JP2001321173A - サルｂウイルスの測定方法及びそれに用いられるプライマー - Google Patents
サルｂウイルスの測定方法及びそれに用いられるプライマーInfo
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 サルＢウイルス(BV)由来の核酸は増幅さ
れるがヒト単純ヘルペスウイルス由来の核酸は増幅され
ない、ＰＣＲにより検体中のＢＶを測定する方法及びそ
れに用いられるプライマーを提供すること。 【解決手段】 サルＢウイルス(BV)由来の核酸は増幅さ
れるがヒト単純ヘルペスウイルス由来の核酸は増幅され
ない、特定の塩基配列を有するＰＣＲプライマーのセッ
トを見出した。また、ベタイン存在下でＰＣＲを行うこ
とにより、このＰＣＲプライマーセットを用いてBVの増
幅が可能であった。
れるがヒト単純ヘルペスウイルス由来の核酸は増幅され
ない、ＰＣＲにより検体中のＢＶを測定する方法及びそ
れに用いられるプライマーを提供すること。 【解決手段】 サルＢウイルス(BV)由来の核酸は増幅さ
れるがヒト単純ヘルペスウイルス由来の核酸は増幅され
ない、特定の塩基配列を有するＰＣＲプライマーのセッ
トを見出した。また、ベタイン存在下でＰＣＲを行うこ
とにより、このＰＣＲプライマーセットを用いてBVの増
幅が可能であった。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、サルＢウイルス(H
erpesvirus simiae)（以下、「ＢＶ」と言うことがあ
る）の特異的な測定方法及びそれに用いられるプライマ
ーに関する。
erpesvirus simiae)（以下、「ＢＶ」と言うことがあ
る）の特異的な測定方法及びそれに用いられるプライマ
ーに関する。
【０００２】
【従来の技術】ＢＶは、ヒト単純ヘルペスウイルス(HSV
タイプ１(HSV-1)及びタイプ２(HSV-2))と同様、アルフ
ァヘルペスウイルス亜科に属するウイルスである。この
ウイルスは、マカク猿における一般的な病原体である。
ＢＶがサルに感染しても通常、無徴候であるが、ヒトに
感染すると、感染直後に適切な医療処置がとられない限
り、高い死亡率でヒトに死をもたらす。従って、ＢＶ感
染を正確かつ迅速に診断することは、ＢＶ−陽性サル又
は組織に接触する可能性がある研究者や動物世話係の人
々の安全にとって極めて重要である。
タイプ１(HSV-1)及びタイプ２(HSV-2))と同様、アルフ
ァヘルペスウイルス亜科に属するウイルスである。この
ウイルスは、マカク猿における一般的な病原体である。
ＢＶがサルに感染しても通常、無徴候であるが、ヒトに
感染すると、感染直後に適切な医療処置がとられない限
り、高い死亡率でヒトに死をもたらす。従って、ＢＶ感
染を正確かつ迅速に診断することは、ＢＶ−陽性サル又
は組織に接触する可能性がある研究者や動物世話係の人
々の安全にとって極めて重要である。
【０００３】従来より、ＢＶ感染の確定診断は、スワブ
培養により行われている。しかしながら、スワブ培養に
は２〜３日かかり、また、物理的封じ込めレベル４の施
設が必要である。一方、各種ウイルスＤＮＡの診断に、
迅速かつ安全なＰＣＲが用いられるようになり、ＢＶの
診断にもＰＣＲを用いることが提案されている(Black,
D.H. et al., 1997, J. Vet. diagn. Invest. 9:225-23
1; Scinicariello, F.et al., J. Infect. Dis. 168:74
7-750; Scinicariello, F. et al., 1993, Lancet 341:
1660-1661; Slomka, M.J. et al., 1993, Arch. Virol.
131:89-99)。
培養により行われている。しかしながら、スワブ培養に
は２〜３日かかり、また、物理的封じ込めレベル４の施
設が必要である。一方、各種ウイルスＤＮＡの診断に、
迅速かつ安全なＰＣＲが用いられるようになり、ＢＶの
診断にもＰＣＲを用いることが提案されている(Black,
D.H. et al., 1997, J. Vet. diagn. Invest. 9:225-23
1; Scinicariello, F.et al., J. Infect. Dis. 168:74
7-750; Scinicariello, F. et al., 1993, Lancet 341:
1660-1661; Slomka, M.J. et al., 1993, Arch. Virol.
131:89-99)。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、ＰＣＲ
を用いたこれらの公知方法のうち、Slomka, M.J. et a
l., 1993, Arch. Virol. 131:89-99に記載された方法
は、ヒトに対して最も多くの死をもたらしているアカゲ
ザル由来のウイルスを検出することができない。また、
他の方法では、ＢＶの遺伝子と塩基配列が類似している
HSVの遺伝子も増幅されてしまい、増幅産物がＢＶ由来
かHSV由来かを調べるために、増幅産物をさらに制限酵
素で処理してその切断パターンを調べる(RFLP)か、又は
放射標識プローブを用いたサザンハイブリダイゼーショ
ンを行わなければならず、そのための手間と時間がかか
っていた。もし、ＰＣＲにより、ＢＶ由来の核酸のみが
増幅され、HSV由来の核酸が増幅されなければ、増幅後
のRFLPやサザン法を行う必要がなくなり、より迅速な診
断が可能となり、有利である。
を用いたこれらの公知方法のうち、Slomka, M.J. et a
l., 1993, Arch. Virol. 131:89-99に記載された方法
は、ヒトに対して最も多くの死をもたらしているアカゲ
ザル由来のウイルスを検出することができない。また、
他の方法では、ＢＶの遺伝子と塩基配列が類似している
HSVの遺伝子も増幅されてしまい、増幅産物がＢＶ由来
かHSV由来かを調べるために、増幅産物をさらに制限酵
素で処理してその切断パターンを調べる(RFLP)か、又は
放射標識プローブを用いたサザンハイブリダイゼーショ
ンを行わなければならず、そのための手間と時間がかか
っていた。もし、ＰＣＲにより、ＢＶ由来の核酸のみが
増幅され、HSV由来の核酸が増幅されなければ、増幅後
のRFLPやサザン法を行う必要がなくなり、より迅速な診
断が可能となり、有利である。
【０００５】従って、本発明の目的は、ＢＶ由来の核酸
