JP2001314188A - アシクロビル耐性ウイルスの検出方法 - Google Patents
アシクロビル耐性ウイルスの検出方法Info
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- JP2001314188A JP2001314188A JP2000134528A JP2000134528A JP2001314188A JP 2001314188 A JP2001314188 A JP 2001314188A JP 2000134528 A JP2000134528 A JP 2000134528A JP 2000134528 A JP2000134528 A JP 2000134528A JP 2001314188 A JP2001314188 A JP 2001314188A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 単純ヘルペスウイルス（HSV）、水痘帯状疱
疹ウイルス（VZV）について、アシクロビル耐性ウイル
スの検出方法を提供する。 【解決手段】 本発明では、ウイルスのチミジンキナー
ゼ遺伝子の上流側にプライマーと蛋白質発現用プロモー
ター遺伝子とを結合させ、チミジンキナーゼ遺伝子を増
幅するとともにチミジンキナーゼを産生させ、得られた
チミジンキナーゼを測定してアシクロビル耐性ウイルス
を検出することができる。従って、HSV、ＶZV等の感染
患者に対する早期治療の開始、ＡＣＶ投与中止による副
作用発現の低減、治療剤の選択等に多大な貢献をする。
疹ウイルス（VZV）について、アシクロビル耐性ウイル
スの検出方法を提供する。 【解決手段】 本発明では、ウイルスのチミジンキナー
ゼ遺伝子の上流側にプライマーと蛋白質発現用プロモー
ター遺伝子とを結合させ、チミジンキナーゼ遺伝子を増
幅するとともにチミジンキナーゼを産生させ、得られた
チミジンキナーゼを測定してアシクロビル耐性ウイルス
を検出することができる。従って、HSV、ＶZV等の感染
患者に対する早期治療の開始、ＡＣＶ投与中止による副
作用発現の低減、治療剤の選択等に多大な貢献をする。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明はウイルスのチミジン
キナーゼ遺伝子の上流側にプライマーと蛋白質発現用プ
ロモーターとを結合させ、チミジンキナーゼ遺伝子を増
幅するとともにチミジンキナーゼ（以下ＴＫという）を
産生させ、得られたＴＫを測定することを特徴とするア
シクロビル耐性ウイルスの検出方法に関する。
キナーゼ遺伝子の上流側にプライマーと蛋白質発現用プ
ロモーターとを結合させ、チミジンキナーゼ遺伝子を増
幅するとともにチミジンキナーゼ（以下ＴＫという）を
産生させ、得られたＴＫを測定することを特徴とするア
シクロビル耐性ウイルスの検出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】アシクロビル（以下ＡＣＶという）は単
純ヘルペスウイルス（HSV）、水痘帯状疱疹ウイルス（V
ZV）等のウイルス感染者への治療剤として用いられてい
るが、これらのウイルスにはＡＣＶでは治療効果を示さ
ないＡＣＶ耐性ウイルスが知られている。
純ヘルペスウイルス（HSV）、水痘帯状疱疹ウイルス（V
ZV）等のウイルス感染者への治療剤として用いられてい
るが、これらのウイルスにはＡＣＶでは治療効果を示さ
ないＡＣＶ耐性ウイルスが知られている。
【０００３】従来、感染ウイルスがＡＣＶ耐性であるか
否かの判定には、Ｖｅｒｏ細胞におけるプラーク減少ア
ッセイ（plaque reduction assay）、色素取り込みアッ
セイ、ＴＫ陰性細胞株を使用するプラークオートラジオ
グラフィー等によって測定が行われていた（J Clin Mic
rob; 1983, 17,122-7, J Infect Dis; 1998, 178,618-
25 等参照）。
否かの判定には、Ｖｅｒｏ細胞におけるプラーク減少ア
ッセイ（plaque reduction assay）、色素取り込みアッ
セイ、ＴＫ陰性細胞株を使用するプラークオートラジオ
グラフィー等によって測定が行われていた（J Clin Mic
rob; 1983, 17,122-7, J Infect Dis; 1998, 178,618-
25 等参照）。
【０００４】また、ＡＣＶは、ウイルスにコードされる
ＴＫによってウイルス治療剤の活性型に変換されるた
め、ＡＣＶ耐性ウイルスではウイルス中のＴＫの活性が
