JP2001299347A - 産業用パン酵母の遺伝的バックグラウンドに劣性を導入する方法 - Google Patents
産業用パン酵母の遺伝的バックグラウンドに劣性を導入する方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 産業用パン酵母の遺伝的バックグラウンドに
劣性を導入する方法を提供すること。 【解決手段】 産業用パン酵母の遺伝的バックグラウン
ドに、劣性対立遺伝子に基づく、酵母菌株の性質を導入
する方法であって、（ａ）劣性対立遺伝子に基づく所望
の性質を有する酵母を選択する工程と；（ｂ）（ａ）で
選択した酵母を二倍体化して、ホモ接合型に関して選択
する工程と；（ｃ）産業用パン酵母を二倍体化して、ホ
モ接合型に関して選択する工程と；（ｄ）逆接合型を有
する、上記（ｂ）と（ｃ）において得られる菌株を接合
させて、四倍体接合体を得る工程と；（ｅ）（ｄ）で得
られた接合体を胞子形成させる工程と；（ｆ）所望の性
質を示す菌株を選択する工程と；（ｇ）逆接合型を有す
る、（ｆ）で選択した菌株を任意に接合させる工程とを
含む前記方法。
劣性を導入する方法を提供すること。 【解決手段】 産業用パン酵母の遺伝的バックグラウン
ドに、劣性対立遺伝子に基づく、酵母菌株の性質を導入
する方法であって、（ａ）劣性対立遺伝子に基づく所望
の性質を有する酵母を選択する工程と；（ｂ）（ａ）で
選択した酵母を二倍体化して、ホモ接合型に関して選択
する工程と；（ｃ）産業用パン酵母を二倍体化して、ホ
モ接合型に関して選択する工程と；（ｄ）逆接合型を有
する、上記（ｂ）と（ｃ）において得られる菌株を接合
させて、四倍体接合体を得る工程と；（ｅ）（ｄ）で得
られた接合体を胞子形成させる工程と；（ｆ）所望の性
質を示す菌株を選択する工程と；（ｇ）逆接合型を有す
る、（ｆ）で選択した菌株を任意に接合させる工程とを
含む前記方法。
Description
【０００１】
【発明が属する技術分野】本発明は、産業用パン酵母の
遺伝的バックグラウンドに、例えばｌｔｉ性質のよう
な、劣性対立遺伝子に基づく、特定酵母菌株の性質を安
定に導入する新規な方法に関する。本発明はさらに、上
記方法によって得られる酵母菌株であって、ドウの製造
及び産業的規模でのそれからのベークト製品の製造に用
いることができる前記酵母菌株に関する。
遺伝的バックグラウンドに、例えばｌｔｉ性質のよう
な、劣性対立遺伝子に基づく、特定酵母菌株の性質を安
定に導入する新規な方法に関する。本発明はさらに、上
記方法によって得られる酵母菌株であって、ドウの製造
及び産業的規模でのそれからのベークト製品の製造に用
いることができる前記酵母菌株に関する。
【０００２】
【従来の技術】市場では、現在、消費者が例えばピザー
クラスト、パン、クロワッサン等のような、多様な種類
のベークト食物を製造するために非常に種々なドウ製品
が入手可能である。これらの製品は一般に、ドウを発酵
させるプロセスに基づいて２つの主要なグループに、即
ち、化学的作用剤を用いてドウを発酵させるような製品
と、ドウ中に含有されるパン酵母の発酵活性によってド
ウを発酵させるような製品に分類することができる。
クラスト、パン、クロワッサン等のような、多様な種類
のベークト食物を製造するために非常に種々なドウ製品
が入手可能である。これらの製品は一般に、ドウを発酵
させるプロセスに基づいて２つの主要なグループに、即
ち、化学的作用剤を用いてドウを発酵させるような製品
と、ドウ中に含有されるパン酵母の発酵活性によってド
ウを発酵させるような製品に分類することができる。
【０００３】ドウのための発酵剤としての化学薬品の使
用は一般に利用されており、それらの挙動が予測可能な
化学反応に基づくものであり、ドウを発酵させるための
二酸化炭素発生量（体積）の特異的制御を可能にすると
いう利点を有する。二酸化炭素発生量と前記発生が行わ
れる瞬間とが制御可能であるので、長い貯蔵寿命後にも
ドウからのベークト製品(baked products)の製造を行う
ことができる。
用は一般に利用されており、それらの挙動が予測可能な
化学反応に基づくものであり、ドウを発酵させるための
二酸化炭素発生量（体積）の特異的制御を可能にすると
いう利点を有する。二酸化炭素発生量と前記発生が行わ
れる瞬間とが制御可能であるので、長い貯蔵寿命後にも
ドウからのベークト製品(baked products)の製造を行う
ことができる。
【０００４】それにも拘わらず、それによって得られる
最終ベークト製品はパン酵母を用いて発酵された製品に
比べて総合品質において劣っている。特に、前記製品の
テキスチャーは消費者にしばしば許容されず、製品は発
酵プロセス中に酵母によって発生されるフレーバー化合
物をも欠いている。
最終ベークト製品はパン酵母を用いて発酵された製品に
比べて総合品質において劣っている。特に、前記製品の
テキスチャーは消費者にしばしば許容されず、製品は発
酵プロセス中に酵母によって発生されるフレーバー化合
物をも欠いている。
【０００５】この理由から、食用ベークト製品の製造者
はかれらの製品にこのような化学薬品の使用をむしろ避
けようと試みて、パン酵母の使用に頼っている。しか
し、通常のパン酵母を含有する製品は“生きている微生
物”そのもの自体の使用に固有な、非常に多様な問題を
有している。
はかれらの製品にこのような化学薬品の使用をむしろ避
けようと試みて、パン酵母の使用に頼っている。しか
し、通常のパン酵母を含有する製品は“生きている微生
物”そのもの自体の使用に固有な、非常に多様な問題を
有している。
【０００６】これらの問題の１つは、ドウ中の酵母の活
性が直線的に制御されることができないという事実にあ
る。この理由から、通常のパン酵母は例えば室温のよう
な一般的な貯蔵条件下又は冷蔵庫において一般的である
ような、より低温においてさえも、二酸化炭素の一貫し
た産生を結果として生じる実質的な活性を示すので、酵
母含有ドウ組成物はごく限られた期間のみ貯蔵できるに
過ぎない。所望の活性化度を越えた通常のパン酵母のこ
の連続的な活性はドウの感覚器官刺激的及びレオロジー
的性質に不利な影響を与えて、味及びテキスチャーの観
点から許容されない最終製品を生じる。
性が直線的に制御されることができないという事実にあ
る。この理由から、通常のパン酵母は例えば室温のよう
な一般的な貯蔵条件下又は冷蔵庫において一般的である
ような、より低温においてさえも、二酸化炭素の一貫し
た産生を結果として生じる実質的な活性を示すので、酵
母含有ドウ組成物はごく限られた期間のみ貯蔵できるに
過ぎない。所望の活性化度を越えた通常のパン酵母のこ
の連続的な活性はドウの感覚器官刺激的及びレオロジー
的性質に不利な影響を与えて、味及びテキスチャーの観
点から許容されない最終製品を生じる。
【０００７】この特定の欠点を回避するための１つの試
みは、酵母の活性を最小に減ずるために、酵母含有ドウ
を通常はプレベークト(prebaked)形で約−２０℃の凍結
温度において貯蔵することであった。
みは、酵母の活性を最小に減ずるために、酵母含有ドウ
を通常はプレベークト(prebaked)形で約−２０℃の凍結
温度において貯蔵することであった。
【０００８】この目的に関して、ＥＰ−０４４２５７５
は、基質限定説を利用するドウ組成物の使用を教示す
る。したがって、ドウをマルターゼ陰性酵母によって、
その直接発酵可能な成分の全てが消耗されるまで発酵さ
せ、その後、このドウを長期間貯蔵のために凍結する。
使用の前に、凍結ドウを解凍して、化学作用剤を用いて
ドウをさらに発酵させる。しかし、このアプローチは、
凍結ドウ組成物から製造された製品が消費者のために新
鮮な、例えば冷蔵された、ドウ製品ほど便利ではない点
で不充分であることも実証されている。凍結ドウは解凍
して、たいていの場合に、ベーキングの前に予め活性化
しなければならず、ドウの徹底した活性化を回避するた
めに、この予めの活性化は消費者によるモニターリング
を必要とする。
は、基質限定説を利用するドウ組成物の使用を教示す
る。したがって、ドウをマルターゼ陰性酵母によって、
その直接発酵可能な成分の全てが消耗されるまで発酵さ
せ、その後、このドウを長期間貯蔵のために凍結する。
使用の前に、凍結ドウを解凍して、化学作用剤を用いて
ドウをさらに発酵させる。しかし、このアプローチは、
凍結ドウ組成物から製造された製品が消費者のために新
鮮な、例えば冷蔵された、ドウ製品ほど便利ではない点
で不充分であることも実証されている。凍結ドウは解凍
して、たいていの場合に、ベーキングの前に予め活性化
しなければならず、ドウの徹底した活性化を回避するた
めに、この予めの活性化は消費者によるモニターリング
を必要とする。
【０００９】その上、凍結ドウに由来する最終ベークト
製品のテキスチャーは、非凍結ドウから製造された製品
よりも劣ることが判明しており、酵母発酵に伴う特徴的
なフレーバーも劣っているか又はしばしば全く欠けてい
る。
製品のテキスチャーは、非凍結ドウから製造された製品
よりも劣ることが判明しており、酵母発酵に伴う特徴的
なフレーバーも劣っているか又はしばしば全く欠けてい
る。
【００１０】新鮮な酵母を含有するドウ組成物の貯蔵問
題を克服するための他のアプローチは、低温不活性な酵
母菌株を開発して、ドウ中に用いることである。これら
