JP2001309736A - トランスジェニック動物の作製方法、トランスジェニック動物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 効率の良い、新規な形質転換動物の作製方法
を開発する。 【解決手段】 本発明により、動物の精巣内精子形成
細胞に外来遺伝子を導入し、マーカー遺伝子を指標とし
て遺伝子が導入された精母細胞、精子細胞又は精子を選
択し、未受精卵と受精させる事を特徴とする、新規の形
質転換動物の作製方法が与えられた。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新規な形質転換動
物の作製方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】これまで、哺乳動物個体に外来遺伝子を
導入する方法として最も広く用いられているのは受精卵
前核中へのＤＮＡ顕微注入である。この方法は、家畜を
含む多くの動物種に用いられており、比較的確実な方法
である。

【０００３】しかし、この方法の遺伝子導入率は低く、
一般的に、顕微操作受精卵のうち約１％の確率で遺伝子
導入動物が得られる。この様に導入率が低いことから、
ＤＮＡ顕微注入を大型動物に適用する場合には、非常に
大きなコストが必要となる。また、染色体上での外来遺
伝子の組み換え場所を制御する事はできず、ランダムに
近い。

【０００４】また、精子をＤＮＡで処理して受精させる
ことによる遺伝子導入方法は、安定性・信頼性が低かっ
たが、最近になってハワイ大学の柳町教授のグループか
ら発表された結果は注目されている。即ち、マウスにお
いて凍結精子とＤＮＡとを混ぜた後に卵子細胞内注入法
によって顕微受精を行うことにより、高い率で遺伝子導
入マウスが得られた。その方法を現在他のマウス系統や
他動物種でも適用可能かどうか検討されているが、まだ
適用範囲は不明である。また染色体上の挿入場所は前核
注入法と同じく制御できない。

【０００５】染色体上の標的遺伝子を外来ベクターを置
き換えることによって、遺伝子破壊などを行える標的遺
伝子組み換え（遺伝子ターゲッティング）は、内在遺伝
子と相同部分を持つベクターを導入して、相同遺伝子組
み換えを起こした物を選別することによって可能であ
る。現在は、胚幹細胞（ＥＳ細胞）株において遺伝子導
入と選別を行った後、生殖系列に寄与したキメラマウス
を作り交配することによって標的遺伝子改変マウス個体
が作られている。

【０００６】この方法の効率は低く、時間とコストの両
面で大きな投資が必要である。また遺伝子ターゲッティ
ングに用いることができるＥＳ細胞株は、現在のところ
数種類のマウス系統でのみ存在する。それが存在しない
家畜などで現在試みられているのが、体細胞株において
相同遺伝子組み換えを起こさせた後に、除核卵子への核
移植による動物クローニングを行って標的遺伝子組み換
え動物を作る方法であるが、その成功率などについては
不明である。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】そこで、本発明の課題
は低コストで効率の高い形質転換動物の作出方法を開発
することである。また、家畜等の形質転換に用いる事を
考えると、大型の動物に適用できる事も求められる。

【０００８】

【課題を解決するための手段】上記の方法と比較して、
精巣内に存在する精子形成細胞への遺伝子導入は、生殖
細胞への直接的遺伝子導入であるので、高い効率で形質
転換動物の作出が実現できる可能性がある。そこで本発
明者らは、精巣内精細管へＤＮＡを注入した後、電気パ
ルス附加を行うなどの比較的簡便で短時間で実行可能な
手段により、精子形成細胞への遺伝子導入を行うという
方法に注目した。そして、遺伝子が導入された精母細
胞、精子細胞及び精子を選別し、卵母細胞と体外受精を
行い、遺伝子が導入されたマウスを作出する方法を開発
した。

【０００９】尚、山崎らは、組織化学染色によって検出
できるＬａｃＺマーカー遺伝子をマウス精巣に注入し、
電気パルス附加を行った２カ月後においても少数ながら
マーカー遺伝子を発現する精子形成細胞の集団が精巣内
に存在していた、という結果を報告している（Ｙａｍａ
ｚａｋｉ ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｒｅ
ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，５９，１４３９−１４４４（１
９９８））。しかし、外来遺伝子の染色体への組み込み
を確認することや、遺伝子導入マウス個体の作出は行っ
ていない。