は増幅されるがHSV由来の核酸は増幅されない、ＰＣＲ
により検体中のＢＶを測定する方法及びそれに用いられ
るプライマーを提供することである。
は増幅されるがHSV由来の核酸は増幅されない、ＰＣＲ
により検体中のＢＶを測定する方法及びそれに用いられ
るプライマーを提供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本願発明者らは、ＢＶの
糖タンパクＧ(glycoprotein G)遺伝子(以下、「BVgG」
と言うことがある）が、対応するHSV遺伝子との相同性
が比較的低いことに気付き、この遺伝子中の適切な領域
とハイブリダイズするプライマーを用いてＰＣＲを行う
ことにより上記本発明の目的を達成できるのではないか
と考えた。しかし、通常の条件でＰＣＲを行うと、増幅
が起きなかった。これは、BVgG遺伝子中のシトシンとグ
アニンの含量が多いため、セルフライゲーションが起き
て増幅が進まないためと考えられた。そこで、シトシン
とグアニンの含量が多い核酸のＰＣＲによる増幅に用い
ることが知られている、ベタインの存在下にＰＣＲを行
ったところ増幅が起きた。そして、被検試料中にＢＶと
HSVの両者が共存する場合であっても、BVgG中の領域は
増幅されるが、HSV遺伝子中の領域は増幅されないよう
にすることが可能なプライマー領域の組合せを見出し、
これを実験的に確認して本願発明を完成した。
糖タンパクＧ(glycoprotein G)遺伝子(以下、「BVgG」
と言うことがある）が、対応するHSV遺伝子との相同性
が比較的低いことに気付き、この遺伝子中の適切な領域
とハイブリダイズするプライマーを用いてＰＣＲを行う
ことにより上記本発明の目的を達成できるのではないか
と考えた。しかし、通常の条件でＰＣＲを行うと、増幅
が起きなかった。これは、BVgG遺伝子中のシトシンとグ
アニンの含量が多いため、セルフライゲーションが起き
て増幅が進まないためと考えられた。そこで、シトシン
とグアニンの含量が多い核酸のＰＣＲによる増幅に用い
ることが知られている、ベタインの存在下にＰＣＲを行
ったところ増幅が起きた。そして、被検試料中にＢＶと
HSVの両者が共存する場合であっても、BVgG中の領域は
増幅されるが、HSV遺伝子中の領域は増幅されないよう
にすることが可能なプライマー領域の組合せを見出し、
これを実験的に確認して本願発明を完成した。
【０００７】すなわち、本発明は、配列表の配列番号１
に示す塩基配列の連続する少なくとも１５塩基から成る
核酸又は該核酸を構成する塩基の１０％以下の数の塩基
が置換若しくは欠失し又は付加された塩基配列を有する
核酸であって、ＰＣＲのプライマーとして用いた場合に
サルＢウイルスＤＮＡを増幅可能な核酸から成る、サル
Ｂウイルス測定用の第１のフォワード側プライマーを提
供する。また、本発明は、配列表の配列番号３に示す塩
基配列の連続する少なくとも１５塩基から成る核酸又は
該核酸を構成する塩基の１０％以下の数の塩基が置換若
しくは欠失し又は付加された塩基配列を有する核酸であ
って、ＰＣＲのプライマーとして用いた場合にサルＢウ
イルスＤＮＡを増幅可能な核酸から成る、サルＢウイル
ス測定用の第１のリバース側プライマーを提供する。さ
らに、本発明は、配列表の配列番号５に示す塩基配列の
連続する少なくとも１５塩基から成る核酸又は該核酸を
構成する塩基の１０％以下の数の塩基が置換若しくは欠
失し又は付加された塩基配列を有する核酸であって、Ｐ
ＣＲのプライマーとして用いた場合にサルＢウイルスＤ
ＮＡを増幅可能な核酸から成る、サルＢウイルス測定用
の第２のフォワード側プライマーを提供する。さらに、
本発明は、配列表の配列番号７に示す塩基配列の連続す
る少なくとも１５塩基から成る核酸又は該核酸を構成す
る塩基の１０％以下の数の塩基が置換若しくは欠失し又
は付加された塩基配列を有する核酸であって、ＰＣＲの
プライマーとして用いた場合にサルＢウイルスＤＮＡを
増幅可能な核酸から成る、サルＢウイルス測定用の第２
のリバース側プライマーを提供する。さらに、本発明
は、上記第１のフォワード側プライマーと、上記第１の
リバース側プライマーを用いて、ベタインの存在下で被
検試料についてＰＣＲを行い、増幅産物を測定すること
から成る、サルＢウイルスの測定方法を提供する。さら
に、本発明は、上記第２のフォワード側プライマーと、
上記第２のリバース側プライマーを用いて、ベタインの
存在下で被検試料についてＰＣＲを行い、増幅産物を測
定することから成る、サルＢウイルスの測定方法を提供
する。
に示す塩基配列の連続する少なくとも１５塩基から成る
核酸又は該核酸を構成する塩基の１０％以下の数の塩基
が置換若しくは欠失し又は付加された塩基配列を有する
核酸であって、ＰＣＲのプライマーとして用いた場合に
サルＢウイルスＤＮＡを増幅可能な核酸から成る、サル
Ｂウイルス測定用の第１のフォワード側プライマーを提
供する。また、本発明は、配列表の配列番号３に示す塩
基配列の連続する少なくとも１５塩基から成る核酸又は
該核酸を構成する塩基の１０％以下の数の塩基が置換若
しくは欠失し又は付加された塩基配列を有する核酸であ
って、ＰＣＲのプライマーとして用いた場合にサルＢウ
イルスＤＮＡを増幅可能な核酸から成る、サルＢウイル
ス測定用の第１のリバース側プライマーを提供する。さ
らに、本発明は、配列表の配列番号５に示す塩基配列の
連続する少なくとも１５塩基から成る核酸又は該核酸を
構成する塩基の１０％以下の数の塩基が置換若しくは欠
失し又は付加された塩基配列を有する核酸であって、Ｐ
ＣＲのプライマーとして用いた場合にサルＢウイルスＤ
ＮＡを増幅可能な核酸から成る、サルＢウイルス測定用
の第２のフォワード側プライマーを提供する。さらに、
本発明は、配列表の配列番号７に示す塩基配列の連続す
る少なくとも１５塩基から成る核酸又は該核酸を構成す
る塩基の１０％以下の数の塩基が置換若しくは欠失し又
は付加された塩基配列を有する核酸であって、ＰＣＲの
プライマーとして用いた場合にサルＢウイルスＤＮＡを
増幅可能な核酸から成る、サルＢウイルス測定用の第２
のリバース側プライマーを提供する。さらに、本発明
は、上記第１のフォワード側プライマーと、上記第１の
リバース側プライマーを用いて、ベタインの存在下で被
検試料についてＰＣＲを行い、増幅産物を測定すること
から成る、サルＢウイルスの測定方法を提供する。さら
に、本発明は、上記第２のフォワード側プライマーと、
上記第２のリバース側プライマーを用いて、ベタインの
存在下で被検試料についてＰＣＲを行い、増幅産物を測
