JP2001245668A - 微生物による天然ガスの漏気検知及びモニタリング方法 - Google Patents
微生物による天然ガスの漏気検知及びモニタリング方法Info
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- JP2001245668A JP2001245668A JP2000062326A JP2000062326A JP2001245668A JP 2001245668 A JP2001245668 A JP 2001245668A JP 2000062326 A JP2000062326 A JP 2000062326A JP 2000062326 A JP2000062326 A JP 2000062326A JP 2001245668 A JP2001245668 A JP 2001245668A
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Abstract
(57)【要約】
【解決手段】 炭化水素資化能を有する微生物群で、ゲ
ノムＤＮＡの塩基配列において特異的に保存性を有する
領域の塩基配列又はそれに相補的な塩基配列を用いて、
天然ガスの岩盤備蓄基地における地下水中の前記微生物
の個体数をモニタリングすることにより、前記岩盤備蓄
基地における天然ガスの漏気を検知する方法を提供す
る。 【効果】 本発明により、高い地下水圧がかかっている
天然ガスの地下岩盤備蓄基地において、漏気ガスを直接
的に、また原位置での漏気状況を間接的に検出すること
で検知感度の向上が可能となる。これにより、岩盤内で
の天然ガス漏気状況のモニタリング技術として本発明の
方法を適用し、これを安全管理の指標とすることが可能
である。また、メタン酸化細菌等の消長を追うことによ
り、漏気したメタン等の微生物環境浄化状態の診断を行
うことができる。
ノムＤＮＡの塩基配列において特異的に保存性を有する
領域の塩基配列又はそれに相補的な塩基配列を用いて、
天然ガスの岩盤備蓄基地における地下水中の前記微生物
の個体数をモニタリングすることにより、前記岩盤備蓄
基地における天然ガスの漏気を検知する方法を提供す
る。 【効果】 本発明により、高い地下水圧がかかっている
天然ガスの地下岩盤備蓄基地において、漏気ガスを直接
的に、また原位置での漏気状況を間接的に検出すること
で検知感度の向上が可能となる。これにより、岩盤内で
の天然ガス漏気状況のモニタリング技術として本発明の
方法を適用し、これを安全管理の指標とすることが可能
である。また、メタン酸化細菌等の消長を追うことによ
り、漏気したメタン等の微生物環境浄化状態の診断を行
うことができる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、天然ガスの漏気を
検知又はモニタリングする方法に関し、より詳細には、
漏気ガスを資化する微生物群を遺伝子レベルで特異的に
検出することにより岩盤備蓄における天然ガスの漏気を
検知又はモニタリングする方法に関する。
検知又はモニタリングする方法に関し、より詳細には、
漏気ガスを資化する微生物群を遺伝子レベルで特異的に
検出することにより岩盤備蓄における天然ガスの漏気を
検知又はモニタリングする方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】天然ガスは、メタンを主成分とする可燃
性ガスであり、都市ガス、火力発電、一般工業用の燃料
などに利用されている。また、将来においては、自動車
用燃料、燃料電池等、多くの分野での利用が期待されて
いる。このような天然ガスの備蓄方法としては、主に岩
盤備蓄と呼ばれる方法が採られる。
性ガスであり、都市ガス、火力発電、一般工業用の燃料
などに利用されている。また、将来においては、自動車
用燃料、燃料電池等、多くの分野での利用が期待されて
いる。このような天然ガスの備蓄方法としては、主に岩
盤備蓄と呼ばれる方法が採られる。
【０００３】天然ガスの岩盤備蓄には、大深度地下空間
に巨大なタンク施設（トンネル）を建造し、高水圧下で
天然ガスを貯蔵する方式がある。従来、岩盤備蓄におい
て天然ガスの漏気を検知する方法としては、家庭のガス
警報器と同様にメタンガスを酸化錫の半導体センサー等
で直接検知する方法、タンク内のガス充填圧の変化をモ
ニタリングする簡易法が用いられてきた。
に巨大なタンク施設（トンネル）を建造し、高水圧下で
天然ガスを貯蔵する方式がある。従来、岩盤備蓄におい
て天然ガスの漏気を検知する方法としては、家庭のガス
警報器と同様にメタンガスを酸化錫の半導体センサー等
で直接検知する方法、タンク内のガス充填圧の変化をモ
ニタリングする簡易法が用いられてきた。
【０００４】しかし、上記の高水圧下で貯蔵する方式で
は、その水圧の高さに起因して、漏気した天然ガスの地
下水中への溶解度が高く、さらに溶解した天然ガスが地
下水中を水平拡散移動するため、地上でのガス検知に時
間差が生じる。また、地下水中に棲息するメタン酸化細
菌等によって溶存メタンが資化されるため、地上での漏
気の確認に遅延が生じる可能性がある。
は、その水圧の高さに起因して、漏気した天然ガスの地
下水中への溶解度が高く、さらに溶解した天然ガスが地
下水中を水平拡散移動するため、地上でのガス検知に時
間差が生じる。また、地下水中に棲息するメタン酸化細
菌等によって溶存メタンが資化されるため、地上での漏
気の確認に遅延が生じる可能性がある。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、従来
の検知方法に加えて、天然ガス岩盤備蓄における地下水
中の漏気ガス資化微生物の増殖をモニタリングする方法
を用いることにより、漏気検知感度の向上、並びに漏気
の早期検知を図ることにある。
の検知方法に加えて、天然ガス岩盤備蓄における地下水
中の漏気ガス資化微生物の増殖をモニタリングする方法
を用いることにより、漏気検知感度の向上、並びに漏気
の早期検知を図ることにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の課
題を解決するために鋭意検討を行った結果、天然ガスの
岩盤備蓄基地における地下水中の炭化水素資化能を有す
る微生物の個体数をモニタリングすることにより、前記
岩盤備蓄基地における天然ガスの漏気を検知できるこ
と、及び前記岩盤備蓄基地における地下水溶存ガスの微
生物浄化の状態を診断できることを見出し、本発明を完
成させるに至った。
題を解決するために鋭意検討を行った結果、天然ガスの
岩盤備蓄基地における地下水中の炭化水素資化能を有す
る微生物の個体数をモニタリングすることにより、前記
岩盤備蓄基地における天然ガスの漏気を検知できるこ
と、及び前記岩盤備蓄基地における地下水溶存ガスの微
生物浄化の状態を診断できることを見出し、本発明を完
成させるに至った。
【０００７】すなわち、本発明は、天然ガスの岩盤備蓄
基地における地下水中の炭化水素資化能を有する微生物
の個体数をモニタリングすることにより、前記岩盤備蓄
基地における天然ガスの漏気を検知する方法を提供す
る。
基地における地下水中の炭化水素資化能を有する微生物
の個体数をモニタリングすることにより、前記岩盤備蓄
基地における天然ガスの漏気を検知する方法を提供す
る。
【０００８】この天然ガス漏気検知法において、前記微
生物はメタン酸化細菌であることが好ましい。また、該
検知法では、炭化水素資化能を有する微生物群で、ゲノ
ムＤＮＡの塩基配列において特異的に保存性を有する領
域の塩基配列又はそれに相補的な塩基配列を用いること
が好ましい。前記微生物群で特異的に保存性を有する前
記領域は、好ましくは16SｒＲＮＡ遺伝子上の領域又は
メタンモノオキシゲナーゼ遺伝子上の領域である。前記
炭化水素は、好ましくはメタン、エタン、プロパン、ｎ
−ブタン（ノルマルブタン）又はｉ−ブタン（イソブタ
ン）であり、より好ましくはメタンである。
生物はメタン酸化細菌であることが好ましい。また、該
検知法では、炭化水素資化能を有する微生物群で、ゲノ
ムＤＮＡの塩基配列において特異的に保存性を有する領
域の塩基配列又はそれに相補的な塩基配列を用いること
が好ましい。前記微生物群で特異的に保存性を有する前
記領域は、好ましくは16SｒＲＮＡ遺伝子上の領域又は
メタンモノオキシゲナーゼ遺伝子上の領域である。前記
炭化水素は、好ましくはメタン、エタン、プロパン、ｎ
−ブタン（ノルマルブタン）又はｉ−ブタン（イソブタ
ン）であり、より好ましくはメタンである。
【０００９】本発明の好ましい実施形態では、上記天然
ガス漏気検知法は、前記地下水から得られる核酸試料に
対して、前記微生物群で特異的に保存性を有する前記領
域の塩基配列又はそれに相補的な塩基配列を含むオリゴ