【００１０】

【発明の実施の形態】本発明者らは、外来遺伝子を生殖
細胞の減数分裂の前段階又は最中に挿入する事を試み
た。その手段としては、マウス精巣中の精原細胞又は精
母細胞への電気穿孔法を用いた。卵細胞内精子注入法に
よるインビトロ受精に用いる、遺伝子導入された精母細
胞、精子細胞又は精子を検出して選択するために、本発
明者らはＧｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏ
ｔｅｉｎ（ＧＦＰ）マーカー遺伝子及びＹｅｌｌｏｗ
Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＹＦＰ）マ
ーカー遺伝子等の蛍光蛋白質の遺伝子を用いた。

【００１１】本発明者らは、１４日齢のマウスの精巣の
精細管にＤＮＡを注入し、電気穿孔法のパラメーターの
最適化を行った。そして、生殖細胞において広範囲に発
現しているＧＦＰ／ＹＦＰの蛍光は、最大１週間まで安
定であった。一週間以上経過すると、蛍光を有する細胞
は減少した。

【００１２】遺伝子導入の１８−２０日後に、精細管に
おいて蛍光を発現する精子のクラスターを得た。その様
な精子を、卵細胞内精子注入法に使用した結果、体全体
に蛍光を有する胎児及び子を得た。サザンブロッティン
グ解析の結果、その様な蛍光を有する個体において、染
色体に遺伝子が導入されている事が示された。本方法に
おいて、得られた個体の８分の７以上が形質転換してお
り、体全体にマーカー遺伝子を発現している事が見られ
た。それは、形質転換が非常に高い頻度で起こってお
り、遺伝子導入は精子形成細胞において既に起こってい
ることを示している。

【００１３】本発明の方法では、パキテン期の第一次精
母細胞までの、精子形成細胞しか含まれていないマウス
を用いている。すなわち、減数分裂の初期において、生
殖細胞へ外来ベクターを導入するという新たな遺伝子導
入方法である。それは、相同染色体の間で相同遺伝子組
み換えが頻繁に起こる時期であり、高い確率で標的遺伝
子組み換えが起こる可能性が大きい。上述した山崎らの
論文は、４週齢から６週齢のマウスを用いているが、そ
れと比較して幼若マウスを用いる本発明の方法において
は、遺伝子導入の効率が増加している。

【００１４】この様な形質転換方法は、蛍光マーカー遺
伝子と結合させることにより、他の遺伝子を導入するた
めにも用いる事ができる。この電気穿孔法は非常に簡単
であり、大型家畜を含む種々の動物に用いることができ
る。本発明は、生殖細胞に外来遺伝子を直接導入する方
法を開くものである。この哺乳動物の形質転換の代替え
方法は、種々の新たな可能性を開く、有用な方法を切り
開くものである。

【００１５】本発明の方法は、実験動物及び家畜におけ
る、形質転換と遺伝子ターゲッティングの、効率の良い
方法となり得る。後者の可能性は、病気に関係する原因
遺伝子を破壊する事により、ヒトの病態モデルを作成す
るのに重要である。さらに、主要組織適合性遺伝子を入
れ換えることにより、器官及び組織移植のためのドナー
動物を開発するためにも重要である。

【００１６】本発明の特徴として、以下の点が挙げられ
る。 （１）生きたままで遺伝子発現が確認できるマーカー遺
伝子を用いることにより、遺伝子が組み込まれた精子
を、蛍光観察で選別する事が可能である。 （２）精巣へ遺伝子導入されたオスマウスを交配させる
のではなく、遺伝子が組み込まれている精子を用いた体
外受精を行うことにより、遺伝子導入個体を非常に高率
で作成することに、はじめて成功した。マーカー蛋白質
により、遺伝子が組み込まれた生殖細胞を生きたまま選
抜する事が可能であり、このために高い確率で形質転換
動物を作出できる。 （３）精子形成過程がまだ初期の段階にある子供マウス
の精巣を選んで遺伝子導入を行った。 （４）マーカー蛋白質（ＧＦＰやＹＦＰ）は、精子形成
過程で細胞毒性を示すらしく、蛍光を発現する精子形成
細胞は遺伝子導入後１週から３週にかけて、急激に減少
して消失することも多い。この細胞毒性を少なくするた
めに、ミトコンドリア局在シグナルペプチドを連結した
ＹＦＰ遺伝子を選んで導入した。