の酵母菌株は、低温において本質的に不活性であるが、
高温になったときに、即ち活性化温度になったときに、
それらの活性を保有する酵母菌株である。
題を克服するための他のアプローチは、低温不活性な酵
母菌株を開発して、ドウ中に用いることである。これら
の酵母菌株は、低温において本質的に不活性であるが、
高温になったときに、即ち活性化温度になったときに、
それらの活性を保有する酵母菌株である。
【００１１】ＥＰ−０４８７８７８には、ｌｔｉ性質を
有する酵母を構築する方法であって、サッカロマイセス
セレヴィジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒ
ｅｖｉｓｉａｅ）の菌株に突然変異誘発処理を受けさせ
て、ｌｔｉ性質を有する少なくとも１種類の突然変異体
を選択して、逆接合型を有するサッカロマイセス セレ
ヴィジエの野性型一倍体菌株によって少なくとも１回も
どし交雑して、ｌｔｉ性質と逆接合型とを有する少なく
とも２種類のもどし交雑分離体を選択して、少なくとも
１回交雑し、このようにして得られた、増殖力と、ｌｔ
ｉ性質と、ドウを膨張させる能力とを有する二倍体菌株
を選択する前記方法が記載されている。
有する酵母を構築する方法であって、サッカロマイセス
セレヴィジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒ
ｅｖｉｓｉａｅ）の菌株に突然変異誘発処理を受けさせ
て、ｌｔｉ性質を有する少なくとも１種類の突然変異体
を選択して、逆接合型を有するサッカロマイセス セレ
ヴィジエの野性型一倍体菌株によって少なくとも１回も
どし交雑して、ｌｔｉ性質と逆接合型とを有する少なく
とも２種類のもどし交雑分離体を選択して、少なくとも
１回交雑し、このようにして得られた、増殖力と、ｌｔ
ｉ性質と、ドウを膨張させる能力とを有する二倍体菌株
を選択する前記方法が記載されている。
【００１２】さらに、異なるｌｔｉ誘導体の構築が述べ
られている。このように、ＥＰ−０６６３４４１では、
ドウ中に含有されるマルトースとより不活発に反応する
ｌｔｉ菌株を構築する方法が記載されている。これらの
菌株は、ｌｔｉ性質を有する一倍体サッカロマイセス
セレヴィジエを、カタボライト抑制下にある活性マルタ
ーゼ遺伝子を有する一倍体サッカロマイセス セレヴィ
ジエと交雑させ、その後に分離帯を交雑させ、ｌｔｉ性
質、活性Ｍａｌ表現型（Ｍａｌ+）（マルターゼをコー
ドする遺伝子を誘導的に（野性型）又は構成的に発現す
る）を示す二倍体菌株を選択することによって、得られ
ることができ、増殖力を有する。
られている。このように、ＥＰ−０６６３４４１では、
ドウ中に含有されるマルトースとより不活発に反応する
ｌｔｉ菌株を構築する方法が記載されている。これらの
菌株は、ｌｔｉ性質を有する一倍体サッカロマイセス
セレヴィジエを、カタボライト抑制下にある活性マルタ
ーゼ遺伝子を有する一倍体サッカロマイセス セレヴィ
ジエと交雑させ、その後に分離帯を交雑させ、ｌｔｉ性
質、活性Ｍａｌ表現型（Ｍａｌ+）（マルターゼをコー
ドする遺伝子を誘導的に（野性型）又は構成的に発現す
る）を示す二倍体菌株を選択することによって、得られ
ることができ、増殖力を有する。
【００１３】しかし、業界の製造者の観点からは、ドウ
組成物又はそれからの食用ベークト製品の製造に見られ
る主要な問題の１つは、妥当な経費でのドウの大規模生
産を可能にする酵母菌株を用いなければならないことで
ある。このためには、酵母菌株は高収率、高度なバイオ
マス産生及び／又は良好な乾燥性を有するべきである。
産業的規模でドウ組成物のこのような生産を可能にする
菌株はまだ限られた数でのみ入手可能であるにすぎず、
それゆえ、その遺伝的理由、即ち、これらの性質を惹起
する遺伝子はまだ不明である。このような菌株の例はＬ
ｅｖｕｒｅ Ｂｏｕｌａｎｇｅｅｒｅ Ｂｌｅｕｅ（Ｌ
ｅｓａｆｆｒｅ ｅｔ Ｃｉｅ、パリ、フランスから入
手可能）、Ｆｅｒｍｉｐａｎ（Ｆｅｒｍｉｐａｎ Ｒｅ
ｄ、Ｇｉｓｔ−Ｂｒｏｃａｄｅｓ、デルフト、オランダ
から入手可能）、又はＨＳ（Ｈｅｆｅ Ｓｃｈｗｅｉ
ｚ、シュテットフルト、スイスから入手可能）である。
組成物又はそれからの食用ベークト製品の製造に見られ
る主要な問題の１つは、妥当な経費でのドウの大規模生
産を可能にする酵母菌株を用いなければならないことで
ある。このためには、酵母菌株は高収率、高度なバイオ
マス産生及び／又は良好な乾燥性を有するべきである。
産業的規模でドウ組成物のこのような生産を可能にする
菌株はまだ限られた数でのみ入手可能であるにすぎず、
それゆえ、その遺伝的理由、即ち、これらの性質を惹起
する遺伝子はまだ不明である。このような菌株の例はＬ
ｅｖｕｒｅ Ｂｏｕｌａｎｇｅｅｒｅ Ｂｌｅｕｅ（Ｌ
ｅｓａｆｆｒｅ ｅｔ Ｃｉｅ、パリ、フランスから入
手可能）、Ｆｅｒｍｉｐａｎ（Ｆｅｒｍｉｐａｎ Ｒｅ
ｄ、Ｇｉｓｔ−Ｂｒｏｃａｄｅｓ、デルフト、オランダ
から入手可能）、又はＨＳ（Ｈｅｆｅ Ｓｃｈｗｅｉ
ｚ、シュテットフルト、スイスから入手可能）である。
【００１４】しかも、これらの産業用菌株は、たいてい
の上記技術的性質を示すとはいえ、例えば低温不活性又
はグルコース脱抑制又はトレハラーゼ欠乏又は一つ若し
くは幾つかの栄養要求性のような、新規の特別な性質を
さらに開発することは今まではできていない。
の上記技術的性質を示すとはいえ、例えば低温不活性又
はグルコース脱抑制又はトレハラーゼ欠乏又は一つ若し
くは幾つかの栄養要求性のような、新規の特別な性質を
さらに開発することは今まではできていない。
【００１５】それ故、当業者がこのような性質を産業用
パン酵母の遺伝的バックグラウンドに導入することを可
能にする必要性が当該技術分野に存在する。しかし、酵
母菌株のこれらの性質は（ａ）劣性対立遺伝子（単数又
は複数）に最もしばしば基づいているので、このような
性質を産業用菌株の性質と組み合わせることは容易に達
成できる仕事ではない。
パン酵母の遺伝的バックグラウンドに導入することを可
能にする必要性が当該技術分野に存在する。しかし、酵
母菌株のこれらの性質は（ａ）劣性対立遺伝子（単数又
は複数）に最もしばしば基づいているので、このような
性質を産業用菌株の性質と組み合わせることは容易に達
成できる仕事ではない。
【００１６】
【発明が解決しようとする課題】したがって、本発明の
課題は産業用パン酵母の遺伝的バックグラウンドに既知
菌株の性質を導入するための手段を提供して、劣性対立
遺伝子によって与えられる性質と産業用パン酵母によっ
て与えられる性質の両方を有する新規な酵母を提供する
ことにある。
課題は産業用パン酵母の遺伝的バックグラウンドに既知
菌株の性質を導入するための手段を提供して、劣性対立
遺伝子によって与えられる性質と産業用パン酵母によっ
て与えられる性質の両方を有する新規な酵母を提供する
ことにある。
【００１７】
【課題を解決するための手段】この課題は、下記工程： （ａ）所望の性質を有する酵母を選択する工程と； （ｂ）（ａ）で選択した酵母を二倍体化して、ホモ接合
型に関して選択する工程と； （ｃ）産業用パン酵母を二倍体化して、ホモ接合型に関
して選択する工程と； （ｄ）それぞれ、逆接合型を有する、上記（ｂ）と
（ｃ）において得られる菌株を接合させて、四倍体接合
体を得る工程と； （ｅ）（ｄ）で得られた接合体を胞子形成させる工程
と； （ｆ）劣性の性質を示す菌株を選択する工程と； （ｇ）（ｆ）で選択した、逆接合型を有する菌株を任意
に接合させる工程とを含む方法によって解決されてい
る。
型に関して選択する工程と； （ｃ）産業用パン酵母を二倍体化して、ホモ接合型に関
して選択する工程と； （ｄ）それぞれ、逆接合型を有する、上記（ｂ）と
（ｃ）において得られる菌株を接合させて、四倍体接合
体を得る工程と； （ｅ）（ｄ）で得られた接合体を胞子形成させる工程
と； （ｆ）劣性の性質を示す菌株を選択する工程と； （ｇ）（ｆ）で選択した、逆接合型を有する菌株を任意
に接合させる工程とを含む方法によって解決されてい
る。
【００１８】劣性対立遺伝子に基づくことが知られた、
産業用パン酵母の性質に組み合わせるための性質とし
て、下記性質を例示的に挙げることができる：不活性な
グルコースリプレッサーに又は不活性なトレハラーゼ
（単数又は複数種類）に由来する性質；栄養要求性及び
ｌｔｉ性質。好ましい実施態様によると、導入すべき対
立遺伝子はｌｔｉ対立遺伝子である。特定の例は例え
ば、マルトース利用遺伝子を脱抑制して、小麦粉中の主
要な炭素源にスクロース増殖酵母(sucrose-grown yeas
t)を迅速に適応させることを可能にするカタボライトリ
プレッサー遺伝子（例えば：ＭＩＧＩ又はＨＸＫ２）、
トレハロース分解（例えば、中性トレハラーゼ（ＮＴＨ
Ｉ）又は酸性トレハラーゼ（ＡＴＨＩ））に関与する遺
伝子の非機能性対立遺伝子であって、迅速なトレハロー
ス分解を回避して、酵母のトレハロース含量を間接的に
高めて、ストレス条件（例えば、乾燥、凍結、有害なレ
ベルのエタノールに対する耐性）に酵母をより耐性にす
る非機能性対立遺伝子、又はプラスミドの選択を可能に
する栄養要求性対立遺伝子（例えば、ｕｒａ３、ｌｅｕ
２等）である。
産業用パン酵母の性質に組み合わせるための性質とし
て、下記性質を例示的に挙げることができる：不活性な
