JP2001305030A

JP2001305030A - 試料調整法

Info

Publication number: JP2001305030A
Application number: JP2000118633A
Authority: JP
Inventors: Yoshinori Iketaki; 慶記池滝; Masaaki Fujii; 正明藤井; Takashige Omatsu; 尾松　　孝茂; Tomoo Suzuki; 智雄鈴木; Makoto Minakata; 皆方　　誠; Kimihisa Yamamoto; 公寿山元; Kazuhiko Nakatani; 和彦中谷
Original assignee: Nippon Roper Co Ltd; Japan Science and Technology Corp; Olympus Optical Co Ltd
Current assignee: Japan Science and Technology Agency; Olympus Corp; Nippon Roper Co Ltd
Priority date: 2000-04-19
Filing date: 2000-04-19
Publication date: 2001-10-31

Abstract

(57)【要約】【課題】蛍光信号を短時間、且つ高感度で計測するこ
とができ、二重共鳴吸収顕微鏡の超解像性を十分に引き
出して実用性をより向上させることのできる、新しい試
料調整法を提供する。【解決手段】二重共鳴吸収顕微鏡における試料を調整
する方法であって、試料を量子ドットにより染色する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】この出願の発明は、試料調整
法に関するものである。さらに詳しくは、この出願の発
明は、蛍光信号の短時間、且つ高感度測定を実現し、二
重共鳴吸収顕微鏡の超解像性を十分に引き出して実用性
をさらに向上させることのできる、二重共鳴吸収顕微鏡
に用いられる新しい試料調整法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】近年、レーザー技術や電子画像技術をは
じめとする周辺技術の進歩にともない、様々なタイプの
高性能かつ多機能な顕微鏡が開発されてきている。本願
発明の発明者も、その一つとして、複数波長の光を試料
に照明することによって発生する二重共鳴吸収過程を用
いて、得られる画像のコントラスト制御および試料の化
学分析を可能とする顕微鏡（以下、二重共鳴吸収顕微鏡
と呼ぶ）をすでに提案している（特願平６−３２９１６
５参照）。

【０００３】この二重共鳴吸収顕微鏡では、二重共鳴吸
収過程を用いて特定の分子を選択し、特定の光学遷移に
起因する吸収および蛍光を観測することができる。その
原理を説明すると、まず、基底状態（Ｓ₀状態：図１）
の試料分子（つまり、試料を構成する分子）が持つ価電
子軌道の電子を、レーザー光などの共鳴波長λ₁光によ
り第一電子励起状態へ励起させ（Ｓ₁状態：図２）、続
いて共鳴波長λ₂光により第二電子励起状態またはさら
に高位の励起状態へ励起させる（Ｓ₂状態：図３）。分
子は、この励起状態から蛍光あるいは燐光を発光したり
して基底状態に戻る（図４）。そして、図２に示した吸
収や図４に示した蛍光や燐光の発光を用いて吸収像や発
光像を観察する。

【０００４】Ｓ₁状態への励起過程においては、単位体
積内のＳ₁状態の分子数は照射する光の強度が増加する
にしたがって増加する。線吸収係数は、分子一個当たり
の吸収断面積と単位体積当たりの分子数の積で与えられ
るので、Ｓ₂状態への励起過程においては続いて照射す
る共鳴波長λ₂に対する線吸収係数は最初に照射した共
鳴波長λ₁の光の強度に依存する。すなわち、共鳴波長
λ₂（以下、波長λ₂と略称）に対する線吸収係数は共鳴
波長λ₁（以下、波長λ₁と略称）の光の強度で制御でき
る。このことは、波長λ₁および波長λ₂の２波長の光で
試料を照射し、波長λ₂による透過像を撮影すれば、透
過像のコントラストを波長λ₁の光で完全に制御できる
ことを示している。また、Ｓ₂状態からの蛍光または燐
光による脱励起過程が可能である場合には、その発光強
度はＳ₁状態にある分子数に比例する。したがって、蛍
光顕微鏡として利用する場合にも画像コントラストの制
御が可能となる。

【０００５】また、この二重共鳴吸収顕微鏡は、コント
ラストの制御のみならず、化学分析も可能にする。図１
に示される最外穀価電子軌道は個々の分子に固有なエネ
ルギー準位をもつので、波長λ₁は分子によって異な
る。同時に波長λ₂も分子固有のものとなる。単一波長
で照明・観察を行う従来の顕微鏡においても、ある程度
は特定の分子の吸収像あるいは蛍光像を観察することが
可能ではあるが、一般にはいくつかの分子の吸収帯の波
長領域は重複するため、試料の化学組成の正確な同定ま
では不可能である。これに対し、二重共鳴吸収顕微鏡で
は波長λ₁および波長λ₂の２波長により吸収あるいは発
光する分子を限定するので、従来技術よりも正確な試料
の化学組成の同定が可能となる。また、価電子を励起す
る場合、分子軸に対して特定の電場ベクトルを持つ光の
みが強く吸収されるので、波長λ₁および波長λ₂の偏光
方向を決めて、吸収像または蛍光像を撮影すれば、同じ
分子でも配向方向の同定をも行うことができる。

【０００６】本願発明の発明者はさらに、回折限界を越
える高い空間分解能の二重共鳴吸収顕微鏡をも提案して
いる（特願平８−３０２２３２参照）。二重共鳴吸収過
程については、図５に例示したようにＳ₂状態からの蛍
光が極めて弱くなるある種の分子が存在する。このよう
な光学的性質を持つ分子に対しては、以下のような極め
て興味深い現象が起きる。図６は、図５と同じく二重共
鳴吸収過程の概念図であるが、横紬にＸ軸を設けて空間
的距離の広がりを表現しており、波長λ₁光および波長
λ₂光が照射されている空間領域Ａ₁（＝蛍光抑制領域）
と、波長λ₁光のみが照射されて波長λ₂光が照射されて
いない空間領域Ａ₀（＝蛍光領域）について示してい
る。空間領域Ａ₀では波長λ₁光による励起によってＳ₁
状態の分子が多数生成される。このとき空間領域Ａ₀か
らは波長λ₃で発光する蛍光が見られる。しかし空間領
域Ａ₁では、波長λ₂光が照射されるので、Ｓ₁状態の分
子が即座に高位のＳ₂状態へと励起され、Ｓ₁状態の分子
は存在しなくなる。このため空間領域Ａ₁においては、
波長λ₃の蛍光は全く発生せず、しかもＳ₂状態からの蛍
光はもともとないので、完全に蛍光自体が抑制されるこ
ととなる。すなわち蛍光が発生するのは空間領域Ａ₀の
みとなる。このような現象の発生が数種類の分子におい
て確認されている。

【０００７】したがって、従来の走査型レーザー顕微鏡
などでは、レーザー光を集光して観察試料上に形成され
るマイクロビームのサイズが集光レンズの開口数と波長
による回折限界で決まるので、それ以上の空間分解能が
原理的に期待できないにの対し、図６で示した現象によ
れば波長λ₁光と波長λ₂光を空間的に一部分重ね合わせ
ることで、波長λ₂光の照射で蛍光領域が抑制されるた
め、たとえば波長λ₁光の照射領域に着目すると、蛍光
領域は集光レンズの開口数と波長とで決まるビームのサ
イズよりも狭くなっており、実質的に空間分解能の向上
が図られている。本願発明者による二重共鳴吸収顕微鏡
（特願平８−３０２２３２参照）は、この原理を用い
て、回折限界を越える超解像顕微鏡を実現しているので
ある。

【０００８】そして本願発明の発明者は、この二重共鳴
吸収顕微鏡の超解像性をさらに高めるべく、その機能を
十分に活かすための試料の調整や波長λ₁光・波長λ₂光
の試料への照射タイミングなどをもすでに提案している
（特願平９−２５５４４４）。より具体的には、試料を
染色分子により染色する。この染色分子として、基底状
態を含め少なくとも３つの量子状態（Ｓ₀状態，Ｓ₁状
態，Ｓ₂状態・・・）を有し、且つＳ₁状態を除く高位の
量子状態から基底状態へ脱励起するときの遷移において
蛍光による緩和過程よりも熱緩和過程が支配的である各
種分子（以下、蛍光ラベラー分子と呼ぶ）を用いるので
ある。このような蛍光ラベラー分子と生化学的な染色技
術を施した生体分子とを化学結合させてなる試料に、波
長λ₁光を照射して蛍光ラベラー分子をＳ₁状態に励起さ
せ、続いて即座に波長λ₂光を照射して蛍光ラベラー分
子をより高位の量子準位に励起させることで、Ｓ₁状態
からの蛍光を効果的に抑制できるようになる。この際
に、上述したような空間的な蛍光領域の人為的な抑制を
行うことにより、空間分解能のさらなる向上が実現され
る。