【００１７】本発明は、以下の過程より構成される、ト
ランスジェニック動物の作成方法を提供する。以下の記
載した本発明の概要を、図１に示す。 （１）目的遺伝子及び蛍光蛋白質をコードする遺伝子を
組み込んだプラスミドを、動物の精巣内の生殖細胞に導
入する。 （２）蛍光蛋白質の蛍光を指標として、目的遺伝子が導
入された精母細胞、精子細胞又は精子の選抜を行う。 （３）目的遺伝子が導入された精母細胞、精子細胞又は
精子を、未受精の卵母細胞に受精させる。 （４）受精させた卵を生育させる。

【００１８】本発明の方法を用いて、種々の哺乳動物の
形質転換体を作成する事が可能である。本発明の方法は
哺乳類のみならず、鳥類または魚類等にも適用する事が
できる。本方法は雄動物の精細管に外来遺伝子を導入す
るという方法を採用しているため、精細管及びそれに類
するものを有する限り、任意の動物に適用する事が可能
である。更に、本発明の方法により作製されたトランス
ジェニック動物も、本発明の範囲内である。

【００１９】また、外来遺伝子が導入された精母細胞、
精子細胞又は精子を選抜するためのマーカーとして、種
々の蛍光蛋白質を使用することが可能である。好適な蛍
光蛋白質の例として、緑色蛍光蛋白質（Ｇｒｅｅｎ Ｆ
ｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）、青色蛍光蛋
白質（Ｂｌｕｅ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅ
ｉｎ）、黄色蛍光蛋白質（Ｙｅｌｌｏｗ Ｆｌｕｏｒｅ
ｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）、シアン蛍光蛋白質（Ｃ
ｙａｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）、
及び赤色蛍光蛋白質（Ｒｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ
Ｐｒｏｔｅｉｎ）等が挙げられる。

【００２０】また、本発明の方法を用いて、種々の外来
遺伝子を導入する事ができる。理論的には、本発明の方
法を用いて任意の遺伝子を導入する事が可能である。本
発明の方法を用いて外来遺伝子を導入することにより、
家畜の品種改良を行うことができる。例えば、成長ホル
モンの遺伝子を導入して、脂肪分の少ない高品質の肉質
を有する家畜を作出する事が可能である。病原性ウイル
スに対する耐病性を有する家畜動物の作出が、現在求め
られているが、病気にかかりにくい様に家畜の品質改良
を行うことが可能である。また、乳汁の分泌に関与する
遺伝子を導入する事により、大量の乳汁を生産するウシ
を作出する事が可能である

【００２１】本発明の方法を用いて、動物に種々の物質
の生産を行わせることが可能である。例えば、インシュ
リン、成長ホルモンやα−アンチトリプシン等、有用物
質や医薬品を生産する様に、形質転換した動物を作出す
る事が可能である。これらの生理活性物質が大量に生産
される事により、当該形質転換動物に障害が起こる場合
には、乳腺細胞において当該遺伝子発現させ、生産され
た後にすぐに体外に分泌させる事も可能である。

【００２２】現在、ヒトの組織適合性抗原遺伝子を発現
させた動物を作成して、臓器移植のドナーとして使用す
る事が検討されている。本発明の方法を用いて、ドナー
動物自身の組織適合性抗原遺伝子を欠損させてヒトの遺
伝子と置き換えれば、臓器移植のドナーとして、非常に
適した動物を作出することができる。

