JP4083370B2 - サルbウイルスの測定方法及びそれに用いられるプライマー - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、サルBウイルス(Herpesvirus simiae)(以下、「BV」と言うことがある)の特異的な測定方法及びそれに用いられるプライマーセットに関する。
【0002】
【従来の技術】
BVは、ヒト単純ヘルペスウイルス(HSVタイプ1(HSV-1)及びタイプ2(HSV-2))と同様、アルファヘルペスウイルス亜科に属するウイルスである。このウイルスは、マカク猿における一般的な病原体である。BVがサルに感染しても通常、無徴候であるが、ヒトに感染すると、感染直後に適切な医療処置がとられない限り、高い死亡率でヒトに死をもたらす。従って、BV感染を正確かつ迅速に診断することは、BV−陽性サル又は組織に接触する可能性がある研究者や動物世話係の人々の安全にとって極めて重要である。
【0003】
従来より、BV感染の確定診断は、スワブ培養により行われている。しかしながら、スワブ培養には2〜3日かかり、また、物理的封じ込めレベル4の施設が必要である。一方、各種ウイルスDNAの診断に、迅速かつ安全なPCRが用いられるようになり、BVの診断にもPCRを用いることが提案されている(Black, D.H. et al., 1997, J. Vet. diagn. Invest. 9:225-231; Scinicariello, F. et al., J. Infect. Dis. 168:747-750; Scinicariello, F. et al., 1993, Lancet 341:1660-1661; Slomka, M.J. et al., 1993, Arch. Virol. 131:89-99)。
【0004】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、PCRを用いたこれらの公知方法のうち、Slomka, M.J. et al., 1993, Arch. Virol. 131:89-99に記載された方法は、ヒトに対して最も多くの死をもたらしているアカゲザル由来のウイルスを検出することができない。また、他の方法では、BVの遺伝子と塩基配列が類似しているHSVの遺伝子も増幅されてしまい、増幅産物がBV由来かHSV由来かを調べるために、増幅産物をさらに制限酵素で処理してその切断パターンを調べる(RFLP)か、又は放射標識プローブを用いたサザンハイブリダイゼーションを行わなければならず、そのための手間と時間がかかっていた。もし、PCRにより、BV由来の核酸のみが増幅され、HSV由来の核酸が増幅されなければ、増幅後のRFLPやサザン法を行う必要がなくなり、より迅速な診断が可能となり、有利である。
【0005】
従って、本発明の目的は、BV由来の核酸は増幅されるがHSV由来の核酸は増幅されない、PCRにより検体中のBVを測定する方法及びそれに用いられるプライマーを提供することである。
【0006】
【課題を解決するための手段】
本願発明者らは、BVの糖タンパクG(glycoprotein G)遺伝子(以下、「BVgG」と言うことがある)が、対応するHSV遺伝子との相同性が比較的低いことに気付き、この遺伝子中の適切な領域とハイブリダイズするプライマーを用いてPCRを行うことにより上記本発明の目的を達成できるのではないかと考えた。しかし、通常の条件でPCRを行うと、増幅が起きなかった。これは、BVgG遺伝子中のシトシンとグアニンの含量が多いため、セルフライゲーションが起きて増幅が進まないためと考えられた。そこで、シトシンとグアニンの含量が多い核酸のPCRによる増幅に用いることが知られている、ベタインの存在下にPCRを行ったところ増幅が起きた。そして、被検試料中にBVとHSVの両者が共存する場合であっても、BVgG中の領域は増幅されるが、HSV遺伝子中の領域は増幅されないようにすることが可能なプライマー領域の組合せを見出し、これを実験的に確認して本願発明を完成した。
【0007】