欠損又は低レベルであること、ＴＫの基質特異性が変化
していることなどが報告されている（Lancet; 1987, 2,
1461; J Gen Virol; 1987, 70, 375-82 等）。
ＴＫによってウイルス治療剤の活性型に変換されるた
め、ＡＣＶ耐性ウイルスではウイルス中のＴＫの活性が
欠損又は低レベルであること、ＴＫの基質特異性が変化
していることなどが報告されている（Lancet; 1987, 2,
1461; J Gen Virol; 1987, 70, 375-82 等）。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】従来行われていたＡＣ
Ｖ耐性ウイルスの検出法では、ウイルスの分離培養技術
に熟練を有し、結果を得るまで１ないし２週間必要とす
るために、簡便な検出方法ではなかった。また、ウイル
スが発現するＴＫを遺伝子レベルで測定することができ
るが、測定にはウイルスを分離精製した後、そのウイル
ス遺伝子を増幅して測定するなど、煩雑な操作を必要と
していた。、HSVやVZV感染患者について、感染ウイルス
がＡＣＶ耐性であるか否かの判定は、早期治療の開始、
ACV投与中止による副作用の低減、抗ウイルス剤の選択
等に極めて重要であり、新たな検出法が望まれていた。
Ｖ耐性ウイルスの検出法では、ウイルスの分離培養技術
に熟練を有し、結果を得るまで１ないし２週間必要とす
るために、簡便な検出方法ではなかった。また、ウイル
スが発現するＴＫを遺伝子レベルで測定することができ
るが、測定にはウイルスを分離精製した後、そのウイル
ス遺伝子を増幅して測定するなど、煩雑な操作を必要と
していた。、HSVやVZV感染患者について、感染ウイルス
がＡＣＶ耐性であるか否かの判定は、早期治療の開始、
ACV投与中止による副作用の低減、抗ウイルス剤の選択
等に極めて重要であり、新たな検出法が望まれていた。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者は、鋭意検討の
結果、単純ヘルペスウイルス１型（HSV−１）、単純ヘ
ルペスウイルス２型（HSV−２）、VZV等のウイルスのＴ
Ｋ遺伝子を増幅し、ＴＫを発現させ、このＴＫを測定す
ることによるアシクロビル耐性ウイルスの検出方法を見
出し、本発明を完成した。
結果、単純ヘルペスウイルス１型（HSV−１）、単純ヘ
ルペスウイルス２型（HSV−２）、VZV等のウイルスのＴ
Ｋ遺伝子を増幅し、ＴＫを発現させ、このＴＫを測定す
ることによるアシクロビル耐性ウイルスの検出方法を見
出し、本発明を完成した。
【０００７】以下、本発明を詳細に説明する。ウイルス
のＴＫ遺伝子を増幅するには、ウイルスのＴＫ遺伝子配
列とハイブリダイズするプライマーを作製し、遺伝子増
幅法に従い増幅をすることができる。このプライマーに
はさらに蛋白質発現用プロモーターを結合させることが
好ましい。
のＴＫ遺伝子を増幅するには、ウイルスのＴＫ遺伝子配
列とハイブリダイズするプライマーを作製し、遺伝子増
幅法に従い増幅をすることができる。このプライマーに
はさらに蛋白質発現用プロモーターを結合させることが
好ましい。
【０００８】プライマーは、ＴＫ遺伝子領域とハイブリ
ダイズする配列を周知の方法に従い合成し、用いること
ができる。このプライマーの遺伝子配列や塩基数につい
ては限定されるものではない。これらのプライマーは周
知の方法に従い市販のＤＮＡ合成機（例えば、ＡＢＩ社
製ＤＮＡ合成機）で容易に合成することができる。
ダイズする配列を周知の方法に従い合成し、用いること
ができる。このプライマーの遺伝子配列や塩基数につい
ては限定されるものではない。これらのプライマーは周
知の方法に従い市販のＤＮＡ合成機（例えば、ＡＢＩ社
製ＤＮＡ合成機）で容易に合成することができる。
【０００９】プライマーにはその下流に蛋白質発現用プ
ロモーターを組み込み測定を行うことができる。この蛋
白質発現用プロモーターとしては、例えばＴ７プロモー
ター、ｌａｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｔｒ
ｐプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＬＴＲ、ＳＲα
プロモーター等を挙げることができが、効率よく蛋白質
を発現させるにはＴ７プロモーターを用いることが好ま
しい。これらの蛋白質発現用プロモーターは、容易に入
手可能であり、前記ＤＮＡ合成機により製造することも
できる。