【０００９】上記の蛍光ラベラー分子の光学的性質は、
以下のように量子化学的な見地から説明できる。一般
に、分子はそれを構成する各原子のσまたはπ結合によ
って結ばれている。言い換えると、分子の分子軌道はσ
分子軌道またはπ分子軌道をもっていて、これらの分子
軌道に存在する電子が各原子を結合する重要な役割を担
っている。そのなかでも、σ分子軌道の電子は、各原子
を強く結合し、分子の骨格である分子内の原子間距離を
決める。これに対して、π分子軌道の電子は、各原子の
結合にほとんど寄与しないで、むしろ分子全体に極めて
弱い力で束縛される。

【００１０】多くの場合、σ分子軌道にいる電子を光で
励起させると、分子の原子間隔が大きく変化し、分子の
解離を含む大きな構造変化が起こる。その結果として、
原子の運動エネルギーや構造変化するために光が分子に
与えたエネルギーのほとんどが熱エネルギーに形を変え
る。したがって、励起エネルギーは蛍光という光の形態
で消費されない。また、分子の構造変化は極めて高速に
おこるので（たとえばピコ秒より短い）、その過程で仮
に蛍光が起きても極めて蛍光寿命が短い。しかしそれに
対して、π分子軌道の電子が励起しても、分子の構造自
体はほとんど変化せず、高位の量子的な離散準位に長時
間とどまり、ナノ秒のオーダーで蛍光を放出して脱励起
する性質を持つ。

【００１１】量子化学よれば、分子がπ分子軌道を持つ
ことと、二重結合を持つこととは同等であり、用いる蛍
光ラベラー分子には、二重結合を豊富に持つ分子を選定
することが必要条件となる。そして、二重結合を持つ分
子でもベンゼンやビラジンなどの６員環分子において
は、Ｓ２状態からの蛍光が極めて弱いことが確かめられ
ている（例えば、M..Fujii et.al., Chem. Phys. Lett.
171 (1990) 341）。したがって、ベンゼンやビラジン
などの６員環分子を含む分子を蛍光ラベラー分子として
選定すればＳ１状態からの蛍光寿命が長くなり、しかも
光照射によりＳ₁状態からＳ₂状態に励起させることで分
子からの蛍光を容易に抑制でき、上述の二重共鳴吸収顕
微鏡の超解像性を効果的に利用することができるように
なる。

【００１２】すなわち、これらの蛍光ラベラー分子によ
り試料を染色して観察を行えば、高空間分解能の蛍光像
を取得することができるだけでなく、その蛍光ラベラー
分子の側鎖の化学基を調整することにより生体試料の特
定の化学組織のみを選択的に染色でき、試料の詳細な化
学組成までも分析可能となる。

【００１３】一般に、二重共鳴吸収過程は二つの光の波
長や偏光状態等が特定の条件を満たす場合のみに起こる
ので、これを用いることで非常に詳細な分子の構造を知
ることが可能となる。すなわち、光の偏光方向と分子の
配向方向とは強い相関関係があり、二波長光それぞれの
偏光方向と分子の配向方向とが特定の角度をなすとき二
重共鳴吸収過程が強く起こる。したがって、二波長光を
試料に照射して、各光の偏光方向を回転することによ
り、蛍光の消失の程度が変化するので、その様子から観
察しようとする組織の空間配向の情報も得られる。さら
に、二つの波長の光を調整させることでもこのことが可
能である。

【００１４】他方、波長λ₁光と波長λ₂光の照射タイミ
ングを適当なものに調整することにより（特願平９−２
５５４４４参照）、蛍光像のＳ／Ｎを改善し、且つ蛍光
抑制をさらに効果的に起こすことも可能となっている。

【００１５】また、本願発明の発明者により、波長λ₁
光と波長λ₂光の照射タイミングのさらなる工夫によ
り、Ｓ／Ｎおよび蛍光抑制のさらなる向上を実現するこ
とも提案されている（特願平１０―９７９２４参照）

【００１６】

【発明が解決しようとする課題】さて、以上のように本
願発明の発明者によってこれまで開発されてきた二重共
鳴吸収顕微鏡は、その超解像性と分析能力において際立
った有用性と技術的優位性を示しているものの、未だに
以下に示すような改良すべき点が残されているのが実情
である。

【００１７】二重共鳴吸収顕微鏡では、上述したように
光の回折限界を遥かに上回り、観察できる空間分解能は
たとえば数１０ｎｍにも達する。しかしながらその反
面、蛍光ラベラー分子を用いて試料を染色した場合、観
察領域すなわち蛍光発光領域に存在する蛍光ラベラー分
子は、極端に少なくなり、極限的な場合として１分子検
出にまで至る。

【００１８】従来の蛍光ラベラー分子は有機分子であ
り、Ｓ₁状態の寿命と同じ程度のパルス幅のポンプ光を
照射すると、基底状態の蛍光ラベラー分子は１回だけＳ
₁状態に励起する。これは、分子の特定の分子軌道に居
る電子一個のみが、共鳴波長の光により特定の離散的な
エネルギー的に高位の量子準位に励起されることによ
る。励起された蛍光ラベラー分子は、寿命分の時間を経
て１光子を放出することにより基底状態に戻った後、再
びポンプ光により励起できるようになる。言い換える
と、Ｓ₁状態にある間は、幾らポンプ光を蛍光ラベラー
分子に照射しても、蛍光ラベラー分子はＳ₁状態にある
ままで何も変化が起こらないので、蛍光として放出する
光子の数は１個のままで２個以上となり得ないことにな
る。

【００１９】たとえば、ポンプ光光源としてパルスレー
ザーを用いる場合、仮に観察領域に１個しか分子が存在
しないとすると、１回のパルスレーザー光の照射で、ラ
ベラー分子は１回だけＳ₁状態に励起する。しかし、蛍
光収率が１以下であると、蛍光過程で放出される光子の
数は１以下となってしまう。さらに、たとえば、観察光
学系にもよるが検出器にたどり着く蛍光が数１０％であ
り、しかも検出器の検出効率が１以下である場合には、
一回のパルスレーザー光照射では観察領域からの蛍光の
観察が極めて困難であることを意味する。

【００２０】したがって、微小観察領域からの蛍光信号
を測定するためには、レーザー光照射を極めて多くの回
数、長時間行う必要がある。そして、このことは以下の
ような問題点を生じさせる。

【００２１】まず第一に、計測時間の問題がある。近年
では高繰り返しのパルスレーザーが市販されているもの
の、たとえば観察試料を１点１点走査して多数の画素に
ついて測定し、蛍光信号から二次元画像を形成するとい
う方式においては、画像形成に要する時間が長くなり、
実用上好ましくない。

【００２２】第二の問題点としては、蛍光ラベラー分子
に対する影響がある。ポンプ光およびイレース光として
のレーザー光を長時間、同じ分子に照射し続けると、分
子が光学反応を起こし、別の性質をもった分子に変化し
たり、最悪の場合には光解離などを起こして破壊されて
しまうことがある。いわゆる色素退色で蛍光ラベラー分
子が発光しなくなる。

【００２３】第三の問題点としては、観察試料、特に生
体試料に対する影響がある。可視光領域では生体試料は
透明であり、受けるダメージは少ないはずであるが、パ
ルスレーザー光照射の場合には非常に確立は小さいなが
らも多光子吸収がおこり、パルスレーザー光照射を繰り
返すうちにその影響が生体試料に蓄積される恐れもあり
得る。

【００２４】これらの問題点は、上述したとおりの長時
間光照射に起因するものであり、二重共鳴吸収顕微鏡の
実用性をさらに向上させるべく、改善すべき問題点であ
る。

【００２５】この出願の発明は、以上のとおりの事情に
鑑みてなされたものであり、従来の二重共鳴吸収顕微鏡
を改良し、できるだけ少ない光照射でも微小領域からの
蛍光信号を短時間で計測することができ、その超解像性
を十分に引き出して実用性をより向上させることのでき
る、二重共鳴吸収顕微鏡に用いられる新しい試料調整法
を提案することを課題としている。

【００２６】

【課題を解決するための手段】この出願の発明は、上記
の課題を解決するものとして、二重共鳴吸収顕微鏡にお
ける試料を調整する方法であって、試料を量子ドットに
より染色することを特徴とする試料調整法（請求項１）
を提供し、この試料調整法において、量子ドットとし
て、元素周期表における第III属元素と第V属元素の組合
せからなるもの、または第II属元素と第VI属元素の組合
せからなるものを用いること（請求項２）、量子ドット
として、BN, BP, BAs, AlN, AlP, AlAs, AlSb, GaN, Ga
P, GaSb, InN, InP, InAs, InSb, ZnO, ZnS, ZnSe, ZnT
e, CdSe, CdTe, HgS, HgSe, HgTe,MgTe, MgSe, C, Si,
Ge, BeTe, AlGaAs, GaInP, GaInAs, AlGaInP, AlGaAsS
b, InAsSbP, InGaN, ZnSSe, ZnCdSe, PbSnSeTeのいずれ
かを用いること（請求項３）、量子ドットとして、S, T
e, Seのいずれかを含む材料でコーティングされたもの
を用いること（請求項４）、コーティング材料として、
量子ドットのバンドギャップよりも大きいバンドギャッ
プを有するものを用いること（請求項５）、量子ドット
として、その表面またはコーティング表面に有機側鎖を
有するものを用いること（請求項６）、有機側鎖が、末
端官能基-COOH, -NH₂, -SH, -OH, -CH=CH₂, -Ph-1を有
する化学基を持つものであること（請求項７）をその態
様としている。