ヌクレオチドをプローブとするハイブリダイゼーション
を行う工程を含む。
ガス漏気検知法は、前記地下水から得られる核酸試料に
対して、前記微生物群で特異的に保存性を有する前記領
域の塩基配列又はそれに相補的な塩基配列を含むオリゴ
ヌクレオチドをプローブとするハイブリダイゼーション
を行う工程を含む。
【００１０】本発明の他の好ましい実施形態では、前記
微生物群で特異的に保存性を有する前記領域が２つあ
り、上記天然ガス漏気検知法は、5'末端側の領域の塩基
配列を含むプライマー及び3'末端側の領域の塩基配列に
相補的な塩基配列を含むプライマーを用いて、前記地下
水から得られる核酸試料を鋳型とするポリメラーゼ連鎖
反応を行う工程を含む。
微生物群で特異的に保存性を有する前記領域が２つあ
り、上記天然ガス漏気検知法は、5'末端側の領域の塩基
配列を含むプライマー及び3'末端側の領域の塩基配列に
相補的な塩基配列を含むプライマーを用いて、前記地下
水から得られる核酸試料を鋳型とするポリメラーゼ連鎖
反応を行う工程を含む。
【００１１】さらに、本発明は、天然ガスの岩盤備蓄基
地における地下水中の炭化水素資化能を有する微生物の
個体数をモニタリングすることにより、前記岩盤備蓄基
地における地下水溶存ガスの微生物浄化の状態を診断す
る方法を提供する。
地における地下水中の炭化水素資化能を有する微生物の
個体数をモニタリングすることにより、前記岩盤備蓄基
地における地下水溶存ガスの微生物浄化の状態を診断す
る方法を提供する。
【００１２】この診断法において、前記微生物はメタン
酸化細菌であることが好ましい。また、該診断法では、
炭化水素資化能を有する微生物群で、ゲノムＤＮＡの塩
基配列において特異的に保存性を有する領域の塩基配列
又はそれに相補的な塩基配列を用いることが好ましい。
前記微生物群で特異的に保存性を有する前記領域は、好
ましくは16SｒＲＮＡ遺伝子上の領域又はメタンモノオ
キシゲナーゼ遺伝子上の領域である。前記炭化水素は、
好ましくはメタン、エタン、プロパン、ｎ−ブタン（ノ
ルマルブタン）又はｉ−ブタン（イソブタン）であり、
より好ましくはメタンである。
酸化細菌であることが好ましい。また、該診断法では、
炭化水素資化能を有する微生物群で、ゲノムＤＮＡの塩
基配列において特異的に保存性を有する領域の塩基配列
又はそれに相補的な塩基配列を用いることが好ましい。
前記微生物群で特異的に保存性を有する前記領域は、好
ましくは16SｒＲＮＡ遺伝子上の領域又はメタンモノオ
キシゲナーゼ遺伝子上の領域である。前記炭化水素は、
好ましくはメタン、エタン、プロパン、ｎ−ブタン（ノ
ルマルブタン）又はｉ−ブタン（イソブタン）であり、
より好ましくはメタンである。
【００１３】本発明の好ましい実施形態では、上記診断
法は、前記地下水から得られる核酸試料に対して、前記
微生物群で特異的に保存性を有する前記領域の塩基配列
又はそれに相補的な塩基配列を含むオリゴヌクレオチド
をプローブとするハイブリダイゼーションを行う工程を
含む。
法は、前記地下水から得られる核酸試料に対して、前記
微生物群で特異的に保存性を有する前記領域の塩基配列
又はそれに相補的な塩基配列を含むオリゴヌクレオチド
をプローブとするハイブリダイゼーションを行う工程を
含む。
【００１４】本発明の他の好ましい実施形態では、前記
微生物群で特異的に保存性を有する前記領域が２つあ
り、上記診断法は、5'末端側の領域の塩基配列を含むプ
ライマー及び3'末端側の領域の塩基配列に相補的な塩基
配列を含むプライマーを用いて、前記地下水から得られ
る核酸試料を鋳型とするポリメラーゼ連鎖反応を行う工
程を含む。
微生物群で特異的に保存性を有する前記領域が２つあ
り、上記診断法は、5'末端側の領域の塩基配列を含むプ
ライマー及び3'末端側の領域の塩基配列に相補的な塩基
配列を含むプライマーを用いて、前記地下水から得られ
る核酸試料を鋳型とするポリメラーゼ連鎖反応を行う工
程を含む。
【００１５】
【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、天然ガスの岩盤備蓄基地における地下水中の
前記微生物を定量的に検出し、該検出を経時的に行うこ
とにより該微生物の個体数をモニタリングすることによ
って、天然ガスの岩盤備蓄基地における天然ガスの漏気
を検知する方法に関し、これは、例えば、炭化水素資化
能を有する微生物群で、ゲノムＤＮＡの塩基配列におい
て特異的に保存性を有する領域（以下「特異的保存領
域」という。）の塩基配列又はそれに相補的な塩基配列
を用いることにより行うことができる。
本発明は、天然ガスの岩盤備蓄基地における地下水中の
前記微生物を定量的に検出し、該検出を経時的に行うこ
とにより該微生物の個体数をモニタリングすることによ
って、天然ガスの岩盤備蓄基地における天然ガスの漏気
を検知する方法に関し、これは、例えば、炭化水素資化
能を有する微生物群で、ゲノムＤＮＡの塩基配列におい
て特異的に保存性を有する領域（以下「特異的保存領
域」という。）の塩基配列又はそれに相補的な塩基配列
を用いることにより行うことができる。
【００１６】また、本発明は、天然ガスの岩盤備蓄基地
における地下水溶存ガスの微生物浄化の状態を診断する
方法に関し、これも、上記と同様の手段により、炭化水
素資化能を有する微生物の個体数をモニタリングするこ
とによって行うことができる。
における地下水溶存ガスの微生物浄化の状態を診断する
方法に関し、これも、上記と同様の手段により、炭化水
素資化能を有する微生物の個体数をモニタリングするこ
とによって行うことができる。
【００１７】上記炭化水素は、好ましくはメタン、エタ
ン、プロパン、ｎ−ブタン（ノルマルブタン）又はｉ−
ブタン（イソブタン）であり、より好ましくはメタンで
ある。上記微生物群で特異的に保存性を有する上記領域
は、好ましくは16SｒＲＮＡ遺伝子上の領域又はメタン
モノオキシゲナーゼ遺伝子上の領域である。上記微生物
は、炭化水素資化能を有するものであればよく、特に限
定されないが、好ましくはメタン、エタン、プロパン、
ｎ−ブタン（ノルマルブタン）又はｉ−ブタン（イソブ
タン）を資化するものであり、より好ましくはメタン酸
化細菌である。上記メタン酸化細菌としては、炭素資化
にリブロース１リン酸経路（RuMP pathway）を利用する
もの、セリン経路（Serine pathway）を利用するもの等
を挙げることができる。
ン、プロパン、ｎ−ブタン（ノルマルブタン）又はｉ−
ブタン（イソブタン）であり、より好ましくはメタンで
ある。上記微生物群で特異的に保存性を有する上記領域
は、好ましくは16SｒＲＮＡ遺伝子上の領域又はメタン
モノオキシゲナーゼ遺伝子上の領域である。上記微生物
は、炭化水素資化能を有するものであればよく、特に限
定されないが、好ましくはメタン、エタン、プロパン、
ｎ−ブタン（ノルマルブタン）又はｉ−ブタン（イソブ
タン）を資化するものであり、より好ましくはメタン酸
化細菌である。上記メタン酸化細菌としては、炭素資化
にリブロース１リン酸経路（RuMP pathway）を利用する
もの、セリン経路（Serine pathway）を利用するもの等
を挙げることができる。
【００１８】上記RuMP経路メタン酸化細菌としては、例
えば、単離株761、メチロバクター・ボビス（Methyloba
cter bovis）、メチロバクター・カプスラタス（Methyl
obacter capsulatus）（メチロバクター・ウィテンブリ
イ（Methylobacter whittenburyi））、メチロバクター
・ビネランディー（Methylobacter vinelandii）、メチ
ロコッカス・カプスラタスBath（Methylococcus capsul
atus Bath）、メチロモナス・アジル（Methylomonas ag
ile）（メチロバクター・アジリス（Methylobacter agi
lis））、メチロモナス・アルブスBG8（Methylomonas a
lbus BG8）、メチロモナス・グラシリス（Methylomonas
gracilis）、メチロモナス・ルテウス（Methylomonas
luteus）、メチロモナス・メタニカ（Methylomonas met
hanica）、メチロモナス・ルブラ（Methylomonas rubr
a）等が挙げられるが、これらに限定されない。
えば、単離株761、メチロバクター・ボビス（Methyloba
cter bovis）、メチロバクター・カプスラタス（Methyl
obacter capsulatus）（メチロバクター・ウィテンブリ
イ（Methylobacter whittenburyi））、メチロバクター
・ビネランディー（Methylobacter vinelandii）、メチ