【００２３】

【実施例】（プラスミドＤＮＡの作成）ｐＣＡＧ−ＥＹ
ＦＰ−Ｍｉｔｏ発現ベクターは、サイトメガウイルスエ
ンハンサー、ニワトリベーターアクチンプロモーター、
ウサギベーターグロビンポリアデニレーションシグナル
を有するｐＣＡＧＧＳベクターのＥｃｏＲＩ部位へｐＥ
ＹＦＰ−Ｍｉｔｏベクター（ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のＮｈ
ｅＩ−ＮｏｔＩ断片由来のＥＹＦＰ−Ｍｉｔｏ遺伝子を
サブコローニングすることにより構築した。ｐＣＡＧ−
ＥＹＦＰ−Ｍｉｔｏ発現ベクターの調製は、大腸菌ＪＭ
１０９に発現ベクターをトランスフェクションし生育さ
せた後、ＱＩＡＧＥＮ ＰｌａｓｍｉｄＭｅｇａ Ｋｉ
ｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて行った。マウス生殖細胞へ
遺伝子導入するＣＡＧ−ＥＹＦＰ−Ｍｉｔｏ遺伝子は、
ｐＣＡＧ−ＥＹＦＰ−Ｍｉｔｏベクターより制限酵素Ｓ
ａｌＩ及びＨｉｎｄＩＩＩを用いて切り出した。

【００２４】（ＤＮＡの注入及びエレクトロポレーショ
ン）生後１４日齢 オスＩＣＲマウスをネブタール溶液
で麻酔して、精巣を顕微鏡下で露出した。マイクロピペ
ットを精巣網に挿入し、そこから１００−１２０μｇ／
ｍｌのＤＮＡ／ＨＢＳ（ＨＢＳ：Ｈａｎｋｓ’ｂａｌａ
ｎｃｅｄ ｓａｌｔ）溶液としたＣＡＧ−ＥＹＦＰ−Ｍ
ｉｔｏ ＤＮＡを、精細管に６−１０μｌ注入した。

【００２５】ＤＮＡを注入した後、電子パルス発生機
（エレクトロスクエアポレーターＴ８２０；ＢＴＸ，サ
ンディエゴ，カリフォルニア）を用いて電子パルスを発
生させた。電子パルス発生機をグラフパルス解析機（オ
プティマイザー５００；ＢＴＸ）に接続し、パルスを検
出した。そしてモニター出力付抵抗測定装置（ＭＢＸ−
４，（株）テーアールテック）を用いて、パルスの方向
を、プラス又はマイナスの方向にコントロールした。ピ
ンセット型の電極で精巣をはさみ、スクエア電子パルス
を３０−５０Ｖで、プラス方向に４回、マイナス方向に
４回連続してアプライした。それぞれのパルスの長さは
５０ｍ秒であった。電子パルス処理の後に、筋肉と皮膚
を縫い、解析又は卵子細胞内注入法に使用する生殖細胞
を採取するまでマウスを飼った。

【００２６】（精子の採取）ＣＡＧ−ＥＹＦＰ−Ｍｉｔ
ｏ ＤＮＡを注入したオスマウス（ＩＣＲ）より、電子
パルス処理１８−２０日後に精巣を単離し、結合組織性
の薄膜を除去した。ＹＦＰを励起する光源と適当なフィ
ルターを備えた顕微鏡下で、ピンセットを用いてＹＦＰ
を発現している精子を含む精細管を採取し、スライドガ
ラスに置きカバーガラスで覆って、４８８ｎｍの励起
下、ＣＣＤ顕微鏡で、ＹＦＰを発現している精子を調べ
た。ＹＦＰを発現している精子を含む精細管を、５．６
ｍＭグルコース、５．４ｍＭ乳酸ナトリウム及び１％Ｐ
ＶＰ (ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ: 分
子量３６０、０００ 和光純薬）を添加した冷却ダルベ
ッコＰＢＳの中に置いた。ハサミを用いて小片に切断
し、０．５ｍｇ／ｍｌのトリプシン／ＰＢＳ溶液で分散
させた。精子と他の精子形成細胞とを、穏やかにピペッ
ティングを行う事により、培地中に分散させた。細胞懸
濁液を、Ｈｅｐｅｓ−ＣＺＢ（ＣＺＢ：Ｊ．Ｒｅｐｒｏ
ｄ．Ｆｅｒｔｉｌ．８６，６７９，１９８９参照）で２
回洗浄した。

【００２７】（卵母細胞の調製）７週齢から１０週齢の
Ｂ６Ｄ２Ｆ１メスマウスを、セロトロピン（（株）帝国
臓器製薬）とゴナトロピン（（株）帝国臓器製薬）を連
続的に投与し、排卵を誘発した。ゴナトロピンを注入し
て１６−１８時間後、卵管から卵母細胞を採取した。Ｈ
ｅｐｅｓ−ＣＺＢに溶解した０．１％ヒアルロニダーゼ
（４４０Ｕ／ｍｇ：シグマケミカルズ）を用いて、５％
の二酸化炭素の存在下で、３７℃で２分間処理を行うこ
とにより、卵母細胞を遊離させた。

