制限フラグメントを含む（「ORF」および「TPC2」と表記した）。図４は、ヒトTPC2遺伝子、mRNA、およびタンパク質産物に対応するTPC2 オープンリーディングフレームのヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列の部分を列挙する。図５は、約８kbのプラスミドpGRN92の制限部位および機能地図を示す。このプラスミドは、TPC3タンパク質をコードする約1.1kbのオープンリーディングフレームを含む約1.4kb EcoRI-BamHI制限フラグメントを含む（「ORF」および「TPC3」と表記する）。図６は、ヒトTPC3遺伝子、mRNA、およびタンパク質産物に対応するTPC3オープンリーディングフレームのヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を列挙する。開始メチオニンコドンは、「^★★★」で表記し、そして停止コドンは「−−−」で表記した。プラスミドpGRN92は、図６に示すヌクレオチド１〜82を含まない。 TPC2およびTPC3は共に、そのオープンリーディングフレームまたは他の遺伝子の配列について、EST以外の公共データベースの配列に対する有意な相同性を示さない。しかし、これらは共にモチーフ象徴を有する。TPC2は、２つのWWドメインおよび１つのL22象徴ドメインを有し；TPC3は、ホメオボックスドメインを有する。「ホメオボックス」は、多数のDrosophilaホメオティックおよび分節タンパク質で最初に同定され、そしてこれまで多くの動物（脊椎動物を含む）で非常に十分に保存されていることが分かっている60アミノ酸のタンパク質ドメイン（ Gehring、1992、Trends Biochem．Sci．17:277-280を参照のこと）である。このドメインは、ヘリックス−ターン−ヘリックス型の構造によってDNAに結合する。ホメオボックスドメインを含有するタンパク質は、発生において役割を果たすようである；ほとんどは、配列特異的DNA結合転写因子であると知られている。最近の刊行物は、ホメオボックスドメインが、RNAもまた結合し得ることを示唆している。DubnauおよびStruhl、1996年２月22日、Nature 379:694。TPC3中に示されたホメオボックスは、以下である：LAMCTNLPEARVQVWFKNRRAKFR。 TPC2は、２つのWWドメインおよびL22リボソームRNA象徴ドメインを含有する。リボソームタンパク質L22は、E.coliにおいて、23S rRNAに結合する大きなリボソームサブユニットのタンパク質成分である；このタンパク質は、リボソームタンパク質のファミリーに属する。Ganttら、1991，EMBO J.10:3073-3078を参照のこと。TPC2については、このドメインは、以下である：SSSKVHSFGKRDQAIRRNPNVP VVV。WWドメイン（rep5またはWWPとしても知られる）は、多数の非関連タンパク質において短い保存領域である（とりわけ、Duchenne筋ジストロフィーを担うジストロフィン）。ドメインは、約35残基に及び、いくつかのタンパク質において４回まで繰り返され得、そしてSH3ドメインに幾分類似する特定のプロリンモチーフ[AP]-P-P-[AP]-Yを有するタンパク質に結合することが見出されている。WW ドメインは、頻繁には、シグナル伝達プロセスにおいて他のタンパク質と会合し、そして４つの保存された芳香族位置（一般にはTrp）周辺に分類されたβ鎖を含むようである；名称WWPは、これらの保存されたTrpおよびPro残基の存在に由来する。TPC2については、このドメインは、３つのアミノ酸残基配列により表される：WSYGVCRDGRVFFINDQLRCTTWLHP；WFVLADYCLFYYKAEKKRSSXSIP；およびWEEGFTEE GASYFIDHNQQTTAFRHP。 TPC2およびTPC3オープンリーディングフレームをコードするプラスミドの利用可能性は、広範な種々の利益を提供する。このような利益には、TPC2および／またはTPC3オープンリーディングフレーム配列またはTPC2および／またはTPC3遺伝子産物と特異的に反応する産物をコードする配列を含む組換え遺伝子産物を発現する組換え宿主細胞の利益が含まれる。 III．組換え宿主細胞１つの実施態様では、本発明は、以下を含有する、組換え噛乳動物宿主細胞を提供する：（ｉ）プラスミドpGRN109の約3.5kbのNotI-BstEII制限フラグメントのヒトDNA 挿入物に含有されるヒト遺伝子TPC2のオープンリーディングフレーム配列に対応する、少なくとも約10、15、25、100またはそれより多い数の連続したヌクレオチドを含む、組換えまたは合成核酸；または上記オープンリーディングフレーム配列によりコードされたアミノ酸配列に対応する、少なくとも約６、10、15、25、100またはそれより多い数の連続したアミノ酸を含む、合成または組換えペプチドまたはタンパク質；および（ii）プラスミドpGRN109の約1.4kbのEcoRI-BamHI制限フラグメントのヒトDNA 挿入物に含有されるヒト遺伝子TPC3のオープンリーディングフレーム配列に対応する、少なくとも約10．15、25、100またはそれより多い数の連続したヌクレオチドを含む、組換えまたは合成核酸；または上記遺伝子TPC3のオープンリーディングフレーム配列によりコードされたアミノ酸配列に対応する、少なくとも約６、10、15、25、100またはそれより多い数の連続したアミノ酸を含む、合成または組換えペプチドまたはタンパク質；上記TPC2およびTPC3遺伝子は、テロメア長を調節するかまたはテロメラーゼ活性を調整し、そしてテロメラーゼ活性を発現するヒトまたは他の哺乳動物細胞に存在するタンパク質をコードすることで特徴づけられる。本発明により提供された他の哺乳動物宿主細胞は、TPC2およびTPC3誘導組換えまたは合成核酸、ペプチド、またはタンパク質のいずれかまたは両方を含有するものを包含する。さらに、本発明はまた、pGRN33（ATCC75926）の約2.5kbのHind III-SacI制限フラグメントに位置したヒトhTRの連続ヒトヌクレオチド配列に対応する、少なくとも約10、15、25、100またはそれより多い数の連続したヌクレオチドを含む、合成または組換え核酸を含有するようにさらに改変されたこのような細胞を提供する。本発明の組換え宿主細胞は、本発明によってまた提供される多くの有用な方法における適用を有する。例えば、本発明は、ヒトTPC2またはTPC3遺伝子によりコードされたタンパク質に実質的に同一の配列におけるアミノ酸をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された発現制御配列を有し、必要に応じて組換え hTR遺伝子もまた有する新規な発現ベクターを含む組換え宿主細胞を提供する。これらの組換え宿主細胞は、テロメラーゼ活性を調整するかまたはテロメア長を調節する因子の同定するスクリーンにおいて用いるため、ならびに以下に記載の種々の他の目的のための、組換えヒトテロメラーゼの生産に有用である。本発明の組換え宿主細胞はまた、非ヒトトランスジェニック哺乳動物の生殖系列および／または体細胞組織に取り込まれ得、そして治療目的のために咄乳動物に投与され得る。従って、テロメア長またはテロメラーゼ活性を調節する遺伝子（例えば、ヒト TPC2もしくはTPC3遺伝子、またはそれらの組換えバージョン（変異タンパク質TP C2もしくはTPC3遺伝子産物をコードするバージョンを含む））のゲノムクローンは、少なくとも１つの機能的に破壊された（またはさもなければ変化された）対立遺伝子を有する細胞およびトランスジェニック非ヒト動物を生成するための相同的標的化構築物を構築するために用いられ得る。相同的標的化構築物の構築のための指針は、当該分野において見出され得る。これらには、以下が含まれる： Rahemtullaら、1991、Nature 353:180；Jasinら、1990、Genes Devel．4:157；K ohら、1992,Science 256:1210；Molinaら、1992，Nature 357:161；Grusbyら、1 991，Science 253:1417；およびBradleyら、1992、Bio/Technology 10:534。また米国特許第5,464,764号および第5,482,992号を参照のこと。トランスジェニック細胞および／またはトランスジェニック非ヒト動物は、抗新生物剤についてのスクリーンおよび／または潜在的な発癌性物質についてのスクリーニングのために用いられ得る。これは、テロメア長またはテロメラーゼ活性を調節するタンパク質の不適切な発現が、新生物形成前もしくは新生物形成状態または他の疾患もしくは症状を生じ得るからである。相同的標的化は、いわゆる「ノックアウト」マウスを生成するために用いられ得る。このマウスは、不活性化対立遺伝子について異種接合性または同種接合性である。このようなマウスは、免疫系発生、新生物形成、精子形成の研究のための実験用動物として、またはペットとして、または動物製品（食糧）のために、または他の目的で市販され得る。キメラトランスジェニックマウスは、Hoganら、1988、Manipulating the Mous e Embryo:A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，and Teratoc arcinomas and Embryonic Stem Cells:A Practical Approach，E.J．Robertson 編、IRL Press，Washington，D.C．(1987)に従って誘導する。胚幹細胞は、公開された手順（Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells:A Practical Approa ch、E.J．Robertson編、IRL Press，Washington，D.C．(1987)；PCT特許公開第 96/22362号;Zjilstraら、1989、Nature 342:435；およびSchwartzbergら、Scien ce 246:799（それぞれは、本明細書中に参考として援用される）に従って操作され得る。さらに、TPC2またはTPC3 cDNAまたはゲノムクローンは、高レベルおよび／または遺伝子に隣接して天然に存在し得ない（逆も同様である、すなわち、TPC2またはTPC3遺伝子は、スクリーニングまたは他の用途において有用なレポーター遺伝子の前に位置する）転写調節配列の転写制御下でポリペプチドを発現させるための導入遺伝子を構築するために用いられ得る。例えば（しかし、限定されない）、構成プロモーター（例えば、HSV-tkまたはpgk（ホスホグリセリン酸キナーゼ）プロモーター）または細胞系統特異的転写調節配列（例えば、CD4またはCD8 遺伝子プロモーター／エンハンサー）は、ポリヌクレオチド配列をコードするタンパク質に作動可能に連結されて、導入遺伝子を（代表的には、選択可能マーカー（例えば、neo遺伝子発現カセット）と組み合わせて）形成し得る。このような導入遺伝子は、細胞（例えば、ES細胞、造血幹細胞、癌細胞）およびトランスジェニック細胞、細胞株に導入され得、そしてトランスジェニック非ヒト動物が、それに加えて従来の方法に従って得られ得る。本発明の組換え宿主細胞は、頻繁には、上記の発現制御ベクターのような、本発明によって提供される有用なオリゴヌクレオチドおよび核酸試薬を用いて調製されるか、またはそれの供給源として作用する。