ロコッカス・カプスラタスBath（Methylococcus capsul
atus Bath）、メチロモナス・アジル（Methylomonas ag
ile）（メチロバクター・アジリス（Methylobacter agi
lis））、メチロモナス・アルブスBG8（Methylomonas a
lbus BG8）、メチロモナス・グラシリス（Methylomonas
gracilis）、メチロモナス・ルテウス（Methylomonas
luteus）、メチロモナス・メタニカ（Methylomonas met
hanica）、メチロモナス・ルブラ（Methylomonas rubr
a）等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１９】上記セリン経路メタン酸化細菌としては、
例えば、メチロシスティス・エキノイデス（Methylocys
tis echinoides）、メチロシスティス・ミニムス（Meth
ylocystis minimus）、メチロシスティス・パルブスOBB
P（Methylocystis parvus OBBP）、メチロシスティス・
ピリホルミス（Methylocystis pyriformis）、IMV B-30
60株、メチロシヌス・メタニカ81Z（Methylosinus meth
anica 81Z）、メチロシヌス・スポリウム（Methylosinu
s sporium）、メチロシヌス・トリコスポリウムOB3b（M
ethylosinus trichosporium OB3b）、メチロシヌスsp．
LAC株（Methylosinus sp． strain LAC）、メチロシヌ
スsp．B株（Methylosinus sp． strainB）等が挙げられ
るが、これらに限定されない。
例えば、メチロシスティス・エキノイデス（Methylocys
tis echinoides）、メチロシスティス・ミニムス（Meth
ylocystis minimus）、メチロシスティス・パルブスOBB
P（Methylocystis parvus OBBP）、メチロシスティス・
ピリホルミス（Methylocystis pyriformis）、IMV B-30
60株、メチロシヌス・メタニカ81Z（Methylosinus meth
anica 81Z）、メチロシヌス・スポリウム（Methylosinu
s sporium）、メチロシヌス・トリコスポリウムOB3b（M
ethylosinus trichosporium OB3b）、メチロシヌスsp．
LAC株（Methylosinus sp． strain LAC）、メチロシヌ
スsp．B株（Methylosinus sp． strainB）等が挙げられ
るが、これらに限定されない。
【００２０】炭化水素資化能を有する他の微生物として
は、例えば、上記メタン酸化細菌以外のメチロトローフ
（含まれる炭素原子が１つの化合物を資化する細菌）が
挙げられ、これにもRuMP経路メチロトローフ、セリン経
路メチロトローフ等がある。
は、例えば、上記メタン酸化細菌以外のメチロトローフ
（含まれる炭素原子が１つの化合物を資化する細菌）が
挙げられ、これにもRuMP経路メチロトローフ、セリン経
路メチロトローフ等がある。
【００２１】上記RuMP経路メチロトローフとしては、例
えば、上記RuMP経路メタン酸化細菌の他に、メチロバチ
ルス・フラゲラツムKT1（Methylobacillus flagellatum
KT1）、メチロバチルス・グリコゲネス（Methylobacil
lus glycogenes）、メチロモナス・メタノリカ（Methyl
omonas methanolica）、メチロモナス・メチロボラ（Me
thylomonas methylovora）、メチロフィルス・メチロト
ローフスAS1（Methylophilus methylotrophus AS1）等
が挙げられるが、これらに限定されない。
えば、上記RuMP経路メタン酸化細菌の他に、メチロバチ
ルス・フラゲラツムKT1（Methylobacillus flagellatum
KT1）、メチロバチルス・グリコゲネス（Methylobacil
lus glycogenes）、メチロモナス・メタノリカ（Methyl
omonas methanolica）、メチロモナス・メチロボラ（Me
thylomonas methylovora）、メチロフィルス・メチロト
ローフスAS1（Methylophilus methylotrophus AS1）等
が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２２】上記セリン経路メチロトローフとしては、
例えば、上記セリン経路メタン酸化細菌の他に、メチロ
バクテリウム・エクストルクエンス（Methylobacterium
extorquens）、メチロバクテリウム・オルガノフィル
ムXX（Methylobacterium organophilum XX）、メチロバ
クテリウム・ロデシアナム（Methylobacterium rhodesi
anum）、メチロバクテリウム・ロジナム（Methylobacte
rium rhodinum）、メチロバクテリウム・ザトマニイ（M
ethylobacterium zatmanii）、メチロバクテリウム・エ
クストルクエンスAM1（Methylobacterium extorquens A
M1）、メチロバクテリウムsp．M27株（Methylobacteriu
m sp． strain M27）、メチロバクテリウムsp．DM4株
（Methylobacterium sp． strain DM4）、PK-1株、PR-6
株等が挙げられるが、これらに限定されない。また、メ
タンもメタノールも資化しないメチロトローフとして
は、例えば、ER2株等が挙げられるが、これに限定され
ない。
例えば、上記セリン経路メタン酸化細菌の他に、メチロ
バクテリウム・エクストルクエンス（Methylobacterium
extorquens）、メチロバクテリウム・オルガノフィル
ムXX（Methylobacterium organophilum XX）、メチロバ
クテリウム・ロデシアナム（Methylobacterium rhodesi
anum）、メチロバクテリウム・ロジナム（Methylobacte
rium rhodinum）、メチロバクテリウム・ザトマニイ（M
ethylobacterium zatmanii）、メチロバクテリウム・エ
クストルクエンスAM1（Methylobacterium extorquens A
M1）、メチロバクテリウムsp．M27株（Methylobacteriu
m sp． strain M27）、メチロバクテリウムsp．DM4株
（Methylobacterium sp． strain DM4）、PK-1株、PR-6
株等が挙げられるが、これらに限定されない。また、メ
タンもメタノールも資化しないメチロトローフとして
は、例えば、ER2株等が挙げられるが、これに限定され
ない。
【００２３】上記のような特異的保存領域は、炭化水素
資化能を有する微生物およびその他の微生物のゲノム上
の塩基配列、好ましくは16SｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列
を比較することにより特定することができる。より詳細
には、これらの塩基配列を比較して、炭化水素資化能を
有する微生物由来のものの間でのみ保存性が高く、その
他の微生物由来のものとは保存性が低い領域を、特異的
保存領域として特定することができる。また、検出対象
の微生物がメタン酸化細菌である場合には、メタン酸化
細菌特有の酵素であるメタンモノオキシゲナーゼ（CH4-
monooxygenase）の遺伝子の塩基配列を比較して保存領
域を特定し、これを上記特異的保存領域として用いるこ
とができる。このような特異的保存領域の塩基数は特に
制限されないが、好ましくは１０塩基以上、より好まし
くは１５塩基以上、最も好ましくは２０塩基以上であ
る。
資化能を有する微生物およびその他の微生物のゲノム上
の塩基配列、好ましくは16SｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列
を比較することにより特定することができる。より詳細
には、これらの塩基配列を比較して、炭化水素資化能を
有する微生物由来のものの間でのみ保存性が高く、その
他の微生物由来のものとは保存性が低い領域を、特異的
保存領域として特定することができる。また、検出対象
の微生物がメタン酸化細菌である場合には、メタン酸化
細菌特有の酵素であるメタンモノオキシゲナーゼ（CH4-
monooxygenase）の遺伝子の塩基配列を比較して保存領
