JP2005218322A

JP2005218322A - 塩素化エタン分解菌検出用核酸断片、検出方法および塩素化エタン分解方法

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Publication number: JP2005218322A
Application number: JP2004027271A
Authority: JP
Inventors: Noriya Okutsu; 徳也奥津
Original assignee: Kurita Water Industries Ltd
Current assignee: Kurita Water Industries Ltd
Priority date: 2004-02-03
Filing date: 2004-02-03
Publication date: 2005-08-18

Abstract

【課題】塩素化エタン分解細菌の塩素化エタン分解遺伝子に優先的にハイブリダイズする核酸断片、この核酸断片からなる塩素化エタン分解細菌検出用標識プローブ、これらの核酸断片または標識プローブを用い、または塩素化エタン分解遺伝子を標的にした迅速かつ高精度な塩素化エタン分解細菌の検出方法および方法、ならびに効率のよい塩素化エタンの分解方法を提案する。
【解決手段】塩素化エタン分解細菌の塩素化エタン分解遺伝子に優先的にハイブリダイズする２０〜２５ヌクレオチドからなる核酸断片であって、該核酸断片塩基配列と９０％以上のホモロジーを有する塩基配列またはこれらの塩基配列と相補的な塩基配列を有する塩素化エタン分解細菌検出用核酸断片、標識プローブ、およびこれらを用い、特定の塩基配列の塩素化エタン分解遺伝子を標的として塩素化エタン分解細菌検出、モニタリングし、塩素化エタンを分解する。
【選択図】なし

Description

本発明は、塩素化エタン分解細菌の塩素化エタン分解遺伝子に優先的にハイブリダイズする核酸断片、この核酸断片からなる塩素化エタン分解細菌検出用標識プローブ、これらの核酸断片または標識プローブを用い、または塩素化エタン分解遺伝子を標的にした塩素化エタン分解細菌の検出方法およびモニタリング方法、ならびに塩素化エタンの分解方法に関する。

塩素化エタンで汚染された土壌または地下水などには、塩素化エタンの分解活性が非常に高い塩素化エタン分解菌が存在することが知られている（非特許文献１）。このような汚染土壌中に存在する塩素化エタン分解細菌を利用することにより、塩素化エタンを脱塩素化して汚染土壌を浄化することが考えられる。これらの細菌が汚染土壌または地下水に存在しない場合には、他の場所で採取される塩素化エタン分解細菌を添加して浄化することが考えられる。しかし、このような塩素化エタン分解細菌が存在するとしても、これを検出または採取するのは困難であり、汚染現場でこのような菌を増殖させて脱塩素化し、良好な処理効果が得られる保証はない。このため、塩素化エタン分解細菌を利用して塩素化エタンで汚染された土壌または地下水などを浄化する場合、有効に脱塩素化が行われるかどうかを予め判定する方法が要望されている。

非特許文献１では、塩素化エタンの分解活性が高い塩素化エタン分解菌（Dehalobacter sp str.TCA1）が報告されており、１６ＳｒＤＮＡによりその細菌がDehalobacter restrictusの近縁に属するものとして分類されている。しかしこの菌を検出する方法、あるいはそのためのプライマーとして用いる核酸断片などについては示されておらず、菌の入手方法あるいは増殖方法も示されていない。またこのような塩素化エタン分解菌の１６ＳｒＤＮＡからデザインした核酸断片をプライマーとしてＰＣＲを行うと、非特許文献１の塩素化エタン分解菌の他に、類似の１６ＳｒＤＮＡを有する細菌、例えば非特許文献２に示されたようなトリクロロエチレンに対する分解活性を有する細菌も検出されてしまう。従って上記の塩素化エタン分解菌を利用して塩素化エタンで汚染された土壌または地下水などを浄化できるかどうかは不明である。

非特許文献２には、トリクロロエチレンに対する分解活性を有する細菌（Dehalobacter restrictus str.TEA）がトリクロロエチレンを高活性で分解することが示されているが、それが生産するPCE-RDase（トリクロロエチレンの還元分解酵素−Ｐｃｅ−Ａ）のトリクロロエチレンに対する基質分解活性を１００としたとき、トリクロロエタンに対する基質分解活性は１．４±０．１であり、トリクロロエタンに対する分解活性が極めて低いことが示されている。このことはトリクロロエチレンに対する分解活性が高い細菌であっても、トリクロロエタンに対する分解活性が高いとはいえず、またDehalobacter restrictusを含めその近縁に属する細菌には、トリクロロエチレンに対する分解活性が高い細菌と、トリクロロエタンに対する分解活性が高い細菌とが存在することを示している。これらの細菌は近縁に属するため分離は困難であり、トリクロロエタンに対する分解活性が高い細菌が存在するかどうかを、簡単な方法により短時間で検出することは困難である。
Science Vol298 １ NOVEMBER 2002,p．1023−1025 Applied and Environ. Microbiology Vol 69 No.8 pp4628-4638