定することから成る、サルＢウイルスの測定方法を提供
する。
【０００８】
【発明の実施の形態】本発明の第１のフォワード側プラ
イマーは、配列表の配列番号１に示す塩基配列の連続す
る少なくとも１５塩基から成る核酸であり、下記実施例
では、配列番号２に示す塩基配列を有する２１塩基から
成る核酸(プライマーgGS4)を用いている。配列番号１に
示す塩基配列は、配列番号９に示すBVgGの塩基配列(Slo
mka, M.J. et al., J. Gen. Virol. 76(Pt)), 2161-216
8(1995); DDBJ Accession No.AB032191)の1063番目のヌ
クレオチド（本明細書において、「1063nt」と記載す
る。他のヌクレオチドの位置も同様な方法で記載する）
〜1103ntの領域に相当し、プライマーgGS4は、1073nt〜
1093ntの領域に相当する。第１のフォワード側プライマ
ーとしては、配列番号１に示される塩基配列の11nt〜31
ntの範囲内の連続する少なくとも１５塩基を含む核酸が
好ましく、プライマーgGS4が特に好ましい。なお、上記
した核酸を構成する塩基の１０％以下の数の塩基が置換
若しくは欠失し又は付加された場合であっても、鋳型核
酸とハイブリダイズし、ＰＣＲのプライマーとして機能
する場合があるので、本発明の第１のフォワード側プラ
イマーは、上記した核酸を構成する塩基の１０％以下の
数の塩基が置換若しくは欠失し又は付加された塩基配列
を有する核酸であって、ＰＣＲのプライマーとして用い
た場合にサルＢウイルスＤＮＡを増幅可能な核酸をも包
含する。
イマーは、配列表の配列番号１に示す塩基配列の連続す
る少なくとも１５塩基から成る核酸であり、下記実施例
では、配列番号２に示す塩基配列を有する２１塩基から
成る核酸(プライマーgGS4)を用いている。配列番号１に
示す塩基配列は、配列番号９に示すBVgGの塩基配列(Slo
mka, M.J. et al., J. Gen. Virol. 76(Pt)), 2161-216
8(1995); DDBJ Accession No.AB032191)の1063番目のヌ
クレオチド（本明細書において、「1063nt」と記載す
る。他のヌクレオチドの位置も同様な方法で記載する）
〜1103ntの領域に相当し、プライマーgGS4は、1073nt〜
1093ntの領域に相当する。第１のフォワード側プライマ
ーとしては、配列番号１に示される塩基配列の11nt〜31
ntの範囲内の連続する少なくとも１５塩基を含む核酸が
好ましく、プライマーgGS4が特に好ましい。なお、上記
した核酸を構成する塩基の１０％以下の数の塩基が置換
若しくは欠失し又は付加された場合であっても、鋳型核
酸とハイブリダイズし、ＰＣＲのプライマーとして機能
する場合があるので、本発明の第１のフォワード側プラ
イマーは、上記した核酸を構成する塩基の１０％以下の
数の塩基が置換若しくは欠失し又は付加された塩基配列
を有する核酸であって、ＰＣＲのプライマーとして用い
た場合にサルＢウイルスＤＮＡを増幅可能な核酸をも包
含する。
【０００９】本発明の第１のリバース側プライマーは、
配列表の配列番号３に示す塩基配列の連続する少なくと
も１５塩基から成る核酸であり、下記実施例では、配列
番号４に示す塩基配列を有する１８塩基から成る核酸
(プライマーgGAS4)を用いている。配列番号３に示す塩
基配列は、配列番号９に示すBVgGの塩基配列の1254nt〜
1291ntの領域に相補的であり、プライマーgGAS4は、126
4nt〜1281ntの領域に相補的である。第１のリバース側
プライマーとしては、配列番号３に示される塩基配列の
11nt〜28ntの範囲内の連続する少なくとも１５塩基を含
む核酸が好ましく、プライマーgGAS4が特に好ましい。
なお、上記した核酸を構成する塩基の１０％以下の数の
塩基が置換若しくは欠失し又は付加された場合であって
も、鋳型核酸とハイブリダイズし、ＰＣＲのプライマー
として機能する場合があるので、本発明の第１のリバー
ス側プライマーは、上記した核酸を構成する塩基の１０
％以下の数の塩基が置換若しくは欠失し又は付加された
塩基配列を有する核酸であって、ＰＣＲのプライマーと
して用いた場合にサルＢウイルスＤＮＡを増幅可能な核
酸をも包含する。
配列表の配列番号３に示す塩基配列の連続する少なくと
も１５塩基から成る核酸であり、下記実施例では、配列
番号４に示す塩基配列を有する１８塩基から成る核酸
(プライマーgGAS4)を用いている。配列番号３に示す塩
基配列は、配列番号９に示すBVgGの塩基配列の1254nt〜
1291ntの領域に相補的であり、プライマーgGAS4は、126
4nt〜1281ntの領域に相補的である。第１のリバース側
プライマーとしては、配列番号３に示される塩基配列の
11nt〜28ntの範囲内の連続する少なくとも１５塩基を含
む核酸が好ましく、プライマーgGAS4が特に好ましい。
なお、上記した核酸を構成する塩基の１０％以下の数の
塩基が置換若しくは欠失し又は付加された場合であって
も、鋳型核酸とハイブリダイズし、ＰＣＲのプライマー
として機能する場合があるので、本発明の第１のリバー
ス側プライマーは、上記した核酸を構成する塩基の１０
％以下の数の塩基が置換若しくは欠失し又は付加された
塩基配列を有する核酸であって、ＰＣＲのプライマーと
して用いた場合にサルＢウイルスＤＮＡを増幅可能な核
酸をも包含する。
【００１０】本発明の第２のフォワード側プライマー
は、配列表の配列番号５に示す塩基配列の連続する少な
くとも１５塩基から成る核酸であり、下記実施例では、
配列番号６に示す塩基配列を有する２１塩基から成る核
酸(プライマーgGS5)を用いている。配列番号５に示す塩
基配列は、配列番号９に示すBVgGの塩基配列の1330nt〜
1369ntの領域に相当し、プライマーgGS5は、1340nt〜13
59ntの領域に相当する。第２のフォワード側プライマー
としては、配列番号５に示される塩基配列の11nt〜30nt
の範囲内の連続する少なくとも１５塩基を含む核酸が好
ましく、プライマーgGS5が特に好ましい。なお、上記し
た核酸を構成する塩基の１０％以下の数の塩基が置換若
しくは欠失し又は付加された場合であっても、鋳型核酸
とハイブリダイズし、ＰＣＲのプライマーとして機能す
る場合があるので、本発明の第２のフォワード側プライ
マーは、上記した核酸を構成する塩基の１０％以下の数
の塩基が置換若しくは欠失し又は付加された塩基配列を
有する核酸であって、ＰＣＲのプライマーとして用いた