【００２８】（卵母細胞への精原細胞の注入）単離した
精子を、微滴（２μｌ）の１２％ＰＶＰ Ｈｅｐｅｓ−
ＣＺＢ中に移した。標準的なフィルターセットを備えた
（ＢＰ４７０−４９０及びＢＡ５１５）蛍光顕微鏡（Ｌ
ＥＩＣＡ ＭＩ ＡＰＯ Ｌｅｉｃａ）で、ＹＦＰの発
現を検出した。ＹＦＰを発現している精子とＹＦＰ陰性
精子を分離し、その後一つのＹＦＰ陽性精子をインジェ
クションピペットで吸引し、単離した。インジェクショ
ンピペットには、ピエゾエレクトリックピペットのドラ
イビングユニットが取り付けられている。１回または数
回のピエゾパルスを精子の首の部分かけて、精子の頭部
と尾部とを分離した後、頭部のみを卵母細胞へ注入し
た。精子が乾燥しないように、全ての注入操作はＨｅｐ
ｅｓ−ＣＺＢ中で、室温において１時間内に行った。精
子を注入した卵母細胞はＣＺＢの中で、５％の二酸化炭
素下、３７．５℃でインキュベートし、４−６時間後に
試験した。２つの前核及び二次極体を有する受精卵を、
正常に受精したものと見做した。

【００２９】（胚転移）受精させた卵は、４時間から６
時間培養した後には二次極体と２つの前核が認められ
た。ＩＣＲメスマウスを、精管を切除したオスと１８時
間前に交尾させて擬制妊娠を作製し、そのメスマウスの
卵管に正常な胚を移した。各卵管に移した胚の数は１０
−１５個であった。レシピエントのメスを妊娠１２．５
日目に解剖し、胎児のＹＦＰの発現を明視野又は励起光
を用いた蛍光顕微鏡で調べた。もう一匹のメスのレシピ
エントは、１９．５−２０．５日目に帝王切開を行なっ
た。生きた胎児と死んだ胎児の双方について調べ、生き
た胎児は、仮親に生育させた。

【００３０】（組織化学的解析）精巣と胚を、２．５％
ホルムアルデヒド中で、４℃で２−４時間固定した。Ｙ
ＦＰ励起光源と適切なフィルターを備えた顕微鏡の下
で、ＹＦＰを発現している精細管をピンセットを用いて
取り出し、スライドガラスにのせ、カバーガラスで覆っ
た。ＹＦＰを発現している生殖細胞を、共焦点レーザー
顕微鏡を用いて検出した。励起波長は４８８ｎｍであ
り、５１０ｎｍから５２５ｎｍのバンドパスフィルター
で検出を行った。

【００３１】（サザンブロット解析）ＹＦＰ陽性精子由
来の胎児（胎齢１２．５日目）のDNA をサザンブロッテ
ィングで解析した。ゲノミックＤＮＡを制限酵素Ａｐａ
Ｉにより消化し、１．０％アガロースゲルを用いて電気
泳動を行った後、ブロッティング膜（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ
⁺ ナイロンメンブレン）に転写した。その後、³²P-dCTP
で標識したＥＹＦＰ遺伝子をプローブ（７４０ｂｐ、Ｂ
ａｍＨＩ／ＮｏｔＩ断片）に用い、６５℃で１８時間、
ハイブリダイゼーションを行った。膜の洗浄は、（１）
２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ（１×ＳＳＣ＝０．１５Ｍ
ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ
７．０、ＳＤＳ: ドデシル硫酸ナトリウム） 室温
（２）１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ ６５℃ （３）
０．５×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ ６５℃ （４）０．
１×ＳＳＣ/0.1% SDS ６５℃ の順番で行い、ＢＡＳ２
０００イメージアナライザーで解析を行った。