ロモーターを組み込み測定を行うことができる。この蛋
白質発現用プロモーターとしては、例えばＴ７プロモー
ター、ｌａｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｔｒ
ｐプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＬＴＲ、ＳＲα
プロモーター等を挙げることができが、効率よく蛋白質
を発現させるにはＴ７プロモーターを用いることが好ま
しい。これらの蛋白質発現用プロモーターは、容易に入
手可能であり、前記ＤＮＡ合成機により製造することも
できる。
【００１０】前記方法によって得られたプライマーと蛋
白質発現用プロモーターとの結合物は検体中のウイルス
の測定に用いることができる。測定にあっては、この検
体を蛋白質発現用のプロモーターを組み込んだ前記プラ
イマーと混合し、周知のＰＣＲ法等の遺伝子増幅法によ
り目的遺伝子を増幅することができる。ＰＣＲ法により
遺伝子を増幅する方法としては、例えばＪ．サムブロッ
ク等；モレキュラ クローニング第２版（ゴールド ス
プリング ハーバー ラボラトリー）（１９８９）等に
記載されている。測定に用いる検体としては、ウイルス
が存在すると考えられる検体であり、ヒト組織（角膜、
咽頭を含む皮膚、粘膜領域等）、ヒトの体液（血清、血
漿、尿等）等を用いることができる。これらの検体は通
常ウイルスの単離精製などの前処理を行うことなく測定
に用いることができる。
白質発現用プロモーターとの結合物は検体中のウイルス
の測定に用いることができる。測定にあっては、この検
体を蛋白質発現用のプロモーターを組み込んだ前記プラ
イマーと混合し、周知のＰＣＲ法等の遺伝子増幅法によ
り目的遺伝子を増幅することができる。ＰＣＲ法により
遺伝子を増幅する方法としては、例えばＪ．サムブロッ
ク等；モレキュラ クローニング第２版（ゴールド ス
プリング ハーバー ラボラトリー）（１９８９）等に
記載されている。測定に用いる検体としては、ウイルス
が存在すると考えられる検体であり、ヒト組織（角膜、
咽頭を含む皮膚、粘膜領域等）、ヒトの体液（血清、血
漿、尿等）等を用いることができる。これらの検体は通
常ウイルスの単離精製などの前処理を行うことなく測定
に用いることができる。
【００１１】増幅されたＴＫ遺伝子は、ＴＫ遺伝子から
ＴＫを発現させ、そのＴＫ量、ＴＫの酵素活性等を測定
することができる。ＴＫの測定には、例えば、in vitro
translation法によって、直接ＴＫを作製し、このＴＫ
の酵素活性を測定する方法、増幅された遺伝子を蛍光標
識体とともにＴＫを発現させ、蛍光光度を分析する方法
等を挙げることができる。この測定結果より、検体に含
まれていたウイルスのＴＫ活性の欠損、ＴＫの基質特異
性の変異等の測定がなされ、ＡＣＶ耐性ウイルスを検出
することができる。
ＴＫを発現させ、そのＴＫ量、ＴＫの酵素活性等を測定
することができる。ＴＫの測定には、例えば、in vitro
translation法によって、直接ＴＫを作製し、このＴＫ
の酵素活性を測定する方法、増幅された遺伝子を蛍光標
識体とともにＴＫを発現させ、蛍光光度を分析する方法
等を挙げることができる。この測定結果より、検体に含
まれていたウイルスのＴＫ活性の欠損、ＴＫの基質特異
性の変異等の測定がなされ、ＡＣＶ耐性ウイルスを検出
することができる。
【００１２】
【実施例】本発明の測定は以下の方法に従い行うことが
できる。 （プラーク減少アッセイ；従来法）ＡＣＶおよびホスホ
ノ酢酸（ＰＡＡ）に対するウイルスの感受性を Antimic
rob Agents Chemother; 1986, 29, 524-6に記載された
方法に従い、ＨＥＬ細胞における５０％プラーク減少ア
ッセイで測定した。
できる。 （プラーク減少アッセイ；従来法）ＡＣＶおよびホスホ
ノ酢酸（ＰＡＡ）に対するウイルスの感受性を Antimic
rob Agents Chemother; 1986, 29, 524-6に記載された
方法に従い、ＨＥＬ細胞における５０％プラーク減少ア
ッセイで測定した。
【００１３】（PCR法）プライマーセットのT7-HSV1-TK
およびHSV1-TK-Dw、T7-HSV2-TKおよびHSV2-TK-Dw、なら
びにT7-VZV-TKおよびVZV-TK-Dwをそれぞれ使用して、T7
プロモーターの制御下でHSV-1、HSV-2、およびVZVのTK
遺伝子を調製した。配列を図１に示す。また、プライマ
ーとＴ７プロモーターの塩基配列を配列番号１に示す。