すなわち、本発明は、配列表の配列番号2に示される塩基配列を有する21塩基の核酸から成るサルBウイルス測定用の第1のフォワード側プライマーと、配列表の配列番号4に示される塩基配列を有する18塩基の核酸から成るサルBウイルス測定用の第1のリバース側プライマーとから成る、サルBウイルス測定用の第1のプライマーセットを提供する。さらに、本発明は、配列表の配列番号6に示される塩基配列を有する20塩基の核酸から成るサルBウイルス測定用の第2のフォワード側プライマーと、配列表の配列番号8に示される塩基配列を有する18塩基の核酸から成るサルBウイルス測定用の第2のリバース側プライマーとから成る、サルBウイルス測定用の第2のプライマーセットを提供する。さらに、本発明は、上記第1又は第2のプライマーセットを用いて、ベタインの存在下で被検試料についてPCRを行い、増幅産物を測定することから成る、サルBウイルスの測定方法を提供する。
【0008】
【発明の実施の形態】
本発明で用いられる第1のフォワード側プライマーは、配列表の配列番号2に示す塩基配列を有する21塩基から成る核酸であり、下記実施例では、該核酸(プライマーgGS4)を用いている。配列番号1に示す塩基配列は、配列番号9に示すBVgGの塩基配列(Slomka, M.J. et al., J. Gen. Virol. 76(Pt)), 2161-2168(1995); DDBJ Accession No. AB032191)の1063番目のヌクレオチド(本明細書において、「1063nt」と記載する。他のヌクレオチドの位置も同様な方法で記載する)〜1103ntの領域に相当し、プライマーgGS4は、1073nt〜1093ntの領域に相当する。
【0009】
本発明で用いられる第1のリバース側プライマーは、配列表の配列番号4に示す塩基配列を有する18塩基から成る核酸であり、下記実施例では、該核酸(プライマーgGAS4)を用いている。配列番号3に示す塩基配列は、配列番号9に示すBVgGの塩基配列の1254nt〜1291ntの領域に相補的であり、プライマーgGAS4は、1264nt〜1281ntの領域に相補的である。
【0010】
本発明で用いられる第2のフォワード側プライマーは、配列表の配列番号6に示す塩基配列を有する20塩基から成る核酸であり、下記実施例では、該核酸(プライマーgGS5)を用いている。配列番号5に示す塩基配列は、配列番号9に示すBVgGの塩基配列の1330nt〜1369ntの領域に相当し、プライマーgGS5は、1340nt〜1359ntの領域に相当する。
【0011】
本発明で用いられる第2のリバース側プライマーは、配列表の配列番号8に示す塩基配列を有する18塩基から成る核酸であり、下記実施例では、該核酸(プライマーgGAS5)を用いている。配列番号7に示す塩基配列は、配列番号9に示すBVgGの塩基配列の1503nt〜1540ntの領域に相補的であり、プライマーgGAS5は、1513nt〜1530ntの領域に相補的である。
【0012】
上記したプライマーは、市販のDNA合成装置等を用いて容易に化学合成することができる。
【0013】
本発明のBVの測定方法では、上記第1のフォワード側プライマーと、上記第1のリバース側プライマーとから成る第1のプライマーセットを用いて、ベタインの存在下で被検試料についてPCRを行う。あるいは、上記第2のフォワード側プライマーと、上記第2のリバース側プライマーとから成る第2のプライマーセットを用いて、ベタインの存在下で被検試料についてPCRを行う。ここで、ベタインとは、1-カルボキシ-N,N,N-トリメチルメタンアンモニウム分子内塩を意味する。PCR反応液中のベタイン濃度は0.5M〜2.0Mが好ましく、さらに好ましくは0.8M〜1.8Mであり、さらに好ましくは1.3M〜1.7Mである。ベタイン濃度が0.5M未満の場合には、測定可能な程度に増幅が起きにくく、2.0Mを超える場合にも感度が低下する。反応溶液がベタインを含むこと以外は、常法によりPCRを行うことができる。PCRの方法自体は周知であり、そのための試薬キット及び装置が市販されているので、それらを用いて容易に行うことができる。なお、PCRの条件の一例が下記実施例に詳細に記載されている。
【0014】
被検試料としては、BVを含むか否かを知りたいいずれのものであってもよく、血液等の体液を挙げることができる。血液からのDNAの抽出は、常法により行うことができる。
【0015】
PCRによる増幅後、増幅産物を測定する。これは、増幅産物を電気泳動にかけ、エチジウムブロミド等で染色して増幅バンドを検出する常法により容易に行うことができる。また、検出される増幅バンドの強度に基づき、被検試料中のBVウイルス量を半定量することも可能である。さらに、増幅産物にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであって、レポーター蛍光色素とクエンチャー蛍光色素が結合されたプローブの存在下にPCRを行う、いわゆるリアルタイムPCRに行えば、増幅産物を定量することができる。従って、本明細書で言う、ウイルスの「測定」には、定性的な検出の他、上記のような半定量的又は定量的な検出も包含される。