これらの核酸試薬は、以下の章においてより詳細に記載される。IV. オリゴヌクレオチドおよび核酸別の実施態様において、本発明は、種々の形態で（すなわち、単離可能か、単離したか、精製したか、または実質的に純粋な形態で）、そして種々の目的のため（すなわち、プローブまたはプライマーとして、哺乳動物宿主細胞におけるテロメア長を調節するか、またはテロメラーゼ活性を調整する組換え遺伝子産物を導入するためのポリヌクレオチドプラスミドおよびベクターとして、有用な核酸を創造するための制限フラグメントとして、ならびに治療的、診断的、および他の適用のための試薬として）の合成および組換えのオリゴヌクレオチドおよび核酸を提供する。本発明の単離したか、または精製したポリヌクレオチドは、代表的には、約10kb未満のサイズである。特に、本発明は、以下のいずれかに位置する連続したヌクレオチド配列に、配列が実質的に同一かまたは相補的な少なくとも約10、15、25、100、またはより多くの連続したヌクレオチドを含む、組換えまたは合成核酸を提供する： (i)プラスミドpGRN109の約3.5kbのNotI-BstEII制限フラグメントのヒトDNA挿入物中に含まれるヒト遺伝子TPC2のオープンリーディングフレーム配列；または (ii)プラスミドpGRN92の約1.4kbのEcoRI-BamHI制限フラグメントのヒトDNA挿入物中に含まれるヒト遺伝子TPC3のオープンリーディングフレーム配列。本発明の新規なオリゴヌクレオチドプローブおよびプライマーは、代表的には、TPC2もしくはTPC3遺伝子、または核酸の複合混合物におけるそれらへの特異的なハイブリダイゼーションを可能にする遺伝子産物中のヌクレオチドの配列に、実質的に同一か、あるいは相補的な配列中のヌクレオチドを含む。ヌクレオチド置換、欠失、および付加は、本発明のポリヌクレオチド中に組み込まれ得る。ヌクレオチド配列変化は、種々の対立遺伝子の配列多型、微量の配列決定誤差などから生じ得る。標的配列への特異的なハイブリダイゼーションのために必要とされるポリヌクレオチドの最小長は、以下のいくつかの因子に依存する：とりわけ、 G/Cの含有量、（もしあれば）ミスマッチ塩基の位置、標的ポリヌクレオチドの集団と比較した場合の配列の独特の程度、およびポリヌクレオチド（メチルホスホン酸バックボーン、ポリアミド核酸、ホスホロチオネートなど）の化学的性質。本発明のプローブおよびプライマーは、種々の診断的、治療的、および他の適用において有用な適用を有する。それらは、不死のヒト細胞株間で区別して発現されるので、TPC2およびTPC3の遺伝子および遺伝子産物は、テロメラーゼ活性および腫瘍細胞マーカーとして作用する。独特なTPC2またはTPC3遺伝子配列に対応するオリゴヌクレオチドは、プライマーまたはプローブとして使用され得、他の核酸、タンパク質、ラベルなどに付着され得、そして種々の目的（例えば、臨床的検体中の腫瘍細胞のための診断的プローブとして、を含む）について有用である。本発明のオリゴヌクレオチドは、TPC2またはTPC3遺伝子産物の存在を検出するため、細胞において上昇または減少したTPC2またはTPC3 mRNAレベルの存在によって特徴付けられる腫瘍性疾患を診断するため、組織分類を実施するため（すなわち、テロメラーゼ、またはTPC2もしくはTPC3 mRNAの発現によって特徴付けられる組織を同定するため）などのハイブリダイゼーションプローブまたはPCR プライマーとして使用され得る。プローブを用いて、例えば、法医学的DNA分析、またはTPC2もしくはTPC3遺伝子の増幅、変換、および／もしくは再配列によって特徴付けられる疾患の診断のために、DNAサンプル中のTPC2またはTPC3特異的ヌクレオチド配列を検出し得る。本発明の特定の好ましいオリゴヌクレオチドは、代表的には、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、pGRN109 の約3.5kbのNotI-BstEII挿入物、またはpGRN92の約1.4kbのEcoRI-BamHI挿入物中のヌクレオチド配列に対応する核酸にハイブリダイズし得る、少なくとも８、10 、15、25、99、250、1000、またはより多くの連続したヌクレオチドを含み、そして例えば、プローブ、プライマー、アンチセンス治療薬、およびリボザイム治療薬として有用である。ポリペプチドの発現が所望されない場合、本発明のポリヌクレオチドは、機能的なタンパク質をコードする必要はない。本発明のポリヌクレオチドは、RNAまたはDNA配列を検出するためのハイブリダイゼーションプローブおよび／またはP CRプライマーおよび／またはLCRオリゴマーとして作用し得る。あるいは、本発明のボリヌクレオチドは、関連する遺伝子（例えば、構造的または進化的に関連するタンパク質をコードする遺伝子）のRNAまたはDNA配列を検出するための、ハイブリダイゼーションプローブまたはプライマーとして作用し得る。そのようなハイブリダイゼーションおよび他の適用（例えば、PCRを含む適用）のために、本発明のポリヌクレオチドは、機能的なポリペプチドをコードする必要はない。従って、本発明の特定のポリヌクレオチドは、TPC2もしくはTPC3遺伝子またはmR NA遺伝子産物への特異的なハイブリダイゼーション、あるいはそれらの特異的な増幅の能力が保持される限り、実質的な欠失、付加、ヌクレオチド置換、および／または転移を含み得る。ひとつの例として、アンチセンスポリヌクレオチドは、関連する標的配列（代表的にはmRNA）への特異的なハイブリダイゼーションが、ポリヌクレオチドの機能的な特性として保持される限り、ヌクレオチド置換、付加、欠失、または転移を含み得る。相補的なアンチセンスポリヌクレオチドは、mRNA種および遺伝子に特異的にハイブリダイズし得、従ってmRNAを産生する遺伝子の転写ならびに／またはmRNAの翻訳を妨げ得る、可溶性のアンチセンスRNAオリゴヌクレオチドあるいは可溶性のアンチセンスDNAオリゴヌクレオチドを含む。種々の長さのアンチセンスポリヌクレオチドを使用し得るが、そのようなアンチセンスポリヌクレオチドは、代表的には、天然に存在するTPC2またはTPC3遺伝子配列に実質的に同一である少なくとも約25の連続したヌクレオチドの配列を含む。アンチセンスポリヌクレオチドは、トランスフェクタント細胞またはトランスジェニック細胞（例えば、個体の造血幹細胞集団のすべてまたは一部を再構成するために使用されるトランスジェニック多能性造血幹細胞）において異種の発現カセットから産生され得る。あるいは、アンチセンスポリヌクレオチドは、インビトロでの培養培地においてか、またはインビボでの循環系もしくは組織液においてのいずれかで、外部環境に投与される可溶性オリゴヌクレオチドを含み得る。外部環境において存在する可溶性アンチセンスポリヌクレオチドは、細胞質へ接近し、そして特定のmRNA種の翻訳を阻害することが示されている。いくつかの実施態様において、アンチセンスポリヌクレオチドは、メチルホスホン酸部分、または他の合成部分を含む。アンチセンスポリヌクレオチドに関連する一般的な方法について、Anti sense RNA and DNA(1988)，D.A．Melton編、Cold Spring Harbor Laboratory，C old Spring Harbor，NYを参照のこと。阻害核酸はまた、いわゆる「センス」または他の核酸（すなわち、三重鎖形成核酸）であり得る。ひとつの例として、ガン細胞株における組換えTPC3 mRNAの発現は、90％を越えるテロメラーゼ活性の阻害を生じた。この例において、TPC3 遺伝子の約1.1kbの全コード配列を、ベクターpTATPC3.9からEcoRIフラグメント( 約2.1kb)として単離し、そして哺乳動物発現ベクターpBBS212のEcoRI部位中に挿入し、以下の２つのベクターを生成した：pGRN111（ここで、TPC3遺伝子のセンス鎖は、骨髄増殖性肉腫ウイルス(myelo proliferative sarcomavirus)(MPSV)プロモーターに作動可能に連結されている)、およびpGRN112（ここで、アンチセンス鎖は、MPSVプロモーターに作動可能に連結されている）。ベクターpTAT PC3.9 を、TPC3 5'-RACE産物(約2.1kb)のpCRIIべクター(Invitrogen)への連結によって構築した。センスおよびアンチセンスベクター、ならびにコントロールベクター pBBS212を用いて、エレクトロポレーションによってHeTe7細胞を形質転換した。培地を、ハイグロマイシン（300μｇ/ml）およびピューロマイシン（0.2μｇ/ml ）を含む選択培地に４週間変え、そして個々のクローンを得た。次いで、個々のクローンを、単離し、拡大し、そしてセンスまたはアンチセンスTPC3遺伝子産物の発現、およびRT-PCRによるベクター転写についてアッセイした。次いで、ポジティブクローンをTRAPアッセイを用いてテロメラーゼ活性についてアッセイし、そして平均TRF値を異なる時点で測定した。図７は、遺伝子TPC3のセンスもしくはアンチセンスmRNA、またはコントロールベクターを発現する組換えHeTe7細胞におけるテロメラーゼ活性レベルの分析の結果を示す。上記のように、組換えセンスmRNAの存在は、テロメラーゼ活性を、これらの細胞において顕著に減少させた。図８は、遺伝子TPC3のセンスもしくはアンチセンスmRNA、またはコントロールベクターを発現する組換えHeTe7細胞におけるテロメア長の分析の結果を示す。組換えTPC3センスmRNAは、細胞における平均TRFを減少させた。従って、組換えTPC3遺伝子産物は、これらの細胞におけるテロメラーゼ活性だけではなく、テロメア長もまた調節し得る。この実験は、本発明の組換え核酸が、それに作動可能に連結された発現制御配列を含む発現ベクターで細胞をトランスフェクトすることによってどのように発現され得るかを示す。TPC2またはTPC3のフラグメントまたはアナログもまた、発現され得、そしてテロメア長またはテロメラーゼ活性を調節する酵素の他の活性な成分と競争するように機能し得る。リボヌクレオタンパク質または他の巨大分子の非機能的成分とのアセンブリは、非機能的複合体およびその後の関連する活性（すなわち、テロメラーゼ活性、テロメア維持、およびテロメア長）における減少を生じる。本発明の発現ベクターは、代表的には、TPC2またはTPC3タンパク質遺伝子産物中のアミノ酸配列に同一の配列中のアミノ酸をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結される発現制御配列を含む。作動可能に連結されたヌクレオチド配列は、代表的には少なくとも５〜９アミノ酸をコードするか、あるいはTPC2またはTPC3タンパク質のすべてもしくは少なくとも活性部分をコードするか、あるいはTPC2もしくはTPC3のアミノ酸配列または変異体であるがそれに関連する配列から選択される配列中の15、20、25、100、またはより多くの連続したアミノ酸をコードする。例えば、有用なTPC2およびTPC3変異タンパク質は、融合タンパク質を含み、ここでTPC2またはTPC3タンパク質のすべてまたは一部は、いくつかの有用な特徴（例えば、アフィニティー精製における使用のための結合部位（すなわち、約６つのヒスチジン残基のポリヒスチジンタグまたはマルトース結合タンパク質））を与えるペプチドあるいはポリペプチドに融合される。好ましくは、これらのアミノ酸配列は、天然に存在するタンパク質の所定の順序で（アミノ酸末端からカルボキシ末端の方向で）存在するが、他の介在配列および／または末端配列を含み得；一般にそのようなポリペプチドは、1000未満のアミノ酸長、より一般には約500未満アミノ酸長、そして頻繁には約200アミノ酸長である。