PCRをExpand Hi-Fi PCR Sysytem（Roche Molecular Sy
stems）を使用し、100μlの反応混合物で行った。最初
の変性は94℃で２分間であり、続いて変性（94℃で20秒
間）、アニーリング（HSV TK遺伝子について58℃でまた
はVZV TK遺伝子について60℃で、２分間）、および伸長
（72℃で１分20秒間）の10サイクル、次いで変性、アニ
ーリング、および伸長（72℃で１分20秒間＋５秒間／サ
イクル伸長）の20サイクルを行い、最後のサイクル後に
さらに72℃で20分間伸長した。QLAquick PCRPurificati
on Kit（Qiagen、Hilden、Germany）でPCR産物を精製
し、そして30μlの10mM Tris-HCl pH8.5中に溶解し、そ
して-20℃で保存した。
およびHSV1-TK-Dw、T7-HSV2-TKおよびHSV2-TK-Dw、なら
びにT7-VZV-TKおよびVZV-TK-Dwをそれぞれ使用して、T7
プロモーターの制御下でHSV-1、HSV-2、およびVZVのTK
遺伝子を調製した。配列を図１に示す。また、プライマ
ーとＴ７プロモーターの塩基配列を配列番号１に示す。
PCRをExpand Hi-Fi PCR Sysytem（Roche Molecular Sy
stems）を使用し、100μlの反応混合物で行った。最初
の変性は94℃で２分間であり、続いて変性（94℃で20秒
間）、アニーリング（HSV TK遺伝子について58℃でまた
はVZV TK遺伝子について60℃で、２分間）、および伸長
（72℃で１分20秒間）の10サイクル、次いで変性、アニ
ーリング、および伸長（72℃で１分20秒間＋５秒間／サ
イクル伸長）の20サイクルを行い、最後のサイクル後に
さらに72℃で20分間伸長した。QLAquick PCRPurificati
on Kit（Qiagen、Hilden、Germany）でPCR産物を精製
し、そして30μlの10mM Tris-HCl pH8.5中に溶解し、そ
して-20℃で保存した。
【００１４】（インビトロ転写）HSVおよびVZV株のTK蛋
白質を、Single Tube Protein System ３（Novagen、Ma
dison、WI）を使用して、使用法に従いPCRで増幅された
TK遺伝子から直接的に合成した。簡潔には、１μlの10m
M Tris-HCl pH8.5中に溶解された100ngのPCR産物を、４
μlの転写混合物とともに混合し、そして30℃で１５分
間インキュベートした。１μlの転写サンプルを３μlの
翻訳混合物（ウサギ網状赤血球抽出物）および１μlの1
25μMメチオニンまたは８μCi[35S]-メチオニン（＞100
0Ci/mmol；Amersham Pharmacia Biotech Ltd）と混合
し、そして37℃で60分間インキュベートした。
白質を、Single Tube Protein System ３（Novagen、Ma
dison、WI）を使用して、使用法に従いPCRで増幅された
TK遺伝子から直接的に合成した。簡潔には、１μlの10m
M Tris-HCl pH8.5中に溶解された100ngのPCR産物を、４
μlの転写混合物とともに混合し、そして30℃で１５分
間インキュベートした。１μlの転写サンプルを３μlの
翻訳混合物（ウサギ網状赤血球抽出物）および１μlの1
25μMメチオニンまたは８μCi[35S]-メチオニン（＞100
0Ci/mmol；Amersham Pharmacia Biotech Ltd）と混合
し、そして37℃で60分間インキュベートした。
【００１５】（TKの測定）HSV感染された細胞のサンプ
ルを以下のように得た：24ウェル組織培養プレート中の
コンフルエントなHEL細胞の単層を擬似感染するか、ま
たは１の感染効率でHSVで感染した。８時間のインキュ
ベーション後、細胞をトリプシン処理によって採集し、
MEMで１回洗浄し、そして0.2mlの200mM Tris-HCl pH7.4
中に懸濁した。細胞を超音波処理によって破壊し、そし
て10,000×gで10分間４℃での遠心分離の後に上清を回
収した。TK活性を、Antimicrob Agents Chemother; 198
8, 32,1046-52に記載された方法に従って測定した。感
染された細胞から調製されたまたはインビトロ翻訳によ
り調製されたTKサンプルについて、それぞれ、20または
90分間、37℃にて、１または0.1μMチミジン、0.1μCi