【００２７】また、この出願の発明は、二重共鳴吸収顕
微鏡における試料を調整する方法であって、試料をデン
ドリマーにより染色することを特徴とする試料調整法
（請求項８）をも提供し、この試料調整法において、デ
ンドリマーとして、蛍光色素分子を含むものを用いるこ
と（請求項９）や、蛍光色素分子が、2,2"-Dimethyl-p-
terphenyl;P-terphenyl(PTP);3,3',2",3"-Tetramethyl-
P-quaterphenyl;2,2'''-Dimethyl-P-quaterphenyl;2-Me
thyl-5-t-butyl-p-quaterphenyl;2-(4-Biphenylyl)-5-
(4-t-butylphenyl)-1,3,4-oxiazol(BPBD-365);2-(4-Bip
henylyl)-phenyl-1,3,4-oxadiazol;2,5,2''''5,''''-Te
tramethyl-p-quinquephenyl;3,5,3''''5,''''-Tetra-t-
butyl-p-quinquephenyl;2,5-Diphenyloxazol;2,5-Diphe
nylfuran;PQP(p-Quanterphenyl;2,5-Bis-(4-biphenyly
l)-1,3,4-oxadiazol;p-Quaterphenyl-4-4'''-disulfoni
cacid Disodiumsalt;p-Quaterphenyl-4-4'''-disulfoni
cacid Dipotassiumsalt;4,4'''-Bis-(2-butyloctyloxy)
-p-quanterphenyl;3,5,3''''5,''''-Tetra-t-butyl-p-s
exiphenyl;2-(1-Naphthyl)-5-phenyloxazol;2-(4-Biphe
nylyl)-6-phenylbenzoxazotetrasulfonicacid Potassiu
m Salt;2-(4-Biphenylyl)-6-phenylbenzoxazol-1,3;4,
4'-Diphenylstilbene;[1,1'-Biphenyl]-4-sulfonic aci
d, 4,4"-1,2-ethene-diylbis-,dipotassium salt;2,5-B
is-(4-biphenylyl)-oxazol;2,2'-([1,1'-Biphenyl]-4,
4'-diyldi-2,1-ethenediyl)-bis-benzenesulfonic acid
Disodium Salt;7-Amino-4-methylcarbostyryl;1,4-Di
[2-(5-phenyloxazoly)]benzene;7-Hydroxy-4-methylcou
marin;p-Bis(o-methylstyryl)-benzene;Benzofuran,2,
2'-[1,1'-biphenyl]-4,4'-diyl-bis-tetrasulfonic-aci
d;7-Dimethylamino-4-methylquinolom-2;7-Amino-4-met
hylcoumarin;2-(p-Dimethylaminostyryl)-pyridylmethy
l Iodide;7-Diethylaminocoumarun;7-Diethylamino-4-m
ethylcoumarin;2,3,5,6-1H,4H-Tetrahydro-8-methylqin
olizino-[9,9a,1-gh]-coumarin;7-Diethylamino-4-trif
luormethylcoumarin;7-Dimethylamino-4-trifluormethy
lcoumarin;7-Amino-4-trifluormethylcoumarin;2,3,5,6
-1H,4H-Tetrahydroquinolizino-[9,9a,1-gh]-coumarin;
7-Ethylamino-6-methyl-4-trifluormethylcoumarin;7-E
thylamino-4-trifluormethylcoumarin;2,3,5,6-1H,4H-T
etrahydro-9-carboethoxyquinolizino--[9,9a,1-gh]cou
marin;2,3,5,6-1H,4H-Tetrahydro-9-(3-pyridyl)-quino
lizino-[9,9a,1-gh]coumarin;3-(2'-N-Methylbenzimida
zolyl)-7-n,n-diethylaminocoumarin;2,3,5,6-1H,4H-Te
trahydro-9-acetylquinolizino-[9,9a,1-gh]-coumarin;
N-Methyl-4-trifluormethylpiperidino-[3,2-g]-coumar
in;2-(p-Dimethylaminostyryl)-benzothiazolylethyl I
odide;3-(2'-Benzimidazolyl)-7-N,N-diethylaminocoum
arin;Brillantsulfaflavin;3-(2'-Benzothiazolyl)-7-d
iethylaminocoumarin;2,3,5,6-1H,4H-Tetrahydro-8-tri
fluormethylquinolizino-[9,9a,1-gh]coumarin;3,3'-Di
ethyloxacarbocyanine Iodide;3,3'-Dimethyl-9-ethylt
hiacarbocyanine Iodide;Disodium Fluorescein (Urani
n);9-(o-Carboxyphenyl)-2,7-dichloro-6-hydroxy-3H-x
anthen-3-on2,7-Dichlorofluorescien・Fluorescein 54
8;Fluorol 555 (Fluorol 7GA);o-(6-Amino-3-imino-3H-
xanthen-9-yl)-benzonic acid (Rhodamine 560);Benzoi
cAcid,2-[6-(ethylamino)-3-(ethylimino)-2,7-dimethy
l-3H-xanthen9-yl], perchlorate(Rhodamine 575);Benz
onic Acid,2-[6-(ethylamino)-3-(ethylimino)-2,7-di
methyl-3X-xanthen-9-yl]-ethylester,monohydrochlori
de (Rhodamine 590);1,3'-Diethyl-4,2'-quinolyloxaca
rbocyanine Iodide;1,1'-Diethyl-2,2'-carbocyanine I
odid;2-[6-(diethylamino)-3-(diethylimino)-3H-xanth
en-9-yl] benzonic acid (Rhodamine 610);Ethanaminiu
m,N-[(6-diethylamino)-9-(2,4-disulfophenyl)-3H-xan
then-3-ylidene]-N- ethylhydroxid,inner salt,sodium
salt;Malachit Green;3,3'-Diethylthiacarbocyanine
Iodide;1,3'-Diethyl-4,2'-quinolylthiacarbocyanine
Iodide;8-(2-Carboxyphenyl)-2,3,5,6,11,12,14,15-oct
ahydro-1H,4H,10H,13H-diquinolizino[9,9a,1-bc:9',9
a',1-hi]xanthylium Perchlorate (Rhodamine640);4-Di
cyanmethylene-2-methyl-6-(p-dimethylaminostyryl)-4
H-pyran;3,3'-Diethyloxadicarbocyanine Iodide;8-(2,
4-Disulfophenyl)-2,3,5,6,11,12,14,15-octahydro-1H,
4H,10H,13H-diquinolizino [9,9a,1-bc:9',1-hi]xanthe
ne (Sulforhodamine 640);5,9-Diaminobenzo[a]phenoxa
zonium Perchorate;9-Diethylamino-5H-benzo(a)phenox
azin-5-one;5-Amino-9-diethylimino(a)phenoxazonium
Perchlorate;3-Ethylamino-7-ethylimino-2,8-dimethyl
phenoxazin-5-ium Perchorate;8-(Trifluoromethyl)-2,
3,5,6,11,12,14,15-octahydro-1H,4H,10H,13H-diquinol
izino[9,9a,1-bc:9',9a,1-hi]xanthylium Perchlorate;
1-Ethyl-2-(4-(p-Dimethylaminophenyl)-1,3-butadieny
l)-pyridinium Perchlorate;Carbazine 122;9-Ethylami
no-5-ethylimino-10-methyl-5H- benzo(a)phenoxazoniu
m Perchlorate;3-Diethylamino-7-diethyliminophenoxa
zonium Perchlorate;3-Diethylthiadicarbocyanine Iod
ide;Oxazine 750;1-Ethyl-4-(4-(p-Dimethylaminopheny
l)-1,3-butadienyl)-pyridininum Perchlorate;1,1',3,
3,3',3'-Hexamethylindodicarbocyanine Iodide;1,1'-D
iethyl-4,4'-carbocyanine Iodide;2-(4-(p-Dimethylam
inophenyl)-1,3-butadienyl)-1,3,3-trimethyl-3H-indo
liumPerchlorate;2-(4-(p-Dimethylaminophenyl)-1,3-b
utadienyl)-3-ethylbenzothoazolium Perchlorate;1,1'
-Diethyl-2,2'-dicarbocyanine Iodide;1-Ethyl-4-(4-
(9-(2,3,6,7-tetrahydro-1H,5H-benzo(i,j)-chinolinoz
inium))-1,3-buta dienyl)-pyridinium Perchlorate;3,
3'-DimethyloxatricarbocyanineIodide;1-Ethyl-4-(p-D
imethylaminophenyl)-1,3-buta dienyl)-quinoliniumPe
rchlorate;8-Cyano-2,3,5,6,11,12,14,15-octahydro-1
H,4H,10H,13H-diquinolizino[9,9a,1-bc:9a',1-hi]xant
hylium Perchlorate (Rhodamine800];2-(6-(4-Dimethyl
aminophenyl)-2,4-neopentylene-1,3,5)-3-methylbenzo
thiazolium Perchlorate;1,1',3,3,3',3'-Hexamethylin
dotricarbocyanine Iodide;IR125;3,3'-Diethylthiatri
carbocyanine Iodide;IR144;2-(6-(9-(2,3,6,7,-Tetrah
ydro-1H,5H-benzo(i,j)-chinolizinium))-2,4-neopenty
lene-1,3,5-hexatrienyl)-3-methyllbenzothiazolium P
erchlorate;3,3'-Diethyl-9,11-neopentylenethiatrica
rbocyanine Iodide;1,1',3,3,3',3'-Hexamethyl-4,4',
5,5'-dibenzo-2,2'-indotricarbocyanine Iodide;3,3'-
Diethyl-4,4',5,5'-dibenzothiatricarbocyanine Iodid
e;1,2'-Diethyl-4,4'-dicarbocyanine Iodide;IR140;2-
(8-(4-p-Dimethyhlaminophenyl)-2,4-neopentylene-1,
3,5,7-octatetraenyl)-3-methylbenzothiazolium Perch
lorate;IR132;2-(8-(9-(2,3,6,7-Tetrahydro-1H,5H-ben
zo(i,j)chinolizinium))-2,4-neopentylene-1,3,5,7-oc
tatetraenyl)-3-methylbenzothiazolium Perchlorate;I
R26;IR 5のいずれかであること（請求項１０）、デンド
リマーとして、その中心活性部が６員環を含む蛍光分子
であるものを用いること（請求項１１）、デンドリマー
として、その中心活性部が６員環を含む蛍光鎖体分子で
あるものを用いること（請求項１２）、デンドリマーと
して、その中心活性部がベンゼン環を含む分子であるも
のを用いること（請求項１３）、デンドリマーとして、
その中心活性部がポルフィリン分子を含む分子であるも
のを用いること（請求項１４）、デンドリマーとして、
その末端官能基が末端官能基 COOH, -NH₂, -SH, -OH, -
CH=CH₂, -Ph-1を有する化学基を持つものを用いること
（請求項１５）をその態様として提供する。