遺伝コードの縮重は、これらのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列の有限のセットを与え；縮重配列のこのセットは、手で、または市販のソフトウェア (Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0)を用いるコンピユーターによって容易に生成され得る。本発明のこれらの発現ベクターおよび他の発現ベクターは、多くの有用な適用（本発明の治療的方法において、標的細胞または組織において、テロメラーゼ活性を調整することについては、その活性を活性化もしくは阻害のいずれかをするため、またはテロメア長を調節することについては、長さを増加もしくは減少のいずれかをさせるための遺伝子治療ベクターとしてを含む）を有する。従って、本発明の遺伝子治療発現ベクターは、TPC2および／もしくはTPC3タンパク質の変異体または「変異タンパク質」をコードする（すなわち、１つ以上のアミノ酸の欠失、置換、および／もしくは付加によってTPC2ならびに／またはTP C3と異なるタンパク質を発現する）ベクターを含む。しかし、本発明の遺伝子治療ベクターはまた、他の有用な核酸（例えば、hTR、またはTPC2、TPC3、および／もしくはhTR遺伝子産物（すなわち、mRNAおよびテロメラーゼRNAを標的化するアンチセンス核酸もしくはリボザイム））をコードし得る。本発明のベクターはまた、免疫原として提示される場合、TPC2もしくはTPC3タンパク質に特異的に結合する抗体、またはそれらのタンパク質を発現する細胞の産生を誘発し得るタンパク質の発現をコードし得る。そのようなベクターはまた、構造的に関連するタンパク質（例えば、TPC2もしくはTPC3タンパク質フラグメントまたはアナログ）をコードし得る。これらのベクターは、テロメラーゼ活性またはテロメア長の調整が有益であり得る疾患もしくは健康状態を処置または予防するための本発明の治療的方法において有用である。例えば、テロメラーゼポジティブガン細胞において、テロメラーゼ活性の阻害は、それらの細胞におけるテロメア維持を妨げ得、連続性の増殖に際して、テロメア損失、細胞危機、および死を誘導する。そのような目的のために、非機能的TPC2もしくはTPC3変異タンパク質または変異体タンパク質、あるいは細胞におけるテロメラーゼ活性によるテロメラーゼ形成またはテロメア延伸を（例えば、RNA成分もしくはタンパク質成分についての競合すること、内因性遺伝子発現の阻害、または他の手段により）阻害し得る他の核酸（すなわち、TPC3 mRNAの発現にわたって）を発現する本発明の遺伝子治療ベクターは好ましい。本発明の発現ベクターは、目的の宿主細胞と適合可能な発現および複製シグナル（すなわち、コード配列の転写および翻訳を促進し、その結果コードされたポリペプチド産物が産生される配列（発現配列））を含む。そのようなポリヌクレオチドの構築は、当該分野で周知であり、そしてさらにManiatisら、前出にさらに記載される。そのようなポリヌクレオチドは、例えば、プロモーター、転写終結部位（真核生物発現宿主におけるポリアデニル化部位）、リボソーム結合部位、および必要に応じて真核生物発現宿主における使用のためのエンハンサー、および必要に応じてベクターの複製のために必要な配列を含み得るが、これらに限定されない。代表的な真核生物発現カセットは、プロモーター（例えば、HSV、t k、pgk、メタロチオネイン、または哺乳動物細胞における使用に適切な広範な種々の任意の他のプロモーター）の下流（すなわち、翻訳リーディングフレーム方向で；ポリヌクレオチド連結）に連結され、必要に応じてエンハンサーおよび下流ポリアデニル化部位（例えば、SV40ラージＴAgポリＡ付加部位）に連結された、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む。組換えTPC2、TPC3、および本発明の他のタンパク質を発現するために有用な発現ベクターは、ウイルスベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）（すなわち、治療方法については、プラスミドベクター（例えば、pcDNA1 (Invitrogen，San Diego，CA)）を含み、ここで、発現制御配列は、CMVプロモーター、コスミド、リポソームなどを含む。ウイルスベクターおよびプラスミドベクターは、頻繁には、哺乳動物細胞をトランスフェクトするために好ましい。本発明の核酸試薬はまた、TPC2およびTPC3遺伝子産物、ならびにヒトTPC2およびTPC3遺伝子の哺乳動物（すなわち、マウス）相同体と相互作用するタンパク質をコードする核酸を同定、単離、ならびにクローニングすることにおいて有用な試薬を含む。相同なDNAは、目的の哺乳動物細胞（例えば、マウス、ラット、ウサギ、または他の細胞（すなわち、酵母人工染色体、コスミド、またはバクテリオファージλ（例えば、Charon 35)中の））から調製されたゲノムまたはcDNAクローンライブラリーを、本明細書中に開示されるTPC2またはTPC3のcDNA配列の少なくとも約24（または15〜30もしくはそれ以上の範囲）の連続したヌクレオチド（またはそれらの相補体）の配列を含むポリヌクレオチドプローブを用いてスクリーニングすることによって容易に同定され得る。代表的には、ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件を、慣習的なハイブリダイゼーション手順に従って、種々の程度のストリンジェンシーで実施する。ポジティブクローンを単離し、そして配列決定する。例示のためであって、限定のためではないが、TPC2およびTPC3 遺伝子のオープンリーディングフレーム配列に対応する完全長のポリヌクレオチドが標識され得、そしてマウスもしくは他の哺乳動物のゲノムクローンまたはcD NAライブラリー（すなわち、Promega Corporation，Madison，Wisconsinから入手可能なもの）からゲノムクローンを単離するためにハイブリダイゼーションプローブとして使用され得る。本発明の核酸をまた使用して、TPC2および／もしくはTPC3遺伝子産物と相互作用するか、またはそれらに結合する遺伝子産物を単離ならびに同定し得る。酵母「ツーハイブリッド」システム（Chienら、1991，Proc．Natl．Acad．Sci．（US A）88:9578を参照のこと）は、融合タンパク質として所定のポリペプチド配列をコードする発現ベクターを利用し、そして転写活性因子の再構成を介してインビボでのタンパク質-タンパク質相互作用を同定するために使用される(FieldsおよびSong，1989，Nature 340:245)。通常、酵母Gal4転写タンパク質（これは、DNA 結合および転写活性化を担う分離可能なドメインからなる）は、転写活性因子として作用する。２つのハイブリッドタンパク質（１つは、第１のタンパク質のポリペプチド配列に融合された酵母Gal4 DNA結合ドメインからなり、そしてもう一方は、第２のタンパク質のポリペプチド配列に融合されたGal4活性化ドメインからなる）（第１または第２のタンパク質は、代表的には、他方のタンパク質と特異的に相互作用する能力についてスクリーニングされるべき多くの異なるタンパク質である）をコードするポリヌクレオチドを構築し、そして酵母宿主細胞中に導入する。もしあれば、２つの融合タンパク質間の分子間結合は、Gal4 DNA結合ドメインを、Gal4活性化ドメインと再構成し、それは、Gal4結合部位に作動可能に連結されたレポーター遺伝子（例えば、lacZ，HIS3)の転写活性化を導く。代表的には、ツーハイブリッド法は、公知のタンパク質と相互作用する新規なポリペプチド配列を同定するために用いられる。本発明はまた、ツーハイブリッドシステムおよびスリーハイブリッドシステムを、代表的にはTPC2またはTPC3のいずれかを含む第一のハイブリッドタンパク質、第二のハイブリッドタンパク質、およびレポーター遺伝子をコードするポリヌクレオチドの形態で提供する。ここで、上記のポリヌクレオチド（単数または複数）は、一時的な発現のために、安定に複製または導入される。宿主生物は、レポーター遺伝子転写調節配列が、Gal4応答性プロモーター（結合部位）を含む酵母細胞（例えば、Saccharomyces cervisiae）であり得る。酵母細胞は、（１）T PC2またはTPC3タンパク質の結合フラグメントに融合したGal4 DNA結合ドメイン（またはGal4アクチベータードメイン）をコードする発現カセット；（２）cDNA ライブラリーメンバーに融合したGal4 DNAアクチベータードメイン（それぞれまたは、Gal4結合ドメイン）をコードする発現カセット；および（３）シス結合Ga l4転写応答エレメントを含むレポーター遺伝子（例えば、β-ガラクトシダーゼ）を含み、TPC2および／またはTPC3タンパク質に特異的に結合するポリペプチドをコードするcDNAを同定するためにcDNAをスクリーニングするために使用され得る。酵母ツーハイブリッドシステムは、哺乳動物（代表的には、ヒト）cDNA発現ライブラリー（例えば、ヒト成熟Ｂ細胞株（Namalwa）mRNAから産生されたcDNA ライブラリーのような）をスクリーニングするために使用され得る（Ambrusら、 1993，Proc．Natl．Acad．Sci．(U.S.A.)を参照のこと）。一旦、このような相互作用ポリペプチドをコードするcDNAが同定されると、得られたポリペプチドはクローン化され、特徴づけられ、そして結合相互作用を阻害し得る化合物を同定するために、化合物をスクリーニングするために使用され得る。本発明のオリゴヌクレオチドおよび核酸試薬の多くの、ならびに多様な適用にもかかわらず、１つの重要な適用は、以下の節で議論されるように、本発明の組換えペプチドおよびタンパク質の産生に関する。Ｖ．ペプチドおよびタンパク質別の実施態様において、本発明は、哺乳動物細胞においてテロメア長およびテロメラーゼ活性を調節する遺伝子および遺伝子産物に関する、ペプチド、タンパク質、抗体、および酵素を提供する。特に、本発明は、合成もしくは組換えペプチド、または以下のいずれかに位置するヒト遺伝子のオープンリーディングフレーム配列によってコードされるアミノ酸配列と、配列において同一の、少なくとも約６、15、25、100もしくはそれより多くの連続アミノ酸を含むタンパク質を提供する：（i）プラスミドpGRN109の約3.5kb NotI-BstEII制限フラグメント；または（ii）プラスミドpGRN92の約1.4kb EcoRI-BamHI制限フラグメント。本発明は、組換えTPC2および／またはTPC3タンパク質を発現する真核生物または原核生物宿主細胞由来、もしくはインビトロでの翻訳系由来の単離可能な形態で、ならびにインビトロ合成由来の精製および実質的に純粋な形態で、TPC2およびTPC3遺伝子によりコードされる、または組換え宿主細胞からの精製による、もしくは本発明の抗体もしくは他の試薬を使用する天然に存在するタンパク質の精製による、ペプチドおよびタンパク質、ならびにそれらのフラグメントおよびアナログを提供する。組換え宿主における異種タンパク質の発現、ポリペプチドの化学合成、およびインビトロ翻訳の方法は、当該分野に周知であり、そしてMani atisらおよびBergerならびにKimmel、前出にさらに記載される。このようなタンパク質は、インビトロでのテロメアーゼの再構成、またはテロメアーゼを維持しおよびテロメアーゼ長を調節する他の酵素活性についての方法において適用を有する。