本発明の課題は、塩素化エタン分解細菌の塩素化エタン分解遺伝子に優先的にハイブリダイズする核酸断片、この核酸断片からなる塩素化エタン分解細菌検出用標識プローブ、これらの核酸断片または標識プローブを用い、または塩素化エタン分解遺伝子を標的にした迅速かつ高精度な塩素化エタン分解細菌の検出方法およびモニタリング方法、ならびに効率のよい塩素化エタンの分解方法を提案することである。

本発明は、次の塩素化エタン分解細菌の塩素化エタン分解遺伝子に優先的にハイブリダイズする核酸断片、この核酸断片からなる塩素化エタン分解細菌検出用標識プローブ、これらの核酸断片または標識プローブを用いた塩素化エタン分解細菌の検出方法およびモニタリング方法、ならびに塩素化エタンの分解方法である。
（１）配列番号１の塩基配列またはこれと９０％以上のホモロジーの塩基配列を有する塩素化エタン分解遺伝子をもつ塩素化エタン分解細菌を、前記塩素化エタン分解遺伝子を標的にした分析法で検出することを特徴とする塩素化エタン分解細菌の検出方法。
（２）塩素化エタン分解細菌の塩素化エタン分解遺伝子に優先的にハイブリダイズする２０〜２５ヌクレオチドからなる核酸断片であって、配列番号２〜３４のいずれかの塩基配列、これらの塩基配列と９０％以上のホモロジーを有する塩基配列またはこれらの塩基配列と相補的な塩基配列を有する核酸断片。
（３）塩素化エタン分解細菌の塩素化エタン分解遺伝子に優先的にハイブリダイズする１０〜５０ヌクレオチドからなる核酸断片であって、少なくとも１０個の連続する塩基配列が、配列番号２〜３４のいずれかの塩基配列と同じ塩基配列またはこれらの塩基配列と相補的な塩基配列である核酸断片。
（４）塩素化エタン分解細菌検出用である上記（２）または（３）記載の核酸断片。
（５）上記（２）ないし（４）のいずれかに記載の核酸断片を標識物質で標識した塩素化エタン分解細菌検出用標識プローブ。
（６）上記（２）ないし（４）のいずれかに記載の核酸断片をプライマーとし、試料中の核酸を鋳型としてＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ）を行い、合成されたＤＮＡ断片を検出する塩素化エタン分解細菌の検出方法。
（７）上記（５）記載の塩素化エタン分解細菌検出用標識プローブと、試料または試料から調製した核酸とを接触させてＲＮＡまたはＤＮＡハイブリダイゼーションを行った後、標識を指標にして検出する塩素化エタン分解細菌の検出方法。
（８）地下水または土壌を試料として上記（１）、（６）または（７）記載のエタン分解細菌の検出方法を実施し、塩素化エタン分解細菌が検出された地下水、土壌またはそれらを接種した培養液を、塩素化エタンで汚染された土壌または地下水に導入する塩素化エタンの分解方法。
（９）上記（１）、（６）または（７）記載のエタン分解細菌の検出方法を実施し、塩素化エタンで汚染された土壌または地下水で検出された塩素化エタン分解細菌または、導入した塩素化エタン分解細菌の細菌数を定量することによる、塩素化エタン分解細菌のモニタリング方法。

塩素化エタン分解細菌を用いて塩素化エタンで汚染された土壌または地下水などを浄化する方法において、処理効果が常に良好でない理由を検討した結果、塩素化エタンの脱塩素化を行う塩素化エタン分解細菌が処理現場に生息している場合には処理効果が良好であり、生息していない場合には処理効果が期待できない。したがって、対象現場の土壌や地下水を調査し、塩素化エタン分解細菌が生息しているかどうかを確認すれば、処理が良好に行えるか否かを判断できる。調査の結果、汚染土壌または地下水に塩素化エタン分解細菌が存在しない場合には、他の場所で採取される塩素化エタン分解細菌を添加して浄化することができるが、そのためにも高い塩素化エタン分解活性を有する細菌の検出が必要となる。

本発明では、塩素化エタン分解遺伝子を標的にして分析して塩素化エタン分解細菌を検出することにより、高い塩素化エタン分解活性を有する塩素化エタン分解細菌を検出することを可能にする。塩素化エタン分解遺伝子は、塩素化エタンで汚染された土壌または地下水などに生息している塩素化エタン分解細菌の遺伝子中の塩素化エタン分解酵素をコードする遺伝子配列を選択することにより、塩素化エタン分解遺伝子として特定することができる。ここで配列番号１の塩基配列またはこれと９０％以上のホモロジーの塩基配列を有する塩素化エタン分解遺伝子を標的にして分析することにより、配列番号１の塩基配列またはこれと類似の塩基配列を有する塩素化エタン分解遺伝子を有する塩素化エタン分解細菌を検出することができる。