【００３２】（遺伝子導入の確認）ＤＮＡ濃度、電圧、
時間及びパルス回数の様な種々のパラメーターを変化さ
せてエレクトロポレーションを行い、遺伝子導入の最適
条件を検討した。ＧＦＰ／ＹＦＰ遺伝子の導入は、蛍光
を標識として確認を行った。ＧＦＰ／ＹＦＰ遺伝子を導
入した後、１５−１８日目に精巣より細胞を分離し、精
母細胞と精子細胞の存在を検討した結果を、図２から図
７に示す。図２から図４は精母細胞、図５から図７は精
子細胞の結果である。図２と図５は明視野像、図３と図
６は蛍光像、図４と図７は明視野像と蛍光像を重ね合わ
せた像を示す。図６と図７の結果より、遺伝子導入して
１５−１８日後には、ＧＦＰ遺伝子が導入され、精子細
胞まで分化した細胞の存在が確認された。

【００３３】（精巣中におけるＧＦＰ／ＹＦＰ遺伝子の
発現）精巣及び精細管における遺伝子発現の検討を行っ
た。図８と図９は遺伝子導入後２日目の精巣の写真であ
り、図８は蛍光像を、図９は明視野像を示す。図１０と
図１１は精細管の蛍光図であり、図１０は遺伝子導入後
２日目の精細管を、図１１は１８−２０日後の精細管を
示す。図１２と図１３は、図１１の精細管を分離し、そ
こから単離された細胞を示す。

【００３４】本発明においては、未成熟な精子形成細胞
に遺伝子を導入することを目的として、精巣の生殖細胞
へのトランスフェクトを、可能な限り早期に行った。１
３日齢または１４日齢において精細管の中央空洞が開く
ために、この時期より、遺伝子を精細管へ注入する事が
可能であった。生後１３日齢から１４日齢の精巣には精
原細胞及び第一次精母細胞のみが存在する事が、組織化
学的検討により示されている。

【００３５】生殖細胞及びセルトリ細胞において、ＧＦ
Ｐ／ＹＦＰの蛍光は広範囲に検出された（図８）。エレ
クトロポレーションの後、７日間は蛍光を有する生殖細
胞の数は変わらなかったが、その後に急激に減少した。
セルトリ細胞は強い蛍光を維持し、精細管に沿って散在
し、単独の細胞として存在していた。対照的に、蛍光を
有する残りの生殖細胞は、２０ないし５０個の細胞の塊
として存在していた。解離した精細管を解析した結果、
第一次精母細、精子細胞及び精子において、蛍光が確認
された（図１０、図１１）。それらは、いくつかのクラ
スターのグループとして存在しており、少数の精母細
胞、精子細胞及び精子より構成されていた。

【００３６】遺伝子導入の１８日から２０日後の精巣で
は、精細管において蛍光を有する精子のクラスターが存
在していた（図１２）。その様な精子のクラスターの形
成は、比較的まれであった。それは、遺伝子導入が比較
的まれであるか、ＧＦＰ／ＹＦＰが毒性を有している事
のいずれかを示している。実際に、ＧＦＰで遺伝子導入
して１４日後の精巣において、異常なまたは退化した蛍
光を発する生殖細胞を見かけた。その様なＧＦＰの毒性
は、培養細胞においても報告されている。本発明におい
て、その様な毒性を低下させるために、ミトコンドリア
局在シグナルを結合させたＹＦＰを用い、その様なＹＦ
Ｐを用いた時にのみ、蛍光を有する精子が得られた。

【００３７】（卵細胞内精子注入法により受精した卵の
発生）更に、蛍光を発する精子を含んでいる精細管の断
片を切り出し、トリプシン溶液で、それらを解離させ
た。蛍光を発する精子を取り出し、それらを用いて卵母
細胞へ精子を注入した。この様にして精子を注入した受
精卵の発生について、まとめた結果を表１に示す。表１
において示された数はそれぞれ、受精卵、胚、胎児、子
の数を示す。最初に、３つの受精卵を４８時間から７２
時間培養して８細胞期の胚を作成した。図１４は蛍光像
を、図１５は明視野像を示す。上述した８細胞期の早期
胚はすべて、図１４で見られる様に蛍光蛋白質の発現を
示した（表１：実験１のＤ）。