域を特定し、これを上記特異的保存領域として用いるこ
とができる。このような特異的保存領域の塩基数は特に
制限されないが、好ましくは１０塩基以上、より好まし
くは１５塩基以上、最も好ましくは２０塩基以上であ
る。
【００２４】上記の特異的保存領域の特定のための配列
比較に用いる公知の塩基配列としては、微生物のゲノム
上の塩基配列として知られているものであればいずれの
ものを用いてもよく、特に限定されないが、好ましくは
16SｒＲＮＡ遺伝子又はメタンモノオキシゲナーゼ遺伝
子の塩基配列を用いる。このような塩基配列はGenBank
等のＤＮＡデータベースを用いて検索し、入手すること
ができる。ＤＮＡデータベースから入手できる16SｒＲ
ＮＡ遺伝子の塩基配列としては、例えば、下記の表１に
示されるものが挙げられる。
比較に用いる公知の塩基配列としては、微生物のゲノム
上の塩基配列として知られているものであればいずれの
ものを用いてもよく、特に限定されないが、好ましくは
16SｒＲＮＡ遺伝子又はメタンモノオキシゲナーゼ遺伝
子の塩基配列を用いる。このような塩基配列はGenBank
等のＤＮＡデータベースを用いて検索し、入手すること
ができる。ＤＮＡデータベースから入手できる16SｒＲ
ＮＡ遺伝子の塩基配列としては、例えば、下記の表１に
示されるものが挙げられる。
【００２５】
【表１】
【００２６】さらに、表１に示される塩基配列のうち、
一部のものの比較を図１及び図２に示す。例えば、これ
らの比較図に基づき、モニタリングの対象とする微生物
の間で保存性が高く、かつ、大腸菌（E. coli）の塩基
配列との間で保存性の低い領域を、特異的保存領域とし
て特定することができる。このようにして特定される特
異的保存領域の塩基配列としては、例えば、配列番号１
〜５で表わされる塩基配列が挙げられる。
一部のものの比較を図１及び図２に示す。例えば、これ
らの比較図に基づき、モニタリングの対象とする微生物
の間で保存性が高く、かつ、大腸菌（E. coli）の塩基
配列との間で保存性の低い領域を、特異的保存領域とし
て特定することができる。このようにして特定される特
異的保存領域の塩基配列としては、例えば、配列番号１
〜５で表わされる塩基配列が挙げられる。
【００２７】本発明の好ましい実施形態では、上記天然
ガス漏気検知法及び上記溶存ガス微生物浄化診断法は、
上記地下水から得られる核酸試料に対して、上記特異的
保存領域の塩基配列又はそれに相補的な塩基配列を含む
オリゴヌクレオチドをプローブとするハイブリダイゼー
ションを行う工程を含む。
ガス漏気検知法及び上記溶存ガス微生物浄化診断法は、
上記地下水から得られる核酸試料に対して、上記特異的
保存領域の塩基配列又はそれに相補的な塩基配列を含む
オリゴヌクレオチドをプローブとするハイブリダイゼー
ションを行う工程を含む。
【００２８】上記核酸試料は、ＤＮＡ試料及びＲＮＡ試
料のいずれであってもよい。このような核酸試料は、天
然ガスの岩盤備蓄基地の地下水から公知の核酸抽出法に
よって得ることができる（例えば、Short Protocols in
Molecular Biology, 3rd ed., Frederick M. Ausubel
ら編, John Wiley & Sons, Inc., 1995を参照された
い）。
料のいずれであってもよい。このような核酸試料は、天
然ガスの岩盤備蓄基地の地下水から公知の核酸抽出法に
よって得ることができる（例えば、Short Protocols in
Molecular Biology, 3rd ed., Frederick M. Ausubel
ら編, John Wiley & Sons, Inc., 1995を参照された
い）。
【００２９】上記プローブは、上記特異的保存領域の塩
基配列と相同的又は相補的な塩基配列を含むオリゴヌク
レオチドである。例えば、特異的保存領域として上記の
配列番号１〜５に示される塩基配列を用いる場合には、
配列番号６〜１０で表わされる塩基配列を含むプローブ
を設計することができる。ここで、配列番号６又は７で
表わされる塩基配列を含むプローブはRuMP経路メタン酸
化細菌を検出するためのものであり、配列番号８で表わ
される塩基配列を含むプローブはRuMP経路メチロトロー
フ（メタン酸化細菌を除く）を検出するためのものであ
り、配列番号９で表わされる塩基配列を含むプローブは
セリン経路メタン酸化細菌を検出するためのものであ
り、配列番号１０で表わされる塩基配列を含むプローブ
はセリン経路メチロトローフ（メタン酸化細菌を除く）
を検出するためのものである。さらに、RuMP経路メチロ
トローフ（メタン酸化細菌を除く）を検出するためには
配列番号１１で表わされる塩基配列を含むプローブを用
いることができ、また、セリン経路メチロトローフ（メ
タン酸化細菌を除く）を検出するためには配列番号１２
で表わされる塩基配列を含むプローブを用いることがで
きる。例えば、メタン酸化細菌のみを出来るだけもれな
く検出するためには、配列番号７で表わされる塩基配列
を含むプローブ及び配列番号９で表わされる塩基配列を
含むプローブを用いることが好ましい。
基配列と相同的又は相補的な塩基配列を含むオリゴヌク
レオチドである。例えば、特異的保存領域として上記の
配列番号１〜５に示される塩基配列を用いる場合には、
配列番号６〜１０で表わされる塩基配列を含むプローブ
を設計することができる。ここで、配列番号６又は７で
表わされる塩基配列を含むプローブはRuMP経路メタン酸
化細菌を検出するためのものであり、配列番号８で表わ
される塩基配列を含むプローブはRuMP経路メチロトロー
フ（メタン酸化細菌を除く）を検出するためのものであ
り、配列番号９で表わされる塩基配列を含むプローブは
セリン経路メタン酸化細菌を検出するためのものであ
り、配列番号１０で表わされる塩基配列を含むプローブ
はセリン経路メチロトローフ（メタン酸化細菌を除く）
を検出するためのものである。さらに、RuMP経路メチロ
トローフ（メタン酸化細菌を除く）を検出するためには
配列番号１１で表わされる塩基配列を含むプローブを用
いることができ、また、セリン経路メチロトローフ（メ
タン酸化細菌を除く）を検出するためには配列番号１２
で表わされる塩基配列を含むプローブを用いることがで
きる。例えば、メタン酸化細菌のみを出来るだけもれな
く検出するためには、配列番号７で表わされる塩基配列
を含むプローブ及び配列番号９で表わされる塩基配列を
含むプローブを用いることが好ましい。
【００３０】このようにして設計されたプローブは、オ
リゴヌクレオチドの合成法として当技術分野で公知の方
法により調製することができる。さらに、ハイブリダイ
ゼーション後の該プローブの検出を可能とするために
は、該プローブを標識化することが好ましい。このよう
な標識としては、当業者に公知のものを用いることがで
き、特に限定されないが、例えば、ジゴキシゲニン（DI
G）を用いることができる。DIGを用いる標識化及び検出
は、市販のキット、例えば、DIG DNA labelingmixture
（Boehringer mannheim Biochemica）及びDIG luminesc
ent detection kit（Boehringer Mannheim）を用いるこ
とにより、簡便に行うことができる。
リゴヌクレオチドの合成法として当技術分野で公知の方
法により調製することができる。さらに、ハイブリダイ
ゼーション後の該プローブの検出を可能とするために
は、該プローブを標識化することが好ましい。このよう
な標識としては、当業者に公知のものを用いることがで
き、特に限定されないが、例えば、ジゴキシゲニン（DI
G）を用いることができる。DIGを用いる標識化及び検出
は、市販のキット、例えば、DIG DNA labelingmixture
（Boehringer mannheim Biochemica）及びDIG luminesc
ent detection kit（Boehringer Mannheim）を用いるこ
とにより、簡便に行うことができる。
【００３１】ハイブリダイゼーションに関する他の試
薬、温度条件等は、当業者であれば適切に選択及び設定
することができるため、特に限定されないが、好ましく
は、緩衝液（0.9M NaCl，20mM Tris-HCl (pH7.2)，0.01
％(w/v)SDS）にホルムアミドを最適濃度で加えたハイブ
リダイゼーション緩衝液を用い、４６℃で３時間のハイ
ブリダイゼーションを行い、その後に４８℃で２０分間
の洗浄を行う。ホルムアミドの上記最適濃度は、使用す
るプローブの塩基配列に依存して決まるが、例えば、配
列番号７で表わされる塩基配列を含むプローブを用いる
場合には２０％（v/v）、配列番号９で表わされる塩基
