JP2001238900A - 心臓弁基材およびその製造方法、並びに心臓弁の再生方法 - Google Patents
心臓弁基材およびその製造方法、並びに心臓弁の再生方法Info
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- A61F2/24—Heart valves ; Vascular valves, e.g. venous valves; Heart implants, e.g. passive devices for improving the function of the native valve or the heart muscle; Transmyocardial revascularisation [TMR] devices; Valves implantable in the body
- A61F2/2412—Heart valves ; Vascular valves, e.g. venous valves; Heart implants, e.g. passive devices for improving the function of the native valve or the heart muscle; Transmyocardial revascularisation [TMR] devices; Valves implantable in the body with soft flexible valve members, e.g. tissue valves shaped like natural valves
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Abstract
(57)【要約】
【課題】心臓弁を提供する。
【解決手段】心臓弁本体および該本体の外面を覆う血液
漏出防止層を有する生体吸収性材料からなる心臓弁基
材。
漏出防止層を有する生体吸収性材料からなる心臓弁基
材。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、人工心臓弁及びそ
の製造方法、心臓弁の再生方法並びに心臓弁に関する。
の製造方法、心臓弁の再生方法並びに心臓弁に関する。
【０００２】
【従来の技術及びその課題】僧帽弁狭窄症、僧帽弁閉鎖
不全症（逆流症）、大動脈弁狭窄症、大動脈弁閉鎖不全
症、三尖弁閉鎖不全症等の心臓弁膜症のように、弁が正
常に働かず、狭窄や逆流が生じた場合弁を交換する必要
がある。現在手術に用いられる弁には(1)機械弁(2)異種
生体弁(3)同種弁の三種類がある。
不全症（逆流症）、大動脈弁狭窄症、大動脈弁閉鎖不全
症、三尖弁閉鎖不全症等の心臓弁膜症のように、弁が正
常に働かず、狭窄や逆流が生じた場合弁を交換する必要
がある。現在手術に用いられる弁には(1)機械弁(2)異種
生体弁(3)同種弁の三種類がある。
【０００３】機械弁は耐久性に優れるが、一生抗凝固剤
を飲みつづける必要がある。また動物の弁を用いる異種
生体弁は抗凝固剤を飲みつづける必要はないが、6-10年
で弁機能不全をきたすことがある。一方死体より提供さ
れるヒト凍結同種弁は長期遠隔成績が異種生体弁より優
れ、死体組織の利用が進んでいる欧米では一般的に使用
されているが、本邦においては、供給が十分ではないと
いう問題がある。
を飲みつづける必要がある。また動物の弁を用いる異種
生体弁は抗凝固剤を飲みつづける必要はないが、6-10年
で弁機能不全をきたすことがある。一方死体より提供さ
れるヒト凍結同種弁は長期遠隔成績が異種生体弁より優
れ、死体組織の利用が進んでいる欧米では一般的に使用
されているが、本邦においては、供給が十分ではないと
いう問題がある。
【０００４】これに対して、近年組織培養（Tissue Eng
ineering）技術を用いて生体の多くの組織を再生させる
試みが行われている。これは生体吸収性高分子からなる
足場に組織の細胞を播種し、培養することによって自己
の組織を再生しようとする試みである。すでに皮膚（M.
L.Cooper,L.F.Hansbrough,R.L.Spiel vogel et.al.:In
vivo optimization of dermal substitute employing c
ultured human fibroblasts on a biodegradable polyg
lycolic acid or polyglactin mesh. Biomaterials, 1
2:243-248,1991）や軟骨（C.A.Vacanti,R. Langer et.a
l.:Synthetic polymers seeded with chondrocytes pr
ovide a templete for new cartilage formation. Plas
t.Reconstr.Surg.,88:753-759,1991）については多くの
研究例が報告されている。
ineering）技術を用いて生体の多くの組織を再生させる
試みが行われている。これは生体吸収性高分子からなる
足場に組織の細胞を播種し、培養することによって自己
の組織を再生しようとする試みである。すでに皮膚（M.
L.Cooper,L.F.Hansbrough,R.L.Spiel vogel et.al.:In
vivo optimization of dermal substitute employing c
ultured human fibroblasts on a biodegradable polyg
lycolic acid or polyglactin mesh. Biomaterials, 1
2:243-248,1991）や軟骨（C.A.Vacanti,R. Langer et.a
l.:Synthetic polymers seeded with chondrocytes pr
ovide a templete for new cartilage formation. Plas
t.Reconstr.Surg.,88:753-759,1991）については多くの
研究例が報告されている。
【０００５】また心臓弁についても組織培養技術による
再生の試みが行われ、弁葉構造の再生に関して良好な研
究成果が報告されている（T.Shinoka et.al. :Tissue-e
ngineered heart valve leaflets. Autologous valv le
aflet replacement study ina lamb model. Circulatio
n, 94(suppl.II):II-164-II-168,1996. T.Shinokaet.