配列番号１の塩基配列は、塩素化エタンで汚染された土壌または地下水などに生息している塩素化エタン分解細菌（ＫＷＩ−Ａ１）の塩素化エタン分解酵素をコードする遺伝子配列であり、塩素化エタン分解遺伝子の標的として用いることができる。塩素化エタン分解細菌（ＫＷＩ−Ａ１）は、分離および同定はされていないが、Dehalobacter restrictusの近縁に属する塩素化エタン分解細菌であり、配列番号３５の１６ＳｒＤＮＡを有する。配列番号１の塩基配列有する塩素化エタン分解遺伝子は、このような塩素化エタン分解細菌（ＫＷＩ−Ａ１）の染色体に含まれる遺伝子である。非特許文献１には塩素化エタン分解遺伝子の塩基配列は示されておらず、非特許文献２にはトリクロロエチレン分解遺伝子が示されているが、配列番号１の塩基配列は非特許文献２のトリクロロエチレン分解遺伝子pceA（GenBank：AJ439607）の塩基配列とは相違している。

このような塩素化エタン分解遺伝子を標的にした分析法は、その遺伝子の塩基配列からＰＣＲなど、標的遺伝子の特徴部分を増幅等の手段により検出することにより、このような塩素化エタン分解遺伝子をもつ塩素化エタン分解細菌を、定性的または定量的に検出可能にする分析法である。このような分析法は、１６ＳｒＤＮＡを標的にした分析法とは異なり、塩素化エタン分解遺伝子を標的にすることにより、高い塩素化エタン分解活性を有する塩素化エタン分解細菌を検出することができる。この分析法は塩素化エタン分解遺伝子を標的にするが、この塩素化エタン分解遺伝子の全塩基配列を検出する必要はなく、一部の塩基配列として例えば特徴的な塩基配列を分析することにより、配列番号１の塩基配列またはこれと９０％以上のホモロジーの塩基配列を有する塩素化エタン分解遺伝子をもつ塩素化エタン分解細菌を検出することが可能である。塩素化エタン分解遺伝子を標的にした分析法の具体的な手段としては、ＰＣＲの他にも、標識プローブを用いるハイブリダイゼーション、Ｔ−ＲＦＬＰなどの公知の手段が採用できる。

本発明では、塩素化エタン分解遺伝子を標的にして分析するために、塩素化エタン分解遺伝子からその塩素化エタン分解遺伝子検出用としてデザインした核酸断片を利用することにより、その塩素化エタン分解遺伝子をもつ塩素化エタン分解細菌の検出を可能とする。この核酸断片は、配列番号１の塩基配列の中から配列番号１の塩素化エタン分解遺伝子の特徴的な部分の塩基配列を選び出すことにより、ＰＣＲなどの特徴部分の増幅手段等による標的遺伝子の検出を可能とすることができる。

本発明の核酸断片は、塩素化エタン分解細菌の塩素化エタン分解遺伝子に優先的にハイブリダイズする２０〜２５ヌクレオチドからなる核酸断片であって、配列表の配列番号２〜３４のいずれかの塩基配列、これらの塩基配列と９０％以上のホモロジーを有する塩基配列またはこれらの塩基配列と相補的な塩基配列を有する核酸断片、または塩素化エタン分解細菌の塩素化エタン分解遺伝子に優先的にハイブリダイズする１０〜５０、好ましくは１５〜３５ヌクレオチドからなる核酸断片であって、少なくとも１０個の連続する塩基配列が、配列番号２〜３４のいずれかの塩基配列と同じ塩基配列またはこれらの塩基配列と相補的な塩基配列である核酸断片（以下、それぞれの配列番号の核酸断片およびその変形の核酸断片を含めて、それぞれの配列番号の核酸断片等という）である。配列番号２〜３４の核酸断片等には、配列番号２〜３４の塩基配列の任意の位置から始まる連続した１０個以上の塩基配列と同じ塩基配列またはこの塩基配列と相補的な塩基配列を有する核酸断片も含まれ、この配列番号２〜３４の塩基配列と同じ塩基配列またはこの塩基配列と相補的な塩基配列の上流および／または下流には塩基が結合していてもよい。

本発明の核酸断片等、すなわち配列番号２〜３４の塩基配列、これらの塩基配列と９０％以上のホモロジーを有する塩基配列、これらの塩基配列と相補的な塩基配列、および少なくとも１０個の連続する塩基配列が配列番号２〜３４のいずれかの塩基配列と同じである塩基配列またはこれらの塩基配列と相補的な塩基配列の核酸断片は、公知の方法により化学的に容易に合成することができるが、後述の実施例で得られる塩素化エタン分解細菌（ＫＷＩ−Ａ１）などの細菌の核酸から切り出してもよい。