【００２８】

【発明の実施の形態】この出願の発明の試料調整法は、
上記のとおり、試料を量子ドットまたはデンドリマーに
より染色することを特徴としている。より具体的には、
超微細の無機半導体材料または超分子である量子ドット
またはデンドリマーを蛍光ラベラー分子として用い、試
料を染色することで、たとえば生体試料の細胞内の観察
対象となる部位に量子ドットまたはデンドリマーを結合
させる。これにより、蛍光信号の短時間、且つ高感度の
超解像計測を実現することができる。以下に、量子ドッ
トおよびデンドリマーについてさらに説明する。

【００２９】［量子ドット］量子ドットは、ナノメート
ルオーダーの微小領域にバンド構造をもたすことがで
き、極めて狭い空間領域に無数の励起子を発生させるこ
とができる。したがって、禁制帯幅以上の光子エネルギ
ーをもつパルスレーザー光の照射により、一瞬に価電子
帯の電子が多数導電帯に励起され、然るべき励起寿命を
経て、極めて強い蛍光発光を観測することができるよう
になる。有機分子からなる従来の蛍光ラベラー分子が一
回のパルスレーザー光照射で一回の励起しか起こらない
のに対し、この発明の試料調整方法で用いる量子ドット
は一回のパルスレーザー光照射で多数の励起電子が発生
し、その数に応じた光子が蛍光として放出されるのであ
る。したがって、同じ１回のパルス光照射であっても、
発光する蛍光強度は格段に強くなる。

【００３０】このような量子ドットの光学的性質によっ
て、試料の興味のある部位に修飾すれば、１個の量子ド
ットであっても１回のパルスレーザー光照射で計測可能
な十分な光子数の蛍光が放出される。その結果として、
パルスレーザーを光源とする従来の二重共鳴吸収顕微鏡
においては、蛍光信号の計測時間が短くなり、しかも照
射する光の総量も少なくなるので、試料に対するダメー
ジは低減されることとなる。

【００３１】図７および図８は、各々、量子ドットのバ
ンド構造の一例を示したものである。量子ドットを蛍光
ラベラー分子として用いる場合も、たとえば特願平１０
−９７９２４などにおいて従来の蛍光ラベラー分子とし
て用いられている各有機系色素分子と同様に、二重共鳴
吸収過程と誘導放出過程により蛍光を抑制できる。

【００３２】図７に例示したように、バンドギャップＥ
ｇ以上の光子エネルギーをもった波長λ₁の光が量子ド
ットに入射した場合、価電子帯に居た電子が伝導帯１に
励起される。励起された電子は、然るべき寿命ののちに
伝導帯１の最下端まで失活した後、波長λｆの蛍光を発
して、再び価電子帯に戻る。

【００３３】図８に例示したように、波長λ₁光の照射
によって伝導帯１にいる励起電子は、波長λ₂光の照射
によって、二重共鳴吸収過程によりさらにエネルギー的
に高い伝導帯２や真空準位に励起し、あるいは誘導放出
過程により強制的に波長λ₂光を放出して再び価電子帯
に戻る。このとき、図７の場合とは異なり、波長λｆの
蛍光を全く発しないのである。言い換えると、たとえば
波長λｆのみの蛍光を検出しているとすれば、波長λ₁
光による励起によって蛍光を発していた量子ドットが、
波長λ₂光を照射した瞬間に蛍光を発しなくなることに
なる。

【００３４】このような量子ドットの光学的特性を利用
することで、二重共鳴吸収顕微鏡における蛍光の検出時
間および検出感度を格段に高めることができるのであ
る。

【００３５】図９（ａ）（ｂ）は、各々、数１０ｎｍの
ＣｄＳｅ量子ドットをＤＮＡの特定の部位に結合させた
一例を示したものである。これら図９（ａ）（ｂ）に示
した例は、R.L.Letsinger等により行われた量子ドット
−ＤＮＡ結合例である（R.L.Letsinger et.al J.Am.Che
m.Soc 121, 8122,(1999)参照）。これらの例からも分か
るように、この発明の試料調整法による量子ドットを用
いた試料染色は、たとえば生体試料における特定の部位
を選択して任意に実施可能である。

【００３６】［デンドリマー］この出願の発明の試料調
整法では、蛍光ラベラー分子として、上述した量子ドッ
トの代わりに、樹木構造をもつ巨大分子であるデンドリ
マーを用いてもよい。デンドリマーとは、たとえば図１
０〜図１４に例示したように、特定な分子を構成単位と
して、幹上に結合させた超分子である。このような構造
を有するデンドリマーは、数１００以上の単位構成分子
を内包することが可能であり、またそのサイズも数〜数
１０ナノメートルであって量子ドットとほぼ同等の大き
さをもつ。このデンドリマーの単位構成分子に蛍光色素
分子を選べば、量子ドットと同様に１回のパルスレーザ
ー光照射により、デンドリマー内に多数のＳ₁状態の励
起分子を発生させることができ、デンドリマーは強い蛍
光を発光するようになる。なお、図１０〜図１４に例示
した各デンドリマーは、コアにアゾユニットを持つ一連
のアゾデンドリマーである。

【００３７】以上のように、この出願の発明の試料調整
法では、上述した量子ドットまたはデンドリマーにより
試料を染色することで、特に量子ドットまたはデンドリ
マーを化学結合基を突出させた生体試料の蛋白質の終端
に修飾することで、二重共鳴吸収顕微鏡における検出時
間を短縮させ、且つ検出感度を格段に高めることができ
る。

【００３８】上述した光学特性を有する量子ドットの具
体例としては、たとえば、元素周期表における第III属
元素と第V属元素の組合せからなるもの、または第II属
元素と第VI属の組合せからなるものがある。以下はその
組合せ例である。・BN, BP, BAs, AlN, AlP, AlAs, AlSb, GaN, GaP, GaS
b, InN, InP, InAs, InSb （以上、第III属と第V属）・ZnO, ZnS, ZnSe, ZnTe, CdSe, CdTe, HgS, HgSe, HgT
e （以上、第II属と第VI属）また、これ以外のMgTe, MgSe, C, Si, Ge, BeTe,や、二
つ以上の元素を含むAlGaAs, GaInP, GaInAs, AlGaInP,
AlGaAsSb, InAsSbP, InGaN, ZnSSe, ZnCdSe, PbSnSeTe
なども量子ドットとして用いることができる。

【００３９】さらに、これらの中でも硫黄Sを含んだも
のは、直接有機分子とチオール結合が可能であり、任意
の化学基を持つ側鎖分子を結合できる。この側鎖分子を
ブリッジとしてさらに任意の試料（特に生体試料）の部
位に量子ドットを結合できる。硫黄Ｓと同じ第VI属にあ
るTe, Seも同様な化学結合が可能であり、S, Te, Seの
いずれかを含む量子ドットは生体分子の結合性が極めて
良いものとなる。