al. :Tissue-engineered heart valve leaflets. Does
cell origin affect outocome? Circulation, 96(supp
l.II):II-102-II-107,1996 ）。
再生の試みが行われ、弁葉構造の再生に関して良好な研
究成果が報告されている（T.Shinoka et.al. :Tissue-e
ngineered heart valve leaflets. Autologous valv le
aflet replacement study ina lamb model. Circulatio
n, 94(suppl.II):II-164-II-168,1996. T.Shinokaet.
al. :Tissue-engineered heart valve leaflets. Does
cell origin affect outocome? Circulation, 96(supp
l.II):II-102-II-107,1996 ）。
【０００６】しかしながら心臓弁全体を生体吸収性材料
にて作製する実用的な生体吸収性基材は得られていな
い。
にて作製する実用的な生体吸収性基材は得られていな
い。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、血液の漏出
のない人工心臓弁基材および心臓弁を提供することを目
的とする。
のない人工心臓弁基材および心臓弁を提供することを目
的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明は、以下の項１〜
項８に関する。 項１． 心臓弁本体および該本体の外面を覆う血液漏出
防止層を有する生体吸収性材料からなる心臓弁基材。 項２． 血液漏出防止層がフィルムである項１記載の人
工心臓弁基材。 項３． 心臓弁本体が、筒状の基体の内部に弁尖を備
え、かつバルサルバ洞を形成してなる項１に記載の心臓
弁基材。 項４． 心臓弁本体の外面にフィルムを貼着して血液漏
出防止層を形成することを特徴とする心臓弁基材の製造
方法。 項５． 心臓弁本体を生体分解吸収性高分子溶液に浸漬
後乾燥してフィルム状の血液漏出防止層を形成すること
を特徴とする心臓弁基材の製造方法。 項６． 外面にフィルム状の血液漏出防止層を備えた筒
状の基体にバルサルバ洞を形成する工程および基体の内
部に弁尖を形成する工程を含むことを特徴とする心臓弁
基材の製造方法。 項７． 項１〜３のいずれかに記載の人工心臓弁基材に
内皮細胞及び繊維芽細胞を同時に又は別々に播種し、心
臓弁組織を再生することを特徴とする心臓弁の再生方
法。 項８． 生体吸収性材料からなる心臓弁本体の内面、バ
ルサルバ洞及び弁尖を繊維芽細胞及び内皮細胞を含む生
体細胞層で覆ってなる心臓弁。
項８に関する。 項１． 心臓弁本体および該本体の外面を覆う血液漏出
防止層を有する生体吸収性材料からなる心臓弁基材。 項２． 血液漏出防止層がフィルムである項１記載の人
工心臓弁基材。 項３． 心臓弁本体が、筒状の基体の内部に弁尖を備
え、かつバルサルバ洞を形成してなる項１に記載の心臓
弁基材。 項４． 心臓弁本体の外面にフィルムを貼着して血液漏
出防止層を形成することを特徴とする心臓弁基材の製造
方法。 項５． 心臓弁本体を生体分解吸収性高分子溶液に浸漬
後乾燥してフィルム状の血液漏出防止層を形成すること
を特徴とする心臓弁基材の製造方法。 項６． 外面にフィルム状の血液漏出防止層を備えた筒
状の基体にバルサルバ洞を形成する工程および基体の内
部に弁尖を形成する工程を含むことを特徴とする心臓弁
基材の製造方法。 項７． 項１〜３のいずれかに記載の人工心臓弁基材に
内皮細胞及び繊維芽細胞を同時に又は別々に播種し、心
臓弁組織を再生することを特徴とする心臓弁の再生方
法。 項８． 生体吸収性材料からなる心臓弁本体の内面、バ
ルサルバ洞及び弁尖を繊維芽細胞及び内皮細胞を含む生
体細胞層で覆ってなる心臓弁。
【０００９】
【発明の実施の形態】本発明において、心臓弁基材を構
成する心臓弁本体（基体、バルサルバ洞および弁尖を含
む）、血液漏出防止層などは全て生体吸収性材料からな
る。
成する心臓弁本体（基体、バルサルバ洞および弁尖を含
む）、血液漏出防止層などは全て生体吸収性材料からな
る。
【００１０】生体吸収性材料としては、ポリグリコール
酸、ポリ乳酸（Ｄ体，Ｌ体、ＤＬ体）、ポリカプロラク
トン、グリコール酸−乳酸（Ｄ体，Ｌ体、ＤＬ体）共重
合体、グリコール酸−カプロラクトン共重合体、乳酸
（Ｄ体，Ｌ体、ＤＬ体）−カプロラクトン共重合体、ポ
リ（ｐ−ジオキサノン）等の合成生体吸収性高分子やコ
ラーゲン、変性コラーゲン、ゼラチン、キチン、キトサ