本発明の核酸断片等は、塩素化エタン分解細菌の塩素化エタン分解遺伝子の塩基配列を決定後、塩素化エタン分解細菌の塩素化エタン分解遺伝子に優先的にハイブリダイズするように、それらに特異的な部分を利用してデザインされている。本発明の配列番号２〜３４の塩基配列を有する核酸断片等は、実際には配列番号１の塩基配列の塩素化エタン分解遺伝子を有する実施例の塩素化エタン分解細菌（ＫＷＩ−Ａ１）に特有部分の塩素化エタン分解遺伝子の塩基配列の核酸断片等としてデザインされている。これらの配列番号２〜３４の核酸断片等は後述の実施例において配列番号１の塩基配列中における位置として図１および図２に示されている。本発明の核酸断片等は、実際には特定の塩素化エタン分解細菌の塩基配列を利用してデザインされているが、僅少差の塩基配列の塩素化エタン分解細菌を有する細菌もＰＣＲにより検出される。

このように本発明の核酸断片等は、塩素化エタン分解細菌の塩素化エタン分解遺伝子の塩基配列を決定後、それらに特異的な部分を利用してデザインしているので、塩素化エタン分解細菌の塩素化エタン分解遺伝子に優先的にハイブリダイズする。このため本発明の核酸断片等は、後述するように、プライマーとして用いてＰＣＲを行うか、またはハイブリダイゼーションを行うことにより塩素化エタン分解細菌を特異的に高精度で、しかも容易に検出することができる。ここで検出される塩素化エタン分解細菌の具体的なものとしては、配列番号１の塩基配列の塩素化エタン分解遺伝子を有する実施例の塩素化エタン分解細菌（ＫＷＩ−Ａ１）、ならびにこれに類似の塩基配列の塩素化エタン分解遺伝子を有する塩素化エタン分解細菌などがこれに含まれる。

本発明の核酸断片等は、非特許文献２のトリクロロエチレンに対する分解活性を有する細菌（Dehalobacter restrictus str.TEA）のトリクロロエチレン分解遺伝子とは異なる塩基配列を有するため、この細菌が存在する場合でもそのトリクロロエチレン分解遺伝子にハイブリダイズすることはない。従って塩素化エタン分解細菌とトリクロロエチレン分解細菌が存在する場合でも、塩素化エタン分解細菌が検出されるが、トリクロロエチレン分解細菌が検出されることはない。塩素化エタン分解細菌（ＫＷＩ−Ａ１）、およびこれに類似の塩基配列の塩素化エタン分解遺伝子を有する塩素化エタン分解細菌が共存する場合は、類似のものも検出される。類似のものも塩素化エタン分解活性を有するため、分離しなくてもよいが、特に特徴部分をデザインした核酸断片等を用いることにより、これらの分離は可能である。

塩素化エタン分解細菌により分解（脱塩素化）される塩素化エタンの具体的なものとしては、１，１，１−トリクロロエタン、１，１−ジクロロエタン、およびこれらの脱塩素化中間体などがあげられる。本発明で検出する塩素化エタン分解細菌は、これらの塩素化エタンの分解活性を有する細菌であり、これらの塩素化エタンで汚染された土壌または地下水などに生息する。本発明により検出される塩素化エタン分解細菌が存在する系では、これらの塩素化エタンの分解が可能である。塩素化エタン分解細菌とともに、トリクロロエチレン分解細菌その他の細菌が検出される場合でも、これらを分離しなくても塩素化エタンの分解が可能であるが、分離してもよい。

本発明の塩素化エタン分解細菌検出用標識プローブは、前記本発明の核酸断片等を放射性元素、蛍光物質、化学物質、抗原、抗体または酵素などの標識物質で標識したプローブである。このような標識物質としては従来から使用されている標識物質が使用でき、具体的なものとしては32Ｐ等の放射性元素；ＦＩＴＣ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）、ローダミン等の蛍光物質；ジコキシゲニン等のハプテン；アルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼ等の酵素；ビオチン等の生化学物質などがあげられる。これらの標識物質は、公知の方法で核酸断片に導入することができる。本発明の塩素化エタン分解細菌検出用標識プローブは、塩素化エタン分解細菌の有無を検出したい試料とハイブリダイゼーションを実施し、その後標識物質を指標にして検出することにより、標識プローブがハイブリダイゼーションした塩素化エタン分解細菌を特異的に高精度で、しかも容易に検出することができる。

本発明の配列番号２〜３４の塩基配列を有する核酸断片等はいずれも、ＰＣＲプライマーとして用いることができるほか、標識物質で標識して細菌検出用プローブとして用いることができる。いずれの場合も、上記の核酸断片等の単独または組み合わせで用いてもよく、また上記の核酸断片と他の核酸断片との組み合わせで用いてもよい。上記の核酸断片等のうち、配列番号２〜６および１１〜３４の核酸断片等はプライマーとして用いるのが好ましく、配列番号７〜１０の核酸断片等はプローブとして用いるのが好ましいが、これに限らない。本発明の核酸断片等と他の核酸断片とを組み合わせて用いる場合、例えば一方のプライマーとして本発明の核酸断片等を用いる場合は、他方のプライマーとして他の公知の核酸断片を用いることができる。