グルコースリプレッサーに又は不活性なトレハラーゼ
（単数又は複数種類）に由来する性質；栄養要求性及び
ｌｔｉ性質。好ましい実施態様によると、導入すべき対
立遺伝子はｌｔｉ対立遺伝子である。特定の例は例え
ば、マルトース利用遺伝子を脱抑制して、小麦粉中の主
要な炭素源にスクロース増殖酵母(sucrose-grown yeas
t)を迅速に適応させることを可能にするカタボライトリ
プレッサー遺伝子（例えば：ＭＩＧＩ又はＨＸＫ２）、
トレハロース分解（例えば、中性トレハラーゼ（ＮＴＨ
Ｉ）又は酸性トレハラーゼ（ＡＴＨＩ））に関与する遺
伝子の非機能性対立遺伝子であって、迅速なトレハロー
ス分解を回避して、酵母のトレハロース含量を間接的に
高めて、ストレス条件（例えば、乾燥、凍結、有害なレ
ベルのエタノールに対する耐性）に酵母をより耐性にす
る非機能性対立遺伝子、又はプラスミドの選択を可能に
する栄養要求性対立遺伝子（例えば、ｕｒａ３、ｌｅｕ
２等）である。
【００１９】本発明はまた、本発明の方法によって得ら
れる、新規な酵母菌株を提供する。これらの菌株は特に
下記に挙げる、親“産業用菌株”によって示される“産
業的可能性”を保有する： ・ 流加培養法(fed batch process)において糖１ｇか
ら生成される０．１〜０．５ｇのバイオマス産生、 ・ 流加培養法による酵母バイオマス産生中に実質的な
エタノール産生のないこと、 ・ ３５ｇのモデルドウ中に１６０ｍｇのドライイース
トを用いた場合に２時間のインキュベーション期間中に
３０℃において少なくとも３０ｍｌの二酸化炭素発生を
生じる、５６．４重量％の小麦粉、４２．３重量％の
水、１．１５重量％のＮａＣｌ、０．１５重量％の（Ｎ
Ｈ4）2ＳＯ4から成るドウ中での活性。
れる、新規な酵母菌株を提供する。これらの菌株は特に
下記に挙げる、親“産業用菌株”によって示される“産
業的可能性”を保有する： ・ 流加培養法(fed batch process)において糖１ｇか
ら生成される０．１〜０．５ｇのバイオマス産生、 ・ 流加培養法による酵母バイオマス産生中に実質的な
エタノール産生のないこと、 ・ ３５ｇのモデルドウ中に１６０ｍｇのドライイース
トを用いた場合に２時間のインキュベーション期間中に
３０℃において少なくとも３０ｍｌの二酸化炭素発生を
生じる、５６．４重量％の小麦粉、４２．３重量％の
水、１．１５重量％のＮａＣｌ、０．１５重量％の（Ｎ
Ｈ4）2ＳＯ4から成るドウ中での活性。
【００２０】このようにして得られた菌株は親の産業用
菌株の性質と、例えば栄養要求性（単数又は複数種
類）、グルコース脱抑制、トレハラーゼ不活性（単数又
は複数種類）、好ましくはｌｔｉ突然変異のような、産
業用パン酵母の遺伝的バックグラウンドに導入されるべ
き性質（単数又は複数種類）を示す菌株の劣性対立遺伝
子（単数又は複数種類）に由来する性質（単数又は複数
種類）との両方を有する。
菌株の性質と、例えば栄養要求性（単数又は複数種
類）、グルコース脱抑制、トレハラーゼ不活性（単数又
は複数種類）、好ましくはｌｔｉ突然変異のような、産
業用パン酵母の遺伝的バックグラウンドに導入されるべ
き性質（単数又は複数種類）を示す菌株の劣性対立遺伝
子（単数又は複数種類）に由来する性質（単数又は複数
種類）との両方を有する。
【００２１】他の好ましい実施態様によると、酵母菌株
は四倍体であり、サイズが大きく、このことはこれらの
酵母菌株を生産中の濾過工程に特に適したものにする。
は四倍体であり、サイズが大きく、このことはこれらの
酵母菌株を生産中の濾過工程に特に適したものにする。
【００２２】他の好ましい実施態様によると、本発明の
ｌｔｉ酵母は、約３℃〜１２℃の範囲の冷蔵庫温度にお
いて、３ｍｌ未満の二酸化炭素、好ましくは１ｍｌ未満
のＣＯ2／時／ｇドウ（５６．４重量％の小麦粉、４
２．３重量％の水、１．１５重量％のＮａＣｌ、０．１
５重量％の（ＮＨ4）2ＳＯ4を含有するドウ３５ｇ中に
ドライイースト１６０ｍｇ）を発生する能力を有する。
ｌｔｉ酵母は、約３℃〜１２℃の範囲の冷蔵庫温度にお
いて、３ｍｌ未満の二酸化炭素、好ましくは１ｍｌ未満
のＣＯ2／時／ｇドウ（５６．４重量％の小麦粉、４
２．３重量％の水、１．１５重量％のＮａＣｌ、０．１
５重量％の（ＮＨ4）2ＳＯ4を含有するドウ３５ｇ中に
ドライイースト１６０ｍｇ）を発生する能力を有する。
【００２３】他の好ましい実施態様によると、酵母菌株
はそれらが由来する菌株、即ち、親産業用菌株及び／又
は親ｌｔｉ菌株の活性よりも高い、発酵温度における活
性、さらに冷蔵庫温度（約３℃〜１２℃）における、親
ｌｔｉ菌株の活性に比べて高い活性を含むＣＯ2発生プ
ロフィルを示す。
はそれらが由来する菌株、即ち、親産業用菌株及び／又
は親ｌｔｉ菌株の活性よりも高い、発酵温度における活
性、さらに冷蔵庫温度（約３℃〜１２℃）における、親
ｌｔｉ菌株の活性に比べて高い活性を含むＣＯ2発生プ
ロフィルを示す。
【００２４】このようなＣＯ2発生プロフィルを示す酵
母菌株は、このような菌株が付加的な利益を与えること
で、ドウ組成物の製造に重要であると判明している。こ
れらの菌株によって、約３０℃の温度（発酵温度）にお
ける酵母の増強した活性のために、まだドウの発酵時に
同じ結果を得ながら、ドウ組成物中に最少量の酵母を含
めることが可能になる。或いは、ドウ中に少ない酵母物
質が存在して、このことが貯蔵中のドウが過度膨張する
危険性をも減ずるので、ドウ組成物の貯蔵寿命を延長す
ることができる。
母菌株は、このような菌株が付加的な利益を与えること
で、ドウ組成物の製造に重要であると判明している。こ
れらの菌株によって、約３０℃の温度（発酵温度）にお
ける酵母の増強した活性のために、まだドウの発酵時に
同じ結果を得ながら、ドウ組成物中に最少量の酵母を含
めることが可能になる。或いは、ドウ中に少ない酵母物
質が存在して、このことが貯蔵中のドウが過度膨張する
危険性をも減ずるので、ドウ組成物の貯蔵寿命を延長す
ることができる。
【００２５】特に好ましい実施態様によると、この菌株
はＦＣＬ３１３（ＮＣＩＭＢ ４１００２）、ＣＬ１４
（ＮＣＩＭＢ ４１０３２）又はＣＬ１８（ＮＣＩＭＢ
４１０３３）であり、これらはブダペスト条約に従っ
てＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｉ
ｎｄｕｓｔｒｉａｌ ａｎｄ Ｍａｒｉｎｅ Ｂａｃｔ
ｅｒｉａ Ｌｔｄ．（アバーディーン、スコットラン
ド、英国）に寄託されている。
はＦＣＬ３１３（ＮＣＩＭＢ ４１００２）、ＣＬ１４
（ＮＣＩＭＢ ４１０３２）又はＣＬ１８（ＮＣＩＭＢ
４１０３３）であり、これらはブダペスト条約に従っ
てＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｉ
ｎｄｕｓｔｒｉａｌ ａｎｄ Ｍａｒｉｎｅ Ｂａｃｔ
ｅｒｉａ Ｌｔｄ．（アバーディーン、スコットラン
ド、英国）に寄託されている。
【００２６】これらの新規な酵母菌株はドウ組成物の製
造に使用可能であり、結局はベークト製品の製造に使用
可能である。したがって、本発明は、本発明による酵母
菌株によって製造された製品をも包含する。
造に使用可能であり、結局はベークト製品の製造に使用
可能である。したがって、本発明は、本発明による酵母
菌株によって製造された製品をも包含する。
【００２７】好ましい実施態様によると、“産業用性質
(industrial behavior)”を示す本発明による新規なｌ
ｔｉ菌株は、マルターゼ遺伝子を構成的にも非構成的に
も発現する菌株である。他方では、例えば、ドウ中に存
在するマルトースの消費に起因する酵母の過度活性を回
避するために、存在する他の成分によって抑制されるよ
うに、親ｌｔｉ酵母を選択することができる。本発明の
ｌｔｉ酵母菌株を含有するドウ組成物中に、異なる表現
型／遺伝子型を有する他のｌｔｉ酵母菌株を付加的に用
いることができる。したがって、例えば、新規なｌｔｉ
菌株と、例えばＭａｌ-ｌｔｉ菌株（マルトースを代謝
することができない酵母菌株）又はＭａｌ+ｌｔｉ菌株
のような、通常のｌｔｉ菌株との混合物を用いることが
できる。当業者は例えばマルトースの存在、温度、存在
する任意の他の糖等のような、酵母活性に影響する要因
に従って、入手可能なｌｔｉ菌株から適当な混合物を選
択して、ドウ組成物を望ましいＣＯ2プロフィルに適応
させることができる。
(industrial behavior)”を示す本発明による新規なｌ
ｔｉ菌株は、マルターゼ遺伝子を構成的にも非構成的に
も発現する菌株である。他方では、例えば、ドウ中に存
在するマルトースの消費に起因する酵母の過度活性を回
避するために、存在する他の成分によって抑制されるよ
うに、親ｌｔｉ酵母を選択することができる。本発明の
ｌｔｉ酵母菌株を含有するドウ組成物中に、異なる表現
型／遺伝子型を有する他のｌｔｉ酵母菌株を付加的に用
いることができる。したがって、例えば、新規なｌｔｉ
菌株と、例えばＭａｌ-ｌｔｉ菌株（マルトースを代謝
することができない酵母菌株）又はＭａｌ+ｌｔｉ菌株
のような、通常のｌｔｉ菌株との混合物を用いることが
できる。当業者は例えばマルトースの存在、温度、存在
する任意の他の糖等のような、酵母活性に影響する要因
に従って、入手可能なｌｔｉ菌株から適当な混合物を選
択して、ドウ組成物を望ましいＣＯ2プロフィルに適応