場合にサルＢウイルスＤＮＡを増幅可能な核酸をも包含
する。
は、配列表の配列番号５に示す塩基配列の連続する少な
くとも１５塩基から成る核酸であり、下記実施例では、
配列番号６に示す塩基配列を有する２１塩基から成る核
酸(プライマーgGS5)を用いている。配列番号５に示す塩
基配列は、配列番号９に示すBVgGの塩基配列の1330nt〜
1369ntの領域に相当し、プライマーgGS5は、1340nt〜13
59ntの領域に相当する。第２のフォワード側プライマー
としては、配列番号５に示される塩基配列の11nt〜30nt
の範囲内の連続する少なくとも１５塩基を含む核酸が好
ましく、プライマーgGS5が特に好ましい。なお、上記し
た核酸を構成する塩基の１０％以下の数の塩基が置換若
しくは欠失し又は付加された場合であっても、鋳型核酸
とハイブリダイズし、ＰＣＲのプライマーとして機能す
る場合があるので、本発明の第２のフォワード側プライ
マーは、上記した核酸を構成する塩基の１０％以下の数
の塩基が置換若しくは欠失し又は付加された塩基配列を
有する核酸であって、ＰＣＲのプライマーとして用いた
場合にサルＢウイルスＤＮＡを増幅可能な核酸をも包含
する。
【００１１】本発明の第２のリバース側プライマーは、
配列表の配列番号７に示す塩基配列の連続する少なくと
も１５塩基から成る核酸であり、下記実施例では、配列
番号８に示す塩基配列を有する１８塩基から成る核酸
(プライマーgGAS5)を用いている。配列番号７に示す塩
基配列は、配列番号９に示すBVgGの塩基配列の1503nt〜
1540ntの領域に相補的であり、プライマーgGAS5は、151
3nt〜1530ntの領域に相補的である。第２のリバース側
プライマーとしては、配列番号７に示される塩基配列の
11nt〜28ntの範囲内の連続する少なくとも１５塩基を含
む核酸が好ましく、プライマーgGAS5が特に好ましい。
なお、上記した核酸を構成する塩基の１０％以下の数の
塩基が置換若しくは欠失し又は付加された場合であって
も、鋳型核酸とハイブリダイズし、ＰＣＲのプライマー
として機能する場合があるので、本発明の第２のリバー
ス側プライマーは、上記した核酸を構成する塩基の１０
％以下の数の塩基が置換若しくは欠失し又は付加された
塩基配列を有する核酸であって、ＰＣＲのプライマーと
して用いた場合にサルＢウイルスＤＮＡを増幅可能な核
酸をも包含する。
配列表の配列番号７に示す塩基配列の連続する少なくと
も１５塩基から成る核酸であり、下記実施例では、配列
番号８に示す塩基配列を有する１８塩基から成る核酸
(プライマーgGAS5)を用いている。配列番号７に示す塩
基配列は、配列番号９に示すBVgGの塩基配列の1503nt〜
1540ntの領域に相補的であり、プライマーgGAS5は、151
3nt〜1530ntの領域に相補的である。第２のリバース側
プライマーとしては、配列番号７に示される塩基配列の
11nt〜28ntの範囲内の連続する少なくとも１５塩基を含
む核酸が好ましく、プライマーgGAS5が特に好ましい。
なお、上記した核酸を構成する塩基の１０％以下の数の
塩基が置換若しくは欠失し又は付加された場合であって
も、鋳型核酸とハイブリダイズし、ＰＣＲのプライマー
として機能する場合があるので、本発明の第２のリバー
ス側プライマーは、上記した核酸を構成する塩基の１０
％以下の数の塩基が置換若しくは欠失し又は付加された
塩基配列を有する核酸であって、ＰＣＲのプライマーと
して用いた場合にサルＢウイルスＤＮＡを増幅可能な核
酸をも包含する。
【００１２】上記した本発明のプライマーは、市販のＤ
ＮＡ合成装置等を用いて容易に化学合成することができ
る。
ＮＡ合成装置等を用いて容易に化学合成することができ
る。
【００１３】本発明のＢＶの測定方法では、上記第１の
フォワード側プライマーと、上記第１のリバース側プラ
イマーを用いて、ベタインの存在下で被検試料について
ＰＣＲを行う。あるいは、上記第２のフォワード側プラ
イマーと、上記第２のリバース側プライマーを用いて、
ベタインの存在下で被検試料についてＰＣＲを行う。こ
こで、ベタインとは、1-カルボキシ-N,N,N-トリメチル
メタンアンモニウム分子内塩を意味する。ＰＣＲ反応液
中のベタイン濃度は0.5M〜2.0Mが好ましく、さらに好ま
しくは0.8M〜1.8Mであり、さらに好ましくは1.3M〜1.7M
である。ベタイン濃度が0.5M未満の場合には、測定可能
な程度に増幅が起きにくく、2.0Mを超える場合にも感度
が低下する。反応溶液がベタインを含むこと以外は、常
法によりＰＣＲを行うことができる。ＰＣＲの方法自体
は周知であり、そのための試薬キット及び装置が市販さ
れているので、それらを用いて容易に行うことができ
る。なお、ＰＣＲの条件の一例が下記実施例に詳細に記
載されている。
フォワード側プライマーと、上記第１のリバース側プラ
イマーを用いて、ベタインの存在下で被検試料について
ＰＣＲを行う。あるいは、上記第２のフォワード側プラ
イマーと、上記第２のリバース側プライマーを用いて、
ベタインの存在下で被検試料についてＰＣＲを行う。こ
こで、ベタインとは、1-カルボキシ-N,N,N-トリメチル
メタンアンモニウム分子内塩を意味する。ＰＣＲ反応液
中のベタイン濃度は0.5M〜2.0Mが好ましく、さらに好ま
しくは0.8M〜1.8Mであり、さらに好ましくは1.3M〜1.7M
である。ベタイン濃度が0.5M未満の場合には、測定可能
な程度に増幅が起きにくく、2.0Mを超える場合にも感度
が低下する。反応溶液がベタインを含むこと以外は、常
法によりＰＣＲを行うことができる。ＰＣＲの方法自体
は周知であり、そのための試薬キット及び装置が市販さ
れているので、それらを用いて容易に行うことができ
る。なお、ＰＣＲの条件の一例が下記実施例に詳細に記
載されている。
【００１４】被検試料としては、ＢＶを含むか否かを知
りたいいずれのものであってもよく、血液等の体液を挙
げることができる。血液からのＤＮＡの抽出は、常法に
より行うことができる。
りたいいずれのものであってもよく、血液等の体液を挙
げることができる。血液からのＤＮＡの抽出は、常法に
より行うことができる。
【００１５】ＰＣＲによる増幅後、増幅産物を測定す
る。これは、増幅産物を電気泳動にかけ、エチジウムブ
ロミド等で染色して増幅バンドを検出する常法により容
易に行うことができる。また、検出される増幅バンドの
強度に基づき、被検試料中のＢＶウイルス量を半定量す
ることも可能である。さらに、増幅産物にハイブリダイ
ズするオリゴヌクレオチドであって、レポーター蛍光色