本発明の塩素化エタン分解細菌の検出方法は、前記本発明の核酸断片等を用いて塩素化エタン分解細菌を検出する方法である。すなわち、前記本発明の核酸断片等をプライマーとし、塩素化エタン分解細菌の有無を検出したい試料から調製した核酸を鋳型としてＰＣＲを行い、予想される大きさのＤＮＡが合成されれば試料中に塩素化エタン分解細菌が存在したと判断できる。この場合、塩素化エタン分解遺伝子として、配列番号１の塩基配列またはこれと９０％以上のホモロジーを有する塩基配列をもつ活性の高い塩素化エタン分解細菌を検出することができる。

ＰＣＲは公知の方法で行うことができ、また市販されているＰＣＲ用キットを用いて行うこともできる。ＰＣＲは通常ＵｐｐｅｒＰｒｉｍｅｒおよびＬｏｗｅｒＰｒｉｍｅｒの２種類のプライマーを使用するが、いずれか一方または両方のプライマーとして本発明の核酸断片等を用いることができる。プライマーとして種類の異なる複数の核酸断片等を用いて複数回検出を行うことにより、検出精度をより高くすることができる。半定量的な検出にはブロックＰＣＲを利用できるが、さらに定量性の高い検出を行う場合は、Ｒｅａｌ−ＴｉｍｅＰＣＲを利用するのが好ましい。

また本発明の塩素化エタン分解細菌の検出方法では、前記本発明の塩素化エタン分解細菌検出用標識プローブを用いて塩素化エタン分解細菌を検出することができる。この方法は、前記本発明の塩素化エタン分解細菌検出用標識プローブを、塩素化エタン分解細菌の有無を検出したい試料またはこの試料から調製した核酸に接触させてＲＮＡまたはＤＮＡハイブリダイゼーションを行った後、標識を指標にして塩素化エタン分解細菌を検出する方法である。ハイブリダイゼーションは従来と同様の方法により行うことができる。このような検出は、ＰＣＲの際に行うことができるが、ＰＣＲとは独立して行ってもよい。例えばＲｅａｌ−ＴｉｍｅＰＣＲを行う際、標識物質で標識した核酸断片等をプローブとして用いると、ＰＣＲの過程における増幅の状態が検出できるので好ましい。

ハイブリダイゼーション後の検出は、標識物質の種類に応じて公知の方法により行うことができる。例えば、放射性元素で標識した場合は公知の方法で放射能を測定することにより検出できる。また螢光物質で標識した場合は公知の方法により光量を測定することにより検出できる。また酵素で標識した場合は公知の方法で酵素活性を測定することにより検出できる。化学物質で標識した場合は、その化学物質を分析することにより検出できる。また抗原または抗体で標識した場合は、標識した抗原または抗体と特異的に反応する抗体または抗原を用いて抗原抗体反応させ、反応生成物を公知の方法により測定することにより検出できる。

配列番号２〜３４の核酸断片等は、前述のようにプライマーとしても、プローブとしても用いることもできるほか、プライマーとプローブを兼用することもできる。単にプローブとして用いる核酸断片等は、標識物質を５'末端または３'末端のどちらに付けてもよいが、プライマーと兼用する核酸断片等は、標識物質を５'末端に付け、３'末端は遊離の状態にしておくことにより、３'末端側への核酸の伸長を許容することができる。プローブ専用として用いる核酸断片等の５'末端に標識物質を付けた場合は、３'末端を燐酸等でブロックしてＰＣＲを行うことにより、３'末端側への核酸の伸長を阻止することができる。３'末端をブロックしてプローブ専用として用いる核酸断片等は、１本鎖の核酸にハイブリダイズして検出されるが、ＰＣＲの進行によりプライマーから核酸が伸長するのに伴ってはじき飛ばされ、サイクルの進行により１本鎖になった核酸に再度ハイブリダイズして検出される。プライマー専用として用いる核酸断片等は、標識を付けないで用いることができる。

上記のような方法で塩素化エタン分解細菌を検出することにより、塩素化エタン分解細菌を利用して塩素化エタンで汚染された土壌または地下水などを浄化する場合に、脱塩素化が良好に行われるかどうかを予め判定することができる。このような判定は、汚染場所その他の場所から採取される試料に含まれる細菌の核酸の塩基配列を検出するだけで可能であって、塩素化エタン分解細菌の培養、分離、同定などの操作は不要であり、短時間で正確な判定が可能である。また塩素化エタン分解細菌が検出できない場合、他の場所で検出した塩素化エタン分解細菌を添加するなどの対策を打つことが可能となる。