させることができる。
【００２８】ドウ組成物を製造する方法は水、小麦粉、
及び少なくとも１種類の新規な酵母菌株を混合すること
を含む。用いる小麦粉は商業的に入手可能な任意の小麦
粉であることができるが、存在する酵母菌株の糖源とし
て役立ちうる、ある一定量の損傷澱粉を含有する小麦粉
を用いることが場合によっては有利でありうる。水が一
般に、小麦粉の水和容量と、この容量を増減しうる、ド
ウ中に含有される他の成分の可能な影響とに従って、加
工可能なドウが形成されるまで加えられる。ドウは任意
に塩、好ましくは塩化ナトリウムを１００重量部である
小麦粉量に基づいて０〜８重量部の量で含有することが
できる。さらに、エタノールがこの場合も１００重量部
である小麦粉量に基づいて０〜８重量部の量で含まれる
ことができる。
及び少なくとも１種類の新規な酵母菌株を混合すること
を含む。用いる小麦粉は商業的に入手可能な任意の小麦
粉であることができるが、存在する酵母菌株の糖源とし
て役立ちうる、ある一定量の損傷澱粉を含有する小麦粉
を用いることが場合によっては有利でありうる。水が一
般に、小麦粉の水和容量と、この容量を増減しうる、ド
ウ中に含有される他の成分の可能な影響とに従って、加
工可能なドウが形成されるまで加えられる。ドウは任意
に塩、好ましくは塩化ナトリウムを１００重量部である
小麦粉量に基づいて０〜８重量部の量で含有することが
できる。さらに、エタノールがこの場合も１００重量部
である小麦粉量に基づいて０〜８重量部の量で含まれる
ことができる。
【００２９】酵母は、ドウの調製に用いる水の全量中で
又はその一部中で再水和したドライイーストとして加え
ることができる。約２０〜４０％の乾燥物質含量を有す
るプレスケーキの使用又は約１０〜２０％の乾燥物質含
量を有するイースト−クリーム(yeast-cream)の使用も
同様に、小麦粉に加える水を適当に調節しながら、考え
ることができる。
又はその一部中で再水和したドライイーストとして加え
ることができる。約２０〜４０％の乾燥物質含量を有す
るプレスケーキの使用又は約１０〜２０％の乾燥物質含
量を有するイースト−クリーム(yeast-cream)の使用も
同様に、小麦粉に加える水を適当に調節しながら、考え
ることができる。
【００３０】新規な酵母菌株の製造方法は工程（ａ）〜
（ｆ）と任意に工程（ｇ）を含む。工程（ａ）では、劣
性対立遺伝子に基づく、所望の性質を示す親酵母菌株を
選択する。
（ｆ）と任意に工程（ｇ）を含む。工程（ａ）では、劣
性対立遺伝子に基づく、所望の性質を示す親酵母菌株を
選択する。
【００３１】さらなる処理に関して、この菌株は接合型
に関してホモ接合である二倍体形で存在しなければなら
ない。したがって、以下の理論的オプションが生じる。
菌株は既に二倍体であり、ホモ接合型、即ち、ａ／ａ又
はα／αのいずれかを示す。しかし、たいていの場合
に、このことは該当しないので、その結果として、菌株
を注文に合わせて作製しなければならない。
に関してホモ接合である二倍体形で存在しなければなら
ない。したがって、以下の理論的オプションが生じる。
菌株は既に二倍体であり、ホモ接合型、即ち、ａ／ａ又
はα／αのいずれかを示す。しかし、たいていの場合
に、このことは該当しないので、その結果として、菌株
を注文に合わせて作製しなければならない。
【００３２】接合型に関してホモ接合でない二倍体酵母
菌株から出発する場合、又は四倍体菌株から出発する場
合にさえも、これらの菌株を最初に一倍体形にしなけれ
ばならない。これは、例えば、Ｓｈｅｒｍａｎ，Ｆ．
Ｇ．Ｒ．等、［酵母遺伝学における実験室コース・マニ
ュアル］（１９８６）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａ
ｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（コール
ドスプリングハーバー、ニューヨーク州）に記載されて
いるような、当該技術分野において周知の方法に従って
菌株に胞子形成させることによって、達成することがで
きる。この方法は例えば、マイクロマニピュレータによ
る子嚢切開を含む。このために、胞子形成した培養物の
ループを無菌水中に移し、カタツムリ消化管液(snail j
uice)（Ｓｕｃ ｄ’Ｈｅｌｉｘ ｐｏｍａｔｉａ，Ｂ
ｉｏｓｅｐｒａ、フランス）をこれに加える。胞子が子
嚢から放出され始めるまで、数分間消化を行わせ、次
に、子嚢を分離して、寒天プレート上で画線培養する。
インキュベーションすると、胞子は一倍体酵母細胞から
成るコロニーを生成する。
菌株から出発する場合、又は四倍体菌株から出発する場
合にさえも、これらの菌株を最初に一倍体形にしなけれ
ばならない。これは、例えば、Ｓｈｅｒｍａｎ，Ｆ．
Ｇ．Ｒ．等、［酵母遺伝学における実験室コース・マニ
ュアル］（１９８６）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａ
ｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（コール
ドスプリングハーバー、ニューヨーク州）に記載されて
いるような、当該技術分野において周知の方法に従って
菌株に胞子形成させることによって、達成することがで
きる。この方法は例えば、マイクロマニピュレータによ
る子嚢切開を含む。このために、胞子形成した培養物の
ループを無菌水中に移し、カタツムリ消化管液(snail j
uice)（Ｓｕｃ ｄ’Ｈｅｌｉｘ ｐｏｍａｔｉａ，Ｂ
ｉｏｓｅｐｒａ、フランス）をこれに加える。胞子が子
嚢から放出され始めるまで、数分間消化を行わせ、次
に、子嚢を分離して、寒天プレート上で画線培養する。
インキュベーションすると、胞子は一倍体酵母細胞から
成るコロニーを生成する。
【００３３】これらの一倍体は分離して、ａ接合型又は
α接合型のいずれかを示し、このことは例えばＸ２１８
０−１Ａ（ａ）又はＸ２１８０−１Ｂ（α）（Ｙｅａｓ
ｔＧｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ、分子細
胞生物学科、遺伝学部、カリフォルニア大学、バークレ
ー、カリフォルニア州、９４７２０、アメリカ合衆国か
ら入手）のような標準菌株との交雑で検査することがで
きる。分離体の接合型は、分離体が逆接合型のテスター
菌株と接合体を形成することができるが、同じ接合型の
テスター菌株とは接合体を形成することができないこと
によって確認される。次に、所望の性質を示す菌株を選
択することができる。
α接合型のいずれかを示し、このことは例えばＸ２１８
０−１Ａ（ａ）又はＸ２１８０−１Ｂ（α）（Ｙｅａｓ
ｔＧｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ、分子細
胞生物学科、遺伝学部、カリフォルニア大学、バークレ
ー、カリフォルニア州、９４７２０、アメリカ合衆国か
ら入手）のような標準菌株との交雑で検査することがで
きる。分離体の接合型は、分離体が逆接合型のテスター
菌株と接合体を形成することができるが、同じ接合型の
テスター菌株とは接合体を形成することができないこと
によって確認される。次に、所望の性質を示す菌株を選
択することができる。
【００３４】その後、対応する一倍体菌株を再び二倍体
化する、これは例えば自発二倍体化の現象を利用するこ
とによって行うことができる（Ｓｈｅｒｍａｎ、上記文
献）。このために、各一倍体菌株を適当な液体培地中で
数週間、周囲温度又はやや高い温度において撹拌下で、
規則的に間隔をおいて継代培養しながら、増殖させるこ
とができる。時には、細胞をＹＰＤプレート（以下参
照）上で培養して、増殖するコロニーを特に大きな変種
(varieties)に関してスクリーニングすることができ
る。大きなコロニーが検出されたときに、それらの倍数
性を既知倍数性のテスター菌株ともどし交雑させること
によって検査することができる。未知倍数性（一倍体又
は二倍体）であるがまだ接合型（ａ若しくはａ／ａ；α
若しくはα／α）を示す菌株を既知倍数性（一倍体又は
二倍体）のテスター菌株と交雑させる。得られる接合体
は二倍体（一倍体ｘ一倍体），三倍体（一倍体ｘ二倍
体）又は四倍体（二倍体ｘ二倍体）のいずれかである。
これらの接合体を胞子形成させ、典型的な数の胞子を上
述したように子嚢切開によって単離させた。三倍体接合
体はそれらの劇的に減少した胞子生存率（通常、０〜１
０％）によって容易に同定され、偶数倍数性の接合体
（二倍体又は四倍体）は通常５０％を超える胞子生存率
を生じる。したがって、一倍体分離体は一倍体テスター
菌株との交雑では高い胞子生存率を生じるが、二倍体テ
スターとは低い胞子生存率を生じ、これに反して、二倍
体分離体は一倍体テスターとは低い胞子生存率を生じる
が、二倍体テスターとは高い胞子生存率を生じる。
化する、これは例えば自発二倍体化の現象を利用するこ
とによって行うことができる（Ｓｈｅｒｍａｎ、上記文
献）。このために、各一倍体菌株を適当な液体培地中で
数週間、周囲温度又はやや高い温度において撹拌下で、
規則的に間隔をおいて継代培養しながら、増殖させるこ
とができる。時には、細胞をＹＰＤプレート（以下参
照）上で培養して、増殖するコロニーを特に大きな変種
(varieties)に関してスクリーニングすることができ