【００４０】さらにまた、これらS, Te, Se を含まない
量子ドットはS, Te, Se を含む材料でコーティングすれ
ば、生体組織とのブリッジングが良好となる。なお、コ
ーティング材料としては、励起および蛍光波長に対して
透明であり、中心部の量子ドットの光学特性を損なうこ
とのないものを用いる必要がある。たとえば、図１５に
例示したようにCdSeにZnSをコーティングした場合、ZnS
のバンドギャップは約３．８ｅＶ（波長に換算すると３
２０〜３３０ｎｍ前後）であり、CdSeのバンドギャップ
は約２．２ｅＶ（波長に換算すると５５０〜６００ｎｍ
前後）であるので、ZnSの吸収光子エネルギーは遥かにC
dSeのそれよりも大きく、CdSeの励起波長や蛍光波長に
対して完全に透明になっている。図１６は、図１５に例
示したZnSコートのCdSe量子ドットについての、粒径が
２．１ｎｍ，２．４ｎｍ，３．１ｎｍ，３．６ｎｍ，
４．６ｎｍの場合の吸収スペクトルおよび蛍光スペクト
ルを例示したものである。このように、コーティング材
料のバンドギャップが量子ドットのバンドギャップより
も大きいという関係にあれば、光学特性と生体組織への
接合特性に優れた理想的な蛍光ラベラー分子が実現され
る。

【００４１】また、量子ドットの表面またはその表面を
コーティングした場合にはコーティング表面に有機側鎖
を有するものを用いることもできる。有機側鎖の具体例
としては、たとえば、図１５に例示したように末端官能
基-COOHを有する化学基をもつものや、-NH₂, -SH, -OH,
-CH=CH₂, -Ph-1を有する化学基をもつものが好まし
く、DNAをはじめとする生体部位へのブリッチングを更
に増強することができる。

【００４２】また、上記のような無機材料ではなく、た
とえば図１７（ａ）（ｂ）に例示したように、有機分子
をベースとしたデンドリマーに蛍光色素分子を内包させ
たものを用いることもできる。

【００４３】たとえば、代表的な蛍光色素分子であるロ
ーダミン６Ｇやクマリンでは、１分子／１（ｎｍ）³と
いう高密度で内包させることができるので、たとえば直
径５０ｎｍサイズのデンドリマーを想定すると、６００
００個の色素分子を閉じこめることができ、極めて明る
い蛍光標識として機能する。加えて、蛋白質など任意の
部位に結合できる化学側鎖も無数にあり、生体材料への
ブリッチングは極めて良い。一方、光学特性は蛍光色素
分子そのものなので、従来の二重共鳴吸収顕微鏡と極め
て整合性が良い。たとえば、ローダミン１では、吸収帯
域が４５０〜５００ｎｍ、蛍光波長が５７０〜６２５ｎ
ｍであり、クマリンでは、吸収帯域が３００〜４００ｎ
ｍ、蛍光波長が４００〜５００ｎｍである。

【００４４】この他にも、以下の蛍光色素分子を含んだ
デンドリマーを用いることができる。2,2"-Dimethyl-p-
terphenyl;P-terphenyl(PTP);3,3',2",3"-Tetramethyl-
P-quaterphenyl;2,2'''-Dimethyl-P-quaterphenyl;2-Me
thyl-5-t-butyl-p-quaterphenyl;2-(4-Biphenylyl)-5-
(4-t-butylphenyl)-1,3,4-oxiazol(BPBD-365);2-(4-Bip
henylyl)-phenyl-1,3,4-oxadiazol;2,5,2''''5,''''-Te
tramethyl-p-quinquephenyl;3,5,3''''5,''''-Tetra-t-
butyl-p-quinquephenyl;2,5-Diphenyloxazol;2,5-Diphe
nylfuran;PQP(p-Quanterphenyl;2,5-Bis-(4-biphenyly
l)-1,3,4-oxadiazol;p-Quaterphenyl-4-4'''-disulfoni
cacid Disodiumsalt;p-Quaterphenyl-4-4'''-disulfoni
cacid Dipotassiumsalt;4,4'''-Bis-(2-butyloctyloxy)
-p-quanterphenyl;3,5,3''''5,''''-Tetra-t-butyl-p-s
exiphenyl;2-(1-Naphthyl)-5-phenyloxazol;2-(4-Biphe
nylyl)-6-phenylbenzoxazotetrasulfonicacid Potassiu
m Salt;2-(4-Biphenylyl)-6-phenylbenzoxazol-1,3;4,
4'-Diphenylstilbene;[1,1'-Biphenyl]-4-sulfonic aci
d, 4,4"-1,2-ethene-diylbis-,dipotassium salt;2,5-B
is-(4-biphenylyl)-oxazol;2,2'-([1,1'-Biphenyl]-4,
4'-diyldi-2,1-ethenediyl)-bis-benzenesulfonic acid
Disodium Salt;7-Amino-4-methylcarbostyryl;1,4-Di
[2-(5-phenyloxazoly)]benzene;7-Hydroxy-4-methylcou
marin;p-Bis(o-methylstyryl)-benzene;Benzofuran,2,
2'-[1,1'-biphenyl]-4,4'-diyl-bis-tetrasulfonic-aci
d;7-Dimethylamino-4-methylquinolom-2;7-Amino-4-met
hylcoumarin;2-(p-Dimethylaminostyryl)-pyridylmethy
l Iodide;7-Diethylaminocoumarun;7-Diethylamino-4-m
ethylcoumarin;2,3,5,6-1H,4H-Tetrahydro-8-methylqin
olizino-[9,9a,1-gh]-coumarin;7-Diethylamino-4-trif
luormethylcoumarin;7-Dimethylamino-4-trifluormethy
lcoumarin;7-Amino-4-trifluormethylcoumarin;2,3,5,6
-1H,4H-Tetrahydroquinolizino-[9,9a,1-gh]-coumarin;
7-Ethylamino-6-methyl-4-trifluormethylcoumarin;7-E
thylamino-4-trifluormethylcoumarin;2,3,5,6-1H,4H-T
etrahydro-9-carboethoxyquinolizino--[9,9a,1-gh]cou
marin;2,3,5,6-1H,4H-Tetrahydro-9-(3-pyridyl)-quino
lizino-[9,9a,1-gh]coumarin;3-(2'-N-Methylbenzimida
zolyl)-7-n,n-diethylaminocoumarin;2,3,5,6-1H,4H-Te
trahydro-9-acetylquinolizino-[9,9a,1-gh]-coumarin;
N-Methyl-4-trifluormethylpiperidino-[3,2-g]-coumar
in;2-(p-Dimethylaminostyryl)-benzothiazolylethyl I
odide;3-(2'-Benzimidazolyl)-7-N,N-diethylaminocoum
arin;Brillantsulfaflavin;3-(2'-Benzothiazolyl)-7-d
iethylaminocoumarin;2,3,5,6-1H,4H-Tetrahydro-8-tri
fluormethylquinolizino-[9,9a,1-gh]coumarin;3,3'-Di
ethyloxacarbocyanine Iodide;3,3'-Dimethyl-9-ethylt
hiacarbocyanine Iodide;Disodium Fluorescein (Urani
n);9-(o-Carboxyphenyl)-2,7-dichloro-6-hydroxy-3H-x
anthen-3-on2,7-Dichlorofluorescien・Fluorescein 54
8;Fluorol 555 (Fluorol 7GA);o-(6-Amino-3-imino-3H-
xanthen-9-yl)-benzonic acid (Rhodamine 560);Benzoi
cAcid,2-[6-(ethylamino)-3-(ethylimino)-2,7-dimethy
l-3H-xanthen9-yl], perchlorate(Rhodamine 575);Benz
onic Acid,2-[6-(ethylamino)-3-(ethylimino)-2,7-di
methyl-3X-xanthen-9-yl]-ethylester,monohydrochlori
de (Rhodamine 590);1,3'-Diethyl-4,2'-quinolyloxaca
rbocyanine Iodide;1,1'-Diethyl-2,2'-carbocyanine I
odid;2-[6-(diethylamino)-3-(diethylimino)-3H-xanth
en-9-yl] benzonic acid (Rhodamine 610);Ethanaminiu
m,N-[(6-diethylamino)-9-(2,4-disulfophenyl)-3H-xan
then-3-ylidene]-N- ethylhydroxid,inner salt,sodium
salt;Malachit Green;3,3'-Diethylthiacarbocyanine
Iodide;1,3'-Diethyl-4,2'-quinolylthiacarbocyanine
Iodide;8-(2-Carboxyphenyl)-2,3,5,6,11,12,14,15-oct
ahydro-1H,4H,10H,13H-diquinolizino[9,9a,1-bc:9',9
a',1-hi]xanthylium Perchlorate (Rhodamine640);4-Di
cyanmethylene-2-methyl-6-(p-dimethylaminostyryl)-4
H-pyran;3,3'-Diethyloxadicarbocyanine Iodide;8-(2,
4-Disulfophenyl)-2,3,5,6,11,12,14,15-octahydro-1H,
4H,10H,13H-diquinolizino [9,9a,1-bc:9',1-hi]xanthe
ne (Sulforhodamine 640);5,9-Diaminobenzo[a]phenoxa
zonium Perchorate;9-Diethylamino-5H-benzo(a)phenox
azin-5-one;5-Amino-9-diethylimino(a)phenoxazonium
Perchlorate;3-Ethylamino-7-ethylimino-2,8-dimethyl
phenoxazin-5-ium Perchorate;8-(Trifluoromethyl)-2,
3,5,6,11,12,14,15-octahydro-1H,4H,10H,13H-diquinol
izino[9,9a,1-bc:9',9a,1-hi]xanthylium Perchlorate;
1-Ethyl-2-(4-(p-Dimethylaminophenyl)-1,3-butadieny
l)-pyridinium Perchlorate;Carbazine 122;9-Ethylami
no-5-ethylimino-10-methyl-5H- benzo(a)phenoxazoniu
m Perchlorate;3-Diethylamino-7-diethyliminophenoxa
zonium Perchlorate;3-Diethylthiadicarbocyanine Iod
ide;Oxazine 750;1-Ethyl-4-(4-(p-Dimethylaminopheny
l)-1,3-butadienyl)-pyridininum Perchlorate;1,1',3,
3,3',3'-Hexamethylindodicarbocyanine Iodide;1,1'-D
iethyl-4,4'-carbocyanine Iodide;2-(4-(p-Dimethylam
inophenyl)-1,3-butadienyl)-1,3,3-trimethyl-3H-indo
liumPerchlorate;2-(4-(p-Dimethylaminophenyl)-1,3-b
utadienyl)-3-ethylbenzothoazolium Perchlorate;1,1'
-Diethyl-2,2'-dicarbocyanine Iodide;1-Ethyl-4-(4-
(9-(2,3,6,7-tetrahydro-1H,5H-benzo(i,j)-chinolinoz
inium))-1,3-buta dienyl)-pyridinium Perchlorate;3,
3'-DimethyloxatricarbocyanineIodide;1-Ethyl-4-(p-D
imethylaminophenyl)-1,3-buta dienyl)-quinoliniumPe
rchlorate;8-Cyano-2,3,5,6,11,12,14,15-octahydro-1
H,4H,10H,13H-diquinolizino[9,9a,1-bc:9a',1-hi]xant
hylium Perchlorate (Rhodamine800];2-(6-(4-Dimethyl
aminophenyl)-2,4-neopentylene-1,3,5)-3-methylbenzo
thiazolium Perchlorate;1,1',3,3,3',3'-Hexamethylin
dotricarbocyanine Iodide;IR125;3,3'-Diethylthiatri
carbocyanine Iodide;IR144;2-(6-(9-(2,3,6,7,-Tetrah
ydro-1H,5H-benzo(i,j)-chinolizinium))-2,4-neopenty
lene-1,3,5-hexatrienyl)-3-methyllbenzothiazolium P
erchlorate;3,3'-Diethyl-9,11-neopentylenethiatrica
rbocyanine Iodide;1,1',3,3,3',3'-Hexamethyl-4,4',
5,5'-dibenzo-2,2'-indotricarbocyanine Iodide;3,3'-
Diethyl-4,4',5,5'-dibenzothiatricarbocyanine Iodid
e;1,2'-Diethyl-4,4'-dicarbocyanine Iodide;IR140;2-
(8-(4-p-Dimethyhlaminophenyl)-2,4-neopentylene-1,
3,5,7-octatetraenyl)-3-methylbenzothiazolium Perch
lorate;IR132;2-(8-(9-(2,3,6,7-Tetrahydro-1H,5H-ben
zo(i,j)chinolizinium))-2,4-neopentylene-1,3,5,7-oc
tatetraenyl)-3-methylbenzothiazolium Perchlorate;I
R26;IR 5。