本発明の塩素化エタンの分解方法は、地下水または土壌を試料として上記本発明の塩素化エタン分解細菌の検出方法を実施し、塩素化エタン分解細菌が検出された地下水、土壌またはそれらを接種した培養液（以下、これらをまとめて塩素化エタン分解細菌検出物等という場合がある）を、塩素化エタンで汚染された土壌または地下水（以下、これらをまとめて汚染環境という場合がある）に導入して塩素化エタンを分解する方法である。塩素化エタン分解細菌は嫌気性菌であるため、嫌気状態で塩素化エタンと接触させることにより、塩素化エタン分解細菌を増殖させて塩素化エタンを分解することができる。

汚染環境に導入する塩素化エタン分解細菌検出物等は、どこの場所で検出（採取）されたものでもよい。例えば、塩素化エタンで汚染されていない場所において塩素化エタン分解細菌が検出された地下水、土壌またはそれらを接種した培養液を、塩素化エタンで汚染された土壌または地下水に導入することもできる。また塩素化エタンで汚染された場所において塩素化エタン分解細菌が検出された地下水、土壌またはそれらを接種した培養液を、同一区域内の塩素化エタンで汚染された場所に導入することもできるし、同一区域でない別の場所に導入することもできる。

塩素化エタン分解細菌検出物を汚染環境に導入方法としては、塩素化エタン分解細菌検出物等を汚染された土壌表面に散布する方法、注入管（注入井）から土壌中に注入する方法、地下水源に注入する方法などがあげられる。導入地点は汚染された場所はもちろん、汚染環境の上流などに導入することができる。いずれの場合でも、塩素化エタン分解細菌が塩素化エタンの汚染場所に均一に接触するように導入する。塩素化エタンを分解する際、塩素化エタン分解細菌が検出された地下水、土壌またはそれらを接種した培養液を汚染環境に導入するだけでもよい場合もあるが、場合によっては水、栄養源等をさらに導入することもできる。また１回の導入により完全に分解できない場合には、導入を繰り返すこともできる。さらに塩素化エタン分解細菌検出物等に凝集剤を添加して凝集させたり、あるいは担体に担持させた後導入することもできる。このようにして塩素化エタンを分解することにより、塩素化エタンで汚染された汚染環境を浄化することができる。

塩素化エタンで汚染された汚染環境において、塩素化エタン分解細菌検出用標識プローブを用いて塩素化エタン分解細菌の細菌数を定量することができる。このことにより汚染環境で検出された塩素化エタン分解細菌または導入した塩素化エタン分解細菌の細菌数をモニタリングし、汚染環境における塩素化エタン分解細菌の消長を追うことができる。塩素化エタン分解細菌のモニタリングと、汚染物質としての塩素化エタンのモニタリングを同時に行うことにより、塩素化エタン分解による環境浄化の進み具合を調べることができる。

本発明の核酸断片等は新規かつ有用である。本発明の核酸断片等は、特定の塩基配列を有し、塩素化エタン分解細菌の塩素化エタン分解遺伝子に優先的にハイブリダイズするので、塩素化エタン分解細菌の検出に利用することができる。
本発明の塩素化エタン分解細菌検出用核酸断片は、上記核酸断片等からなるので、この核酸断片を用いることにより、塩素化エタン分解細菌を特異的に高精度で、しかも容易に検出することができる。
本発明の塩素化エタン分解細菌検出用標識プローブは、上記核酸断片等を標識しているので、この標識を指標にして塩素化エタン分解細菌を特異的に高精度で、しかも容易に検出することができる。
本発明の塩素化エタン分解細菌の検出方法およびモニタリング方法は、上記塩素化エタン分解遺伝子を標的にし、または核酸断片等もしくは標識プローブを用いているので、塩素化エタン分解細菌を特異的に高精度で、しかも迅速かつ容易に検出またはモニタリングすることができる。
本発明の塩素化エタンの分解方法は、上記検出方法で塩素化エタン分解細菌が検出された地下水、土壌またはそれらを接種した培養液を、塩素化エタンで汚染された土壌または地下水に導入して塩素化エタンを分解するので、塩素化エタンを容易に効率よく分解して環境を浄化することができる。

次に本発明の実施例について説明する。実施例において標的とした塩素化エタン分解遺伝子は配列番号１に示すとおりである。また実施例において用いた核酸断片と配列番号２〜３４の関係は表１に示すとおりであり、配列番号１におけるこれらの配置を図１および図２に示す。

〔ＰＣＲによる検出〕：
1,1,1−トリクロロエタン（ＴＣＡ）の1,1−ジクロロエタン（ＤＣＡ）およびクロロエタン（ＣＡ）への脱塩素化が起きている地点Ａ、Ｂ、Ｃならびに脱塩素化が起きていない地点Ｄ、Ｅ、Ｆの合計６か所から地下水をサンプリングし、この地下水１００ｍＬ中からＤＮＡを下記の通り抽出した。