る。大きなコロニーが検出されたときに、それらの倍数
性を既知倍数性のテスター菌株ともどし交雑させること
によって検査することができる。未知倍数性（一倍体又
は二倍体）であるがまだ接合型（ａ若しくはａ／ａ；α
若しくはα／α）を示す菌株を既知倍数性（一倍体又は
二倍体）のテスター菌株と交雑させる。得られる接合体
は二倍体（一倍体ｘ一倍体），三倍体（一倍体ｘ二倍
体）又は四倍体（二倍体ｘ二倍体）のいずれかである。
これらの接合体を胞子形成させ、典型的な数の胞子を上
述したように子嚢切開によって単離させた。三倍体接合
体はそれらの劇的に減少した胞子生存率（通常、０〜１
０％）によって容易に同定され、偶数倍数性の接合体
（二倍体又は四倍体）は通常５０％を超える胞子生存率
を生じる。したがって、一倍体分離体は一倍体テスター
菌株との交雑では高い胞子生存率を生じるが、二倍体テ
スターとは低い胞子生存率を生じ、これに反して、二倍
体分離体は一倍体テスターとは低い胞子生存率を生じる
が、二倍体テスターとは高い胞子生存率を生じる。
【００３５】他方では、一倍体菌株のみで出発した場合
には、上記で詳述したように二倍体化を行わなければな
らない。ａ／ａ又はα／α接合型を有し、パン酵母の遺
伝的バックグラウンドに導入すべき望ましい特性に関し
てホモ接合性である、このようにして得られた二倍体菌
株は次にさらなるプロセス工程に用いることができる。
には、上記で詳述したように二倍体化を行わなければな
らない。ａ／ａ又はα／α接合型を有し、パン酵母の遺
伝的バックグラウンドに導入すべき望ましい特性に関し
てホモ接合性である、このようにして得られた二倍体菌
株は次にさらなるプロセス工程に用いることができる。
【００３６】工程（ｃ）の親産業用パン酵母に関して
は、四倍体産業用パン酵母（例えば、ＬＢＢ、ＨＳ、Ｆ
ｅｒｍｉｐａｎ等）を胞子形成させ、接合型を示し、ａ
／ａ又はα／αのいずれかのホモ接合型である二倍体分
離体が選択される。
は、四倍体産業用パン酵母（例えば、ＬＢＢ、ＨＳ、Ｆ
ｅｒｍｉｐａｎ等）を胞子形成させ、接合型を示し、ａ
／ａ又はα／αのいずれかのホモ接合型である二倍体分
離体が選択される。
【００３７】本発明の方法の工程（ｄ）では、各々が特
定の接合型を有する、特定の特性を有する二倍体化菌株
と二倍体化産業用パン酵母とを組み合わせて、逆接合型
を有する菌株、即ち、ａ／ａとα／αとを既知方法（Ｓ
ｈｅｒｍａｎ、上記文献）で組み合わせて、四倍体接合
体ａａ／ααを生成する。二倍体親菌株のこのような交
雑に由来する四倍体接合体を次に工程（ｅ）において再
び胞子形成させ、減数分裂した胞子を単離する。胞子形
成によって得られた胞子をパン酵母の遺伝的バックグラ
ウンドに与えるべき特定の特性に関して選択する（工程
（ｆ））。
定の接合型を有する、特定の特性を有する二倍体化菌株
と二倍体化産業用パン酵母とを組み合わせて、逆接合型
を有する菌株、即ち、ａ／ａとα／αとを既知方法（Ｓ
ｈｅｒｍａｎ、上記文献）で組み合わせて、四倍体接合
体ａａ／ααを生成する。二倍体親菌株のこのような交
雑に由来する四倍体接合体を次に工程（ｅ）において再
び胞子形成させ、減数分裂した胞子を単離する。胞子形
成によって得られた胞子をパン酵母の遺伝的バックグラ
ウンドに与えるべき特定の特性に関して選択する（工程
（ｆ））。
【００３８】好ましい実施態様によると、プロセス工程
（ａ）〜（ｆ）に従って得られる二倍体菌株をさらに多
倍数体化することができる。このために、（ｆ）で得ら
れた菌株をそれらの接合型に関してホモ接合であるか否
かを検査して、逆接合型を有する菌株を交雑させる。多
倍数体化菌株は、それらの拡大化したサイズのために、
それらを容易に濾過することができるので、付加的な産
業上利益を有する。
（ａ）〜（ｆ）に従って得られる二倍体菌株をさらに多
倍数体化することができる。このために、（ｆ）で得ら
れた菌株をそれらの接合型に関してホモ接合であるか否
かを検査して、逆接合型を有する菌株を交雑させる。多
倍数体化菌株は、それらの拡大化したサイズのために、
それらを容易に濾過することができるので、付加的な産
業上利益を有する。
【００３９】産業用菌株として、例えば商業的に入手可
能な菌株、Ｆｅｒｍｉｐａｎ（Ｆｅｒｍｉｐａｎ Ｓｔ
ａｎｄａｒｄ（“Ｆｅｒｍｉｐａｎ Ｒｅｄ”Ｇｉｓｔ
−Ｂｒｏｃａｄｅｓ、オランダから入手可能なインスタ
ント活性なドライイースト）、又はＬＢＢ（“Ｌｅｖｕ
ｒｅ Ｂｏｕｌａｎｇｅｒ Ｂｌｅｕｅ”、Ｌｅ Ｓａ
ｆｆｒｅ、フランスから入手可能）、又はＨＳ（Ｈｅｆ
ｅ Ｓｃｈｗｅｉｚ、スイスから入手可能）のような、
任意の適当な菌株が使用可能である。当業者は、彼自身
の技術的熟練と経験に基づいて、またｌｔｉ性質を導入
すべきであるそれぞれの遺伝的バックグラウンドに依存
して、適当な菌株を選択する。既知産業用菌株の一部は
四倍体性であるので、それらを所望の特性を有する二倍
体菌株と組み合わせる前に、二倍体化しなければならな
い。
能な菌株、Ｆｅｒｍｉｐａｎ（Ｆｅｒｍｉｐａｎ Ｓｔ
ａｎｄａｒｄ（“Ｆｅｒｍｉｐａｎ Ｒｅｄ”Ｇｉｓｔ
−Ｂｒｏｃａｄｅｓ、オランダから入手可能なインスタ
ント活性なドライイースト）、又はＬＢＢ（“Ｌｅｖｕ
ｒｅ Ｂｏｕｌａｎｇｅｒ Ｂｌｅｕｅ”、Ｌｅ Ｓａ
ｆｆｒｅ、フランスから入手可能）、又はＨＳ（Ｈｅｆ
ｅ Ｓｃｈｗｅｉｚ、スイスから入手可能）のような、
任意の適当な菌株が使用可能である。当業者は、彼自身
の技術的熟練と経験に基づいて、またｌｔｉ性質を導入
すべきであるそれぞれの遺伝的バックグラウンドに依存
して、適当な菌株を選択する。既知産業用菌株の一部は
四倍体性であるので、それらを所望の特性を有する二倍
体菌株と組み合わせる前に、二倍体化しなければならな
い。
【００４０】好ましい実施態様では、所望の特性を示す
菌株は、例えば菌株Ｌ５００［ＮＣＩＭＢ ４０３２
９］（これの構築方法はＥＰ−０４８７８７８に詳述さ
れており、この資料は参照することにより本明細書に取
り込まれる）又は菌株ＬＣＧ２２［ＮＣＩＭＢ ４０６
１２］（これの作製方法はＥＰ−０６６３４４１に記載
されており、この資料は参照することにより本明細書に
取り込まれる）のような、ｌｔｉ菌株である。以下で
は、本発明を好ましい実施態様及び図面を参照して説明
する：
菌株は、例えば菌株Ｌ５００［ＮＣＩＭＢ ４０３２
９］（これの構築方法はＥＰ−０４８７８７８に詳述さ
れており、この資料は参照することにより本明細書に取
り込まれる）又は菌株ＬＣＧ２２［ＮＣＩＭＢ ４０６
１２］（これの作製方法はＥＰ−０６６３４４１に記載
されており、この資料は参照することにより本明細書に
取り込まれる）のような、ｌｔｉ菌株である。以下で
は、本発明を好ましい実施態様及び図面を参照して説明
する：
【００４１】
【実施例】実施例１ 新規な菌株の構築 ｌｔｉ酵母に産業用特徴を導入するために、次の遺伝子
型： α ｌｔｓ５００ を有するｌｔｓ５００ ｌｔｉ突然変異体［ＮＣＩＭＢ
４０６１３］が用いられている。 この菌株をマルトース発酵菌株１４０３−７Ａ： ａ ＭＡＬ４ｃ ｕｒａ３ （Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔ
ｅｒ、分子細胞生物学科、遺伝学部、カリフォルニア大
学、バークレー、カリフォルニア州、９４７２０、アメ
リカ合衆国から入手）と交雑させた。（大文字は主要な
対立遺伝子を示し、小文字は劣性対立遺伝子を示す）。
型： α ｌｔｓ５００ を有するｌｔｓ５００ ｌｔｉ突然変異体［ＮＣＩＭＢ
４０６１３］が用いられている。 この菌株をマルトース発酵菌株１４０３−７Ａ： ａ ＭＡＬ４ｃ ｕｒａ３ （Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔ
ｅｒ、分子細胞生物学科、遺伝学部、カリフォルニア大
学、バークレー、カリフォルニア州、９４７２０、アメ
リカ合衆国から入手）と交雑させた。（大文字は主要な
対立遺伝子を示し、小文字は劣性対立遺伝子を示す）。
【００４２】接合体に胞子形成させ（Ｓｈｅｒｍａｎ、
上記文献）、減数分裂した胞子を次のように単離した。
胞子形成した培養物のループをＥｐｐｅｎｄｏｒｆ管中
に含有された０．２ｍｌの無菌水中に懸濁させ、０．０
２〜０．０４ｍｌのカタツムリ消化管液)（Ｓｕｃ
ｄ’Ｈｅｌｉｘ ｐｏｍａｔｉａ，Ｂｉｏｓｅｐｒａ、
フランス）を加えた。懸濁液を室温において約４〜１５
分間インキュベートした。この時間は菌株毎に変化させ
たが、適当な時間は顕微鏡を用いて観察して、胞子が子
嚢から放出され始めたときがほぼ適当であると見なされ
た。これは液体中の“爆発波”と胞子パッケージがより
散漫に配置されることによって表示された。インキュベ
ーション後に、１ｍｌの無菌水を加えて、懸濁液を約５
分間遠心分離した。上澄み液を吸引で取り出し、ペレッ
トを約０．５ｍｌの無菌水中に懸濁させ、遠心分離し、
上澄み液を廃棄した。胞子を約０．５ｍｌの無菌水中に
懸濁させた後に、懸濁液を微細な白金ループで、適当な
サイズに切断した切開寒天パッチ（２％グルコース、１
％酵母エキス、０．５％ペプトン、２％寒天）の縁に画
線培養した。胞子間に２．５ｍｍ及び各四分子間に３ｍ
ｍの間隔を保って、Ｌｅｉｔｚマイクロマニピュレータ
（Ｌｅｉｔｚ、ドイツ）を用いて、四分子を切開した。