素とクエンチャー蛍光色素が結合されたプローブの存在
下にＰＣＲを行う、いわゆるリアルタイムＰＣＲに行え
ば、増幅産物を定量することができる。従って、本明細
書で言う、ウイルスの「測定」には、定性的な検出の
他、上記のような半定量的又は定量的な検出も包含され
る。
る。これは、増幅産物を電気泳動にかけ、エチジウムブ
ロミド等で染色して増幅バンドを検出する常法により容
易に行うことができる。また、検出される増幅バンドの
強度に基づき、被検試料中のＢＶウイルス量を半定量す
ることも可能である。さらに、増幅産物にハイブリダイ
ズするオリゴヌクレオチドであって、レポーター蛍光色
素とクエンチャー蛍光色素が結合されたプローブの存在
下にＰＣＲを行う、いわゆるリアルタイムＰＣＲに行え
ば、増幅産物を定量することができる。従って、本明細
書で言う、ウイルスの「測定」には、定性的な検出の
他、上記のような半定量的又は定量的な検出も包含され
る。
【００１６】上記の方法により、例えば、下記実施例の
方法のように、第１のフォワード側プライマーであるプ
ライマーgGS4と第１のリバース側プライマーであるプラ
イマーgGAS4とを用いてＰＣＲを行った場合には、BVgG
（配列番号９）の1073nt〜1281ntの209bpの断片が増幅
される。また、第２のフォワード側プライマーであるgG
S5と第２のリバース側プライマーであるgGAS5とを用い
てＰＣＲを行った場合にはBVgGの1340nt〜1530ntの191b
pの断片が増幅される。なお、下記実施例において具体
的に記載されている通り、ＢＶと類似したゲノミックＤ
ＮＡの塩基配列を有するHSV-1及びHSV-2が被検試料中に
存在している場合であっても、本発明の方法によれば、
ＢＶのみが増幅され、HSV-1及びHSV-2は増幅されない。
方法のように、第１のフォワード側プライマーであるプ
ライマーgGS4と第１のリバース側プライマーであるプラ
イマーgGAS4とを用いてＰＣＲを行った場合には、BVgG
（配列番号９）の1073nt〜1281ntの209bpの断片が増幅
される。また、第２のフォワード側プライマーであるgG
S5と第２のリバース側プライマーであるgGAS5とを用い
てＰＣＲを行った場合にはBVgGの1340nt〜1530ntの191b
pの断片が増幅される。なお、下記実施例において具体
的に記載されている通り、ＢＶと類似したゲノミックＤ
ＮＡの塩基配列を有するHSV-1及びHSV-2が被検試料中に
存在している場合であっても、本発明の方法によれば、
ＢＶのみが増幅され、HSV-1及びHSV-2は増幅されない。
【００１７】
【実施例】以下、本発明を実施例に基づきより具体的に
説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定される
ものではない。
説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定される
ものではない。
【００１８】実施例１ ＢＶのE-2490株を、無血清培地中でコンフルーエントに
単層培養されているベロ細胞中で増殖させた。ソラレン
存在下で紫外線照射後、ビリオンを回収し、ヨウ化ナト
リウム法(Ishizawa, M. et al., 1991, Nucleic Acids
Res. 19:5792)によりウイルスＤＮＡを精製した。すな
わち、ウイルスタンパク質を4.5Mヨウ化ナトリウムで可
溶化し、次いで、ウイルスＤＮＡを、５０％イソプロパ
ノール中でグリコーゲンと共に共沈殿させることにより
精製した。
単層培養されているベロ細胞中で増殖させた。ソラレン
存在下で紫外線照射後、ビリオンを回収し、ヨウ化ナト
リウム法(Ishizawa, M. et al., 1991, Nucleic Acids
Res. 19:5792)によりウイルスＤＮＡを精製した。すな
わち、ウイルスタンパク質を4.5Mヨウ化ナトリウムで可
溶化し、次いで、ウイルスＤＮＡを、５０％イソプロパ
ノール中でグリコーゲンと共に共沈殿させることにより
精製した。
【００１９】上記プライマーgGS4とプライマーgGAS4の
セット、又はプライマーgGS5とプライマーgGAS5のセッ
トを用いてＰＣＲを行った。Clonetech社製のAdvantage
-GCキットを用い、5% DMSO、１μｌのＢＶ ＤＮＡ溶
液、及び各0.4μＭのフォワード側及びリバース側プラ
イマーを含む50μｌのＰＣＲ混合物を調製した。なお、
ベタイン濃度は0、0.5M、1.0M又は1.5Mとした。なお、
この反応溶液１μｌは、800TCID50（50%組織培養感染
価）のビリオンから抽出されたＢＶ ＤＮＡを含むと見
積もられた。ＰＣＲは、最初に９４℃、５分間の変性工
程を行った後、９４℃、１分間の変性工程、５５℃、１
分間のアニーリング工程、７２℃、１分間の伸長工程か
ら成るサイクルを３５回繰り返し、最後に７２℃、７分
間の伸長工程を行うことにより行った。ＰＣＲ産物を５
％アクリルアミドゲル電気泳動にかけ、SYBR Green I
（Molecular Probes社製）で染色後、波長234nmの紫外
線を照射して増幅バンドを可視化した。なお、分子量マ
ーカーとしては、φX174ファージのHaeIII消化物を用い
た。
セット、又はプライマーgGS5とプライマーgGAS5のセッ
トを用いてＰＣＲを行った。Clonetech社製のAdvantage
-GCキットを用い、5% DMSO、１μｌのＢＶ ＤＮＡ溶
液、及び各0.4μＭのフォワード側及びリバース側プラ
イマーを含む50μｌのＰＣＲ混合物を調製した。なお、
ベタイン濃度は0、0.5M、1.0M又は1.5Mとした。なお、
この反応溶液１μｌは、800TCID50（50%組織培養感染
価）のビリオンから抽出されたＢＶ ＤＮＡを含むと見
積もられた。ＰＣＲは、最初に９４℃、５分間の変性工
程を行った後、９４℃、１分間の変性工程、５５℃、１
分間のアニーリング工程、７２℃、１分間の伸長工程か
ら成るサイクルを３５回繰り返し、最後に７２℃、７分
間の伸長工程を行うことにより行った。ＰＣＲ産物を５
％アクリルアミドゲル電気泳動にかけ、SYBR Green I
（Molecular Probes社製）で染色後、波長234nmの紫外
線を照射して増幅バンドを可視化した。なお、分子量マ
ーカーとしては、φX174ファージのHaeIII消化物を用い
た。
【００２０】その結果、いずれのプライマーセットの場
合もベタイン濃度０の時は増幅バンドは全く検出されな
かったが、gGS4-gGAS4セットの場合は、ベタイン濃度1.