これらの方法は、次いで、治療剤について、診断試験について、および他の適用についてのスクリーニングにおける適用を有する。これらは、不死のヒト細胞株間で個々に発現されるので、TPC2およびTPC3遺伝子ならびに遺伝子産物は、テロメアーゼ活性および腫瘍細胞マーカーとして作用する。TPC2またはTPC3タンパク質の全長アミノ酸配列または部分アミノ酸配列を有するポリペプチドは、例えば、TPC2またはTPC3タンパク質に対する抗体の産生に有用であり、そして腫瘍細胞内でのTPC2またはTPC3タンパク質の欠失に有用である。本発明は、TPC2およびTPC3遺伝子のオープンリーディングフレームによってコードされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有する精製TPC2およびTPC3タンパク質を提供する。このような遺伝子は、ヒト対立遺伝子変異体または哺乳動物同族遺伝子（これは、本発明に従って、および本発明により提供される試薬を使用して得られ得る）を含む。本発明はまた、TPC2およびTPC3タンパク質アナログ、ならびに連続した配列において少なくとも５、10、15、20、25、100またはそれより多くのアミノ酸を含む天然に存在しないポリペプチドを提供し、この連続した配列は、TPC2およびTP C3タンパク質のアミノ酸配列から選択されるが、１つ以上のアミノ酸の欠失または付加を、アミノ末端もしくはカルボキシ末端のいずれか、または内部、あるいは両方に含み；アナログは配列転移をさらに含み得る。アナログはまた、アミノ酸置換体、好ましくは保存的置換体を含み得る。アナログは、活性フラグメントおよび種々の変異タンパク質を含む。例えば、１つまたは複数のアミノ酸置換体（好ましくは保存的アミノ酸置換体）が天然に存在する配列において作製され得る。好ましいアミノ酸置換体には、以下が含まれる：（1）タンパク質分解に対する感受性を減少するアミノ酸置換体、（2）酸化に対する感受性を減少するアミノ酸置換体、（3）アナログの翻訳後の修飾を変化するアミノ酸置換体（おそらくリン酸化を含む）、および（4）このようなアナログの他の物理化学的または機能的特性を与えるかまたは変更するアミノ酸置換体。TPC2またはTPC3タンパク質アナログは、TPC2またはTPC3タンパク質に対する免疫原性であり得る。すなわち、免疫原として提示される場合、アナログは、抗体（TPC2またはTPC3タンパク質に特異的に結合する）の産生を惹起する。活性なフラグメントは、アミノ末端もしくはカルボキシ末端のいずれか、または両方からの欠失により、全長タンパク質のフラグメントを生成し、そして得られたフラグメントを活性について試験することによって経験的に同定され得る。保存的アミノ酸置換は、同様の特徴（例えば、酸性特性を有するもの：AspとG lu）を有する置換アミノ酸によるアミノ酸の置換である。保存的（または同義の）アミノ酸置換は、親タンパク質の構造特徴を実質的に変化させない（例えば、置換したアミノ酸は、親配列で生じるヘリックスを破壊する傾向にも、親配列を特徴付ける二次構造の他の型を破壊する傾向にもないはずである）。当該分野で認識されているポリペプチド二次構造および三次構造の例は、Proteins，Struct ures and Molecular Principles（1984），Creighton（編）、W.H．FreemanおよびCompany，New York；Introduction to Protein Structure（1991）、C．Brand enおよびJ．Tooze，Garland Puglishing，New York，NY；ならびにThorntonら、 1991，Nature 354：105に記載されており、これらは参考として本明細書中で援用される。以下の６つの群は、各々互いに保存的置換基であるアミノ酸を含む：（1）アラニン（A）、セリン（S）、スレオニン（T）；（2）アスパラギン酸（D ）、グルタミン酸（E）；（3）アスパラギン（N）、グルタミン（Q）；（4）アルギニン（R）、リジン（K）；（5）イソロイシン（I）、ロイシン（L）、メチオニン（M）、バリン（V）；および（6）フェニルアラニン（F）、チロシン（Y ）、トリプトファン（W）。アナログは、一般に、アミノ末端またはカルボキシ末端に結合する異種配列を含み得る。ここで、異種配列（単数または複数）は、天然のタンパク質によって分断されない、生じたアナログに機能的特性を与える。このようなアナログは、融合タンパク質と呼ばれ、そして本発明の目的のために、代表的には、TPC2もしくはTPC3タンパク質またはアナログ、およびさらなるペプチドもしくはタンパク質部分を含む。融合タンパク質は、２つの異なったポリペプチドまたはタンパク質の特性を有効に合わせ、そして例えば、ポリヒスチジンポリペプチドまたはマルトース結合タンパク質（融合タンパク質のアフィニティー単離において、有用である）のような標識を与えるかまたは細胞内の分解から融合タンパク質を保護するために使用され得る。融合タンパク質は、所望の特性（例えば、TPC2もしくはTPC3タンパク質または融合タンパク質の保持体（remainder）から切断可能なアナログを有するペプチダーゼ部位）を有するリンカーペプチドを含み得る。融合タンパク質はまた、目的のTPC2またはTPC3タンパク質に対する抗原性エピトープを与え得；次いで、エピトープを結合する抗体は、精製のために融合タンパク質を免疫沈降するために使用され得るか、または結合したタンパク質を同定するために使用され得る。従って、本発明は、組換え融合タンパク質を提供する。ここで、TPC2またはTP C3タンパク質の全体または一部が、目的の別のポリペプチドまたはタンパク質に融合される。例えば、プラスミドpGRN103、pGRN104、pGRN106、およびpGRN110は、本発明の発現プラスミドであり、これらは、TPC2またはTPC3タンパク質のいずれかの一部、およびマルトース結合タンパク質（MBP）を含む本発明の新規の融合タンパク質の発現をコードする。これらのベクターは、市販のpMALc2発現ベクターおよび発現系（New England Biolabs）を使用して作製された。プラスミドp GR N103は、TPC3タンパク質のアミノ末端部分とMBPとを含む融合タンパク質をコードし、そしてプラスミドpMALc2のXmn1-PstI制限フラグメントを、プラスミドpGR N92のPvuII-PstI制限フラグメントに置換することによって調製された。プラスミドpGRN104は、TPC3タンパク質のカルボキシ末端部分とMBPとを含む融合タンパク質をコードし、そしてプラスミドpMALc2のEcl136II-BamHI制限フラグメントを、プラスミドpGRN92のBspEI（dCTPおよびdGTPの存在下でクレノウと処置したのみ）-BamHI制限フラグメントに置換することによって調製された。プラスミドpG RN106は、TPC2タンパク質のアミノ末端部分とMBPとを含む融合タンパク質をコードし、そしてプラスミドpMALc2のSalI-PstI制限フラグメントを、プラスミドpGR N109から単離され得るSalI-Sse8387I制限フラグメントと置換することによって調製された。プラスミドpGRN110は、TPC2タンパク質のカルボキシ末端とMBPとを含む融合タンパク質をコードし、そしてTPC2のオープンリーディングフレームのカルボキシ末端部分を含む制限フラグメントを、プラスミドpMALc2に挿入することによって調製され、その結果、融合タンパク質は、E．coli W3110細胞でのプラスミドの発現からの以下の結果（MBPの末端および結合領域でのTPC2タンパク質のみを示す）を示した：本発明のこれらおよび他の融合タンパク質は、標準的な方法に従って単離され得、次いで、以下の節で記載されるように、ポリクローナル抗血清およびモノクローナル抗体の産生のために、動物（すなわち、マウスおよびウサギ）を免疫化するために使用され得る。 TPC2またはTPC3のタンパク質、アナログ、ペプチド、およびポリペプチドはまた、周知の方法を用いて化学合成によって調製され得る。例えば、TPC2およびTP C3タンパク質の配列に対応するアミノ酸配列を有する種々のペプチドは、インビトロで化学合成され得、そしてTPC2および／またはTPC3タンパク質に特異的に結合する抗体を生成するために使用され得る。本発明の例示的なペプチドには、RG LKRQSDERKRDREおよびKVTSPLQSPTKAKPKが含まれ、これらはインビトロで化学合成され、そしてTPC3タンパク質に特異的な抗体を生成するために動物を免疫化するために使用される。このようなペプチドは、遺伝子またはタンパク質のヌクレオチドおよび／もしくはアミノ酸配列データと、公共のまたは他の配列のデータベースとの比較によって同定される構造的および機能的ドメインに対応し得る。コンピューター化された比較方法は、既知の構造的および／または機能的な他のタンパク質において生じる配列モチーフまたは推定タンパク質コンホメーションドメインを同定するために使用され得る。Proteins，Structures and Molecular P rinciples（1984），Creighton（編），W.H．Freeman and Company，New Yorkを参照のこと；これらは本明細書中に参考として援用される。既知の三次元構造に折り畳むタンパク質配列を同定するための方法は、公知である。Bowieら、1991 ，Science 253：164を参照のこと。認識された配列モチーフおよび構造的コンホメーションは、構造的および機能的ドメインを規定するために使用され得る。コンピュータープログラム、GAP、BESTFIT、FASTA、およびTFASTA（Wisconsin Gen etics Software Package（Genetics Computer Group，575 Science Dr.，Madiso n，WI））は、GenBank/EMBLのようなデーターベースにおける配列（相同領域を有する）を同定するために使用され得る。神経型ネットワーク方法は（ハードウェアまたはソフトウェアのいずれかで実行される場合も）以下のために使用され得る：（1）関連タンパク質配列およびヌクレオチド配列を同定するため、および（2）ポリペプチドにおける構造的ドメインまたは機能的ドメインを規定するため。Brunakら、1991，J．Mol．Biol．220：49を参照のこと、本明細書中に参考として援用される。従って、本発明の好ましいペプチドおよびタンパク質のクラスの１つは、機能的ドメインボーダーの付近のアミノ酸位置に対応するアミノ末端およびカルボキシ末端を有するTPC2またはTPC3タンパク質のフラグメントである。別のフラグメントもまた調製され得る。このようなフラグメントのアミノ末端およびカルボキシ末端の選択は、実践者の分別にかかっており、そして構築の容易さ、タンパク質分解に対する安定性、末端の安定性、免疫学的反応性、アミノ末端残基またはカルボキシ末端残基の修飾のような要因、または他の要因に基づく。本発明の免疫原性ペプチドおよびタンパク質は、治療的免疫化およびワクチン化の手順において使用され得る。それゆえ、本発明は、テロメアーゼを維持し、そしてテロメアーゼ活性を発現する細胞（例えば、癌細胞）に対して被検体を免疫化する方法、ならびにその方法（本発明のこのようなペプチドまたはタンパク質の免疫刺激量を投与する工程を含む）において有用なワクチンを提供する。本発明のペプチドおよびタンパク質は、少なくとも約50％（w/w）以上純粋であり、そして妨害タンパク質および夾雑物が実施的に存在しない場合、実質的に純粋な形態で適切に得られる。