（１）ＤＮＡの抽出：
地下水１００ｍＬを孔径０．２μｍのフィルターで濾過した後、このフィルターを２ｍＬ容のチューブに入れた。さらにそのチューブにＺｉｒｃｏｎｉａ／ＳｉｌｉｃａＢｅａｄｓ（直径０．１ｍｍ）１ｍＬおよびＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＢｕｆｆｅｒ（１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ８．０］，１００ｍＭｓｏｄｉｕｍＥＤＴＡ［ｐＨ８．０］，１００ｍＭｓｏｄｉｕｍｐｈｏｓｐｈａｔｅ［ｐＨ８．０］，１．５ＭＮａＣｌ）１ｍＬを加え、細胞破砕機ＢｅａｄＢｅａｔｅｒで２分間処理した。次に凍結融解を３回繰り返した後、１０μＬのＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ（１０ｍｇ／ｍｌ）を加え、３７℃にて３０分間保温した。この液に、２５０μＬの１０％ＳＤＳ溶液を加え、６５℃で２時間保温した後、再び上記のＢｅａｄＢｅａｔｅｒ処理を行った。その後８０００ｘｇにて室温で１０分間遠心分離し、上清を採取した。上清はクロロホルム抽出し、等量のイソプロパノールを添加後、室温で６０分間静置、８０００ｘｇにて室温で２０分間遠心分離し、ＤＮＡを沈殿させた。沈殿は７０％エタノールで洗浄後、乾燥させた後、５０μＬの滅菌蒸留水に溶解した。この抽出ＤＮＡ溶液を利用して下記の通りＰＣＲ反応を行い、塩素化エタン分解細菌が存在するか否かを調査した。

（２）ＰＣＲによる塩素化エタン分解遺伝子の増幅：
前記（１）で得た抽出ＤＮＡ溶液１μＬをテンプレートにして、塩素化エタン分解遺伝子をＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲ増幅の反応液の全容量は１００μＬとし、２．５ＵのＥｘＴａｑＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造製）、２００μＭのｄＮＴＰを使用した。プライマーペアとしては、表２に示す３２組のプライマーペアをそれぞれ２０ｐｍｏｌ使用した。その他の反応液組成はＰＣＲキットに添付のマニュアルに従った。ＰＣＲ反応は、Ｐｒｅ−ｈｅａｔｉｎｇ；９４℃、２分に続き、第１段階；９４℃、２０秒、第２段階；５５℃、３０秒、第３段階；７２℃、２分を３０サイクル繰り返し、Ｐｏｓｔｅｘｔｅｎｓｉｏｎ；７２℃、７分を行った。

上記ＰＣＲ反応液２μＬをアガロース電気泳動にかけ、予想される大きさのＤＮＡ断片が合成されれば塩素化エタン分解細菌が存在すると判断した。結果を表２に示す。

○：ＤＮＡの合成が観察された
×：ＤＮＡの合成が観察されない

表２の結果から、脱塩素化が観察されているＡ，Ｂ，Ｃサイトでは、ＤＮＡが合成されなかった例外は９回であったが、他はすべてＤＮＡが合成された。一方、脱塩素化が全く観察されないＤ，Ｅ，Ｆサイトでは、すべてＤＮＡが合成されなかった。この結果から、脱塩素化反応が起きているサイトでは、必ず塩素化エタン分解遺伝子を有する細菌が存在し、これらの検出およびモニタリングが可能であることが示された。

ここで検出された塩素化エタン分解細菌は、分離および同定はされていないが、配列番号３５の１６ＳｒＤＮＡを有し、Dehalobacter restrictusの近縁に属する塩素化エタン分解細菌と認められ、染色体に配列番号１の塩基配列を有する塩素化エタン分解遺伝子をもつことが確認された。また配列番号１の塩基配列を有する塩素化エタン分解遺伝子は、非特許文献２のトリクロロエチレン分解遺伝子pceA（GenBank：AJ439607）の塩基配列と１７１４塩基中４５塩基が相違していた。

〔塩素化エタン分解菌の注入と塩素化エタン分解遺伝子の定量〕：
1,1,1−トリクロロエタン（ＴＣＡ）で汚染されている地下水100mlを150ml容積のバイアル瓶に入れ、クエン酸等の栄養剤を添加した後ブチルゴム栓をし、アルミキャップでシールした。このバイアル瓶を30℃で静置培養しながら定期的にサンプリングを行い、下記のＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒを用いるＲｅａｌ−ＴｉｍｅＰＣＲにより、バイアル瓶中のエタン類の濃度の測定および塩素化エタン分解遺伝子のコピー数の定量を行った。なお、栓をして10日後に塩素化エタン分解遺伝子が検出された菌懸濁液を植菌し、塩素化エタン分解遺伝子が最終濃度で１０の７乗copies/mlとなるようにした。なお、比較例１として、コントロールとして塩素化エタン分解菌を植菌しないバイアルも用意し、比較例１としてエタン類の濃度の測定を行った。