寒天パッチをＹＤＰ（ＹＰＤ完全培地、２％Ｂａｃｔｏ
寒天（Ｄｉｆｃｏ）、１％Ｂａｃｔｏ酵母エキス（Ｄｉ
ｆｃｏ）、２％Ｂａｃｔｏペプトン（Ｄｉｆｃｏ）；２
％グルコースによって凝固したもの）寒天プレート上で
移し、３０℃において胞子がコロニーを形成するまでイ
ンキュベートし、これらのコロニーを次に、さらなる分
析のために、ようじ(tooth pick)で新たなＹＰＤ寒天プ
レート（上記）に移した。
上記文献）、減数分裂した胞子を次のように単離した。
胞子形成した培養物のループをＥｐｐｅｎｄｏｒｆ管中
に含有された０．２ｍｌの無菌水中に懸濁させ、０．０
２〜０．０４ｍｌのカタツムリ消化管液)（Ｓｕｃ
ｄ’Ｈｅｌｉｘ ｐｏｍａｔｉａ，Ｂｉｏｓｅｐｒａ、
フランス）を加えた。懸濁液を室温において約４〜１５
分間インキュベートした。この時間は菌株毎に変化させ
たが、適当な時間は顕微鏡を用いて観察して、胞子が子
嚢から放出され始めたときがほぼ適当であると見なされ
た。これは液体中の“爆発波”と胞子パッケージがより
散漫に配置されることによって表示された。インキュベ
ーション後に、１ｍｌの無菌水を加えて、懸濁液を約５
分間遠心分離した。上澄み液を吸引で取り出し、ペレッ
トを約０．５ｍｌの無菌水中に懸濁させ、遠心分離し、
上澄み液を廃棄した。胞子を約０．５ｍｌの無菌水中に
懸濁させた後に、懸濁液を微細な白金ループで、適当な
サイズに切断した切開寒天パッチ（２％グルコース、１
％酵母エキス、０．５％ペプトン、２％寒天）の縁に画
線培養した。胞子間に２．５ｍｍ及び各四分子間に３ｍ
ｍの間隔を保って、Ｌｅｉｔｚマイクロマニピュレータ
（Ｌｅｉｔｚ、ドイツ）を用いて、四分子を切開した。
寒天パッチをＹＤＰ（ＹＰＤ完全培地、２％Ｂａｃｔｏ
寒天（Ｄｉｆｃｏ）、１％Ｂａｃｔｏ酵母エキス（Ｄｉ
ｆｃｏ）、２％Ｂａｃｔｏペプトン（Ｄｉｆｃｏ）；２
％グルコースによって凝固したもの）寒天プレート上で
移し、３０℃において胞子がコロニーを形成するまでイ
ンキュベートし、これらのコロニーを次に、さらなる分
析のために、ようじ(tooth pick)で新たなＹＰＤ寒天プ
レート（上記）に移した。
【００４３】このようにして得られた一倍体分離体をそ
れらの接合型（ａ又はα）に関して、それぞれ、例えば
Ｘ２１８０−１Ａ（ａ）又はＸ２１８０−１Ｂ（α）
（Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔ
ｅｒ、分子細胞生物学科、遺伝学部、カリフォルニア大
学、バークレー、カリフォルニア州、９４７２０、アメ
リカ合衆国から入手可能）のような標準菌株とそれらを
交雑させることによって検査した。
れらの接合型（ａ又はα）に関して、それぞれ、例えば
Ｘ２１８０−１Ａ（ａ）又はＸ２１８０−１Ｂ（α）
（Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔ
ｅｒ、分子細胞生物学科、遺伝学部、カリフォルニア大
学、バークレー、カリフォルニア州、９４７２０、アメ
リカ合衆国から入手可能）のような標準菌株とそれらを
交雑させることによって検査した。
【００４４】この検査は、次のように行った。菌株をＹ
ＰＤ寒天プレ−ト（１％ＤｉｆｃｏＢａｃｔｏ酵母エキ
ス、２％Ｄｉｆｃｏ Ｂａｃｔｏペプトン、２％グルコ
ース、２％寒天）上で一晩増殖させた。分離体の小アリ
コートにａ−テスターの小アリコート及びα−テスター
の小アリコートをＹＰＤプレート上で無菌木製ようじを
用いて混合した。３０℃において５〜６時間インキュベ
ートした後に、両方のミックスを接合体の形成に関して
顕微鏡によって分析した。
ＰＤ寒天プレ−ト（１％ＤｉｆｃｏＢａｃｔｏ酵母エキ
ス、２％Ｄｉｆｃｏ Ｂａｃｔｏペプトン、２％グルコ
ース、２％寒天）上で一晩増殖させた。分離体の小アリ
コートにａ−テスターの小アリコート及びα−テスター
の小アリコートをＹＰＤプレート上で無菌木製ようじを
用いて混合した。３０℃において５〜６時間インキュベ
ートした後に、両方のミックスを接合体の形成に関して
顕微鏡によって分析した。
【００４５】親菌株はｌｔｉ突然変異に関してホモ接合
であったので、全ての分離体は明白なｌｔｉ表現型を示
し、標準方法（Ｓｈｅｒｍａｎ，Ｆ．Ｇ．Ｒ．等、［酵
母遺伝学における実験室コース・マニュアル］（１９８
６）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、コールドスプリングハー
バー、ニューヨーク州）によって判定して、マルトース
発酵性（Ｍａｌ+）又はマルトース非発酵性（Ｍａｌ-）
のいずれか、及びウラシル原栄養性（ＵＲＡ３）又は栄
養要求性（ｕｒａ３）のいずれかであった。
であったので、全ての分離体は明白なｌｔｉ表現型を示
し、標準方法（Ｓｈｅｒｍａｎ，Ｆ．Ｇ．Ｒ．等、［酵
母遺伝学における実験室コース・マニュアル］（１９８
６）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、コールドスプリングハー
バー、ニューヨーク州）によって判定して、マルトース
発酵性（Ｍａｌ+）又はマルトース非発酵性（Ｍａｌ-）
のいずれか、及びウラシル原栄養性（ＵＲＡ３）又は栄
養要求性（ｕｒａ３）のいずれかであった。
【００４６】得られた種々な一倍体菌株から二倍体単離
体を得るために、自発二倍体化の現象を利用した。この
ために、特定の一倍体菌株を液体ＹＰＤ培地（上記）中
で、約３〜４日間の間隔を置いて規則的に継代培養しな
がら、撹拌下で約３０℃において１２週間増殖させた。
時々、細胞をＹＰＤプレート上で培養して、増殖するコ
ロニーを特に大きな変種に関してスクリーニングした。
大きなコロニーが検出されたときに、それらの倍数性を
一倍体テスター菌株（Ｘ２１８０−１Ａ（ａ）、Ｘ２１
８０−１Ｂ（α）上記）又は二倍体テスター菌株（Ｘ２
１８０−１Ａ／１Ａ（ａ／ａ）、Ｘ２１８０−１Ｂ／１
Ｂ（α／α）、ＥＴＨＺ菌株コレクション、Ｅｉｄｇｅ
ｎｏｅｓｓｉｓｃｈ Ｔｅｃｈｎｉｓｃｈｅ Ｈｏｃｈ
ｓｃｈｕｌｅ、チューリッヒ、スイス）とのもどし交雑
によって検査した。
体を得るために、自発二倍体化の現象を利用した。この
ために、特定の一倍体菌株を液体ＹＰＤ培地（上記）中
で、約３〜４日間の間隔を置いて規則的に継代培養しな
がら、撹拌下で約３０℃において１２週間増殖させた。
時々、細胞をＹＰＤプレート上で培養して、増殖するコ
ロニーを特に大きな変種に関してスクリーニングした。
大きなコロニーが検出されたときに、それらの倍数性を
一倍体テスター菌株（Ｘ２１８０−１Ａ（ａ）、Ｘ２１
８０−１Ｂ（α）上記）又は二倍体テスター菌株（Ｘ２
１８０−１Ａ／１Ａ（ａ／ａ）、Ｘ２１８０−１Ｂ／１
Ｂ（α／α）、ＥＴＨＺ菌株コレクション、Ｅｉｄｇｅ
ｎｏｅｓｓｉｓｃｈ Ｔｅｃｈｎｉｓｃｈｅ Ｈｏｃｈ
ｓｃｈｕｌｅ、チューリッヒ、スイス）とのもどし交雑
によって検査した。
【００４７】結果として、次の性質を有する菌株を選択
した： （ａ）二倍体がｌｔｓ５００突然変異に関してホモ接合
性であり、明白なｌｔｉ表現型を示した； （ｂ）二倍体がＵＲＡ３野性型対立遺伝子に関してホモ
接合性であり、原栄養性表現型を示した； （ｃ）二倍体が少なくとも１つのＭａｌ４ｃ対立遺伝子
を保持して、マルトース発酵性（Ｍａｌ+）表現型を生
じた。
した： （ａ）二倍体がｌｔｓ５００突然変異に関してホモ接合
性であり、明白なｌｔｉ表現型を示した； （ｂ）二倍体がＵＲＡ３野性型対立遺伝子に関してホモ
接合性であり、原栄養性表現型を示した； （ｃ）二倍体が少なくとも１つのＭａｌ４ｃ対立遺伝子
を保持して、マルトース発酵性（Ｍａｌ+）表現型を生
じた。
【００４８】上記性質を示した菌株の選択は、次のよう
に行われた：Ｍａｌ及びＵｒａ表現型は、標準方法（Ｓ
ｈｅｒｍａｎ，Ｆ．Ｇ．Ｒ．等、［酵母遺伝学における
実験室コース・マニュアル］（１９８６）、Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｐｒｅｓｓ、コールドスプリングハーバー、ニューヨー
ク州）によって判定した。
に行われた：Ｍａｌ及びＵｒａ表現型は、標準方法（Ｓ
ｈｅｒｍａｎ，Ｆ．Ｇ．Ｒ．等、［酵母遺伝学における
実験室コース・マニュアル］（１９８６）、Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｐｒｅｓｓ、コールドスプリングハーバー、ニューヨー
ク州）によって判定した。
【００４９】ＹＰＤ寒天プレート（１％Ｄｉｆｃｏ Ｂ
ａｃｔｏ酵母エキス、２％Ｄｉｆｃｏ Ｂａｃｔｏペプ
トン、２％グルコース、２％寒天）上で一晩増殖させた
酵母細胞の小さい層を新鮮なＹＰＤ寒天プレート上で画
線培養することによって、ｌｔｉ表現型を分析する。８
℃における２〜３週間のインキュベーション後に増殖反
応を検査する。
ａｃｔｏ酵母エキス、２％Ｄｉｆｃｏ Ｂａｃｔｏペプ
トン、２％グルコース、２％寒天）上で一晩増殖させた
酵母細胞の小さい層を新鮮なＹＰＤ寒天プレート上で画
線培養することによって、ｌｔｉ表現型を分析する。８
℃における２〜３週間のインキュベーション後に増殖反
応を検査する。
【００５０】ｌｔｉ表現型に、全体的に産業用の遺伝的
バックグラウンドを組み合わせるために、次のｌｔｉ遺
伝子型を有する菌株を選択して、さらなる実験に用い