好ましくは、これらのポリペプチドは、少なくとも80％（w/w）、またはより好ましくは少なくとも約95％（w/w）の純度で単離または合成され、そして実質的に他のタンパク質または夾雑物が存在しない。本発明のペプチドおよびタンパク質の１つの重要な適用は、以下の節で議論されるように、TCP2またはTPC3タンパク質に特異的に結合する抗体の生成である。 VI．抗体本発明のタンパク質およびペプチドはまた、TPC2もしくはTPC3タンパク質、またはこれらのタンパク質上の特定のエピトープに特異的な抗体を生成するために使用され得る。TPC2またはTPC3タンパク質、それらのフラグメント、またはそれらのアナログは、特異的な抗体の産生ために動物を免疫化するために使用され得る。例えば、TPC2またはTPC3タンパク質の組換え的に産生されたフラグメントまたは融合タンパク質は、当業者に公知の免疫化プロトコルの後、アジュバントとともにマウスに注射され、その結果、免疫応答を生成し得るが、これに限定されない。あるいは、または組換え的に産生されたポリペプチドとの組み合わせにおいて、TPC2またはTPC3タンパク質に対応するアミノ酸配列を有する化学合成されたペプチドは、TPC2もしくはTPC3タンパク質、または別のテロメアタンパク質もしくはテロメアーゼ関連タンパク質を結合する抗体を惹起するための免疫原として使用され得る。少なくとも約1×10⁶M^-1の結合親和性を有する標的タンパク質に特異的に結合する免疫グロブリンは、抗血清として、免疫化された動物から採取され得、そしてイムノアフィニティークロマトグラフィーまたは他の手段によってさらに生成され得る。さらに、脾臓細胞は、免疫化された動物（代表的には、ラットまたはマウス）から採取され得、そして骨髄腫細胞に融合されて、モノクローナル抗体分泌ハイブリドーマ細胞のバンクを生成し得る。ハイブリドーマのバンクは、目的のタンパク質に結合する（すなわち、少なくとも1×10⁷M^-1の親和性で）免疫グロブリンを分泌するクローンについてスクリーニングされ得る。マウスおよびラット以外の動物は、抗体を惹起するために使用され得る。すなわち、例えば、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、およびニワトリもまた、TPC2またはTPC3タンパク質と反応性である抗体を惹起するために使用され得る。ヒト抗体を実質的に産生する能力を有するトランスジェニックマウスもまた免疫化され、そして抗血清の供給源のために、および/またはモノクローナル抗体分泌ハイブリドーマの作製のために使用され得る。従って、本発明は、TPC2またはTPC3タンパク質に特異的に結合するポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を提供する。バクテリオファージ抗体ディスプレーライブラリーもまた、本発明のペプチドおよびタンパク質に特異的に結合し得るファージについてスクリーニングされ得る。抗体のコンビナトリアルライブラリーは、バクテリオファージラムダ発現系において生成されており、そしてバクテリオファージプラークとして、または溶原菌のコロニーとしてスクリーニングされ得る。抗体を調製するための一般的な方法については、本明細書中で参考として援用されるAntibodies:A Laboratory Manual(1988)，E．HarlowおよびD .Lane，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NYを参照のこと。これらの抗体は、次いで、TPC2またはTPC3タンパク質を正常な細胞または組換え細胞から単離するために使用され、そうしてこれらのタンパク質およびこれらと関連する他のタンパク質を精製するために使用され得る。このような抗体は、サンプル中のTPC2またはTPC3タンパク質の検出、および細胞の複雑な混合物中の TPC2またはTPC3タンパク質を含む細胞の検出において有用である。このような検出方法は、疾患および他の状態（例えば、癌、妊娠、または授精能）のスクリーニング、診断、およびモニタリングにおける適用を有する。なぜなら、TPC2およびTPC3タンパク質は、テロメアDNAを延伸し得、そしてテロメラーゼ活性を発現し得るほとんどの細胞に存在し、そしてテロメラーゼネガティブ細胞において観察されるレベルよりも有意に高いレベルでこれらの細胞中に存在するからである。本発明の抗体のいくつかの適用（例えば、免疫交差反応性タンパク質の同定）のために、所望の抗血清またはモノクローナル抗体は、単一特異性ではない。これらまたは他の場合には、全タンパク質よりも、TPC2またはTPC3タンパク質の合成または組換えフラグメントを、抗原として使用することが好ましい。より詳細には、特定の構造部分（例えば、DNA結合ドメイン）を含む免疫交差反応性のポリペプチドを同定することが目的である場合、TPC2またはTPC3タンパク質中の相応の構造ドメインの一部または全部に対応するフラグメントを抗原として使用することが好ましい。 TPC2またはTPC3と反応性であるカチオン化または脂質化抗体は、これらのタンパク質およびこれらにより調節されるプロセスの過剰または不適切な発現（例えば、新生物形成）の疾患を処置または予防するために治療的に使用され得る。本発明の他の方法が以下の節において議論される。 VII．方法上記の本発明の種々の試薬は、広範な種々の適用を有する。TPC2またはTPC3 c DNAにハイブリダイズし得るポリヌクレオチドおよびTPC2またはTPC3タンパク質に特異的に結合する抗体を提供することにより、細胞中のTPC2およびTPC3の発現を検出することが可能になる。癌性であると予想される細胞内でのTPC2またはTP C3遺伝子発現の検出は、癌の診断において有用である。従って、本発明は、ハイブリダイゼーション法またはイムノアッセイ法によって、TPC2またはTPC3mRNAまたはタンパク質を細胞において検出する方法を提供する。ハイブリダイゼーション法は、ノーザンブロッティング；サザンハイブリダイゼーションを含む任意の日常的な方法を包含し得る；PCR、b-DNA、酵素で標識された抗体、LCR、Q-βレプリカーゼ、または3SRによる標的またはプローブ核酸の増幅などもまた使用し得る。本発明のポリヌクレオチド配列は、個々のヒトの法医学的同定（例えば、故人の同定、父性の決定、犯罪の同定など）のために使用され得る。本発明また、TP C2もしくはTPC3 mRNAの検出、または患者から外移植された細胞におけるTPC2もしくはTPC3遺伝子の転位もしくは増幅、または疾病特徴的なTPC2もしくはTPC3対立遺伝子の検出による、疾患状態（例えば、新生物形成または前新生物形成）の診断のためのTPC2もしくはTPC3ポリヌクレオチドプローブを提供する。同じ細胞型の非新生物形成性細胞または非疾患細胞に比較して変化した量のTPC2またはTP C3 mRNAを含有する細胞は、本発明の方法に従う候補疾患細胞として同定され得る。同様に、細胞サンプル中のTPC2もしくはTPC3遺伝子座または密接に連結した遺伝子座の疾病特徴的な転位または増幅の検出により、病理学的状態または病理学的状態（例えば、癌、遺伝的疾患）を発症する素因の存在が同定される。３つのテロメラーゼ関連、およびテロメア長制御成分であるTPC2、TPC3、およびhTRの単離により、１つ以上のこれらの成分を含む組換えテロメアの産生が可能になる。１つの方法において、組換えテロメラーゼは、TPC2もしくはTPC3タンパク質または活性TPC2もしくはTPC3アナログおよび/または組換えhTRを、細胞中で発現することによって産生される。別の方法において、テロメラーゼは、インビトロで再構築される。テロメラーゼの組換えRNA成分は、例えば、pGRN33（ATC C 75926）の約2.5kb HindIII SacIインサートによってコードされる配列に由来するRNA分子であり得る。組換えテロメラーゼは、例えば、ある化合物がテロメラーゼ活性を調節するか否かを決定するためのスクリーニングアッセイに有用である。テロメアDNA損傷を修復する細胞の能力を（例えば、内因性の天然に生じるテロメラーゼを阻害することによって）低減するテロメラーゼ調節およびテロメア長調節薬剤は、候補新生物形成性薬剤である。次いで、候補新生物形成性薬剤は、ヒト新生物形成性薬物としての使用のための適合性を予想するために日常的に使用されるアッセイにおいて、さらに抗新生物形成活性について試験される。これらのアッセイの例には、候補薬剤の（１）軟寒天中でのアンカー非依存性形質転換細胞の増殖を阻害する能力、（２）nu/nuマウスに移植された形質転換細胞の腫瘍形成能を低減する能力、（３）形質転換細胞の形態学的形質転換を逆行させる能力、（４）nu/nuマウスに移植された腫瘍の増殖を低減する能力、（５）自発的または化学的に誘導された発癌の動物モデルにおける肺瘍または前新生物形成性細胞の形成を阻害する能力、および（６）形質転換細胞において、より分化した表現型を誘導する能力を測定するアッセイが含まれるが、これらに限定されない。テロメア維持またはテロメラーゼ活性を特異的に阻害し得る薬剤の効果的な用量の、患者への投与は、病理学的状態（例えば、癌、炎症、リンパ球増殖性疾患、自己免疫疾患、神経変性性疾患など）を処置するための治療的または予防的方法として使用され得る。これらの状態は、テロメラーゼ活性およびテロメア長を調節することによって効果的に処置され得る。新生物形成または細胞死の調節に関するさらなる実施態様には、特定の阻害性核酸（例えば、TPC2、TPC3、または同族の哺乳動物TPC2またはTPC3タンパク質をコードするヌクレオチド配列に対応するセンスまたはアンチセンスポリヌクレオチド）を利用する方法が含まれる。本発明の好ましい実施態様の上記の記載は、例示および説明の目的のために提示されており、そして本発明を網羅することも、開示されたそのままの形態に本発明を限定することも意図されないが、そのかわり多くの改変および変化が本発明および説明に照らして可能であることを明らかにし、そして本発明およびそれに対する請求の範囲の範囲内の本説明に照らして当業者に明らかであり得るような改変および変化を含む。本願に引用された全ての刊行物および特許文献は、全ての目的のために、各個々の刊行物または特許文献がそのように個々に示されているのと同等な程度に、その全体が本明細書中で参考として援用される。 VIII．実施例以下の実施例は、本発明を例示するために与えられるが、限定するためではない。一般に、本明細書中で使用される命名法、および細胞培養、分子遺伝学、および核酸化学、ならびに以下に記載されるハイブリダイゼーションにおける研究室的手順の多くは、当該分野で周知であり、そして一般に利用されるものである。本明細書および実施例を通じて与えられる全ての百分率は、他に示されない限り、重量に基づく。全てのタンパク質分子量は、他に示されない限り、平均平均分子量に基づく。Ａ．分子遺伝学における方法標準的な技術を、組換え核酸法、ポリヌクレオチド合成、インビトロポリペプチド合成、微生物培養、および形質転換（例えば、エレクトロポレーション）などのために使用する。一般に、市販の開始材料を使用する酵素反応および精製工程は、製造業者の説明書に従って実施される。技術および手順は、一般に、当該分野で従来的な方法および本明細書中で引用される種々の一般的な参考文献（一般には、Sambrookら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、第２版(1989) ；Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）に従って実施される。