（１）ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒによる検出：
脱塩素化が起きているバイアルの抽出ＤＮＡ溶液について、高精度なＤＮＡの検出および定量をＲｅａｌ−ＴｉｍｅＰＣＲにより、ロッシュ・ダイアグノスティック株式会社製のＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒを用いて行った。その際、ＵｐｐｅｒＰｒｉｍｅｒとしてはＫＷＩ−Ｄｅｂ１を、ＬｏｗｅｒＰｒｉｍｅｒとしてはＫＷＩ−Ｄｅｂ４に相補的な核酸断片を利用した。また、ハイブリダイゼーションプローブとして、ＫＷＩ−Ｄｅｂ５の３′末端をＦＩＴＣ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）にて標識したもの、およびＫＷＩ−Ｄｅｂ６の３′末端をリン酸化し、５′末端をＦＩＴＣにて標識したものを使用した。ＰＣＲ反応はＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒＤＮＡＭａｓｔｅｒＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎＰｒｏｂｅｓキット（商標）を使用し、そのマニュアルに従って行った。反応条件は表３〜表６に示す通りである。

結果は図３に示すが、塩素化エタン分解遺伝子が検出された菌懸濁液を培養開始１０日後に添加したところ、植菌開始約１７日後に塩素化エタン分解が顕著となり、１,１―ジクロロエタン（ＤＣＡ）が検出され始めた。その後、ＤＣＡも分解され、約６０日で完全にモノクロロエタン（ＣＡ）に転換された。また、その遺伝子コピー数も１０の８乗copies/mlにまで増加した。

比較例１として、植菌しないで同様に培養したコントロール試験の結果を図４に示すが、1,1,1−トリクロロエタン（ＴＣＡ）の減少はほとんど起きなかった。

ハイブリダイゼーションプローブとして、ＫＷＩ−Ｄｈｂ６の３′末端をＦＩＴＣ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）にて標識したもの、およびＫＷＩ−Ｄｈｂ７の３′末端をリン酸化し、５′末端をＦＩＴＣにて標識したものを使用した場合も、同様に定量が可能であった。これらの結果から、表２に示されたプライマーはハイブリダイゼーションプローブとしても利用できることがわかる。

塩素化エタンで汚染された土壌または地下水などにおける塩素化エタン分解細菌の検出、モニタリング、塩素化エタンの分解による環境浄化などに利用される。

核酸断片の配置図（その１）である。核酸断片の配置図（その２）である。実施例２の結果を示すグラフである。比較例１の結果を示すグラフである。

Claims

配列番号１の塩基配列またはこれと９０％以上のホモロジーの塩基配列を有する塩素化エタン分解遺伝子をもつ塩素化エタン分解細菌を、前記塩素化エタン分解遺伝子を標的にした分析法で検出することを特徴とする塩素化エタン分解細菌の検出方法。
塩素化エタン分解細菌の塩素化エタン分解遺伝子に優先的にハイブリダイズする２０〜２５ヌクレオチドからなる核酸断片であって、配列番号２〜３４のいずれかの塩基配列、これらの塩基配列と９０％以上のホモロジーを有する塩基配列またはこれらの塩基配列と相補的な塩基配列を有する核酸断片。
塩素化エタン分解細菌の塩素化エタン分解遺伝子に優先的にハイブリダイズする１０〜５０ヌクレオチドからなる核酸断片であって、少なくとも１０個の連続する塩基配列が、配列番号２〜３４のいずれかの塩基配列と同じ塩基配列またはこれらの塩基配列と相補的な塩基配列である核酸断片。
塩素化エタン分解細菌検出用である請求項２または３記載の核酸断片。
請求項２ないし４のいずれかに記載の核酸断片を標識物質で標識した塩素化エタン分解細菌検出用標識プローブ。
請求項２ないし４のいずれかに記載の核酸断片をプライマーとし、試料中の核酸を鋳型としてＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ）を行い、合成されたＤＮＡ断片を検出する塩素化エタン分解細菌の検出方法。
請求項５記載の塩素化エタン分解細菌検出用標識プローブと、試料または試料から調製した核酸とを接触させてＲＮＡまたはＤＮＡハイブリダイゼーションを行った後、標識を指標にして検出する塩素化エタン分解細菌の検出方法。
地下水または土壌を試料として請求項１、６または７記載のエタン分解細菌の検出方法を実施し、塩素化エタン分解細菌が検出された地下水、土壌またはそれらを接種した培養液を、塩素化エタンで汚染された土壌または地下水に導入する塩素化エタンの分解方法。
請求項１、６または７記載のエタン分解細菌の検出方法を実施し、塩素化エタンで汚染された土壌または地下水で検出された塩素化エタン分解細菌または、導入した塩素化エタン分解細菌の細菌数を定量することによる、塩素化エタン分解細菌のモニタリング方法。