た：ＲＤ１４８３−２Ｃ−２：α／α ｌｔｓ５００／
ｌｔｓ５００ ＭＡＬ４ｃ／ＭＡＬ４ｃ ＵＲＡ３／Ｕ
ＲＡ３．
バックグラウンドを組み合わせるために、次のｌｔｉ遺
伝子型を有する菌株を選択して、さらなる実験に用い
た：ＲＤ１４８３−２Ｃ−２：α／α ｌｔｓ５００／
ｌｔｓ５００ ＭＡＬ４ｃ／ＭＡＬ４ｃ ＵＲＡ３／Ｕ
ＲＡ３．
【００５１】この菌株に下記商業的パン酵母菌株の二倍
体分離体を組み合わせた： （１）ＬＢＢ（Ｌｅｖｕｒｅ Ｂｏｕｌａｎｇｅｒｅｒ
ｅ Ｂｌｅｕｅ、ＬｅＳａｆｆｒｅ） （２）Ｆｅｒｍｉｐａｎ Ｓｔａｎｄａｒｄ（Ｇｉｓｔ
−Ｂｒｏｃａｄｅｓ）これらの二倍体分離体は、胞子形
成させ、その後に二倍体子嚢胞子を単離することによっ
て得た。二倍体ｌｔｉ菌株ＲＤ１４８３−２Ｃ−２に交
雑するために、接合型（したがって、ホモ接合性ａ／ａ
である）を示す二倍体分離体を選択した。
体分離体を組み合わせた： （１）ＬＢＢ（Ｌｅｖｕｒｅ Ｂｏｕｌａｎｇｅｒｅｒ
ｅ Ｂｌｅｕｅ、ＬｅＳａｆｆｒｅ） （２）Ｆｅｒｍｉｐａｎ Ｓｔａｎｄａｒｄ（Ｇｉｓｔ
−Ｂｒｏｃａｄｅｓ）これらの二倍体分離体は、胞子形
成させ、その後に二倍体子嚢胞子を単離することによっ
て得た。二倍体ｌｔｉ菌株ＲＤ１４８３−２Ｃ−２に交
雑するために、接合型（したがって、ホモ接合性ａ／ａ
である）を示す二倍体分離体を選択した。
【００５２】上記ｌｔｉ菌株と上記遺伝的産業用菌株の
種々な菌株との接合は次のように行った。逆接合型の菌
株をＹＰＤ寒天プレート上で画線培養して、プレートを
３０℃において一晩インキュベートした。接合させるべ
き各菌株の少ないが、等しい量をＹＰＤ寒天プレート上
で混合して、３０℃において５〜６時間インキュベート
した。接合体の形成を顕微鏡下で検査した。目視検査さ
れた接合体を次にＬｅｉｔｚマイクロマニピュレ−タ
（Ｌｅｉｔｚ、ドイツ）によって引き出した。
種々な菌株との接合は次のように行った。逆接合型の菌
株をＹＰＤ寒天プレート上で画線培養して、プレートを
３０℃において一晩インキュベートした。接合させるべ
き各菌株の少ないが、等しい量をＹＰＤ寒天プレート上
で混合して、３０℃において５〜６時間インキュベート
した。接合体の形成を顕微鏡下で検査した。目視検査さ
れた接合体を次にＬｅｉｔｚマイクロマニピュレ−タ
（Ｌｅｉｔｚ、ドイツ）によって引き出した。
【００５３】これによって、下記四倍体分離体を単離す
ることができた： １）ＬＢＢ（Ｌｅｖｕｒｅ Ｂｏｕｌａｎｇｅｒｅ Ｂｌｅｕｅ、Ｌｅ Ｓａｆ ｆｒｅ）からの分離体 Ｆ−７ 接合体として ＲＤ８３−７ Ｆ−２４ ＲＤ８３−２４ Ｆ−２８ ＲＤ８３−２８ ＦＺ１５ ＦＤ１５８３ ＦＺ２４ ＦＤ２４８３ ２）Ｆｅｒｍｉｐａｎ Ｓｔａｎｄａｒｄ（Ｇｉｓｔ Ｂｒｏｃａｄｅｓ）から の分離体 ＦＰ５ 接合体として ＰＤ５８３ ＦＰ６ ＰＤ６８３ ＦＰ１０ ＰＤ１０８３ ＦＰ２０ ＰＤ２０８３
ることができた： １）ＬＢＢ（Ｌｅｖｕｒｅ Ｂｏｕｌａｎｇｅｒｅ Ｂｌｅｕｅ、Ｌｅ Ｓａｆ ｆｒｅ）からの分離体 Ｆ−７ 接合体として ＲＤ８３−７ Ｆ−２４ ＲＤ８３−２４ Ｆ−２８ ＲＤ８３−２８ ＦＺ１５ ＦＤ１５８３ ＦＺ２４ ＦＤ２４８３ ２）Ｆｅｒｍｉｐａｎ Ｓｔａｎｄａｒｄ（Ｇｉｓｔ Ｂｒｏｃａｄｅｓ）から の分離体 ＦＰ５ 接合体として ＰＤ５８３ ＦＰ６ ＰＤ６８３ ＦＰ１０ ＰＤ１０８３ ＦＰ２０ ＰＤ２０８３
【００５４】四倍体接合体を胞子形成させ、減数分裂し
た胞子を、二倍体ｌｔｉ酵母菌株Ｌ５００の胞子形成に
関して上述したように、単離した。１次分析でｌｔｉ表
現型を示した胞子をそれらの接合挙動と胞子形成挙動と
に関して、それぞれ、さらに分析した。
た胞子を、二倍体ｌｔｉ酵母菌株Ｌ５００の胞子形成に
関して上述したように、単離した。１次分析でｌｔｉ表
現型を示した胞子をそれらの接合挙動と胞子形成挙動と
に関して、それぞれ、さらに分析した。
【００５５】実施例２ 産業用性質に関する菌株の選択 産業用流加培養法における菌株の性能を判定するため
に、炭素源としてのエタノールと阻害性物質としてのア
セテートを含む好気性振とうフラスコ培養における増殖
速度を測定する試験を適用した。エタノール濃度は０．
７％の弱毒性(sub-toxic)レベルに選択し、アセテート
濃度（培地のｐＨを４．０に緩衝化することによって遊
離酸として存在）は、充分に機能する基準菌株（Ｌｅｖ
ｕｒｅ Ｂｏｕｌａｎｇｅｅｒｅ Ｂｌｅｕｅ（ＬＢ
Ｂ）、Ｌｅ Ｓａｆｆｒｅから）と充分に機能しない基
準菌株（Ｘ２１８０、Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓ
ｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ、ＵＣ Ｂｅｒｋｅｌｅｙ）と
の増殖速度の差異が最大になるように、最適化した。各
試験シリーズに、両方の基準菌株を含めて、試験した菌
株の性能を充分に機能する産業用菌株ＬＢＢの増殖速度
の％で表現する。
に、炭素源としてのエタノールと阻害性物質としてのア
セテートを含む好気性振とうフラスコ培養における増殖
速度を測定する試験を適用した。エタノール濃度は０．
７％の弱毒性(sub-toxic)レベルに選択し、アセテート
濃度（培地のｐＨを４．０に緩衝化することによって遊
離酸として存在）は、充分に機能する基準菌株（Ｌｅｖ
ｕｒｅ Ｂｏｕｌａｎｇｅｅｒｅ Ｂｌｅｕｅ（ＬＢ
Ｂ）、Ｌｅ Ｓａｆｆｒｅから）と充分に機能しない基
準菌株（Ｘ２１８０、Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓ
ｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ、ＵＣ Ｂｅｒｋｅｌｅｙ）と
の増殖速度の差異が最大になるように、最適化した。各
試験シリーズに、両方の基準菌株を含めて、試験した菌
株の性能を充分に機能する産業用菌株ＬＢＢの増殖速度
の％で表現する。
【００５６】試験すべき菌株の細胞を試験管内の５ｍｌ
のＹＰＤ（１重量％Ｄｉｆｃｏ Ｂａｃｔｏ酵母エキ
ス、２重量％Ｄｉｆｃｏ Ｂａｃｔｏペプトン、２重量
％グルコース）中で１９０ｒｐｍの回転シェーカー上、
３０℃において一晩前培養する。この培養物の１ｍｌを
用いて、１００ｍｌ量のＮＥ培地（０．６７％ｗ／ｖの
ＤＩＦＣＯ酵母窒素塩基ｗ／ｏアミノ酸、１％ｗ／ｖの
Ｎａ2−コハク酸塩、１．１２％ｖ／ｖのＨＣｌ ５
Ｍ、０．７％ｗ／ｖエタノール（オートクレーブ処理後
に添加））を含む振とうフラスコ（底部に４バッフルを
備えた５００ｍｌエーレンマイヤーフラスコ）前培養物
に接種して、インキュベーションを１９０ｒｐｍの回転
シェーカー上、３０℃において２４時間続けた。最終的
試験培養（底部に４バッフルを備えた５００ｍｌエーレ
ンマイヤーフラスコ）を１００ｍｌのＮＥＡ培地（０．
６７％ｗ／ｖのＤＩＦＣＯ酵母窒素塩基ｗ／ｏアミノ
酸、１％ｗ／ｖのＮａ2−コハク酸塩、１．１２％ｖ／
ｖのＨＣｌ ５Ｍ、０．７％ｗ／ｖエタノール、０．３
％ｗ／ｖ氷酢酸（エタノールと酢酸はオートクレーブ処
理後に添加））の接種によって、ＯＤ600が約０．１で
あるように開始した。３０℃における、１９０ｒｐｍの
回転シェーカー上でのインキュベーションを１０時間に
わたって続け、ＯＤ600を２時間間隔で測定した。培養
物の指数増殖期中に増殖速度を確認した。ＬＢＢ（１０
０％）に比較して、寄託菌株の増殖速度は下記の値であ
る： （ＬＢＢ １００％） ＦＣＬ３１３ １３７％ ＣＬ１４ １６５％ ＣＬ１８ ８５％ （Ｘ２１８０ 約３０〜４０％）
のＹＰＤ（１重量％Ｄｉｆｃｏ Ｂａｃｔｏ酵母エキ
ス、２重量％Ｄｉｆｃｏ Ｂａｃｔｏペプトン、２重量
％グルコース）中で１９０ｒｐｍの回転シェーカー上、
３０℃において一晩前培養する。この培養物の１ｍｌを
用いて、１００ｍｌ量のＮＥ培地（０．６７％ｗ／ｖの
ＤＩＦＣＯ酵母窒素塩基ｗ／ｏアミノ酸、１％ｗ／ｖの
Ｎａ2−コハク酸塩、１．１２％ｖ／ｖのＨＣｌ ５
Ｍ、０．７％ｗ／ｖエタノール（オートクレーブ処理後
に添加））を含む振とうフラスコ（底部に４バッフルを
備えた５００ｍｌエーレンマイヤーフラスコ）前培養物
に接種して、インキュベーションを１９０ｒｐｍの回転
シェーカー上、３０℃において２４時間続けた。最終的
試験培養（底部に４バッフルを備えた５００ｍｌエーレ
ンマイヤーフラスコ）を１００ｍｌのＮＥＡ培地（０．
６７％ｗ／ｖのＤＩＦＣＯ酵母窒素塩基ｗ／ｏアミノ
酸、１％ｗ／ｖのＮａ2−コハク酸塩、１．１２％ｖ／
ｖのＨＣｌ ５Ｍ、０．７％ｗ／ｖエタノール、０．３
％ｗ／ｖ氷酢酸（エタノールと酢酸はオートクレーブ処
理後に添加））の接種によって、ＯＤ600が約０．１で
あるように開始した。３０℃における、１９０ｒｐｍの
回転シェーカー上でのインキュベーションを１０時間に
わたって続け、ＯＤ600を２時間間隔で測定した。培養
物の指数増殖期中に増殖速度を確認した。ＬＢＢ（１０
０％）に比較して、寄託菌株の増殖速度は下記の値であ
る： （ＬＢＢ １００％） ＦＣＬ３１３ １３７％ ＣＬ１４ １６５％ ＣＬ１８ ８５％ （Ｘ２１８０ 約３０〜４０％）
【００５７】実施例３ ｌｔｉ性質に関する菌株の選択 細胞を振とうフラスコ培養の２ステージで増殖させた。