配列を含むプローブを用いる場合には１５％（v/v）と
することができる。
薬、温度条件等は、当業者であれば適切に選択及び設定
することができるため、特に限定されないが、好ましく
は、緩衝液（0.9M NaCl，20mM Tris-HCl (pH7.2)，0.01
％(w/v)SDS）にホルムアミドを最適濃度で加えたハイブ
リダイゼーション緩衝液を用い、４６℃で３時間のハイ
ブリダイゼーションを行い、その後に４８℃で２０分間
の洗浄を行う。ホルムアミドの上記最適濃度は、使用す
るプローブの塩基配列に依存して決まるが、例えば、配
列番号７で表わされる塩基配列を含むプローブを用いる
場合には２０％（v/v）、配列番号９で表わされる塩基
配列を含むプローブを用いる場合には１５％（v/v）と
することができる。
【００３２】本発明の好ましい実施形態では、上記特異
的保存領域が２つあり、上記天然ガス漏気検知法及び上
記溶存ガス微生物浄化診断法は、5'末端側の領域の塩基
配列を含むプライマー及び3'末端側の領域の塩基配列に
相補的な塩基配列を含むプライマーを用いて、上記地下
水から得られる核酸試料を鋳型とするポリメラーゼ連鎖
反応（ＰＣＲ）を行う工程を含む。
的保存領域が２つあり、上記天然ガス漏気検知法及び上
記溶存ガス微生物浄化診断法は、5'末端側の領域の塩基
配列を含むプライマー及び3'末端側の領域の塩基配列に
相補的な塩基配列を含むプライマーを用いて、上記地下
水から得られる核酸試料を鋳型とするポリメラーゼ連鎖
反応（ＰＣＲ）を行う工程を含む。
【００３３】鋳型として用いる核酸試料は、ＤＮＡ試料
及びＲＮＡ試料のいずれであってもよいが、好ましくは
ＤＮＡ試料である。このような核酸試料は、天然ガスの
岩盤備蓄基地の地下水から公知の核酸抽出法によって得
ることができる（例えば、Short Protocols in Molecul
ar Biology, 3rd ed., Frederick M. Ausubelら編, Joh
n Wiley & Sons, Inc., 1995を参照されたい）。
及びＲＮＡ試料のいずれであってもよいが、好ましくは
ＤＮＡ試料である。このような核酸試料は、天然ガスの
岩盤備蓄基地の地下水から公知の核酸抽出法によって得
ることができる（例えば、Short Protocols in Molecul
ar Biology, 3rd ed., Frederick M. Ausubelら編, Joh
n Wiley & Sons, Inc., 1995を参照されたい）。
【００３４】２つの特異的保存領域に基づくプライマー
の設計は、両領域のうちの5'末端側のものの塩基配列を
そのままセンスプライマーとし、3'末端側のものの塩基
配列に相補的な配列をアンチセンスプライマーとするこ
とにより行うことができる。設計されるプライマーによ
り増幅される領域の塩基数は特に限定されないが、好ま
しくは３kbp以下、より好ましくは１kbp以下とする。ま
た、プライマーそのものの塩基数もまた特に限定されな
いが、好ましくは１０塩基以上、より好ましくは１５塩
基以上、最も好ましくは１７塩基以上とする。プライマ
ーのＧＣ含量は５０〜６５％とすることが好ましく、Ｔ
ｍ値は、好ましくは５０℃〜６５℃、より好ましくは約
５５℃とする。さらに、２つのプライマーがプライマー
ダイマーを形成しないように、プライマー同士に相補性
がないように設計する必要がある。 ＰＣＲに関する他
の試薬、温度条件、サイクルの回数等は、当業者であれ
ば適切に選択及び設定することができるため、特に制限
されない。
の設計は、両領域のうちの5'末端側のものの塩基配列を
そのままセンスプライマーとし、3'末端側のものの塩基
配列に相補的な配列をアンチセンスプライマーとするこ
とにより行うことができる。設計されるプライマーによ
り増幅される領域の塩基数は特に限定されないが、好ま
しくは３kbp以下、より好ましくは１kbp以下とする。ま
た、プライマーそのものの塩基数もまた特に限定されな
いが、好ましくは１０塩基以上、より好ましくは１５塩
基以上、最も好ましくは１７塩基以上とする。プライマ
ーのＧＣ含量は５０〜６５％とすることが好ましく、Ｔ
ｍ値は、好ましくは５０℃〜６５℃、より好ましくは約
５５℃とする。さらに、２つのプライマーがプライマー
ダイマーを形成しないように、プライマー同士に相補性
がないように設計する必要がある。 ＰＣＲに関する他
の試薬、温度条件、サイクルの回数等は、当業者であれ
ば適切に選択及び設定することができるため、特に制限
されない。
【００３５】上記ＰＣＲにより得られるＰＣＲ産物中
に、目的の増幅断片が含まれるかどうかは、電気泳動、
ＤＮＡハイブリダイゼーション等の公知の方法を用いて
確認することができる。目的の増幅断片のサイズは、検
出しようとする細菌のゲノム上において両プライマーに
挟まれる領域の塩基数となる。
に、目的の増幅断片が含まれるかどうかは、電気泳動、
ＤＮＡハイブリダイゼーション等の公知の方法を用いて
確認することができる。目的の増幅断片のサイズは、検
出しようとする細菌のゲノム上において両プライマーに
挟まれる領域の塩基数となる。
【００３６】
【実施例】以下に実施例を挙げて、本発明をより具体的
に説明する。ただし、これらの実施例は説明のためのも
のであり、本発明の技術的範囲を制限するものではな
い。 〔実施例１〕16S ｒＲＮＡの塩基配列中における各種メ
チロトローフに特異的に保存性を有する塩基配列の決定 各種メチロトローフにおける特異的保存領域を決定する
ため、RuMP経路メタン酸化細菌由来16S ｒＲＮＡとし
て、単離株761、メチロバクター・ボビス（Methylobact
er bovis）、メチロバクター・カプスラタス（Methylob
acter capsulatus）（メチロバクター・ウィテンブリイ
（Methylobacter whittenburyi））、メチロバクター・
ビネランディー（Methylobacter vinelandii）、メチロ
コッカス・カプスラタスBath（Methylococcus capsulat
us Bath）、メチロモナス・アジル（Methylomonas agil
e）（メチロバクター・アジリス（Methylobacter agili
s））、メチロモナス・グラシリス（Methylomonas grac
ilis）、メチロモナス・ルテウス（Methylomonas luteu
s）、メチロモナス・メタニカ（Methylomonas methanic
a）、メチロモナス・ルブラ（Methylomonas rubra）か
らの16S ｒＲＮＡを、セリン経路メタン酸化細菌由来16
S ｒＲＮＡとして、メチロシスティス・エキノイデス
（Methylocystis echinoides）、メチロシスティス・ミ
ニムス（Methylocystis minimus）、メチロシスティス
・パルブスOBBP（Methylocystis parvusOBBP）、メチロ
システィス・ピリホルミス（Methylocystis pyriformi
s）、IMVB-3060株、メチロシヌス・メタニカ81Z（Methy
losinus methanica 81Z）、メチロシヌス・スポリウム
（Methylosinus sporium）、メチロシヌス・トリコスポ
リウムOB3b（Methylosinus trichosporium OB3b）、メ
チロシヌスsp．LAC株（Methylosinus sp． strain LA
C）、メチロシヌスsp．B株（Methylosinus sp． strain
B）からの16S ｒＲＮＡを、RuMP経路メチロトローフ由
来16S ｒＲＮＡとして、メチロバチルス・フラゲラツム
KT1（Methylobacillus flagellatum KT1）、メチロバチ
ルス・グリコゲネス（Methylobacillus glycogenes）、
メチロモナス・メタノリカ（Methylomonas methanolic
a）、メチロモナス・メチロボラ（Methylomonas methyl
ovora）、メチロフィルス・メチロトローフスAS1（Meth
ylophilusmethylotrophus AS1）からの16S ｒＲＮＡ
を、セリン経路メチロトローフ由来16S ｒＲＮＡとし
て、メチロバクテリウム・エクストルクエンス（Methyl
obacterium extorquens）、メチロバクテリウム・オル
ガノフィルムXX（Methylobacterium organophilum X
X）、メチロバクテリウム・ロデシアナム（Methylobact
eriumrhodesianum）、メチロバクテリウム・ロジナム
（Methylobacterium rhodinum）、メチロバクテリウム
・ザトマニイ（Methylobacterium zatmanii）、メチロ