0M及び1.5Mの場合、gGS5-gGAS5セットの場合はベタイン
濃度1.5Mの場合に増幅バンドが明瞭に検出された。上記
以外の場合は増幅バンドは薄かった。従って、実施例２
以降では、ベタイン濃度を1.5Mとした。gGS4-gGAS4セッ
トを用いた場合には、209bpの断片が増幅され、gGS5-gG
AS5セットの場合には191bpの増幅バンドが観察された。
さらに、これらの増幅バンドを切り出して常法によりＤ
ＮＡを抽出し、その塩基配列を決定したところ、gGS4-g
GAS4セットを用いて増幅された断片は、配列番号９の10
73nt〜1281ntの塩基配列を有しており、gGS5-gGAS5セッ
トを用いて増幅された断片は配列番号９の1340nt〜1530
ntの塩基配列を有していた。従って、上記の方法によ
り、BVgG遺伝子中の意図した領域が増幅されたことが証
明された。
合もベタイン濃度０の時は増幅バンドは全く検出されな
かったが、gGS4-gGAS4セットの場合は、ベタイン濃度1.
0M及び1.5Mの場合、gGS5-gGAS5セットの場合はベタイン
濃度1.5Mの場合に増幅バンドが明瞭に検出された。上記
以外の場合は増幅バンドは薄かった。従って、実施例２
以降では、ベタイン濃度を1.5Mとした。gGS4-gGAS4セッ
トを用いた場合には、209bpの断片が増幅され、gGS5-gG
AS5セットの場合には191bpの増幅バンドが観察された。
さらに、これらの増幅バンドを切り出して常法によりＤ
ＮＡを抽出し、その塩基配列を決定したところ、gGS4-g
GAS4セットを用いて増幅された断片は、配列番号９の10
73nt〜1281ntの塩基配列を有しており、gGS5-gGAS5セッ
トを用いて増幅された断片は配列番号９の1340nt〜1530
ntの塩基配列を有していた。従って、上記の方法によ
り、BVgG遺伝子中の意図した領域が増幅されたことが証
明された。
【００２１】実施例２ ヒヒHPV2、アフリカミドリザルAS8、HSV-1(HF株）及びH
SV-2(UW268株)を常法により増殖させ、ウイルスＤＮＡ
を実施例１と同様にヨウ化ナトリウム法により精製し
た。実施例１と同様に、ヒヒHPV2、アフリカミドリザル
AS8、あるいは800TCID50のHSV-1又はHSV-2を含むＰＣＲ
混合溶液を調製し、実施例１と同様にしてＰＣＲを行っ
た。その結果、いずれのプライマーセットを用いた場合
にも増幅は起きなかった。
SV-2(UW268株)を常法により増殖させ、ウイルスＤＮＡ
を実施例１と同様にヨウ化ナトリウム法により精製し
た。実施例１と同様に、ヒヒHPV2、アフリカミドリザル
AS8、あるいは800TCID50のHSV-1又はHSV-2を含むＰＣＲ
混合溶液を調製し、実施例１と同様にしてＰＣＲを行っ
た。その結果、いずれのプライマーセットを用いた場合
にも増幅は起きなかった。
【００２２】偽陰性の可能性を排除するために、プライ
マーとして、HSV-1及びHSV-2ならびにBVを増幅させるこ
とが知られているBV1（配列番号１０）及びBV2(配列番
号１１）(Scinicariello, F. et al., J. Infect. Dis.
168:747-750; Scinicariello, F. et al., 1993, Lanc
et 341:1660-1661)を用いて上記と同様にＰＣＲを行っ
た。その結果、報告されている通り、128bpの増幅断片
が観察された。よって、ＰＣＲ溶液中にヒヒHPV2、アフ
リカミドリザルAS8、HSV-1及びHSV-2が含まれていたこ
とが明らかになり、偽陰性の可能性が排除された。
マーとして、HSV-1及びHSV-2ならびにBVを増幅させるこ
とが知られているBV1（配列番号１０）及びBV2(配列番
号１１）(Scinicariello, F. et al., J. Infect. Dis.
168:747-750; Scinicariello, F. et al., 1993, Lanc
et 341:1660-1661)を用いて上記と同様にＰＣＲを行っ
た。その結果、報告されている通り、128bpの増幅断片
が観察された。よって、ＰＣＲ溶液中にヒヒHPV2、アフ
リカミドリザルAS8、HSV-1及びHSV-2が含まれていたこ
とが明らかになり、偽陰性の可能性が排除された。
【００２３】さらに、本発明の方法の特異性を証明する
ために、実施例１のＰＣＲ溶液にヒヒHPV2、アフリカミ
ドリザルAS8、あるいは各800 TCID50のHSV-1及びHSV-2
とを添加した混合溶液、並びに実施例１のＰＣＲ溶液に
1000コピーのＢ型肝炎ウイルスゲノミックＤＮＡを添加
した混合溶液について実施例１と同様にしてＰＣＲを行
った。
ために、実施例１のＰＣＲ溶液にヒヒHPV2、アフリカミ
ドリザルAS8、あるいは各800 TCID50のHSV-1及びHSV-2
とを添加した混合溶液、並びに実施例１のＰＣＲ溶液に
1000コピーのＢ型肝炎ウイルスゲノミックＤＮＡを添加
した混合溶液について実施例１と同様にしてＰＣＲを行
った。
【００２４】その結果、いずれの場合にも、gGS4-gGAS4
セットの場合は209bpの断片のみが増幅され、gGS5-gGAS
5セットの場合は191bpの断片のみが増幅された。これに
より、本発明の方法によれば、被検試料中にヒヒHPV2、
アフリカミドリザルAS8、HSV-1若しくはHSV-2又はＢ型
肝炎ウイルスが共存している場合であっても、BVgG遺伝
子中の上記領域のみが増幅されることが証明された。
セットの場合は209bpの断片のみが増幅され、gGS5-gGAS
5セットの場合は191bpの断片のみが増幅された。これに
より、本発明の方法によれば、被検試料中にヒヒHPV2、
アフリカミドリザルAS8、HSV-1若しくはHSV-2又はＢ型
肝炎ウイルスが共存している場合であっても、BVgG遺伝
子中の上記領域のみが増幅されることが証明された。
【００２５】実施例３ 実施例１で用いたＢＶ試料を１０倍低減希釈し、それら
について実施例１と同様にＰＣＲを行った。その結果、
１０倍希釈の場合、gGS4-gGAS4セットを用いた場合は20
9bpのバンドが明瞭に増幅バンドが検出され、gGS5-gGAS
5セットを用いた場合は191bpの薄い増幅バンドが検出さ
れた。１００倍希釈の場合には、いずれのプライマーセ
ットを用いても増幅バンドは検出されなかった。このこ
とから、上記方法により、80 TCID50のウイルスＤＮＡ
は検出可能であるが8 TCID50のウイルスＤＮＡは検出で
きないことがわかった。この感度は、Scinicariello et
al.（上掲）の方法による感度と同程度である。
について実施例１と同様にＰＣＲを行った。その結果、
１０倍希釈の場合、gGS4-gGAS4セットを用いた場合は20
9bpのバンドが明瞭に増幅バンドが検出され、gGS5-gGAS
5セットを用いた場合は191bpの薄い増幅バンドが検出さ
れた。１００倍希釈の場合には、いずれのプライマーセ
ットを用いても増幅バンドは検出されなかった。このこ
とから、上記方法により、80 TCID50のウイルスＤＮＡ
は検出可能であるが8 TCID50のウイルスＤＮＡは検出で
きないことがわかった。この感度は、Scinicariello et
al.（上掲）の方法による感度と同程度である。
【００２６】
【発明の効果】本発明により、ＢＶを特異的に、迅速
に、かつ、高感度に測定することができる方法及びその
ためのプライマーが初めて提供された。本発明の方法に
よれば、被検試料中にＢＶが存在する場合にのみ増幅が
起き、存在しない場合には増幅が起きないので、増幅が
起きたか否かを調べるだけで被検試料中にＢＶが存在す
るか否かを知ることができる。特に、ＢＶと各遺伝子の
塩基配列が類似しているHSV-1及びHSV-2が被検試料中に
共存している場合であっても、BVgG遺伝子中の断片のみ
が増幅され、HSV-1やHSV-2由来の断片の増幅は起きな
い。従って、HSV-1又はHSV-2の増幅と区別するためにＰ
ＣＲ後にRFLPや、サザン分析を行う必要がなく、迅速か
つ簡便に測定を行うことができる。従って、本発明は、
ヒトがＢＶに感染した場合のように、緊急を要する診断
に大きな威力を発揮するものと考えられる。