【００４５】以上のデンドリマーを用いれば、従来の有
機蛍光ラベラー分子では試料中の観察部位に蛍光分子を
１分子しかラベリングできないのに対し、実質的に３桁
以上も多い分子を試料中の観察部位に結合でき、ナノ空
間領域におけるさらなる高感度検出を実現することがで
きる。

【００４６】また、デンドリマーの中心活性部に６員環
を含む蛍光分子（蛍光活性分子とも呼ぶ）が結合したも
のを用いることもできる。たとえば、図１８（ａ）
（ｂ）に例示したデンドリマーは、蛍光活性分子として
の各種ローダミン系分子である1-アミノアントラキノン
やその他オジキサン-1が１個または複数個、直接結合さ
れているものであり、また、図１９（ａ）（ｂ）に例示
したデンドリマーは、蛍光活性分子としてのポルフェリ
ン系分子やp-ターフェニルが結合されているものであ
る。

【００４７】また、中心活性部に蛍光錯体分子が配置さ
れているデンドリマーを用いてもよい。図２０は、蛍光
鎖体分子であるルテニウムビピリジル鎖体を含むデンド
リマーの構造を例示したものである。

【００４８】また、デンドリマーとして、その中心活性
部がベンゼン環を含む分子であるものや、中心活性部が
ポルフィリン分子を含む分子であるものを用いてもよ
い。

【００４９】また、デンドリマーと生体部位のブリッジ
ング特性に関しては、量子ドットの場合と同様に、デン
ドリマーの末端官能基が末端官能基COOH, -NH₂, -SH, -
OH,-CH=CH₂, -Ph-1のいずれかを有する化学基を持て
ば、アミノ結合やチオール結合によって結合性が良好と
なる。

【００５０】以上のこの出願の発明の試料調整法は、前
記の特願平６−３２９１６５、特願平８−３０２２３
２、特願平９−２５５４４４、特願平１０−９７９２４
に開示された二重共鳴吸収顕微鏡すべてにそのまま適用
することができる。

【００５１】また、これらの二重共鳴吸収顕微鏡の他に
も、本願発明の発明者は、超解像性をさらに向上させる
べく改良した新しい二重共鳴吸収顕微鏡をすでに提案し
ており（特願２０００−８２８９０、特願２０００−８
２８９３、特願２０００−８２８９８、特願２０００−
８２９３０、特願２０００−８５３６８参照）、この発
明の試料調整法は、これらの新しい二重共鳴吸収顕微鏡
にもそのまま適用することができる。

【００５２】もちろん、そのまま適用可能であるといっ
ても、用いる量子ドットまたはデンドリマーに従って、
ポンプ光およびイレース光（二重共鳴吸収過程のみを利
用した場合）もしくはプローブ光（過渡ラマン散乱過程
と二重共鳴吸収過程を併用した場合）の波長等や、光路
上のフィルター等や、検出光学系等を調整するなど、量
子ドットまたはデンドリマーを用いることにより当然に
調整すべきことは必要となる。

【００５３】二重共鳴吸収顕微鏡の詳細な構成や機能な
どについては、特願平６−３２９１６５、特願平８−３
０２２３２、特願平９−２５５４４４、特願平１０−９
７９２４、特願２０００−８２８９０、特願２０００−
８２８９３、特願２０００−８２８９８、特願２０００
−８２９３０、特願２０００−８５３６８を参照された
い。なお、特願２０００−８５３６８は本願発明の発明
者により提案された新しい蛍光相関法について開示して
おり、この蛍光相関法とこの出願の発明の試料調整法と
を二重共鳴吸収顕微鏡において併用できることは言うま
でもない。

【００５４】この出願の発明は、以上のとおりの特徴を
有するものであるが、以下に、添付した図面に沿って実
施例を示し、さらに詳しくこの出願の発明の実施の態様
について説明する。

【００５５】

【実施例】ここでは、試料を染色する蛍光ラベラー分子
として、図１５に例示したように、CdSe量子ドットの表
面にZnS膜がコーティングされたものであって、ZnS膜表
面に-SCH₂COOH側鎖が伸びて、タンパク質とチオール結
合が可能なものを用いた場合の実施例について説明す
る。

【００５６】図１６に例示したように、CdSe量子ドット
は、４００ｎｍより短波長側に強い吸収バンドがあり、
吸収ピークは波長約３５５ｎｍ近傍に存在している。ま
た、バンドギャップＥｇは約２ｅＶ程度であり、その粒
径に依存して約５００〜６６０ｎｍの広い領域に蛍光帯
域が現れる。たとえば、量子ドットの粒径を３．１ｎｍ
とした場合、約５６０ｎｍ近傍で強い蛍光を発するのが
わかる。

【００５７】したがって、粒径３．１ｎｍの場合、たと
えば、ポンプ光を波長λ₁＝約３５５ｎｍ、イレース光
を波長λ₂＝約５６６ｎｍ（＝蛍光発光中心の５６０ｎ
ｍから外れた波長）とし、まず図２１に例示したように
ポンプ光照射により量子ドットの価電子を伝電帯１に励
起させ、続いて図２２に例示したように励起電子が荷電
子帯へ脱励起する前にイレース光照射する。これによ
り、波長λ₂以外の蛍光は、誘導放出または二重共鳴吸
収過程により抑制されて、二重共鳴吸収顕微鏡による超
解像観察が実現できる。