１工程は前培養を含むものであり、この工程では、各菌
株の−８０℃グリセロール凍結細胞懸濁液０．１ｍｌを
４曝気バッフル付き５００ｍｌエーレンマイヤーフラス
コ中の２００ｍｌのＹＤ培地（０．５％（ｗ／ｖ）Ｄｉ
ｆｃｏ酵母エキス、２％グルコース）に接種して、３０
℃で回転シェーカー上、１８０ｒｐｍにおいて７２時間
インキュベートした。この懸濁液を次に、Ｓｏｒｖａｌ
ｌ遠心分離機上、４℃において５００ｒｐｍで５分間遠
心分離し、培地を廃棄した。細胞ペレットを２００ｍｌ
の最少培地（０．６７％（ｗ／ｖ）のＤｉｆｃｏ酵母窒
素塩基ｗ／ｏアミノ酸、１．００％（Ｎａ2−コハク酸
塩）、０．２％サッカロース）中に再懸濁させ、培養を
４曝気バッフル付き５００ｍｌエーレンマイヤーフラス
コ中で３０℃において６時間続けた。その後、さらに
０．４％（ｗ／ｖ）サッカロース（４ｍｌの無菌２０％
サッカロース溶液４ｍｌ）を加え、回転シェーカー上、
１８０ｒｐｍ，３０℃において振とうを一晩続けた。細
胞を氷冷蒸留水で３回洗浄し、各回に５０００ｒｐｍに
おいて５分間遠心分離した。
１工程は前培養を含むものであり、この工程では、各菌
株の−８０℃グリセロール凍結細胞懸濁液０．１ｍｌを
４曝気バッフル付き５００ｍｌエーレンマイヤーフラス
コ中の２００ｍｌのＹＤ培地（０．５％（ｗ／ｖ）Ｄｉ
ｆｃｏ酵母エキス、２％グルコース）に接種して、３０
℃で回転シェーカー上、１８０ｒｐｍにおいて７２時間
インキュベートした。この懸濁液を次に、Ｓｏｒｖａｌ
ｌ遠心分離機上、４℃において５００ｒｐｍで５分間遠
心分離し、培地を廃棄した。細胞ペレットを２００ｍｌ
の最少培地（０．６７％（ｗ／ｖ）のＤｉｆｃｏ酵母窒
素塩基ｗ／ｏアミノ酸、１．００％（Ｎａ2−コハク酸
塩）、０．２％サッカロース）中に再懸濁させ、培養を
４曝気バッフル付き５００ｍｌエーレンマイヤーフラス
コ中で３０℃において６時間続けた。その後、さらに
０．４％（ｗ／ｖ）サッカロース（４ｍｌの無菌２０％
サッカロース溶液４ｍｌ）を加え、回転シェーカー上、
１８０ｒｐｍ，３０℃において振とうを一晩続けた。細
胞を氷冷蒸留水で３回洗浄し、各回に５０００ｒｐｍに
おいて５分間遠心分離した。
【００５８】モデルドウとして、通常のピザ−レシピを
比較的強力粉と共に選択した：成分は次の通りであっ
た：
比較的強力粉と共に選択した：成分は次の通りであっ
た：
【表１】
【００５９】ドウを次のように調製した。全ての成分を
４℃に維持し、低温室(４℃）においてドウ調製を行っ
た。落花生油を３０分間室温に放置することによって液
化させた。数グラムの酵母ケーキ（約３０％乾燥物質）
を５０ｍｌ Ｆａｌｃｏｎポリプロピレン管に計り入れ
ることによって、酵母スラリーを調製した。等量の冷水
道水を加えて、約１５％乾燥物質のスラリーを得て、こ
のスラリーを激しく混合した。小麦粉と塩とを混合し
て、落花生油と水とを加え、この時点で上記で調製した
４ｍｌの酵母スラリーを加えた。フラット・ビーター・
アタッチメントによってドウを４分間こねて、滑らかな
ドウを得た。１００ｇ片を切断して、これをＲＩＳＯＧ
ＲＡＰＨのガラス計量ジャーに移した。計量ジャーを密
封した後ただちに、測定を開始した。
４℃に維持し、低温室(４℃）においてドウ調製を行っ
た。落花生油を３０分間室温に放置することによって液
化させた。数グラムの酵母ケーキ（約３０％乾燥物質）
を５０ｍｌ Ｆａｌｃｏｎポリプロピレン管に計り入れ
ることによって、酵母スラリーを調製した。等量の冷水
道水を加えて、約１５％乾燥物質のスラリーを得て、こ
のスラリーを激しく混合した。小麦粉と塩とを混合し
て、落花生油と水とを加え、この時点で上記で調製した
４ｍｌの酵母スラリーを加えた。フラット・ビーター・
アタッチメントによってドウを４分間こねて、滑らかな
ドウを得た。１００ｇ片を切断して、これをＲＩＳＯＧ
ＲＡＰＨのガラス計量ジャーに移した。計量ジャーを密
封した後ただちに、測定を開始した。
【００６０】ガス発生を１２０時間にわたって１時間間
隔で８℃において測定した。温度を１２℃に上げて、ガ
ス発生を１００〜１２０時間にわたって１時間間隔で測
定した。温度を３０℃に上げて、ガス発生を６〜１７時
間にわたって１０分間間隔で測定した。ガス発生は各温
度におけるガス曲線の最初の勾配として算出した。３０
℃と８℃における測定結果を図１に示す。
隔で８℃において測定した。温度を１２℃に上げて、ガ
ス発生を１００〜１２０時間にわたって１時間間隔で測
定した。温度を３０℃に上げて、ガス発生を６〜１７時
間にわたって１０分間間隔で測定した。ガス発生は各温
度におけるガス曲線の最初の勾配として算出した。３０
℃と８℃における測定結果を図１に示す。
【００６１】実施例４ リストした量で成分を用いて、モデルドウを調製した：
【表２】
【００６２】ドウを１００ｇのアリコートに分割して、
“Ｎｉｅｓｌｅｒ”の容器（Ｂｉｏｓｐｅｃｔｒａ Ａ
Ｇ、シュリーレン、スイスから入手可能）に導入し、こ
の容器においてドウ組成物を４週間の期間にわたって約
８℃の温度に維持した。前記期間中に、ＣＯ2発生が測
定された。これらの測定結果は図１に示す。このように
調製したドウを１、２、３、４又は５週間後にベーキン
グしたときに、製品は優れたテキスチャーとフレーバー
を示し、これらは新たに混合したドウ組成物から製造さ
れた製品のテキスチャーとフレーバーに匹敵するもので
あった。
“Ｎｉｅｓｌｅｒ”の容器（Ｂｉｏｓｐｅｃｔｒａ Ａ
Ｇ、シュリーレン、スイスから入手可能）に導入し、こ
の容器においてドウ組成物を４週間の期間にわたって約
８℃の温度に維持した。前記期間中に、ＣＯ2発生が測
定された。これらの測定結果は図１に示す。このように
調製したドウを１、２、３、４又は５週間後にベーキン
グしたときに、製品は優れたテキスチャーとフレーバー
を示し、これらは新たに混合したドウ組成物から製造さ
れた製品のテキスチャーとフレーバーに匹敵するもので
あった。
【図１】３０℃と８℃において、それぞれ、得られた菌
株のＣＯ2発生を示す。
株のＣＯ2発生を示す。
【図２】種々の温度における種々の菌株のＣＯ2発生を
絶対速度で例示するグラフを示す。
絶対速度で例示するグラフを示す。
【図３】種々の温度における種々の菌株のＣＯ2発生を
相対速度で例示するグラフを示す。
相対速度で例示するグラフを示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:865） Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ Ｆターム(参考） 4B024 AA05 BA77 CA01 DA12 GA11 4B032 DB01 DK54 4B065 AA72X AA72Y AB01 AC20 BA01 CA42
Claims (13)
- 【請求項１】 産業用パン酵母の遺伝的バックグラウン
ドに、劣性対立遺伝子に基づく、酵母菌株の性質を導入
する方法であって、 （ａ）劣性対立遺伝子に基づく所望の性質を有する酵母
を選択する工程と； （ｂ）（ａ）で選択した酵母を二倍体化して、ホモ接合
型に関して選択する工程と； （ｃ）産業用パン酵母を二倍体化して、ホモ接合型に関
して選択する工程と； （ｄ）逆接合型を有する、上記（ｂ）と（ｃ）において
得られる菌株を接合させて、四倍体接合体を得る工程
と； （ｅ）（ｄ）で得られた接合体を胞子形成させる工程
と； （ｆ）所望の性質を示す菌株を選択する工程と； （ｇ）逆接合型を有する、（ｆ）で選択した菌株を任意
に接合させる工程とを含む前記方法。 - 【請求項２】 所望の性質が、バイオマス産生及び／若
しくは細胞分離及び／若しくは乾燥中に、及び／又は酵
母ドウ製造及び／若しくは貯蔵及び／若しくはベーキン
グ中に改良された性能を生じる（ａ）遺伝子の劣性対立
遺伝子（単数又は複数）に基づくものである、請求項１
記載の方法。 - 【請求項３】 遺伝子がカタボライト・リプレッサー遺
伝子、中性若しくは酸性トレハラーゼをコードする遺伝
子、生合成酵素をコードする遺伝子、又は対立遺伝子形
（単数又は複数）においてｌｔｉ−性質を生じる遺伝子
である、請求項２記載の方法。 - 【請求項４】 所望の性質がｌｔｉ性質である、請求項
３記載の方法。 - 【請求項５】 請求項１〜４のいずれか１項に記載の方
法によって得られるパン酵母。 - 【請求項６】 二倍体又は四倍体である、請求項５記載
のパン酵母。 - 【請求項７】 ｌｔｉ性質を有する、請求項５記載のパ
ン酵母。 - 【請求項８】 ３〜１２℃の冷蔵温度において３ｍｌ未
満／ｇドウ／時間、好ましくは１ｍｌ未満のＣＯ2産生
を有する、請求項７記載のパン酵母。 - 【請求項９】 構成的に又は誘導的にマルターゼを発現
する、請求項８記載のパン酵母。 - 【請求項１０】 ＦＣＬ３１３（ＮＣＩＭＢ４１００
２）又はＣＬ１４（ＮＣＩＭＢ４１０３２）又はＣＬ１
８（ＮＣＩＭＢ４１０３３）である、請求項５記載のパ
ン酵母。 - 【請求項１１】 請求項５〜１０のいずれか１項に記載
の酵母を含有するドウ組成物。 - 【請求項１２】 ベークトドウ製品の製造のための請求
項１０記載のドウ組成物の使用。 - 【請求項１３】 請求項１１記載のドウによって製造さ
れたベークト製品。
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