に、かつ、高感度に測定することができる方法及びその
ためのプライマーが初めて提供された。本発明の方法に
よれば、被検試料中にＢＶが存在する場合にのみ増幅が
起き、存在しない場合には増幅が起きないので、増幅が
起きたか否かを調べるだけで被検試料中にＢＶが存在す
るか否かを知ることができる。特に、ＢＶと各遺伝子の
塩基配列が類似しているHSV-1及びHSV-2が被検試料中に
共存している場合であっても、BVgG遺伝子中の断片のみ
が増幅され、HSV-1やHSV-2由来の断片の増幅は起きな
い。従って、HSV-1又はHSV-2の増幅と区別するためにＰ
ＣＲ後にRFLPや、サザン分析を行う必要がなく、迅速か
つ簡便に測定を行うことができる。従って、本発明は、
ヒトがＢＶに感染した場合のように、緊急を要する診断
に大きな威力を発揮するものと考えられる。
【００２７】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> SRL, INC. <120> Primers for Detecting Monkey B Virus and Method for Dtecting Monk ey B Virus Using the Same <130> 00638 <160> 11
【００２８】 <210> 1 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic Acid for amplifying monkey B virus <400> 1 tcgcgcgcgg ccgcgtacga ctacgagatc ctggtgggcg a 41
【００２９】 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic Acid for amplifying monkey B virus <400> 2 ccgcgtacga ctacgagatc c 21
【００３０】 <210> 3 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic Acid for amplifying monkey B virus <400> 3 caaagagggg gttcgcggcc acgatccagg cggccggg 38
【００３１】 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic Acid for amplifying monkey B virus <400> 4 gttcgcggcc acgatcca 18
【００３２】 <210> 5 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic Acid for amplifying monkey B virus <400> 5 cccgcggaac cccaggacat ggcctacgtg tccgcggcgc 40
【００３３】 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic Acid for amplifying monkey B virus <400> 6 cccaggacat ggcctacgtg 20
【００３４】 <210> 7 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic Acid for amplifying monkey B virus <400> 7 ggcccgactc cgtcccctcc gtcgttaccg acagcaga 38
【００３５】 <210> 8 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic Acid for amplifying monkey B virus <400> 8 cgtcccctcc gtcgttac 18
【００３６】 <210> 9 <211> 2570 <212> DNA <213> Herpesvirus simiae <400> 9 gtcgacccgg cgcactacgg gatcgcgggc acggtggaca cgaacgcccc cgaggtcctg 60 gccggagacc cgtacacgcc gtcggtggac atatggagcg ccggcctggt gatctttgag 120 gcggccgtgc acacggcgtc cctgttttcg gtgtcccgga cggacgagca gcgcccgtac 180 gacgcgcaga tcctgcgcat catccagcag gcccaggtgc acgtggacga gttcccgcag 240 cgcgcggggt cccgcctcgt ttcgcagtac cgccaccggg cggcgcgcaa ccgccgcccg 300 ccgcacaccc gcccggcctg gacgcgctac tacaagctcg acctggacgt ggagtacctc 360 gtttgccggg ccctcacctt cgatggcgcg cggcgcccca gcgcggcgga gctgctgcgg 420 ctgccgctct ttcaaagtag ctgaccggcg tttcccggcg cggcgacccc tcgtcggggc 480 ggtgtcgggg agcgggggag ccccgtatac aaaaaggagg cggccgcggg caggcaccac 540 ggctcccggc ggcacgtcgc catgcgccgc ctcgtctcgc ggctgtcgct cctcgcggcg 600 gtcgtagtgt gtctgtgtcc gggtcccggg ggcgcggggc cgcgccccac cgccgcaccc 660 cctgccgcgc gcgaccccgc gtactgctac gccgtccccc gcctggacga tgtcgggccc 720 acgggcccgg cgccgccggt ggccgacgtc gacagacatc ccgtggtccc gcaccggagc 780 ctggcgcggt cctactcccg gtgcggcctg gccctgctcg tgccccccat ccgccggttc 840 cgcgggacgg acgggggtgc gtttgcggcc cgggtggcct actaccgcgt cggccccggg 900 ggctgccggc gccccatcgc cctcaggtgg tacgggggct gtcggggcgg aacgccgccc 960 tctccgagca cctgcggccg ctactcccac acgtaccaca acggctcgcc ccccatggcc 1020 cacgccctcg tgaacgcctc gctgctggtg cccgtcggcg gctcgcgcgc ggccgcgtac 1080 gactacgaga tcctggtggg cgacaggctc cacgtcgggc gcctgacggt cggcgtcgcc 1140 ccgggcgggc cccgctcccc ccccaaccgg gcctcgcgcc aggacgaccg cgggcccggc 1200 ggacccgcgc cgtgccggcc ggtcgctccc gcggcgcctc tgtggcgctc gatcccggcc 1260 gcctggatcg tggccgcgaa ccccctcttt aacgggccgg agggacgccg ctgcgtgtcc 1320 ccggggaacc ccgcggaacc ccaggacatg gcctacgtgt ccgcggcgcc ccagagcctg 1380 ctggtcggcc tggccggata cctgtttgcc ctgggggggc gggaccgagc gtacgagccg 1440 ccggcgaccg aaccgccggc atcggcgacg gaacggtccg cccgggtccg cctcgcccgg 1500 ggtctgctgt cggtaacgac ggaggggacg gagtcgggcc acacgtccgc cccgaccgcg 1560 