【0016】
上記の方法により、例えば、下記実施例の方法のように、第1のフォワード側プライマーであるプライマーgGS4と第1のリバース側プライマーであるプライマーgGAS4とを用いてPCRを行った場合には、BVgG(配列番号9)の1073nt〜1281ntの209bpの断片が増幅される。また、第2のフォワード側プライマーであるgGS5と第2のリバース側プライマーであるgGAS5とを用いてPCRを行った場合にはBVgGの1340nt〜1530ntの191bpの断片が増幅される。なお、下記実施例において具体的に記載されている通り、BVと類似したゲノミックDNAの塩基配列を有するHSV-1及びHSV-2が被検試料中に存在している場合であっても、本発明の方法によれば、BVのみが増幅され、HSV-1及びHSV-2は増幅されない。
【0017】
【実施例】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【0018】
実施例1
BVのE-2490株を、無血清培地中でコンフルーエントに単層培養されているベロ細胞中で増殖させた。ソラレン存在下で紫外線照射後、ビリオンを回収し、ヨウ化ナトリウム法(Ishizawa, M. et al., 1991, Nucleic Acids Res. 19:5792)によりウイルスDNAを精製した。すなわち、ウイルスタンパク質を4.5Mヨウ化ナトリウムで可溶化し、次いで、ウイルスDNAを、50%イソプロパノール中でグリコーゲンと共に共沈殿させることにより精製した。
【0019】
上記プライマーgGS4とプライマーgGAS4のセット、又はプライマーgGS5とプライマーgGAS5のセットを用いてPCRを行った。Clonetech社製のAdvantage-GCキットを用い、5% DMSO、1μlのBV DNA溶液、及び各0.4μMのフォワード側及びリバース側プライマーを含む50μlのPCR混合物を調製した。なお、ベタイン濃度は0、0.5M、1.0M又は1.5Mとした。なお、この反応溶液1μlは、800 TCID50(50%組織培養感染価)のビリオンから抽出されたBV DNAを含むと見積もられた。PCRは、最初に94℃、5分間の変性工程を行った後、94℃、1分間の変性工程、55℃、1分間のアニーリング工程、72℃、1分間の伸長工程から成るサイクルを35回繰り返し、最後に72℃、7分間の伸長工程を行うことにより行った。PCR産物を5%アクリルアミドゲル電気泳動にかけ、SYBR Green I(Molecular Probes社製)で染色後、波長234nmの紫外線を照射して増幅バンドを可視化した。なお、分子量マーカーとしては、φX174ファージのHaeIII消化物を用いた。
【0020】
その結果、いずれのプライマーセットの場合もベタイン濃度0の時は増幅バンドは全く検出されなかったが、gGS4-gGAS4セットの場合は、ベタイン濃度1.0M及び1.5Mの場合、gGS5-gGAS5セットの場合はベタイン濃度1.5Mの場合に増幅バンドが明瞭に検出された。上記以外の場合は増幅バンドは薄かった。従って、実施例2以降では、ベタイン濃度を1.5Mとした。gGS4-gGAS4セットを用いた場合には、209bpの断片が増幅され、gGS5-gGAS5セットの場合には191bpの増幅バンドが観察された。さらに、これらの増幅バンドを切り出して常法によりDNAを抽出し、その塩基配列を決定したところ、gGS4-gGAS4セットを用いて増幅された断片は、配列番号9の1073nt〜1281ntの塩基配列を有しており、gGS5-gGAS5セットを用いて増幅された断片は配列番号9の1340nt〜1530ntの塩基配列を有していた。従って、上記の方法により、BVgG遺伝子中の意図した領域が増幅されたことが証明された。
【0021】
実施例2
ヒヒHPV2、アフリカミドリザルAS8、HSV-1(HF株)及びHSV-2(UW268株)を常法により増殖させ、ウイルスDNAを実施例1と同様にヨウ化ナトリウム法により精製した。実施例1と同様に、ヒヒHPV2、アフリカミドリザルAS8、あるいは800TCID50のHSV-1又はHSV-2を含むPCR混合溶液を調製し、実施例1と同様にしてPCRを行った。その結果、いずれのプライマーセットを用いた場合にも増幅は起きなかった。