オリゴヌクレオチドは、製造業者によって提供される説明書に従って、Applie d Bio Systemsまたは他の市販のオリゴヌクレオチド合成機で合成され得る。ポリヌクレオチドプライマーは、任意の適切な方法（例えば、ホスホトリエステル法およびホスホジエステル法、またはその自動化された実施態様）を使用して、調製され得る。１つのこのような自動化された実施態様では、ジエステルホスホルアミダイトを開始材料として使用して、そしてBeaucageら、1981，Tetrahedro n Letters 22:1859および米国特許第4,458,066号によって記載されるように合成される。 PCR増幅のための方法は、当該分野で公知である（PCR Technology:Principles and Applications for DNA Amplification、Erlich，Stockton編Press，New Yo rk，NY(1989);PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications，Innis，G elfland，Sninsky，およびWhite編、Academic Press，San Diego，CA(1990);Mat tilaら、1991，Nucleic Acids Res．19:4967;EckertおよびKunkel，1991，PCR M ethods and Applications 1:17;および上記の米国特許）。最適なPCRおよびハイブリダイゼーション条件は、使用される標的ポリヌクレオチドプライマーおよび標的の配列組成および長さ、ならびに当業者によって選択される実験方法に依存して変化する。種々のガイドラインが、適切なプライマー配列およびハイブリダイゼーション条件を選択するために使用され得る（例えば、Sambrook ら、前出を参照のこと）。一般に、PCRは、緩衝化水溶液中で、好ましくは７〜９のpHで、最も好ましくは約８のpHで行われる。デオキシヌクレオシド三リン酸であるdATP、dCTP、dGTP、およびTTPもまた、適切な量で合成混合物中に添加され、そして得られる溶液は、約85〜100℃に約１〜10分間、好ましくは１〜４分間加熱される。この加熱時間の後に、溶液をプライマーハイブリダイゼーションのために、約20〜40℃に冷却させる。冷却した混合物に、ポリマー化のための薬剤を添加し、この反応を当該分野で公知の条件下で生じさせる。この合成反応は、室温から、ポリマー化のための薬剤が効率よく機能しない温度をちょうど超える温度までで起こり得る。従って、例えば、熱不安定なDNAポリメラーゼをポリマー化のための薬剤として使用する場合、合成温度は、一般に、約45℃を超えない。ポリマー化のための薬剤は、酵素を含む、プライマー伸長産物の合成を達成するように機能する任意の化合物または系であり得る。本発明の目的のための適切な酵素には、例えば、E.coli DNAポリメラーゼＩまたはそのクレノウフラグメント、Taq DNAポリメラーゼ、および他の利用可能なDNAポリメラーゼが含まれる。新たに合成された鎖およびその相補核酸鎖は、このプロセスの引き続く工程で使用される二本鎖分子を形成する。次の工程において、二本鎖分子の鎖は、上記の任意の手順を使用して分離され、一本鎖分子を提供する。鎖分離および伸長産物合成の工程は、所望の量の特定の核酸配列を産生するのに必要な頻度だけ繰り返され得る。産生される特異的な核酸配列の量は、指数関数的に蓄積する。Ｂ．サブトラクティブハイブリダイゼーションディファレンシャルディスプレイサブトラクティブハイブリダイゼーション法およびディファレンシャルディスプレイ法の両方は、示差的に発現される希少なmRNAを単離することについて不利点を有する。サブトラクティブハイブリダイゼーションは、豊富でないcDNA種のプールを富化するために有用であり得るが、得られるライブラリーの従来的なスクリーニングは、PCR増幅されたとしても、選択された豊富でないcDNAプール内でなお豊富な種を同定する方に有利に偏り、従来のサブトラクティブハイブリダイゼーション富化プロトコルを用いる非常に希少なcDNA種の単離を困難にする。 PCRによって増幅されたmRNAのディファレンシャルディスプレイは、種々のmRNA 種の最初の豊富さによって偏り、そしてしばしばより豊富で実質的に示差的に発現されない多くのmRNA種の中で希少なmRNA種を過少に示すかまたは検出し損ねる。本発明は、希少なmRNA（例えば、TPC2およびTPC3遺伝子によって発現されるもの）を単離するために特に好ましいサブトラクティブハイブリダイゼーションディファレンシャルディスプレイ法を提供する。簡単には、この方法は、以下の工程を包含する：（１）２つのcDNA集団の１つにおいてより高いレベルで存在する豊富でないmRNAのcDNA種について選択的に富化されたサブトラクトされたcDNAの集団を生成するための、２つのcDNA集団のサブトラクティブハイブリダイゼーションの１以上のサイクル、および（２）電気泳動ゲル上でのcDNAのディファレンシャルディスプレイおよびゲルからの回収による個々の示差的に発現されたcDNA の回収。任意のヌクレオチド配列の5'プライマーを用いる、および必要に応じてポリ(dT)および/またはポリ(dT)PCR産物を生成するための、適切なPCR条件下での、サブトラクトされた上記cDNA集団のならびに3'末端に２つ以上の任意のヌクレオチドを含む3'プライマーを用いるPCR増幅を、代表的には、サブトラクトされたライブラリーを複製または増幅するために使用する。サブトラクティブハイブリダイゼーションの最初の工程を達成するために、従来の方法で第一の細胞集団から調製されたRNA、および第二の細胞集団からのRNA は、別々に逆転写され、そして第二の鎖が合成されて、二本鎖cDNAの２つのプール（富化が所望されるmRNA種の配列を含むテスタープール、およびテスタープールからサブトラクトされる配列を含むドライバープール）を形成する。２つのプールは、タンデム反復配列からなるcDNAを分解すること、およびハイブリダイゼーション効率を増強することを望む場合には、エンドヌクレアーゼ消化（制限エンドヌクレアーゼまたは非特異的エンドヌクレアーゼ）によってフラグメント化され得る。ドライバープールは、例えば、光ビオチン化または別の適切な回収可能な標識の付加によって標識される。ドライバープールおよびテスタープールは、変性され、そしてハイブリダイゼーション条件下で反応混合物中に一緒に混合され、そして適切なハイブリダイゼーション時間インキュベートされる。反応混合物は、ドライバーcDNA上の回収可能な標識に結合し、そして反応混合物から容易に回収可能（例えば、磁気ビーズに結合したアビジンを使用して）であるリガンドと接触され、その結果、ドライバーcDNAの実質的な画分およびそれにハイブリダイズする任意のテスターcDNAが、反応混合物から選択的に除去される。残りの反応混合物が、第二の細胞集団に比較して第一の細胞集団において優先的に発現されるテスターcDNA種について富化される。富化（サブトラクトされた）テスターcDNAプールは、標識されたドライバーcDNAのプール（これは、ドライバーcDNAの最初のプールと実質的に同一であり得るか、またはサブトラクトされたテスターcDNAプールからサブトラクトされることが望まれるmRNA種を有する異なる細胞集団を表し得る）を使用する１以上のさらなる回のサブトラクティブハイブリダイゼーションに供され得る。サブトラクティブハイブリダイゼーションを達成するための種々の手段および適切な方法論的指針は、当業者に利用可能である。Leeら、1991，Proc．Natl．Acad．Sci．（USA）88:2825;Milnerら、1995 ，Nucleic Acids Res．23:176;Luqmaniら、1994，Anal．Biochem．222:102;Zebr owskiら、1994，Anal．Biochem．222:285;Robertsonら、1994，Genomics 23:42; Rosenbergら、1994，Proc．Natl．Acad．Sci．（USA）91:6113;Liら、1994，Bio techniques 16:722;Harkvoortら、1994，Nucleic Acids Res．22:878;Satohら、 1994，Mutat．Res．316:25;Marechalら、1993，Anal．Biochem．208:330;El-Dei ryら、1993，Cell 75:817;Haraら、1991，Nucleic AcidsRes．19:7097;ならびに HerfortおよびGarber，1991，Biotechniques 11:598（これらの各々が本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。サブトラクティブハイブリダイゼーションが完了した後、サブトラクトしたテスターcDNAを、ディファレンシャルディスプレーに供する。一般的なストラテジーは、１つまたは１セットの任意の配列プライマーを用いるPCRによるサブトラクトしたテスターcDNAプールからのcDNAの増幅を含む。任意のプライマーを、増幅産物が、ポリアクリルアミドゲルのような分離システムで分離され、そして個々に回収され得るように、各々が、サブトラクトしたcDNAプールのDNAの画分のみを増幅するように、当業者の裁量で種々の基準に従って選択する。部分的には、任意の特定のサブトラクトしたテスタープールにおいて示されるcDNA種の数および複雑さが、ドライバープールおよびテスタープールの性質および複雑さに依存してかなり変動し得るので、任意のプライマーおよびそれらの配列の選択は、文献を参考にして当業者により決定される。Linskensら，1995，Nucleic Acid s Res．23(16):3244-3251;Liangら，1993，Nucleic Acids Res．21:3269;Utans ら，1994，Proc．Natl．Acad．Sci．(U.S.A.)91:6463;Zimmermannら，1994，Pro c．Natl．Acad．Sci．(U.S.A.)91:5456;Fischerら，1995，Proc．Natl．Acad．S ci．(U.S.A.)92:5331;Lohmannら，1995，Biotechniques 18:200;Reevesら，1995 ，Biotechniques 18:18;およびMaserら，1995，Semin．Nephrol．15:29（これらのそれぞれは、本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。サブトラクトされたテスターcDNAプール、および稀なタンパク質を発現しない（またはより低いレベルで発現する）細胞株または組織から同様の方法で調製された別のcDNAプールを、経験的に決定され得るように、適切な任意のプライマー（すなわち、所望の差別的に発現するmRNAの配列を参照することなく選択された所定の配列を有するプライマー）を用いて、所望の種のディスプレーおよび回収するための十分な増幅産物を生成するに適切な増幅サイクル数で増幅する。プライマーは、他のPCRプライマー（遠位プライマー）を係留するように作用するか、および／あるいは制限部位または半部位もしくは他の連結可能な末端を含む5' 末端配列を含み得る。増幅された産物を、通常、標識し、そして代表的にはポリアクリルアミドゲルでの電気泳動により分離する；サブトラクトしたテスターcD NAにおいて標識が存在するが、コントロールcDNAにおいては存在しない（かまたはずっと低いレベルで存在する）位置を切り出し、標識された産物をゲル部分から、代表的には溶出により回収する。