バクテリウムsp．M27株（Methylobacterium sp． strai
n M27）、メチロバクテリウムsp．DM4株（Methylobacte
rium sp． strain DM4）、PK-1株、PR-6株からの16S ｒ
ＲＮＡを、メタンもメタノールも資化しないメチロトロ
ーフ由来16S ｒＲＮＡとして、ER2株からの各16S ｒＲ
ＮＡの塩基配列を用いた。
に説明する。ただし、これらの実施例は説明のためのも
のであり、本発明の技術的範囲を制限するものではな
い。 〔実施例１〕16S ｒＲＮＡの塩基配列中における各種メ
チロトローフに特異的に保存性を有する塩基配列の決定 各種メチロトローフにおける特異的保存領域を決定する
ため、RuMP経路メタン酸化細菌由来16S ｒＲＮＡとし
て、単離株761、メチロバクター・ボビス（Methylobact
er bovis）、メチロバクター・カプスラタス（Methylob
acter capsulatus）（メチロバクター・ウィテンブリイ
（Methylobacter whittenburyi））、メチロバクター・
ビネランディー（Methylobacter vinelandii）、メチロ
コッカス・カプスラタスBath（Methylococcus capsulat
us Bath）、メチロモナス・アジル（Methylomonas agil
e）（メチロバクター・アジリス（Methylobacter agili
s））、メチロモナス・グラシリス（Methylomonas grac
ilis）、メチロモナス・ルテウス（Methylomonas luteu
s）、メチロモナス・メタニカ（Methylomonas methanic
a）、メチロモナス・ルブラ（Methylomonas rubra）か
らの16S ｒＲＮＡを、セリン経路メタン酸化細菌由来16
S ｒＲＮＡとして、メチロシスティス・エキノイデス
（Methylocystis echinoides）、メチロシスティス・ミ
ニムス（Methylocystis minimus）、メチロシスティス
・パルブスOBBP（Methylocystis parvusOBBP）、メチロ
システィス・ピリホルミス（Methylocystis pyriformi
s）、IMVB-3060株、メチロシヌス・メタニカ81Z（Methy
losinus methanica 81Z）、メチロシヌス・スポリウム
（Methylosinus sporium）、メチロシヌス・トリコスポ
リウムOB3b（Methylosinus trichosporium OB3b）、メ
チロシヌスsp．LAC株（Methylosinus sp． strain LA
C）、メチロシヌスsp．B株（Methylosinus sp． strain
B）からの16S ｒＲＮＡを、RuMP経路メチロトローフ由
来16S ｒＲＮＡとして、メチロバチルス・フラゲラツム
KT1（Methylobacillus flagellatum KT1）、メチロバチ
ルス・グリコゲネス（Methylobacillus glycogenes）、
メチロモナス・メタノリカ（Methylomonas methanolic
a）、メチロモナス・メチロボラ（Methylomonas methyl
ovora）、メチロフィルス・メチロトローフスAS1（Meth
ylophilusmethylotrophus AS1）からの16S ｒＲＮＡ
を、セリン経路メチロトローフ由来16S ｒＲＮＡとし
て、メチロバクテリウム・エクストルクエンス（Methyl
obacterium extorquens）、メチロバクテリウム・オル
ガノフィルムXX（Methylobacterium organophilum X
X）、メチロバクテリウム・ロデシアナム（Methylobact
eriumrhodesianum）、メチロバクテリウム・ロジナム
（Methylobacterium rhodinum）、メチロバクテリウム
・ザトマニイ（Methylobacterium zatmanii）、メチロ
バクテリウムsp．M27株（Methylobacterium sp． strai
n M27）、メチロバクテリウムsp．DM4株（Methylobacte
rium sp． strain DM4）、PK-1株、PR-6株からの16S ｒ
ＲＮＡを、メタンもメタノールも資化しないメチロトロ
ーフ由来16S ｒＲＮＡとして、ER2株からの各16S ｒＲ
ＮＡの塩基配列を用いた。
【００３７】上記のメチロトローフ及び大腸菌（E. col
i）の16S ｒＲＮＡをコードするＤＮＡ配列をGenBankで
検索後、これらのアライメントをとり、各種メチロトロ
ーフに特異的に保存性を有する領域の存在を調べた。上
記各微生物由来16S ｒＲＮＡ遺伝子のGenBankアクセッ
ション番号を上記表１に、アライメントをとった結果を
図１及び図２に示す。その結果、図１及び図２に示され
る計５つのアライメントにおいて、それぞれ配列番号１
〜５で表わされる塩基配列が、それぞれの特異的保存領
域の塩基配列として特定された。
i）の16S ｒＲＮＡをコードするＤＮＡ配列をGenBankで
検索後、これらのアライメントをとり、各種メチロトロ
ーフに特異的に保存性を有する領域の存在を調べた。上
記各微生物由来16S ｒＲＮＡ遺伝子のGenBankアクセッ
ション番号を上記表１に、アライメントをとった結果を
図１及び図２に示す。その結果、図１及び図２に示され
る計５つのアライメントにおいて、それぞれ配列番号１
〜５で表わされる塩基配列が、それぞれの特異的保存領
域の塩基配列として特定された。
【００３８】〔実施例２〕プローブの設計及び調製 実施例１で特定した配列番号１〜５で表わされる特異的
保存領域の塩基配列に基づいて、それぞれ以下のプロー
ブを設計した。 RuMP経路メタン酸化細菌用：5'-GATTCTCTGGATGTCAAGGG-
3'（配列番号６）：洗浄温度５２℃； RuMP経路メタン酸化細菌用：5'-CTCCGCTATCTCTAACAGATT
-3'（配列番号７）：洗浄温度５２℃； RuMP経路メチロトローフ用：5'-ATGCATCTCTGCTTCGTT-3'
（配列番号８）：洗浄温度５２℃； セリン経路メタン酸化細菌用：5'-CCATACCGGACATGTCAAA
AGC-3'（配列番号９）：洗浄温度５０℃； セリン経路メチロトローフ用：5'-GGTAACATGCCATGTCCAG
-3'（配列番号１０）：洗浄温度５０℃
保存領域の塩基配列に基づいて、それぞれ以下のプロー
ブを設計した。 RuMP経路メタン酸化細菌用：5'-GATTCTCTGGATGTCAAGGG-
3'（配列番号６）：洗浄温度５２℃； RuMP経路メタン酸化細菌用：5'-CTCCGCTATCTCTAACAGATT
-3'（配列番号７）：洗浄温度５２℃； RuMP経路メチロトローフ用：5'-ATGCATCTCTGCTTCGTT-3'
（配列番号８）：洗浄温度５２℃； セリン経路メタン酸化細菌用：5'-CCATACCGGACATGTCAAA
AGC-3'（配列番号９）：洗浄温度５０℃； セリン経路メチロトローフ用：5'-GGTAACATGCCATGTCCAG
-3'（配列番号１０）：洗浄温度５０℃
【００３９】さらに、以下のプローブも設計した。 RuMP経路メチロトローフ用：5'-GGTCCGAAGATCCCCCGCTT-
3'（配列番号１１）：洗浄温度５２℃； セリン経路メチロトローフ用：5'-CCCTGAGTTATTCCGAAC-
3'（配列番号１２）：洗浄温度５０℃ これらのプライマーは、通常のオリゴヌクレオチド合成
法に従って合成した。さらに、ハイブリダイゼーション
後の検出のために、DIG DNA labeling mixture（Boehri
nger mannheim Biochemica）を用いて、これらのプロー
ブをDIG標識化した。
3'（配列番号１１）：洗浄温度５２℃； セリン経路メチロトローフ用：5'-CCCTGAGTTATTCCGAAC-
3'（配列番号１２）：洗浄温度５０℃ これらのプライマーは、通常のオリゴヌクレオチド合成
法に従って合成した。さらに、ハイブリダイゼーション
後の検出のために、DIG DNA labeling mixture（Boehri
nger mannheim Biochemica）を用いて、これらのプロー
ブをDIG標識化した。
【００４０】〔実施例３〕プローブを用いた各種メチロ
トローフの特異的検出 （１）微生物からのＲＮＡ調製 上記表１中の１〜40の微生物菌体からＲＮＡを抽出し、
ＲＮＡ試料を得た。微生物菌体からのＲＮＡ調製は、文
献（第４章「ＲＮＡの調製と解析」, Short Protocols
in Molecular Biology, 3rd ed., Frederick M. Ausube