【００５８】また、粒径３．１ｎｍの場合、CdSe結晶は
５．８７ｇ／ｃｍ³であり、Cdの原子量は１１２．４、S
eの原子量は７８．９であるので、１量子ドット当り約
２６０個のCdとSeが含有されている。価電子帯の電子は
各元素の最外殻軌道の電子から混成されているとする
と、Seの４ｐ電子４個とCdの５ｓ電子２個を混成させて
いるので、結局価電子帯には１量子ドット当り１５００
程度の励起可能な電子が存在する。したがって、パルス
レーザー光照射により、１パルスで最大１５００個の励
起電子が発生することとなる。たとえば、発光量子収率
が５０％であり、光学系や検出器の感度を含めた検出器
効率が１０％である場合、蛍光光子の有効計測数は７５
となる。

【００５９】これに対して、ナノ秒のパルスレーザーで
従来の有機蛍光ラベラー分子を励起しても、１個の蛍光
ラベラー分子がＳ₁状態に励起できる回数はせいぜい数
回である。たとえば、従来の有機蛍光ラベラー分子とし
てローダミン６Ｇを用い、パルスレーザー光源として市
販の標準的なＹＡＧレーザーを用いた場合、ローダミン
６Ｇ分子のＳ₁状態の寿命は３ｎｓｅｃ程度であり、他
方、市販ＹＡＧレーザーによるパルス幅は７ｎｓｅｃ程
度であるので、１パルスにつき励起回数は２回である。
これに量子効率および検出効率を考慮すると、有効計測
量は数％となり、１観察領域の画素データを測定するの
に膨大な時間がかかってしまう。

【００６０】このように、この発明の試料調整法におい
て用いられる量子ドットは、パルス計測において、量子
ドットに結合した試料分子（たとえば生体分子）を短時
間、且つ高感度で超解像観測するのに適した蛍光ラベラ
ー分子であることがわかる。

【００６１】また、本実施例におけるCdSe量子ドット
は、液相エピタキシャル成長法で簡易に化学実験室系で
合成できるため、非常に低コストの設備投資で生成でき
るだけでなく、以下のような利点がある。・比較的低温で熱平衡に近い条件下での成長であるため
に、結晶性に優れている。・不純物の偏析効果のために、不純物が溶液中から成長
結晶中に取り込まれる量が少なく、高純度の結晶が得ら
れる。

【００６２】もちろん、本実施例におけるCdSe量子ドッ
トだけではなく、前述したその他の量子ドットおよびデ
ンドリマーを蛍光ラベラー分子として用いた場合でも、
同様に短時間、且つ高感度の優れた超解像観察を実現で
きることは言うまでもない。

【００６３】この発明は以上の例に限定されるものでは
なく、細部については様々な態様が可能である。

【００６４】

【発明の効果】以上詳しく説明した通り、この出願の発
明の試料調整方法によって、従来よりも極めて少ない光
照射により微小領域からの蛍光信号の短時間、且つ高感
度測定を実現することができ、二重共鳴吸収顕微鏡の超
解像性を十分に引き出して実用性のさらなる向上を図る
ことができるようになる。

【図面の簡単な説明】

【図１】基底状態の試料分子の電子配置を例示した図で
ある。

【図２】Ｓ₁状態に励起された試料分子の電子配置を例
示した図である。

【図３】Ｓ₂状態に励起された試料分子の電子配置を例
示した図である。

【図４】脱励起した試料分子の電子配置を例示した図で
ある。

【図５】二重共鳴吸収過程を例示した概念図である。

【図６】二重共鳴吸収過程を空間的に例示した概念図で
ある。

【図７】量子ドットを用いた場合の電子励起過程の一例
を示した概念図である。

【図８】量子ドットを用いた場合の電子励起過程の別の
一例を示した概念図である。

【図９】（ａ）（ｂ）は、各々、量子ドット−ＤＮＡ結
合の一例を示した図である。

【図１０】デンドリマーの一例を示した図である。

【図１１】デンドリマーの別の一例を示した図である。

【図１２】デンドリマーの別の一例を示した図である。

【図１３】デンドリマーの別の一例を示した図である。

【図１４】デンドリマーの別の一例を示した図である。

【図１５】ZnSコートのCdSe量子ドットの一例を示した
図である。

【図１６】粒径が２．１ｎｍ，２．４ｎｍ，３．１ｎ
ｍ，３．６ｎｍ，４．６ｎｍの場合の図１５の量子ドッ
トの吸収スペクトルおよび蛍光スペクトルを例示した図
である。

【図１７】（ａ）（ｂ）は、各々、デンドリマーの一例
を示した図である。

【図１８】（ａ）（ｂ）は、各々、デンドリマーの別の
一例を示した図である。

【図１９】（ａ）（ｂ）は、各々、デンドリマーの別の
一例を示した図である。

【図２０】デンドリマーの別の一例を示した図である。

【図２１】粒径３．１ｎｍの図１５の量子ドットを用い
た場合の電子励起過程の一例を示した概念図である。

【図２２】図２１に続く電子励起過程の一例を示した概
念図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者藤井正明愛知県岡崎市竜美南２−３−１６号棟 303号 (72)発明者尾松孝茂神奈川県横浜市戸塚区平戸５−10−９ (72)発明者鈴木智雄千葉県千葉市花見川区幕張本郷６−11−13 ニューバイオレット101 (72)発明者皆方誠静岡県浜松市広沢１−23−２合同宿舎広沢住宅３−31 (72)発明者山元公寿東京都大田区田園調布９−２−304 (72)発明者中谷和彦京都府宇治市菟道門前11−１コーポみむろ10 Ｆターム(参考） 2G043 BA16 CA03 CA06 DA02 EA01 FA02 GA07 GB21 LA01 NA13 2G045 AA24 BA14 BB25 FA16 FB12 GC15 2H052 AA00 AA09 AC34 AF02