[メチル-3H]チミジン（70〜86Ci/mmol）、10mM MgCl2、
10mM ATP、および200mM Tris-HCl（pH7.5）を含有する1
0μlの全容量中で反応混合物をインキュベートした。
ルを以下のように得た：24ウェル組織培養プレート中の
コンフルエントなHEL細胞の単層を擬似感染するか、ま
たは１の感染効率でHSVで感染した。８時間のインキュ
ベーション後、細胞をトリプシン処理によって採集し、
MEMで１回洗浄し、そして0.2mlの200mM Tris-HCl pH7.4
中に懸濁した。細胞を超音波処理によって破壊し、そし
て10,000×gで10分間４℃での遠心分離の後に上清を回
収した。TK活性を、Antimicrob Agents Chemother; 198
8, 32,1046-52に記載された方法に従って測定した。感
染された細胞から調製されたまたはインビトロ翻訳によ
り調製されたTKサンプルについて、それぞれ、20または
90分間、37℃にて、１または0.1μMチミジン、0.1μCi
[メチル-3H]チミジン（70〜86Ci/mmol）、10mM MgCl2、
10mM ATP、および200mM Tris-HCl（pH7.5）を含有する1
0μlの全容量中で反応混合物をインキュベートした。
【００１６】（蛍光光度分析）35S-メチオニンを用いて
インビトロで翻訳されたTKポリぺプチドの分子量を、SD
S-ポリアクリルアミドゲル電気泳動および蛍光光度分析
によって決定した。12％ポリアクリルアミドゲル上での
サンプルの電気泳動後、45％エタノール-10％酢酸溶液
中にゲルを浸漬することによって蛋白質を固定し、次い
で、製造業者の指示に従ってEN3HANCE（NEN Life Scien
ce Products、Boston、MA）で蛍光光度分析についてゲ
ルをプロセスし、乾燥し、そして２日間-80℃にてＸ線
フィルムで露光した。
インビトロで翻訳されたTKポリぺプチドの分子量を、SD
S-ポリアクリルアミドゲル電気泳動および蛍光光度分析
によって決定した。12％ポリアクリルアミドゲル上での
サンプルの電気泳動後、45％エタノール-10％酢酸溶液
中にゲルを浸漬することによって蛋白質を固定し、次い
で、製造業者の指示に従ってEN3HANCE（NEN Life Scien
ce Products、Boston、MA）で蛍光光度分析についてゲ
ルをプロセスし、乾燥し、そして２日間-80℃にてＸ線
フィルムで露光した。
【００１７】（ＨＳＶのTKについての表現型スクリーニ
ング法の設計）PCRおよびインビトロ翻訳に基づく新規
なスクリーニング法を確立するために、T7プロモーター
の制御下でHSV-1、HSV-2、およびVZVのTK遺伝子を増幅
するため図１Ａに示すプライマーセットを設計した。TK
遺伝子の上流についての各プライマーにおいて、T7プロ
モーターおよびTK遺伝子の直ぐ上流の領域のヌクレオチ
ド配列を５'側に６個のさらなるヌクレオチドを伴って
設計した。他方のプライマーを、TK遺伝子のポリAシグ
ナルの下流領域で設定した。
ング法の設計）PCRおよびインビトロ翻訳に基づく新規
なスクリーニング法を確立するために、T7プロモーター
の制御下でHSV-1、HSV-2、およびVZVのTK遺伝子を増幅
するため図１Ａに示すプライマーセットを設計した。TK
遺伝子の上流についての各プライマーにおいて、T7プロ
モーターおよびTK遺伝子の直ぐ上流の領域のヌクレオチ
ド配列を５'側に６個のさらなるヌクレオチドを伴って
設計した。他方のプライマーを、TK遺伝子のポリAシグ
ナルの下流領域で設定した。
【００１８】プライマーの特異性を、前記PCR条件下で
評価した、その結果を図１Ｂに示す。T7-HSV1-TKおよび
HSV1-TK-Dw（レーン１〜４）、またはT7-HSV2-TKおよび
HSV1-TK-Dw（レーン９〜12）を使用するPCRを用いて、H
SV-1 DNAから1273bpの特異的なDNAフラグメントが観察
され、HSV-2 DNAからフラグメントは検出されず、この
ことはHSV1-TK-DwがHSV-1に型特異的であるが、T7-HSV2
-TKはHSV-2に特異的でないことを示す。DNAフラグメン
トを、T7-HSV1-TKおよびHSV2-TK-Dw（レーン５〜８）、
ならびにT7-HSV2-TKおよびHSV2-TK-Dw（レーン13〜16）
のセットによりHSV-1およびHSV-2 DNAの両方から増幅し
たが、T7-HSV1及びHSV2-TK-DwがHSV DNAの両方の型をハ