【００３８】次に、２匹の仮親マウスの卵管に１１個
（１匹に５個、他の１匹に６個）の受精卵を移植した
（表１：実験２）。その結果仮親は妊娠し、移植した胚
より胎児が生育した。５個の受精卵を移植した仮親から
発生した３匹の胎児について、１２．５日目に調べた。
図１６は胎児の蛍光像を、図１７は明視野像を示す。そ
の結果 図１６で見られる様に３匹の胎児のうち２匹の
体において、ＹＦＰが全体的に発現している事が観察さ
れた（表１：実験２のＥ）。

【００３９】更に６個の受精卵を移植した仮親からは、
２匹の生きた子（Ｆ０世代）が得られ、その２匹はＹＦ
Ｐの蛍光を発した（表１：実験２のＦ）。得られた個体
の尾部の蛍光像を図１８に、明視野像を図１９に示す。
図１８より、尾部全体に蛍光が観察された。別の仮親に
６個の受精卵を移植し行った実験３においても、生まれ
た３匹の子は全て、蛍光を発した（表１：実験３の
Ｆ）。

【００４０】更に、形質転換したＦ０世代のマウスから
Ｆ１世代のマウスへ、導入遺伝子が世代間で伝達される
か検討を行った。オスとメスの形質転換Ｆ０マウスから
生まれたＦ１世代を得て検討を行ったところ、蛍光を有
するＦ１世代の個体に対する、蛍光を有さないＦ１世代
の個体の比は約１：１であった（表１：実験２及び実験
３のＧ）。この結果は、本発明の方法により作製した形
質転換動物へ導入した形質は子孫に遺伝することを示し
ている。また、その子孫は形質転換しない個体と比較し
て、明らかな毒性や発生上の不利が存在しないことを示
している。

【００４１】

【表１】

【００４２】（遺伝子の染色体への導入）卵細胞内精子
注入により作成した胎児及び子のＤＮＡサンプルを得
て、サザンブロッティングを行った。図２０において、
Ｅ−１からＥ−３のレーンは胎児のサンプルを解析した
結果であり、Ｅ−１は蛍光を有しない精子由来のサンプ
ル、Ｅ−２及びＥ−３は蛍光を有する精子由来のサンプ
ルである。Ｅ−２及びＥ−３において、ＹＦＰの遺伝子
を示すバンドがブロッティングの中央に認められ、遺伝
子が導入されていることが認められた。

【００４３】一方図２０において、Ａ−１とＡ−２のレ
ーンは、産まれた子のサンプルを解析した結果を示す。
Ａ−１とＡ−２は共に、蛍光を有する精子より産まれた
子のサンプルであり、ＹＦＰの遺伝子を示すバンドがブ
ロッティングの上部に認められ、やはり遺伝子が導入さ
れていることが示された。ＹＦＰの遺伝子は、単独又は
多数のコピーとして検出された。以上の結果から、導入
された遺伝子は胎児の染色体に導入されている事が示さ
れた。

【００４４】

【発明の効果】本発明により、動物の精巣へ外来遺伝子
を導入し、マーカー遺伝子を指標として遺伝子が導入さ
れた精母細胞、精子細胞及び精子を選択し、未受精卵と
受精させる事を特徴とする、新規の形質転換動物の作製
方法が与えられた。本方法は、目的とした遺伝子が導入
された精母細胞、精子細胞及び精子を選抜できるため
に、低い費用で効率よく形質転換した動物を作成する事
ができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】 本発明の形質転換動物の作製方法の概略を示
す模式図である。