lら編, John Wiley & Sons, Inc., 1995）に記載の方法
に従って行った。
トローフの特異的検出 （１）微生物からのＲＮＡ調製 上記表１中の１〜40の微生物菌体からＲＮＡを抽出し、
ＲＮＡ試料を得た。微生物菌体からのＲＮＡ調製は、文
献（第４章「ＲＮＡの調製と解析」, Short Protocols
in Molecular Biology, 3rd ed., Frederick M. Ausube
lら編, John Wiley & Sons, Inc., 1995）に記載の方法
に従って行った。
【００４１】（２）ＲＮＡブロッティング及びハイブリ
ダイゼーション 上記（１）で得られるＲＮＡ試料に含まれるＲＮＡを、
ドットブロッティングにより、Magnagraphナイロン転写
メンブラン（Micron Separations, Inc., Westboro, Ma
ss）上に固定化した。ＲＮＡ試料は、0.1％ジエチルピ
ロカルボネートで処理したH2Oで希釈して所望の濃度と
し、マイクロピペットを用いて、乾燥したナイロンメン
ブラン上に１μlずつスポットした。該ＲＮＡを、UV架
橋（Hoefer scientific Instruments, San Francisco,
Calif.）により該メンブランに固定した。
ダイゼーション 上記（１）で得られるＲＮＡ試料に含まれるＲＮＡを、
ドットブロッティングにより、Magnagraphナイロン転写
メンブラン（Micron Separations, Inc., Westboro, Ma
ss）上に固定化した。ＲＮＡ試料は、0.1％ジエチルピ
ロカルボネートで処理したH2Oで希釈して所望の濃度と
し、マイクロピペットを用いて、乾燥したナイロンメン
ブラン上に１μlずつスポットした。該ＲＮＡを、UV架
橋（Hoefer scientific Instruments, San Francisco,
Calif.）により該メンブランに固定した。
【００４２】このブロットをプレハイブリダイゼーショ
ン溶液（0.9M NaCl，50mMリン酸ナトリウム(pH 7.2)，5
0mM EDTA，0.5％ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)，10×デ
ンハルト溶液）中、４０、４５、及び４７℃で少なくと
も２時間、実施例２で設計したプローブと共にインキュ
ベートした。該溶液をハイブリダイゼーション溶液（0.
9Mリン酸ナトリウム(pH 7.2)，1.0％SDS，１％ウシ血清
アルブミン，１mM EDTA(pH 8.0)）で置換し、前記ブロ
ットを、同じ温度で少なくとも６時間インキュベートし
た。該ブロットを、40mMリン酸ナトリウム(pH 7.2)、１
mM EDTA、0.5％SDS及び0.5％ウシ血清アルブミンの混合
液で室温にて３０分間洗浄し、次いで、40mMリン酸ナト
リウム(pH 7.2)、１mM EDTA及び１％SDSの混合液で、各
プローブについての上記洗浄温度にて２回洗浄した。化
学発光の検出は、DIG luminescent detection kit（Boe
hringer Mannheim）を用いて行った。
ン溶液（0.9M NaCl，50mMリン酸ナトリウム(pH 7.2)，5
0mM EDTA，0.5％ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)，10×デ
ンハルト溶液）中、４０、４５、及び４７℃で少なくと
も２時間、実施例２で設計したプローブと共にインキュ
ベートした。該溶液をハイブリダイゼーション溶液（0.
9Mリン酸ナトリウム(pH 7.2)，1.0％SDS，１％ウシ血清
アルブミン，１mM EDTA(pH 8.0)）で置換し、前記ブロ
ットを、同じ温度で少なくとも６時間インキュベートし
た。該ブロットを、40mMリン酸ナトリウム(pH 7.2)、１
mM EDTA、0.5％SDS及び0.5％ウシ血清アルブミンの混合
液で室温にて３０分間洗浄し、次いで、40mMリン酸ナト
リウム(pH 7.2)、１mM EDTA及び１％SDSの混合液で、各
プローブについての上記洗浄温度にて２回洗浄した。化
学発光の検出は、DIG luminescent detection kit（Boe
hringer Mannheim）を用いて行った。
【００４３】（３）結果 上記（２）のハイブリダイゼーションの結果、配列番号
６のプローブは、表１中の20〜22、24、25、27〜29及び
31のメチロトローフを検出した。配列番号７のプローブ
は、表１中の20〜22、25及び27〜29のメチロトローフを
検出した。配列番号８のプローブは、表１中の32〜36の
メチロトローフを検出した。配列番号９のプローブは、
表１中の１〜９のメチロトローフを検出した。配列番号
１０のプローブは、表１中の10〜17のメチロトローフを
検出した。配列番号１１のプローブは、表１中の20〜29
及び31〜36のメチロトローフを検出した。配列番号１２
のプローブは、表１中の１〜18のメチロトローフを検出
した。
６のプローブは、表１中の20〜22、24、25、27〜29及び
31のメチロトローフを検出した。配列番号７のプローブ
は、表１中の20〜22、25及び27〜29のメチロトローフを
検出した。配列番号８のプローブは、表１中の32〜36の
メチロトローフを検出した。配列番号９のプローブは、
表１中の１〜９のメチロトローフを検出した。配列番号
１０のプローブは、表１中の10〜17のメチロトローフを
検出した。配列番号１１のプローブは、表１中の20〜29
及び31〜36のメチロトローフを検出した。配列番号１２
のプローブは、表１中の１〜18のメチロトローフを検出
した。
【００４４】
【発明の効果】本発明により、高い地下水圧がかかって
いる天然ガスの地下岩盤備蓄基地において、漏気ガスを
直接的に、また原位置での漏気状況を間接的に検出する
ことで検知感度の向上が可能となる。これにより、岩盤
内での天然ガス漏気状況のモニタリング技術として本発
明の方法を適用し、これを安全管理の指標とすることが
可能である。また、メタン酸化細菌等の消長を追うこと
により、漏気したメタン等の微生物環境浄化状態の診断
を行うことができる。
いる天然ガスの地下岩盤備蓄基地において、漏気ガスを
直接的に、また原位置での漏気状況を間接的に検出する
ことで検知感度の向上が可能となる。これにより、岩盤
内での天然ガス漏気状況のモニタリング技術として本発
明の方法を適用し、これを安全管理の指標とすることが
可能である。また、メタン酸化細菌等の消長を追うこと
により、漏気したメタン等の微生物環境浄化状態の診断
を行うことができる。
【００４５】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> TAISEI Corporation <120> Method for Detecting and Monitoring The Leak of Natural Gas <130> P00-0110 <160> 12 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Specifically conserved region of 16S rRNA among Methylotrophs <400> 1 cccuugacau ccagagaauc 20 <210> 2 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Specifically conserved region of 16S rRNA among Methylotrophs <400> 2 aaucuguuag agauagcgga g 21 <210> 3 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Specifically conserved region of 16S rRNA among Methylotrophs <400> 3 aacgaagcag agaugcau 18 <210> 4 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Specifically conserved region of 16S rRNA among Methylotrophs <400> 4 gcuuuugaca uguccgguau gg 22 <210> 5 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Specifically conserved region of 16S rRNA among