イブリダイズすることを示す。HSV-1ゲノムにおけるHSV
2-TK-Dwのハイブリダイゼーション部位を、PCR産物のヌ
クレオチド配列の解析によって同定し、そして領域５'
−GTacGAcAgaGTGCCAGCCCT（HSV-1ゲノムのヌクレオチド
46,560〜46,539；大文字はプライマーに同一なヌクレオ
チドを示す）においてであった。
評価した、その結果を図１Ｂに示す。T7-HSV1-TKおよび
HSV1-TK-Dw（レーン１〜４）、またはT7-HSV2-TKおよび
HSV1-TK-Dw（レーン９〜12）を使用するPCRを用いて、H
SV-1 DNAから1273bpの特異的なDNAフラグメントが観察
され、HSV-2 DNAからフラグメントは検出されず、この
ことはHSV1-TK-DwがHSV-1に型特異的であるが、T7-HSV2
-TKはHSV-2に特異的でないことを示す。DNAフラグメン
トを、T7-HSV1-TKおよびHSV2-TK-Dw（レーン５〜８）、
ならびにT7-HSV2-TKおよびHSV2-TK-Dw（レーン13〜16）
のセットによりHSV-1およびHSV-2 DNAの両方から増幅し
たが、T7-HSV1及びHSV2-TK-DwがHSV DNAの両方の型をハ
イブリダイズすることを示す。HSV-1ゲノムにおけるHSV
2-TK-Dwのハイブリダイゼーション部位を、PCR産物のヌ
クレオチド配列の解析によって同定し、そして領域５'
−GTacGAcAgaGTGCCAGCCCT（HSV-1ゲノムのヌクレオチド
46,560〜46,539；大文字はプライマーに同一なヌクレオ
チドを示す）においてであった。
【００１９】T7-VZV-TKおよびVZV-TK Dwのプライマーセ
ットは、VZV DNAサンプル（レーン17、18）からVZV TK
遺伝子を特異的に増幅したが、HSV-1 DNA（レーン19）
からは増幅しなかった。それゆえ、VZV TK遺伝子のプラ
イマーセットはVZV TK遺伝子に特異的である。上記され
るHSV TK遺伝子についてのT7-HSV2-TKおよびHSV2-TK-Dw
の共通のプライマーセットは、VZV DNAからTK遺伝子を
増幅し得なかった（レーン20）。
ットは、VZV DNAサンプル（レーン17、18）からVZV TK
遺伝子を特異的に増幅したが、HSV-1 DNA（レーン19）
からは増幅しなかった。それゆえ、VZV TK遺伝子のプラ
イマーセットはVZV TK遺伝子に特異的である。上記され
るHSV TK遺伝子についてのT7-HSV2-TKおよびHSV2-TK-Dw
の共通のプライマーセットは、VZV DNAからTK遺伝子を
増幅し得なかった（レーン20）。
【００２０】TK遺伝子のPCR産物についてのインビトロ
転写および翻訳の条件を、TK活性によって評価した。そ
の結果を図２に示す。コントロール反応において、ウサ
ギ網状赤血球由来の低いＴＫ活性が検出された。ウイル
スTK活性は、最終的な５μlの転写混合物中に５ngのPCR
産物を添加した場合であっても発現され、そして最も高
い活性が、60〜80ngのPCR産物の添加により発現され
た。しかし、実質的に有意な差異が、20〜100ngのDNAの
添加により発現されるTK活性において観察され、このこ
とは系が適用されるDNAの厳密に定量された量を必要と
しないことを示している。
転写および翻訳の条件を、TK活性によって評価した。そ
の結果を図２に示す。コントロール反応において、ウサ
ギ網状赤血球由来の低いＴＫ活性が検出された。ウイル
スTK活性は、最終的な５μlの転写混合物中に５ngのPCR
産物を添加した場合であっても発現され、そして最も高
い活性が、60〜80ngのPCR産物の添加により発現され
た。しかし、実質的に有意な差異が、20〜100ngのDNAの
添加により発現されるTK活性において観察され、このこ
とは系が適用されるDNAの厳密に定量された量を必要と
しないことを示している。
【００２１】（測定結果）図３に示すHSV-1 １５株（野
生型８株、耐性株７株）、HSV-2 １１株（野生型３
株、耐性株８株）およびVZV ２株（野生型１株、耐性
株１株）を前記方法によって分析した。これらの実験に
おいて使用された株を詳細に特徴付けし、表１から３に
まとめた。
生型８株、耐性株７株）、HSV-2 １１株（野生型３
株、耐性株８株）およびVZV ２株（野生型１株、耐性
株１株）を前記方法によって分析した。これらの実験に
おいて使用された株を詳細に特徴付けし、表１から３に
まとめた。
【００２２】
【表１】
【００２３】