【図２】 ＧＦＰ遺伝子の導入を行って１５−１８日後
の、精巣より分離した精母細胞の明視野像を示す写真で
ある。

【図３】 ＧＦＰ遺伝子の導入を行って１５−１８日後
の、精巣より分離した精母細胞の蛍光像を示す写真であ
る。

【図４】 ＧＦＰ遺伝子の導入を行って１５−１８日後
の、精巣より分離した精母細胞の明視野像と蛍光像を重
ね合わせた写真である。

【図５】 ＧＦＰ遺伝子の導入を行って１５−１８日後
の、精巣より分離した精子細胞の明視野像を示す写真で
ある。

【図６】 ＧＦＰ遺伝子の導入を行って１５−１８日後
の、精巣より分離した精子細胞の蛍光像を示す写真であ
る。

【図７】 ＧＦＰ遺伝子の導入を行って１５−１８日後
の、精巣より分離した精子細胞の明視野像と蛍光像を重
ね合わせた写真である。

【図８】 ＹＦＰ遺伝子の導入を行って２日後の、精巣
の蛍光像を示す写真である。

【図９】 ＹＦＰ遺伝子の導入を行って２日後の、精巣
の明視野像を示す写真である。

【図１０】 ＧＦＰ遺伝子の導入を行って２日後の、精
細管の蛍光像を示す写真である。

【図１１】 ＹＦＰ遺伝子の導入を行って１８−２０日
後の、精細管の蛍光像を示す写真である。

【図１２】 ＹＦＰ遺伝子の導入を行って１８−２０日
後の、精細管より単離した細胞の明視野像と蛍光像を重
ね合わせた写真である。

【図１３】 ＹＦＰ遺伝子の導入を行って１８−２０日
後の、精細管より単離した細胞の明視野像を示す写真で
ある。

【図１４】 ＹＦＰ遺伝子の導入精子と受精した、８細
胞期の胚の蛍光像を示す写真である。

【図１５】 ＹＦＰ遺伝子の導入精子と受精した、８細
胞期の胚の明視野像を示す写真である。

【図１６】 １２．５日目の胎児の蛍光像を示す写真で
ある。

【図１７】 １２．５日目の胎児の明視野像を示す写真
である。

【図１８】 得られた個体の尾部の蛍光像を示す写真で
ある。

【図１９】 得られた個体の尾部の明視野像を示す写真
である。

【図２０】 ＹＦＰ遺伝子の検出を行った、ブロッティ
ングの結果を示す写真である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 桜井 敬之 静岡県熱海市伊豆山225 (72)発明者 中馬 新一郎 静岡県三島市柳郷地62−２ ハイコーポ柳 郷地Ｃ−206 (72)発明者 斎藤 哲一郎 静岡県三島市谷田小山押切1362−７ シテ ィーハイムヒロタ102号 Ｆターム(参考） 4B024 AA10 AA11 AA20 BA80 CA02 CA20 DA02 EA04 FA10 FA18 GA13 GA14 4B063 QA01 QA05 QQ08 QQ13 QQ79 QR33 QR56 QR60 QR77 QR80 QS05 QS34 QS36 QS39 QX02 4B065 AA91X AB01 AC14 BA04 BA05 BA25 CA24 CA44 CA46

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 目的遺伝子が導入された形質転換動物の
   作製方法であって、当該目的遺伝子及び蛍光蛋白質をコ
   ードする遺伝子を組み込んだプラスミドを、動物の精巣
   内に存在する生殖細胞中に電気穿孔法又はリポフェクシ
   ョン法により導入し、当該蛍光蛋白質の蛍光を指標とし
   て当該目的遺伝子が導入された精母細胞、精子細胞又は
   精子の選抜を行い、当該目的遺伝子が導入された精母細
   胞、精子細胞又は精子を未受精の卵母細胞に受精させ、
   受精させた細胞より動物個体を得る過程より成る、トラ
   ンスジェニック動物の作製方法。
2. 【請求項２】 前記動物が、哺乳類、鳥類または魚類に
   属する動物である、請求項１記載の方法。
3. 【請求項３】 前記蛍光蛋白質が緑色蛍光蛋白質（Ｇｒ
   ｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）、
   青色蛍光蛋白質（Ｂｌｕｅ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ
   Ｐｒｏｔｅｉｎ）、黄色蛍光蛋白質（Ｙｅｌｌｏｗ Ｆ
   ｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）、シアン蛍光
   蛋白質（Ｃｙａｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔ
   ｅｉｎ）または赤色蛍光蛋白質（Ｒｅｄ Ｆｌｕｏｒｅ
   ｓｃｅｎｔＰｒｏｔｅｉｎ）である、請求項１記載の方
   法。
4. 【請求項４】 前記蛍光蛋白質をコードする遺伝子を、
   ミトコンドリア局在シグナルペプチドに連結することに
   より、当該蛍光蛋白質の毒性を低下させたことを特徴と
   する、請求項１記載の方法。
5. 【請求項５】 前記目的遺伝子が前記動物個体の子孫に
   受け継がれることを特徴とする、請求項１記載の方法。
6. 【請求項６】 請求項１記載の方法により作製された、
   トランスジェニック動物。