gcccccgccg tgactaacca cacggagacc gcaaccgagg gcgcgacgcc gccggccgag 1620 agctccgccg ccaacggtac cggccccggc gagaacggca cgggcgagga gtccgaagcc 1680 accccggcga ctcccacaac cacacccacc gcccccgcct cccccaccgc gccggccggg 1740 aacgacaccg aggcggcggg gaccgagtcg gttccctcgg acgacacgac ccccgccgac 1800 gccttcaccc cccggctcga gattctgacc gcgcgcccgg ggggtgaagg cgggaccgag 1860 ggaggggccg gggaagaaga ggacggcggg gaggacgacg aggcggaggg ggccggggac 1920 ggcgagctgc ccccggccga gtatcctccg cccgcgacgg gcgacgccgg ccccgggacc 1980 gatgatggcg ccgggccgcg gcccggcgga cgcccggact cccacccgta ctccccgacc 2040 ccgcggcgcc cggcctccag gctccccccg ccctacctgg gccccctcac cctccggccc 2100 ccgagccccc cggcggaacc cacgcccccc tccccatccc ccacggaagc cccccacacc 2160 cccctgttcc ccttcctgac cgcctctccc gggctagact tcatcttcct gctcagcatg 2220 gccgcgcacg ccctcgcgtt tgtggttatc accgttatgg tgctgaggcc ctgccgcccg 2280 cgggcccggg cgccgtccca acatcgagcg cggtacactc ggctggccac ctcccacgcc 2340 tgagccttcg cccatccaaa acgcgatgcg tgggaggggg aattccccat cctgtctact 2400 taagacggca gccgccaaac cgctacccag agaacgcctc gcccaccgag tagcggttct 2460 ccgactcgat agcgcttctt ccgatccatc ggtgcccgcc cccgctcatc cgccatgcgg 2520 tcccttctgt tcgtcgtcgg cgcgtgggtg gccgctgcgg tgacccacct 2570
【００３７】 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic Acid for amplifying monkey B virus <400> 10 acctcacgta cgactccgac t 21
【００３８】 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic Acid for amplifying monkey B virus <400> 11 ctgcaggacc gagtagagga t 21
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:93） Ｃ１２Ｒ 1:93） (72)発明者 植田 昌宏 東京都立川市曙町二丁目41番19号 株式会 社エスアールエル内 Ｆターム(参考） 4B024 AA14 CA01 4B063 QA01 QA18 QA19 QQ02 QQ03 QQ10 QQ42 QR08 QR32 QR39 QR62 QS25 QX01
Claims (17)
- 【請求項１】 配列表の配列番号１に示す塩基配列の連
続する少なくとも１５塩基から成る核酸又は該核酸を構
成する塩基の１０％以下の数の塩基が置換若しくは欠失
し又は付加された塩基配列を有する核酸であって、ＰＣ
Ｒのプライマーとして用いた場合にサルＢウイルスＤＮ
Ａを増幅可能な核酸から成る、サルＢウイルス測定用フ
ォワード側プライマー。 - 【請求項２】 配列番号１に示される塩基配列の11nt〜
31ntの範囲内の連続する少なくとも１５塩基を含む請求
項１記載のプライマー。 - 【請求項３】 配列表の配列番号２に示される塩基配列
を有する２１塩基の核酸から成る請求項２記載のプライ
マー。 - 【請求項４】 配列表の配列番号３に示す塩基配列の連
続する少なくとも１５塩基から成る核酸又は該核酸を構
成する塩基の１０％以下の数の塩基が置換若しくは欠失
し又は付加された塩基配列を有する核酸であって、ＰＣ
Ｒのプライマーとして用いた場合にサルＢウイルスＤＮ
Ａを増幅可能な核酸から成る、サルＢウイルス測定用リ
バース側プライマー。 - 【請求項５】 配列番号３に示される塩基配列の11nt〜
28ntの範囲内の連続する少なくとも１５塩基を含む請求
項２記載のプライマー。 - 【請求項６】 配列表の配列番号４に示される塩基配列
を有する１８塩基の核酸から成る請求項５記載のプライ
マー。 - 【請求項７】 配列表の配列番号５に示す塩基配列の連
続する少なくとも１５塩基から成る核酸又は該核酸を構
成する塩基の１０％以下の数の塩基が置換若しくは欠失
し又は付加された塩基配列を有する核酸であって、ＰＣ
Ｒのプライマーとして用いた場合にサルＢウイルスＤＮ
Ａを増幅可能な核酸から成る、サルＢウイルス測定用フ
ォワード側プライマー。 - 【請求項８】 配列番号５に示される塩基配列の11nt〜
30ntの範囲内の連続する少なくとも１５塩基を含む請求
項７記載のプライマー。 - 【請求項９】 配列表の配列番号６に示される塩基配列
を有する２０塩基の核酸から成る請求項８記載のプライ
マー。 - 【請求項１０】 配列表の配列番号７に示す塩基配列の
連続する少なくとも１５塩基から成る核酸又は該核酸を
構成する塩基の１０％以下の数の塩基が置換若しくは欠
失し又は付加された塩基配列を有する核酸であって、Ｐ
ＣＲのプライマーとして用いた場合にサルＢウイルスＤ
ＮＡを増幅可能な核酸から成る、サルＢウイルス測定用
リバース側プライマー。 - 【請求項１１】 配列番号７に示される塩基配列の11nt
〜28ntの範囲内の連続する少なくとも１５塩基を含む請
求項１０記載のプライマー。 - 【請求項１２】 配列表の配列番号８に示される塩基配
列を有する１８塩基の核酸から成る請求項５記載のプラ
イマー。 - 【請求項１３】 請求項１ないし３のいずれか１項に記
載のフォワード側プライマーと、請求項４ないし６のい
ずれか１項に記載のリバース側プライマーを用いて、ベ
タインの存在下で被検試料についてＰＣＲを行い、増幅
産物を測定することから成る、サルＢウイルスの測定方
法。 - 【請求項１４】 フォワード側プライマーが請求項３記
載のプライマーであり、リバース側プライマーが請求項
６記載のプライマーである請求項１３記載の方法。 - 【請求項１５】 請求項７ないし９のいずれか１項に記
載のフォワード側プライマーと、請求項１０ないし１２
のいずれか１項に記載のリバース側プライマーを用い
て、ベタインの存在下で被検試料についてＰＣＲを行
い、増幅産物を測定することから成る、サルＢウイルス
の測定方法。 - 【請求項１６】 フォワード側プライマーが請求項９記
載のプライマーであり、リバース側プライマーが請求項
１２記載のプライマーである請求項１５記載の方法。 - 【請求項１７】 ＰＣＲ反応液中のベタインの濃度が0.
5〜2.0Mである請求項１３ないし１６のいずれか１項に
記載の方法。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114085931A (zh) * | 2022-01-24 | 2022-02-25 | 中国水产科学研究院黄海水产研究所 | 检测鲍疱疹病毒的引物组及其在构建病毒检测方法和试剂盒中的应用 |
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2000
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