【表２】
【００２４】
【表３】
【００２５】HSV-1 TK遺伝子の野生型は、43kDaの大部
分の蛋白質、ならびに39および38kDaの２つの少数蛋白
質を発現し、少数の蛋白質は、前記されるように第２お
よび第３のAUGコドンでの翻訳開始から生じ得る（図３
Ａ）。より小さなまたはより大きな（TAR株；表１）蛋
白質をコードする変異体TK遺伝子（ＴＫ（−））は、予
測される蛋白質の大きさを発現した。野生型HSV-1 TKを
発現する混合物において、コントロール混合物と比較し
て６〜14倍増強されたTK活性が検出されたが、変異体TK
を発現する混合物においては、変化された基質特異性を
伴うTK蛋白質（ＴＫ（Ａ））（SC16 S1株；レーン６）
においてであっても、増加は検出されなかった。類似の
結果が、以下のようないくつかの差異を除いてHSV-2お
よびVZV TKにおいて観察された（図３Ｂおよび３Ｃ）。 １）VZV TK遺伝子はVirus Genes; 1990, 4, 105-20に記
載されるように、２つの蛋白質（ 35および34kDa）
を発現したが、HSV-2 TK遺伝子は43kDa蛋白質１つのみ
を発現した 。 ２）HSV-2およびVZV TK遺伝子から発現されるTK活性
は、HSV-1 TK遺伝子から発現される 活性よりも低か
った。 ３）TK活性は、HSV-1 TKと同様に、TK（A）を発現する
混合物（8708および43659株；図 ３Ｂレーン５およ
び11）において検出されなかった。本発明の実施例で
は、野生型または変異体としてHSVおよびVZV株において
コードされるTK蛋白質の分子量および酵素活性を同定す
ることができた。
分の蛋白質、ならびに39および38kDaの２つの少数蛋白
質を発現し、少数の蛋白質は、前記されるように第２お
よび第３のAUGコドンでの翻訳開始から生じ得る（図３
Ａ）。より小さなまたはより大きな（TAR株；表１）蛋
白質をコードする変異体TK遺伝子（ＴＫ（−））は、予
測される蛋白質の大きさを発現した。野生型HSV-1 TKを
発現する混合物において、コントロール混合物と比較し
て６〜14倍増強されたTK活性が検出されたが、変異体TK
を発現する混合物においては、変化された基質特異性を
伴うTK蛋白質（ＴＫ（Ａ））（SC16 S1株；レーン６）
においてであっても、増加は検出されなかった。類似の
結果が、以下のようないくつかの差異を除いてHSV-2お
よびVZV TKにおいて観察された（図３Ｂおよび３Ｃ）。 １）VZV TK遺伝子はVirus Genes; 1990, 4, 105-20に記
載されるように、２つの蛋白質（ 35および34kDa）
を発現したが、HSV-2 TK遺伝子は43kDa蛋白質１つのみ
を発現した 。 ２）HSV-2およびVZV TK遺伝子から発現されるTK活性
は、HSV-1 TK遺伝子から発現される 活性よりも低か
った。 ３）TK活性は、HSV-1 TKと同様に、TK（A）を発現する
混合物（8708および43659株；図 ３Ｂレーン５およ
び11）において検出されなかった。本発明の実施例で
は、野生型または変異体としてHSVおよびVZV株において
コードされるTK蛋白質の分子量および酵素活性を同定す
ることができた。
【発明の効果】本発明はＨＳＶ、ＶＺＶ等の感染患者の
ウイルスがＡＣＶ耐性か否かを２日間で検出することが
でき、早期治療の開始、ＡＣＶ投与中止による副作用発
現の低減、治療剤の選択等に多大な貢献をする。また、
本発明の方法は、検体よりウイルスの単離を行うことな
く実施することもできるために、煩雑な分離手段や熟練
を要することなく、実施することができる。
ウイルスがＡＣＶ耐性か否かを２日間で検出することが
でき、早期治療の開始、ＡＣＶ投与中止による副作用発
現の低減、治療剤の選択等に多大な貢献をする。また、
本発明の方法は、検体よりウイルスの単離を行うことな
く実施することもできるために、煩雑な分離手段や熟練
を要することなく、実施することができる。
【００２６】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> FUJIREBIO INC. <120> Detection method OF ACYCLOVIR-RESISTANT VIRUSES <130> P0750 <160> １
【００２７】 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> oligonucleotide primer and T7 promoter for amplifying nucleic acid <400> 1 gaattgtaat acgactcact ata 23