Methylotrophs <400> 5 cuugacaugg cauguuacc 19 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Probe <400> 6 gattctctgg atgtcaaggg 20 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Probe <400> 7 ctccgctatc tctaacagat t 21 <210> 8 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Probe <400> 8 atgcatctct gcttcgtt 18 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Probe <400> 9 ccataccgga catgtcaaaa gc 22 <210> 10 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Probe <400> 10 ggtaacatgc catgtccag 19 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Probe <400> 11 ggtccgaaga tcccccgctt 20 <210> 12 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Probe <400> 12 ccctgagtta ttccgaac 18
【００４６】
【配列表フリーテキスト】〔配列番号１〜５〕16SｒＲ
ＮＡにおいて、メチロトローフ間で特異的に保存された
領域。 〔配列番号６〜１２〕プローブ。
ＮＡにおいて、メチロトローフ間で特異的に保存された
領域。 〔配列番号６〜１２〕プローブ。
【図１】各種メチロトローフの16SｒＲＮＡ塩基配列の
比較を示す図である。
比較を示す図である。
【図２】各種メチロトローフの16SｒＲＮＡ塩基配列の
比較を示す図である。
比較を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/566 (Ｃ１２Ｑ 1/06 //(Ｃ１２Ｑ 1/06 Ｃ１２Ｒ 1:26） Ｃ１２Ｒ 1:26） (Ｃ１２Ｑ 1/06 (Ｃ１２Ｑ 1/06 Ｃ１２Ｒ 1:00） Ｃ１２Ｒ 1:00） Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｆターム(参考） 4B024 AA11 AA17 CA01 CA09 CA11 HA12 4B063 QA01 QA20 QQ06 QQ18 QQ42 QQ44 QQ54 QR56 QR62 QS01 QS14 QS16 QS25 QS34 QX02
Claims (12)
- 【請求項１】 天然ガスの岩盤備蓄基地における地下水
中の炭化水素資化能を有する微生物の個体数をモニタリ
ングすることにより、前記岩盤備蓄基地における天然ガ
スの漏気を検知する方法。 - 【請求項２】 炭化水素資化能を有する微生物群で、ゲ
ノムＤＮＡの塩基配列において特異的に保存性を有する
領域の塩基配列又はそれに相補的な塩基配列を用いる請
求項１記載の方法。 - 【請求項３】 前記微生物群で特異的に保存性を有する
前記領域が16SｒＲＮＡ遺伝子上の領域である請求項２
記載の方法。 - 【請求項４】 前記微生物群で特異的に保存性を有する
前記領域がメタンモノオキシゲナーゼ遺伝子上の領域で
ある請求項２記載の方法。 - 【請求項５】 前記地下水から得られる核酸試料に対し
て、前記微生物群で特異的に保存性を有する前記領域の
塩基配列又はそれに相補的な塩基配列を含むオリゴヌク
レオチドをプローブとするハイブリダイゼーションを行
う工程を含む請求項２記載の方法。 - 【請求項６】 前記微生物群で特異的に保存性を有する
前記領域が２つあり、5'末端側の領域の塩基配列を含む
プライマー及び3'末端側の領域の塩基配列に相補的な塩
基配列を含むプライマーを用いて、前記地下水から得ら
れる核酸試料を鋳型とするポリメラーゼ連鎖反応を行う
工程を含む、請求項２記載の方法。 - 【請求項７】 天然ガスの岩盤備蓄基地における地下水
中の炭化水素資化能を有する微生物の個体数をモニタリ
ングすることにより、前記岩盤備蓄基地における地下水
溶存ガスの微生物浄化の状態を診断する方法。 - 【請求項８】 炭化水素資化能を有する微生物群で、ゲ
ノムＤＮＡの塩基配列において特異的に保存性を有する
領域の塩基配列又はそれに相補的な塩基配列を用いる請
求項７記載の方法。 - 【請求項９】 前記微生物群で特異的に保存性を有する
前記領域が16SｒＲＮＡ遺伝子上の領域である請求項８
記載の方法。 - 【請求項１０】 前記微生物群で特異的に保存性を有す
る前記領域がメタンモノオキシゲナーゼ遺伝子上の領域
である請求項８記載の方法。 - 【請求項１１】 前記地下水から得られる核酸試料に対
して、前記微生物群で特異的に保存性を有する前記領域
の塩基配列又はそれに相補的な塩基配列を含むオリゴヌ
クレオチドをプローブとするハイブリダイゼーションを
行う工程を含む請求項８記載の方法。 - 【請求項１２】 前記微生物群で特異的に保存性を有す
る前記領域が２つあり、5'末端側の領域の塩基配列を含
むプライマー及び3'末端側の領域の塩基配列に相補的な
塩基配列を含むプライマーを用いて、前記地下水から得
られる核酸試料を鋳型とするポリメラーゼ連鎖反応を行
う工程を含む、請求項８記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000062326A JP2001245668A (ja) | 2000-03-07 | 2000-03-07 | 微生物による天然ガスの漏気検知及びモニタリング方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000062326A JP2001245668A (ja) | 2000-03-07 | 2000-03-07 | 微生物による天然ガスの漏気検知及びモニタリング方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001245668A true JP2001245668A (ja) | 2001-09-11 |
Family
ID=18582350
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000062326A Pending JP2001245668A (ja) | 2000-03-07 | 2000-03-07 | 微生物による天然ガスの漏気検知及びモニタリング方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2001245668A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006067830A (ja) * | 2004-08-31 | 2006-03-16 | Taisei Corp | メタンガス漏洩箇所の検知方法 |
| CN111573755A (zh) * | 2020-05-28 | 2020-08-25 | 苏州国溯科技有限公司 | 一种医院废水排放监管系统及废水原水泄露识别方法 |
| CN113241454A (zh) * | 2021-05-18 | 2021-08-10 | 中南大学 | 一种监测微生物数量的微生物燃料电池及监测系统与方法 |
-
2000
- 2000-03-07 JP JP2000062326A patent/JP2001245668A/ja active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006067830A (ja) * | 2004-08-31 | 2006-03-16 | Taisei Corp | メタンガス漏洩箇所の検知方法 |
| CN111573755A (zh) * | 2020-05-28 | 2020-08-25 | 苏州国溯科技有限公司 | 一种医院废水排放监管系统及废水原水泄露识别方法 |
| CN113241454A (zh) * | 2021-05-18 | 2021-08-10 | 中南大学 | 一种监测微生物数量的微生物燃料电池及监测系统与方法 |
| CN113241454B (zh) * | 2021-05-18 | 2023-02-03 | 中南大学 | 一种监测微生物数量的微生物燃料电池及监测系统与方法 |
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