【0022】
偽陰性の可能性を排除するために、プライマーとして、HSV-1及びHSV-2ならびにBVを増幅させることが知られているBV1(配列番号10)及びBV2(配列番号11)(Scinicariello, F. et al., J. Infect. Dis. 168:747-750; Scinicariello, F. et al., 1993, Lancet 341:1660-1661)を用いて上記と同様にPCRを行った。その結果、報告されている通り、128bpの増幅断片が観察された。よって、PCR溶液中にヒヒHPV2、アフリカミドリザルAS8、HSV-1及びHSV-2が含まれていたことが明らかになり、偽陰性の可能性が排除された。
【0023】
さらに、本発明の方法の特異性を証明するために、実施例1のPCR溶液にヒヒHPV2、アフリカミドリザルAS8、あるいは各800 TCID50のHSV-1及びHSV-2とを添加した混合溶液、並びに実施例1のPCR溶液に1000コピーのB型肝炎ウイルスゲノミックDNAを添加した混合溶液について実施例1と同様にしてPCRを行った。
【0024】
その結果、いずれの場合にも、gGS4-gGAS4セットの場合は209bpの断片のみが増幅され、gGS5-gGAS5セットの場合は191bpの断片のみが増幅された。これにより、本発明の方法によれば、被検試料中にヒヒHPV2、アフリカミドリザルAS8、HSV-1若しくはHSV-2又はB型肝炎ウイルスが共存している場合であっても、BVgG遺伝子中の上記領域のみが増幅されることが証明された。
【0025】
実施例3
実施例1で用いたBV試料を10倍低減希釈し、それらについて実施例1と同様にPCRを行った。その結果、10倍希釈の場合、gGS4-gGAS4セットを用いた場合は209bpのバンドが明瞭に増幅バンドが検出され、gGS5-gGAS5セットを用いた場合は191bpの薄い増幅バンドが検出された。100倍希釈の場合には、いずれのプライマーセットを用いても増幅バンドは検出されなかった。このことから、上記方法により、80 TCID50のウイルスDNAは検出可能であるが8 TCID50のウイルスDNAは検出できないことがわかった。この感度は、Scinicariello et al.(上掲)の方法による感度と同程度である。
【0026】
【発明の効果】
本発明により、BVを特異的に、迅速に、かつ、高感度に測定することができる方法及びそのためのプライマーが初めて提供された。本発明の方法によれば、被検試料中にBVが存在する場合にのみ増幅が起き、存在しない場合には増幅が起きないので、増幅が起きたか否かを調べるだけで被検試料中にBVが存在するか否かを知ることができる。特に、BVと各遺伝子の塩基配列が類似しているHSV-1及びHSV-2が被検試料中に共存している場合であっても、BVgG遺伝子中の断片のみが増幅され、HSV-1やHSV-2由来の断片の増幅は起きない。従って、HSV-1又はHSV-2の増幅と区別するためにPCR後にRFLPや、サザン分析を行う必要がなく、迅速かつ簡便に測定を行うことができる。従って、本発明は、ヒトがBVに感染した場合のように、緊急を要する診断に大きな威力を発揮するものと考えられる。
【0027】
【配列表】
【0028】
【0029】
【0030】
【0031】
【0032】
【0033】
【0034】
【0035】
【0036】
【0037】
【0038】
Claims (4)
- 配列表の配列番号2に示される塩基配列を有する21塩基の核酸から成るサルBウイルス測定用フォワード側プライマーと、配列表の配列番号4に示される塩基配列を有する18塩基の核酸から成るサルBウイルス測定用リバース側プライマーとから成る、サルBウイルス測定用プライマーセット。
- 配列表の配列番号6に示される塩基配列を有する20塩基の核酸から成るサルBウイルス測定用フォワード側プライマーと、配列表の配列番号8に示される塩基配列を有する18塩基の核酸から成るサルBウイルス測定用リバース側プライマーとから成る、サルBウイルス測定用プライマーセット。
- 請求項1又は2記載のプライマーセットを用いて、ベタインの存在下で被検試料についてPCRを行い、増幅産物を測定することから成る、サルBウイルスの測定方法。
- PCR反応液中のベタインの濃度が 0.5 〜 2.0M である請求項3記載の方法。
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