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】二重共鳴吸収顕微鏡における試料を調整
する方法であって、試料を量子ドットにより染色するこ
とを特徴とする試料調整法。
【請求項２】量子ドットとして、元素周期表における
第III属元素と第V属元素の組合せからなるもの、または
第II属元素と第VI属元素の組合せからなるものを用いる
請求項１の試料調整法。
【請求項３】量子ドットとして、BN, BP, BAs, AlN,
AlP, AlAs, AlSb, GaN, GaP, GaSb, InN, InP, InAs, I
nSb,ZnO, ZnS, ZnSe, ZnTe, CdSe, CdTe, HgS, HgSe, H
gTe, MgTe, MgSe, C, Si, Ge, BeTe, AlGaAs, GaInP, G
aInAs, AlGaInP, AlGaAsSb, InAsSbP, InGaN, ZnSSe, Z
nCdSe, PbSnSeTeのいずれかを用いる請求項１の試料調
整法。
【請求項４】量子ドットとして、S, Te, Seのいずれ
かを含む材料でコーティングされたものを用いる請求項
１の試料調整法。
【請求項５】コーティング材料として、量子ドットの
バンドギャップよりも大きいバンドギャップを有するも
のを用いる請求項４の試料調整法。
【請求項６】量子ドットとして、その表面またはコー
ティング表面に有機側鎖を有するものを用いる請求項１
ないし５のいずれかの試料調整法。
【請求項７】有機側鎖が、末端官能基-COOH, -NH₂, -
SH, -OH, -CH=CH₂,-Ph-1を有する化学基を持つものであ
る請求項６のいずれかの試料調整法。
【請求項８】二重共鳴吸収顕微鏡における試料を調整
する方法であって、試料をデンドリマーにより染色する
ことを特徴とする試料調整法。
【請求項９】デンドリマーとして、蛍光色素分子を含
むものを用いる請求項８の試料調整法。
【請求項１０】蛍光色素分子が、2,2"-Dimethyl-p-te
rphenyl;P-terphenyl(PTP);3,3',2",3"-Tetramethyl-P-
quaterphenyl;2,2'''-Dimethyl-P-quaterphenyl;2-Meth
yl-5-t-butyl-p-quaterphenyl;2-(4-Biphenylyl)-5-(4-
t-butylphenyl)-1,3,4-oxiazol(BPBD-365);2-(4-Biphen
ylyl)-phenyl-1,3,4-oxadiazol;2,5,2''''5,''''-Tetra
methyl-p-quinquephenyl;3,5,3''''5,''''-Tetra-t-but
yl-p-quinquephenyl;2,5-Diphenyloxazol;2,5-Diphenyl
furan;PQP(p-Quanterphenyl;2,5-Bis-(4-biphenylyl)-
1,3,4-oxadiazol;p-Quaterphenyl-4-4'''-disulfonicac
id Disodiumsalt;p-Quaterphenyl-4-4'''-disulfonicac
id Dipotassiumsalt;4,4'''-Bis-(2-butyloctyloxy)-p-
quanterphenyl;3,5,3''''5,''''-Tetra-t-butyl-p-sexi
phenyl;2-(1-Naphthyl)-5-phenyloxazol;2-(4-Biphenyl
yl)-6-phenylbenzoxazotetrasulfonicacid Potassium S
alt;2-(4-Biphenylyl)-6-phenylbenzoxazol-1,3;4,4'-D
iphenylstilbene;[1,1'-Biphenyl]-4-sulfonic acid,
4,4"-1,2-ethene-diylbis-,dipotassium salt;2,5-Bis-
(4-biphenylyl)-oxazol;2,2'-([1,1'-Biphenyl]-4,4'-d
iyldi-2,1-ethenediyl)-bis-benzenesulfonic acid Dis
odium Salt;7-Amino-4-methylcarbostyryl;1,4-Di[2-(5
-phenyloxazoly)]benzene;7-Hydroxy-4-methylcoumari
n;p-Bis(o-methylstyryl)-benzene;Benzofuran,2,2'-
[1,1'-biphenyl]-4,4'-diyl-bis-tetrasulfonic-acid;7
-Dimethylamino-4-methylquinolom-2;7-Amino-4-methyl
coumarin;2-(p-Dimethylaminostyryl)-pyridylmethyl I
odide;7-Diethylaminocoumarun;7-Diethylamino-4-meth
ylcoumarin;2,3,5,6-1H,4H-Tetrahydro-8-methylqinoli
zino-[9,9a,1-gh]-coumarin;7-Diethylamino-4-trifluo
rmethylcoumarin;7-Dimethylamino-4-trifluormethylco
umarin;7-Amino-4-trifluormethylcoumarin;2,3,5,6-1
H,4H-Tetrahydroquinolizino-[9,9a,1-gh]-coumarin;7-
Ethylamino-6-methyl-4-trifluormethylcoumarin;7-Eth
ylamino-4-trifluormethylcoumarin;2,3,5,6-1H,4H-Tet
rahydro-9-carboethoxyquinolizino--[9,9a,1-gh]couma
rin;2,3,5,6-1H,4H-Tetrahydro-9-(3-pyridyl)-quinoli
zino-[9,9a,1-gh]coumarin;3-(2'-N-Methylbenzimidazo
lyl)-7-n,n-diethylaminocoumarin;2,3,5,6-1H,4H-Tetr
ahydro-9-acetylquinolizino-[9,9a,1-gh]-coumarin;N-
Methyl-4-trifluormethylpiperidino-[3,2-g]-coumari
n;2-(p-Dimethylaminostyryl)-benzothiazolylethyl Io
dide;3-(2'-Benzimidazolyl)-7-N,N-diethylaminocouma
rin;Brillantsulfaflavin;3-(2'-Benzothiazolyl)-7-di
ethylaminocoumarin;2,3,5,6-1H,4H-Tetrahydro-8-trif
luormethylquinolizino-[9,9a,1-gh]coumarin;3,3'-Die
thyloxacarbocyanine Iodide;3,3'-Dimethyl-9-ethylth
iacarbocyanine Iodide;Disodium Fluorescein (Urani
n);9-(o-Carboxyphenyl)-2,7-dichloro-6-hydroxy-3H-x
anthen-3-on2,7-Dichlorofluorescien・Fluorescein 54
8;Fluorol 555 (Fluorol 7GA);o-(6-Amino-3-imino-3H-
xanthen-9-yl)-benzonic acid (Rhodamine 560);Benzoi
cAcid,2-[6-(ethylamino)-3-(ethylimino)-2,7-dimethy
l-3H-xanthen9-yl], perchlorate(Rhodamine 575);Benz
onic Acid,2-[6-(ethylamino)-3-(ethylimino)-2,7-di
methyl-3X-xanthen-9-yl]-ethylester,monohydrochlori
de (Rhodamine 590);1,3'-Diethyl-4,2'-quinolyloxaca
rbocyanine Iodide;1,1'-Diethyl-2,2'-carbocyanine I
odid;2-[6-(diethylamino)-3-(diethylimino)-3H-xanth
en-9-yl] benzonic acid (Rhodamine 610);Ethanaminiu
m,N-[(6-diethylamino)-9-(2,4-disulfophenyl)-3H-xan
then-3-ylidene]-N- ethylhydroxid,inner salt,sodium
salt;Malachit Green;3,3'-Diethylthiacarbocyanine
Iodide;1,3'-Diethyl-4,2'-quinolylthiacarbocyanine
Iodide;8-(2-Carboxyphenyl)-2,3,5,6,11,12,14,15-oct
ahydro-1H,4H,10H,13H-diquinolizino[9,9a,1-bc:9',9
a',1-hi]xanthylium Perchlorate (Rhodamine640);4-Di
cyanmethylene-2-methyl-6-(p-dimethylaminostyryl)-4
H-pyran;3,3'-Diethyloxadicarbocyanine Iodide;8-(2,
4-Disulfophenyl)-2,3,5,6,11,12,14,15-octahydro-1H,
4H,10H,13H-diquinolizino [9,9a,1-bc:9',1-hi]xanthe
ne (Sulforhodamine 640);5,9-Diaminobenzo[a]phenoxa
zonium Perchorate;9-Diethylamino-5H-benzo(a)phenox
azin-5-one;5-Amino-9-diethylimino(a)phenoxazonium
Perchlorate;3-Ethylamino-7-ethylimino-2,8-dimethyl
phenoxazin-5-ium Perchorate;8-(Trifluoromethyl)-2,
3,5,6,11,12,14,15-octahydro-1H,4H,10H,13H-diquinol
izino[9,9a,1-bc:9',9a,1-hi]xanthylium Perchlorate;
1-Ethyl-2-(4-(p-Dimethylaminophenyl)-1,3-butadieny
l)-pyridinium Perchlorate;Carbazine 122;9-Ethylami
no-5-ethylimino-10-methyl-5H- benzo(a)phenoxazoniu
m Perchlorate;3-Diethylamino-7-diethyliminophenoxa
zonium Perchlorate;3-Diethylthiadicarbocyanine Iod
ide;Oxazine 750;1-Ethyl-4-(4-(p-Dimethylaminopheny
l)-1,3-butadienyl)-pyridininum Perchlorate;1,1',3,
3,3',3'-Hexamethylindodicarbocyanine Iodide;1,1'-D
iethyl-4,4'-carbocyanine Iodide;2-(4-(p-Dimethylam
inophenyl)-1,3-butadienyl)-1,3,3-trimethyl-3H-indo
liumPerchlorate;2-(4-(p-Dimethylaminophenyl)-1,3-b
utadienyl)-3-ethylbenzothoazolium Perchlorate;1,1'
-Diethyl-2,2'-dicarbocyanine Iodide;1-Ethyl-4-(4-
(9-(2,3,6,7-tetrahydro-1H,5H-benzo(i,j)-chinolinoz
inium))-1,3-buta dienyl)-pyridinium Perchlorate;3,
3'-DimethyloxatricarbocyanineIodide;1-Ethyl-4-(p-D
imethylaminophenyl)-1,3-buta dienyl)-quinoliniumPe
rchlorate;8-Cyano-2,3,5,6,11,12,14,15-octahydro-1
H,4H,10H,13H-diquinolizino[9,9a,1-bc:9a',1-hi]xant
hylium Perchlorate (Rhodamine800];2-(6-(4-Dimethyl
aminophenyl)-2,4-neopentylene-1,3,5)-3-methylbenzo
thiazolium Perchlorate;1,1',3,3,3',3'-Hexamethylin
dotricarbocyanine Iodide;IR125;3,3'-Diethylthiatri
carbocyanine Iodide;IR144;2-(6-(9-(2,3,6,7,-Tetrah
ydro-1H,5H-benzo(i,j)-chinolizinium))-2,4-neopenty
lene-1,3,5-hexatrienyl)-3-methyllbenzothiazolium P
erchlorate;3,3'-Diethyl-9,11-neopentylenethiatrica
rbocyanine Iodide;1,1',3,3,3',3'-Hexamethyl-4,4',
5,5'-dibenzo-2,2'-indotricarbocyanine Iodide;3,3'-
Diethyl-4,4',5,5'-dibenzothiatricarbocyanine Iodid
e;1,2'-Diethyl-4,4'-dicarbocyanine Iodide;IR140;2-
(8-(4-p-Dimethyhlaminophenyl)-2,4-neopentylene-1,
3,5,7-octatetraenyl)-3-methylbenzothiazolium Perch
lorate;IR132;2-(8-(9-(2,3,6,7-Tetrahydro-1H,5H-ben
zo(i,j)chinolizinium))-2,4-neopentylene-1,3,5,7-oc
tatetraenyl)-3-methylbenzothiazolium Perchlorate;I
R26;IR 5のいずれかである請求項９の試料調整法。
【請求項１１】デンドリマーとして、その中心活性部
が６員環を含む蛍光分子であるものを用いる請求項８の
試料調整法。
【請求項１２】デンドリマーとして、その中心活性部
が６員環を含む蛍光鎖体分子であるものを用いる請求項
８の試料調整法。
【請求項１３】デンドリマーとして、その中心活性部
がベンゼン環を含む分子であるものを用いる請求項８の
試料調整法。
【請求項１４】デンドリマーとして、その中心活性部
がポルフィリン分子を含む分子であるものを用いる請求
項８の試料調整法。
【請求項１５】デンドリマーとして、その末端官能基
が末端官能基 COOH,-NH₂, -SH, -OH, -CH=CH₂, -Ph-1を
有する化学基を持つものを用いる請求項８ないし１４の
いずれかの試料調整法。