【図１】 ＰＣＲ法におけるＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２お
よびＶＺＶのTK遺伝子のプライマー配列とプライマーの
特異性を示す図である。
よびＶＺＶのTK遺伝子のプライマー配列とプライマーの
特異性を示す図である。
【図２】 ＴＫ遺伝子のＰＣＲ生成物についてのインビ
トロ転写および翻訳の条件をＴＫ活性により評価した図
である。測定値は、３回測定による平均値±ＳＤで示し
た。
トロ転写および翻訳の条件をＴＫ活性により評価した図
である。測定値は、３回測定による平均値±ＳＤで示し
た。
【図３】 インビトロで、ＰＣＲ生成物の大きさ、転写
されたＴＫ蛋白質の大きさと活性を測定した図である。
図中ＣはウイルスＤＮＡのないコントロール反応の測定
結果である。
されたＴＫ蛋白質の大きさと活性を測定した図である。
図中ＣはウイルスＤＮＡのないコントロール反応の測定
結果である。
Claims (3)
- 【請求項１】 ウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子の上
流側にプライマーと蛋白質発現用プロモーターとを結合
させ、チミジンキナーゼ遺伝子を増幅するとともにチミ
ジンキナーゼを産生させ、得られたチミジンキナーゼを
測定することを特徴とするアシクロビル耐性ウイルスの
検出方法。 - 【請求項２】 ウイルスが単純ヘルペスウイルス１型
（HSV−１）、単純ヘルペスウイルス２型（HSV−２）又
は水痘帯状疱疹ウイルス（VZV）である請求項１記載の
方法。 - 【請求項３】 蛋白質発現用プロモーターがＴ７プロモ
ーター、ｌａｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｔ
ｒｐプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＬＴＲ又はＲ
αプロモーターである請求項１又は２に記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000134528A JP2001314188A (ja) | 2000-05-08 | 2000-05-08 | アシクロビル耐性ウイルスの検出方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000134528A JP2001314188A (ja) | 2000-05-08 | 2000-05-08 | アシクロビル耐性ウイルスの検出方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001314188A true JP2001314188A (ja) | 2001-11-13 |
Family
ID=18642791
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000134528A Pending JP2001314188A (ja) | 2000-05-08 | 2000-05-08 | アシクロビル耐性ウイルスの検出方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2001314188A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110702669A (zh) * | 2019-09-19 | 2020-01-17 | 湖北科益药业股份有限公司 | 一种快速阿昔洛韦凝胶含量测定的方法 |
-
2000
- 2000-05-08 JP JP2000134528A patent/JP2001314188A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110702669A (zh) * | 2019-09-19 | 2020-01-17 | 湖北科益药业股份有限公司 | 一种快速阿昔洛韦凝胶含量测定的方法 |
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| A711 | Notification of change in applicant |
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