得られた回収された産物種（代表的には、発現配列タグ、すなわちEST cDNA）を、複製可能なベクター中に、リンカーの結合を伴ってまたは伴わずにサブクローニングし、さらに増幅し、そして／または直接配列決定し得る。一旦ESTが回収されると、これを用いて実質的に全長のcDNAを、cDNAライブラリーから入手し得る。ESTを、配列決定し得、そして配列情報をプライマー伸長（5'-RACE）のためのプライマーを生成するために用い得るか、またはESTを、標識しそしてハイブリダイゼーションプローブとして用いて、より長いcDNAクローンをcDNAライブラリーから同定し得る。ESTに対応するゲノムDNAクローンまたは全長cDNAクローンを、クローンライブラリー（例えば、Clontech，Palo Alto，CAから入手可能）から、（例えば、ニック翻訳または末端標識により）標識されたESTまたは従来のハイブリダイゼーションスクリーニング方法においてESTで同定された配列に対応するヌクレオチド配列を有する他のハイブリダイゼーションプローブを用いて単離し得る。従って、二本鎖cDNAを、CsCl勾配遠心分離により精製された総RNAから作製する。一般に、５μｇの総RNA、0.5μｇオリゴdT（12〜18塩基）、および水（脱イオン水が日常的に用いられる）を計７μｌで混合し、RNAを95℃で５〜10分間変性し、そして氷上に置く。次いで、変性したRNAおよびオリゴdTを、４μｌの５ ×第１鎖合成緩衝液（BRL）、２μｌの0.1M DTT（BRL）、１μｌのdNTP（各々10 mM）、および１μｌのRNAsin（Pharmacia）を含有するチューブに添加し、そして42℃にて２分間温める。約５μｌのSuperscript II^TM逆転写酵素（BRL）を、反応混合物に添加し、そして第１鎖cDNA合成を、42℃にて60分間行う。次いで、反応混合物を氷上に置き、そして第２鎖の合成のために用意する。第１鎖cDNAを、111.1μｌの水、16μｌの10×E.coliDNAリガーゼ緩衝液、３μｌのdNTP（各々 10mM）、1.5μｌのE.coli DNAリガーゼ（15単位、BRL）、7.7μｌ E.coli DNAポリメラーゼ（40単位、Pharmacia）、および0.7μｌのE.coli RNAse H（BRL）を含有するチューブに添加する。反応混合物を、16℃にて２時間インキュベートし、次いで１μｌのT4 DNAポリメラーゼ（10単位、Pharmacia）を添加する。インキュベーションを、同じ温度でさらに５分間続け、そして反応を、２μｌの0.5 Ｍ EDTAの添加、およびフエノール／クロロホルム抽出（通常、２回行われる）により停止する。二本鎖cDNAを、エタノール沈澱し、そして12μｌのTE緩衝液に再懸濁させる。次いでcDNAを、リンカーの付加により改変する。上記の通りに調製される10μ ｌのcDNAを、RsaIのための10×緩衝液４μｌ、2μｌの水、および５μｌのRsaI （25〜50単位）と混合し、そして混合物を37℃にて２時間インキュベートする。４μｌを取り出し、そして未切断cDNAとともにアガロースゲル（１％）で消化の完了についてチェックする。次いで、制限酵素を、65℃にて10分間不活化させる。リンカーは、各々10μｇの以下： NotA（5'-pATAGCGGCCGCAAGAATTCA-NH₂-3'）；および NotB（5'-TGAATTCTTGCGGCCGCTAT-3'）；または Ancol（5'-pCAGAAGCTTGGTTGGATCCAGCAAG-NH₂-3'）；および PCR02（5'CTTGCTGGATCCAACCAAGCTTCTG-3'）を、5.6μｌの10×緩衝液（One for all^TM，Pharmacia）および56μｌの最終容量までの水と混合することにより二本鎖オリゴヌクレオチドとして調製する。混合物を68℃にて５分間、次いで55℃にて５分間、次いで45℃にて10分間加熱する。55μｌの二本鎖オリゴヌクレオチドNotABを、消化したテスターcDNA（HUVEC、 BJ、IMR90、IDH4、293、または精巣組織--テロメラーゼネガティブ細胞株がコントロールとして用いられる）を含有するチューブに添加する。55μｌの二本鎖オリゴヌクレオチドAncol-PCR02を、消化したドライバーcDNA（HUVEC）を含有するチューブに添加する。両方のチューブに、２μｌの100mM ATP、3.3μｌの10×リパーゼ緩衝液（Pharmacia）１μｌのT4 DNAリガーゼ（Pharmacla）、および100 μｌまでの水を添加する。反応混合物を、15℃にて一晩インキュベートする。次いで、反応混合物を15℃の水浴から室温に取り出し、そしてさらに２時間インキュベートする。連結したcDNAを、フェノール／クロロホルムで２回抽出し、そしてエタノール沈澱する。ペレットを、12μｌのTE緩衝液に再懸濁する。産物の半分を、1.4％の低融点アガロースゲルにロードし、そして100〜1600塩基対の範囲のサイズのDNAを切り出す。テスターおよびドライバーのcDNAライブラリーのPCR増幅を、上記の通りに単離された各々のゲルスライスの約１μｌ（使用前に65℃にて融解される）を取り、そして10μｌのNotB（テスターのため--このオリゴヌクレオチドは、5'および 3'のプライマーの両方として作用する）またはPCR02（ドライバーのため）、５ μｌの10×PCR緩衝液、６μｌのdNTP（各々2.5mM）、１単位のTaqポリメラーゼ（Boehringer MannheimまたはPerkin Elmer）、１単位のPfuポリメラーゼ（Stra tagene）、0.2μｇの遺伝子32タンパク質（Boehringer Mannheim）、および50μ ｌまでの水と混合することにより実施する。PCRを、94℃にて45秒間、60℃にて4 5秒間、および72℃にて２分間で20サイクル、最後のサイクルの完了後に72℃にて５分間の伸長で行う。ドライバーを、光ビオチン化するに十分なDNAを作製するために複数の反応においてPCR増幅する。ドライバーcDNAの光ビオチン化を、以下の通りに便利に達成する。1mM EDTA中の約100μgのドライバーcDNAを、100μｌの光ビオチン（Vector）と混合する。この混合物を、蓋を開けたまま氷上に置き、そしてチューブから約10cm離して位置した光源で15分間照射する。照射後、30μｌの１M Tris-Cl（pH9.1）をチューブに添加し、そしてビオチン化DNAを、水相から橙色が消えるまで水飽和ブタノールで数回（４×）抽出する。抽出プロセスを１回繰り返し、そしてビオチン化 DNAを、エタノール沈澱し、そして１μｇ/μｌの最終濃度までTE緩衝液中に再懸濁させる。サブトラクションハイブリダイゼーションを、以下の通りに便利に達成する。８μｇのビオチン化ドライバーDNAを、0.4μｇのテスターDNA（濃度はOD測定およびゲルの臭化エチジウム染色により見積もられる）と混合する。混合されたDN Aをエタノール沈澱し、そして10μｌのHE緩衝液（10mM HEPES、pH7.3、1mM EDTA ）中に再懸濁させる。このDNAを、100℃にて４分間変性させ、そして氷に移す。次いで、1.5M NaCl、50mM HEPES、pH7.3、10mM EDTA、および0.2％ SDSを含有する２×ハイブリダイゼーション溶液約10μｌを、チューブに添加する。２滴の鉱油を添加し、そしてDNAを、100℃にて４分間、再度変性させ、そして68℃の水浴中に移す。ハイブリダイゼーションを、この温度で22時間行う。ビオチン化DNA を、ストレプトアビジンMagneSphere^TM Paramagnetic Particles（Promega）で除去し、そして残存するテスターDNAを回収する。第２のサブトラクションは、回収されたテスターDNA（約80μｌ）を８μｌ（８μｇ）のビオチン化ドライバーDNAと混合し、次いでエタノール沈澱することにより行う。沈澱されるDNAペレットを、10μｌのHE緩衝液中に再懸濁させる。変性、ハイブリダイゼーション、および回収を、上記の通りに行う；しかし、第２のハイブリダイゼーションは、68℃にて２時間のみ行う。PCRは、２μｌの10 ×Pfuポリメラーゼ緩衝液、2.5μｌの2.5mM dNTP、0.2μｌのTaqポリメラーゼ（１単位）、0.4μｌのPfuポリメラーゼ（１単位）、0.04μｌのT4遺伝子32タンパク質、および20μｌまでの水を含有する反応混合物中で回収されるDNA（0.3μｌ）を18サイクル増幅する。産物を、１％アガロースゲルでチェックして、相対濃度を確認する。サブトラクションハイブリダイゼーションを、これらのサンプルで繰り返し得る。最終サブトラクトしたサンプルを、PCR増幅（18サイクル）し、そして希釈（１対10または１対15）し、そして増強されたディファレンシャルディスプレーのために用いる。サブトラクトされたcDNAの増強されたディファレンシャルディスプレーは、5' 任意プライマーおよび２つのランダム化した塩基を3'末端に有する3'オリゴdTプライマーを用いるPCR増幅、差別的に発現されたmRNAに対応するcDNAを含有すると同定されたバンドの回収、およびPCR増幅、配列決定、および／または同定されたバンドのクローニングを含む。１μｌの１つの5'プライマー（20μＭストック）または２つの5'プライマー（各々半分）または1.2μｌの１つの5'プライマー（１μｌ）および１つの3'プライマー（0.2μｌ）をチューブに添加する。１ μｌのサブトラクトされたDNAを同じチューブに添加する。この混合物に、Pfuポリメラーゼのための10×PCR緩衝液１μｌ（市販）、１μｌのdNTP（各々2.5mM）、0.3mMα-³²Ｐ-dATP、0.1μｌのTaqポリメラーゼ、0.2μｌのPfuポリメラーゼ（Stratagene）、0.02μｌのT4遺伝子32タンパク質（Boehringer Mannheim）、および5.38μｌの水を含有するカクテル混合物８μｌを添加する。１滴の鉱油を重層し、94℃にて45秒間、39℃にて１分間、および72℃にて１分間を４サイクル、次いで94℃にて45秒間、60℃にて１分間、および72℃にて１分間を22サイクル、72℃にて５分間の最終伸長でPCR増幅する。約５μｌのホルムアミド／色素を、PCR産物に添加し、そして産物を、95℃にて２〜３分間変性させ、そして予め温めた６％ポリアクリルアミド配列決定ゲルにロードし、これを1900〜2000の定常電圧（電流は50mAに達しないようにする）でキシレンシアノール色素がゲルの底から１インチに達するまで泳動する。ゲルを、減圧下で80℃にて45分間乾燥し、そしてPhosphorImager^TMスクリーンに曝露し（ノートへの記録のため）、そして／または次いでＸ線フィルムに室温にて１または２日間曝露する（ゲルをフィルムにテープでとめ、そしてバンドの容易な同定のためにゲルおよびフィルムの３つの隅に３つの穴をパンチする）。差別的に発現された遺伝子フラグメントは、テスター細胞のcDNAに対応するゲル上のレーンに存在するが、コントロールレーンのcDNAに対応するレーンにはより低いレベルでしか存在しないか、もしくは存在しない、スクリーンまたはフィルム上のバンドとして現れる。バンドは、最初にゲルを（３つの穴およびマークに基づいて）フィルムまたはスクリーンと並べ、次いで目的のバンドを剃刀の刃で切り出し、そしてゲルスライスをEppendorf^TMチューブに移すことによりゲルから回収し得る。剃刀の刃を、各々の切断操作の間にリンスして、相互汚染を避ける。所望のDNAの実質的な喪失を伴わずに、配列決定ゲルとともに用いた尿素および紙の裏打ちを除去するために、約900μｌのTE緩衝液を、ゲルスライスを含有するチューブに添加し、チューブを室温にて10分間インキュベートし、次いで紙およびTE緩衝液を除去および廃棄する。所望のDNAの溶液をゲルスライスから調製するために、ゲルスライスを、100mM NaClを含有するTE緩衝液40μｌに懸濁し、そして95〜98℃にて10分間加熱する。液体を収集（短い遠心分離は、チューブの底に液体を収集する）し、そして所望のDNAの供給源として供する。このDNAは、１〜３μｌの回収DNAを、６μｇの総プライマー、Pfuポリメラーゼのための10×PCR緩衝液５μｌ、６μｌのdNTP（各々2.5mM）、0.25μｌのTaq ポリメラーゼ、0.5μｌのPfuポリメラーゼ、0.05μｌのT4遺伝子32タンパク質、および水を含有する、50μｌの総反応容量の反応混合物中に入れることによりPC R増幅し得る。PCRを、94℃にて45秒間、60℃にて１分間、および72℃にて１分間の25サイクルで、最終サイクルの終わりに72℃にて５分間の伸長を伴って行う。 PCR産物を、保存およびさらに処理（すなわち、サブクローニングおよび配列決定）し得る。 TPC2およびTPC3遺伝子のオープンリーディングフレームに対応する制限フラグメントを含むプラスミドの入手可能性は、他の啼乳動物細胞からのこれらの遺伝子および遺伝子産物の効率的な単離、ならびにこれらの遺伝子および遺伝子産物ならびに関連試薬（すなわち、ペプチド、オリゴヌクレオチド、抗体、および抗体フラグメント）のインビトロでの化学合成を可能にする。Ｃ．TPC3 についてのRT-PCRプロトコル細胞抽出物を、TRAPアッセイ（TRAP-eze^TMキット、Oncor）について記載される通りにCHAPSを用いて調製する。１アッセイあたり約２μｌの細胞抽出物を用いる；代表的には、30〜35サイクルのPCRを行う。総RNAは、TRIzol^TM RNA抽出方法（Life Technologies）を細胞ペレットまたはCHAPS抽出物に用いて調製する。各 PCRチューブは、以下を含む：約25μｌの総容量中、15μｌの水；2.5μｌの25μ ＭMn(OAc)₂;5.5μｌの５×EZ緩衝液（Perkin Elmer）;0.3μｌの25μＭ dNTP;１ μｌのrTth DNAポリメラーゼ緩衝液（Perkin Elmer）；0.1μｌ（300μＭ）のプライマーTF2（5'-CTCACTGTAGACACTGCCTCAGTTTC-3'）；および0.1μｌ（300μ Ｍ）のプライマーTR2（5'-CAGAGGCTGGCACTGGAACTCAAGATC-3'）。RT-PCR条件は、タンパク質-RNA複合体を変性するための94℃で６分間の処置；逆転写反応のための65℃にて30分間の処理；DNA-RNA複合体を変性するための94℃にて1.5分間の処理；94℃にて30秒間の処理および65℃にて30秒間の処理を含む各サイクルでの30 サイクルのPCR増幅；ならびに60℃にて７分間の処理による最終伸長反応を含む。PCR後、サンプルを、１×TBEポリアクリルアミドゲルを用い、そしてSYBR-Gre en Iで染色されるゲル電気泳動により分析し得る。試験は、このプライマーセットが、死すべき細胞株および不死の細胞株の両方で適切なサイズのバンドを増幅することを示した。そして試験は、TPC3 mRNAが不死の細胞株においてさらに豊富に発現されることを実証する。Ｄ．hTR についてのRT-PCRプロトコル第１鎖cDNA合成は、総RNA（１μｇ）を、11μｌ中40〜80ngのランダムヘキサマーと混合し、95℃にて５分間加熱して核酸を変性させ（サーマルサイクラーがこの工程に用いられ得る）、次いで氷上で冷却することにより行う。４μｌの５ ×緩衝液（BRL、RTaseとともに提供される）、２μｌの0.1M DTT、１μｌの10mM dNTP（各々）、および１μｌのRNAseインヒビター（Pharmacia）を含有する反応混合物（８μｌ）を、変性されたRNAおよびヘキサマーの混合物に添加し、そして42℃の水浴中に置く。１〜２分間のインキュベーション後、１μｌのSupers cript II^TMRTase（BRL）を混合物に添加し、そしてインキュベーションを42℃にて60分間続ける。反応混合物を含有するチューブを、95℃にて10分間加熱することにより反応を停止させる。第１鎖cDNAを、沈澱および短時間の遠心分離により収集し、そして新たなチューブにアリコートに分ける。必要な場合、後の使用のために、チューブの中で第１鎖cDNAを、ドライアイス上で迅速に凍結させ、そして−80℃ にて保存し得る。特異的プライマーセッhTR cDNAのPCR増幅を、一般に以下の通りに達成し得る。約１μｌのcDNAを、各プライマーセットに用いる。³²Ｐ-dATPヌクレオチドでの10μｌ PCRには、１μｌのcDNAを、１μｌの10×Taq緩衝液、20pmolの各プライマー、１μｌの2.5mM dNTP、５μCi α-³²P-dATP、１単位のTaqポリメラーゼ（Boehringer Mannheim）、１単位のTaq抗体（Clontech）、0.2μｇのT4遺伝子3 2タンパク質（Boehringer Mannheim）、および10μｌまでの水と混合する。次いで、１滴の鉱油をチューブに添加する。hTRについてのPCR増幅の条件は、約20サイクルの増幅であり、各サイクルは、94℃にて45秒間、60℃にて45秒間、および 72℃にて1.5分間の処理を含む。hTRのRT-PCRに用いられるプライマーを以下に示す。上流プライマー：F3b、5'-TCTAACCCTAACTGAGAAGGGCGTAG-3'；下流プライマー：R3c、5'-GTTTGCTCTAGAATGAACGGTGGAAG-3'。 F3bおよびR3cプライマー対でのhTRの増幅は、126bp産物を生じる。³²Ｐで標識されるPCR産物を、５μｌのホルムアミド／色素混合物を産物に添加し、産物を加熱して核酸を変性させ、６％尿素ポリアクリルアミドゲル電気泳動により産物を分離し、次いでPhosphorImager^TMカセットまたはＸ線フィルムをゲルに曝露することにより便利に検出し得る。本発明は、好ましい実施態様に関して記載し、そして実施例により例示され、そして以下に請求される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/68 ＡＣ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (72)発明者アンドリュース，ウィリアムエイチ. アメリカ合衆国カリフォルニア 94805, リッチモンド，パークアベニュー 6102 (72)発明者アダムス，ロバートアール. アメリカ合衆国カリフォルニア 94062, レッドウッドシティー，ヒルウェイドライブ 419

Claims

【特許請求の範囲】１．組換え哺乳動物宿主細胞であって、以下：（ｉ）プラスミドpGRN109の約3.5kbのNotI-BstEII制限フラグメントのヒトDNA 挿入物に含まれるヒト遺伝子TPC2のオープンリーディングフレーム配列に対応する少なくとも15の連続したヌクレオチドを含む組換え核酸または合成核酸；または該オープンリーディングフレーム配列によってコードされるアミノ酸配列に対応する少なくとも10の連続したアミノ酸を含む合成ペプチドもしくは組換えペプチドまたは合成タンパク質もしくは組換えタンパク質；および（ii）プラスミドpGRN92の約1.4kbのEcoRI-BamHI制限フラグメントのヒトDNA 挿入物に含まれるヒト遺伝子TPC3のオープンリーディングフレーム配列に対応する少なくとも15の連続したヌクレオチドを含む組換え核酸または合成核酸；または遺伝子TPC3の該オープンリーディングフレーム配列によってコードされるアミノ酸配列に対応する少なくとも10の連続したアミノ酸を含む合成ペプチドもしくは組換えペプチドまたは合成タンパク質もしくは組換えタンパク質；該TPC2遺伝子および該TPC3遺伝子は、テロメア長を調節するか、またはテロメラーゼ活性を調節し、そしてテロメラーゼ活性を表すヒト細胞または他の哺乳動物細胞に存在するタンパク質をコードすることに特徴づけられる、を含む、組換え哺乳動物宿主細胞。２．pGRN33の約2.5kbのHindIII-SacI制限フラグメントに位置するヒトhTRの連続したヌクレオチド配列に対応する少なくとも約15の連続したヌクレオチドを含む合成核酸または組換え核酸をさらに含む、請求項１に記載の哺乳動物宿主細胞。３．以下のいずれか：（ｉ）プラスミドpGRN109の約3.5kbのNotI-BstEII制限フラグメントのヒトDNA 挿入物に含まれるヒト遺伝子TPC2のオープンリーディングフレーム配列；または（ii）プラスミドpGRN92の約1.4kbのEcoRI-BamHI制限フラグメントのヒトDNA 挿入物に含まれるヒト遺伝子TPC3のオープンリーディングフレーム配列；該TPC2遺伝子および該TPC3遺伝子は、テロメア長を調節するか、またはテロメラーゼ活性を調節し、そしてテロメラーゼ活性を表すヒト細胞または他の哺乳動物細胞に存在するするタンパク質をコードすることに特徴づけられる、に位置する連続したヌクレオチド配列に対応する少なくとも約15の連続したヌクレオチドを含む、組換え核酸または合成核酸。４．プラスミドpGRN109の約3.5kbのNotI-BstEII制限フラグメントに位置するヒトDNAの連続したヌクレオチド配列に対応する少なくとも15の連続したヌクレオチドを含む、請求項３に記載の核酸。５．プラスミドpGRN92の約1.4kbのEcoRI-BamHI制限フラグメントに位置するヒト DNAの連続したヌクレオチド配列に対応する少なくとも15の連続したヌクレオチドを含む、請求項３に記載の核酸。６．長さが50ヌクレオチド未満のオリゴヌクレオチドプローブである、請求項４に記載の核酸。７．長さが50ヌクレオチド未満のオリゴヌクレオチドプローブである、請求項５に記載の核酸。８．組換え発現ベクターである、請求項４に記載の核酸。９．組換え発現ベクターである、請求項５に記載の核酸。１０．pGRN106およびpGRN109からなる群より選択される、請求項８に記載の組換え発現ベクター。１１．pGRN92、pGRN103、およびpGRN104からなる群より選択される、請求項９に記載の組換え発現ベクター。１２．請求項８に記載のベクターを含む組換え宿主細胞。１３．請求項９に記載のベクターを含む組換え宿主細胞。１４．E．coli/pGRN109である、請求項１２に記載の組換え宿主細胞。１５．E．coli/pGRN92である、請求項１３に記載の組換え宿主細胞。１６．以下のいずれか：（ｉ）プラスミドpGRN109の約3.5kbのNotI-BstEII制限フラグメント；または（ii）プラスミドpGRN92の約1.4kbのEcoRI-BamHI制限フラグメント、のヒトDNA挿入物に位置するヒト遺伝子のオープンリーディングフレーム配列によってコードされるアミノ酸配列に対応する少なくとも10の連続したアミノ酸を含む、精製ペプチドもしくは合成ペプチドもしくは組換えペプチドまたは精製タンパク質もしくは合成タンパク質もしくは組換えタンパク質。１７．精製TPC2タンパク質または組換えTPC2タンパク質である、請求項１６に記載のタンパク質。１８．精製TPC3タンパク質または組換えTPC3タンパク質である、請求項１６に記載のタンパク質。１９．融合タンパク質である、請求項１６に記載のペプチド。２０．請求項１６に記載のペプチドまたはタンパク質上のエピトープに特異的に結合する抗体。