ン等の天然高分子等が挙げられる。
酸、ポリ乳酸（Ｄ体，Ｌ体、ＤＬ体）、ポリカプロラク
トン、グリコール酸−乳酸（Ｄ体，Ｌ体、ＤＬ体）共重
合体、グリコール酸−カプロラクトン共重合体、乳酸
（Ｄ体，Ｌ体、ＤＬ体）−カプロラクトン共重合体、ポ
リ（ｐ−ジオキサノン）等の合成生体吸収性高分子やコ
ラーゲン、変性コラーゲン、ゼラチン、キチン、キトサ
ン等の天然高分子等が挙げられる。
【００１１】本発明の心臓弁基材の基体は、生体吸収性
材料からなる発泡体、フィルム、不織布等からなり、強
度が必要とされる場合には、同じく生体吸収性高分子か
らなる織物、編物、不織布等の補強材によって補強する
ことも可能である。
材料からなる発泡体、フィルム、不織布等からなり、強
度が必要とされる場合には、同じく生体吸収性高分子か
らなる織物、編物、不織布等の補強材によって補強する
ことも可能である。
【００１２】該基体の外面に急性期の血液漏れ防止を目
的として、生体吸収性高分子からなるフィルムを形成す
る。
的として、生体吸収性高分子からなるフィルムを形成す
る。
【００１３】心臓弁基材の作製方法としては、例えば以
下の方法が例示できる。 （１）バルサルバ洞及び血液漏出防止層を有する基体の
作製 バルサルバ洞構造を有する基体作製用外型に、生体吸収
性材料からなるフィルムをはめ、この内側に必要に応じ
て強化材として用いる生体吸収性高分子からなる織物、
編物、不織布等をはめ、内側から型をはめ込み、間隙に
生体吸収性高分子溶液を流し込み、凍結後凍結乾燥する
ことによってバルサルバ洞及び血液漏出防止層を有する
基体を作製できる。バルサルバ洞及びフィルム状の血液
漏出防止層を有する該基体は、多孔質発泡体からなり、
必要に応じて強化材で補強される。 （２）弁尖(内部弁)の作製 テフロン製試験管に円筒状の織物または編物、あるいは
平面状の織物または編物を円筒状に巻きつけ、融着ある
いは縫合によって円筒状とする。これを外型に入れ、間
隙に基材となる生体吸収性高分子溶液を流し込み、凍結
後凍結乾燥する。取り出した円筒形基材の片側の末端を
内側が重なるように折り込み（二尖の場合は２方向か
ら、三尖の場合は三方から）熱セットして、弁尖を得る
（図１）。 （３）複合化 上記で作製した基体のバルサルバ洞のあたりに弁尖を挿
入し、弁尖の非折り込み部分とバルサルバ洞の辺縁を生
体吸収性縫合糸で縫合する。作製した心臓弁基材はエチ
レンオキサイドガス滅菌して、以下の実験に供する。 （４）細胞培養及び播種 大腿動脈より生体細胞（内皮細胞と線維芽細胞等）を採
取し、混合培養を行った後、人工心臓弁に播種し、人工
心臓弁の内面、バルサルバ洞及び弁尖を覆うように内皮
細胞化させる。なお、人工心臓弁の内面、バルサルバ洞
及び弁尖は、内皮細胞及び繊維芽細胞でほぼ覆われてい
ればよいが、完全に覆われているのがより好ましい。 （５）移植 こうして作製した心臓弁は、ヒトや動物の成人だけでな
く、特に乳幼児あるいは子供への移植に使用することが
できる。
下の方法が例示できる。 （１）バルサルバ洞及び血液漏出防止層を有する基体の
作製 バルサルバ洞構造を有する基体作製用外型に、生体吸収
性材料からなるフィルムをはめ、この内側に必要に応じ
て強化材として用いる生体吸収性高分子からなる織物、
編物、不織布等をはめ、内側から型をはめ込み、間隙に
生体吸収性高分子溶液を流し込み、凍結後凍結乾燥する
ことによってバルサルバ洞及び血液漏出防止層を有する
基体を作製できる。バルサルバ洞及びフィルム状の血液
漏出防止層を有する該基体は、多孔質発泡体からなり、
必要に応じて強化材で補強される。 （２）弁尖(内部弁)の作製 テフロン製試験管に円筒状の織物または編物、あるいは
平面状の織物または編物を円筒状に巻きつけ、融着ある
いは縫合によって円筒状とする。これを外型に入れ、間
隙に基材となる生体吸収性高分子溶液を流し込み、凍結
後凍結乾燥する。取り出した円筒形基材の片側の末端を
内側が重なるように折り込み（二尖の場合は２方向か
ら、三尖の場合は三方から）熱セットして、弁尖を得る
（図１）。 （３）複合化 上記で作製した基体のバルサルバ洞のあたりに弁尖を挿
入し、弁尖の非折り込み部分とバルサルバ洞の辺縁を生
体吸収性縫合糸で縫合する。作製した心臓弁基材はエチ
レンオキサイドガス滅菌して、以下の実験に供する。 （４）細胞培養及び播種 大腿動脈より生体細胞（内皮細胞と線維芽細胞等）を採
取し、混合培養を行った後、人工心臓弁に播種し、人工
心臓弁の内面、バルサルバ洞及び弁尖を覆うように内皮
細胞化させる。なお、人工心臓弁の内面、バルサルバ洞
及び弁尖は、内皮細胞及び繊維芽細胞でほぼ覆われてい
ればよいが、完全に覆われているのがより好ましい。 （５）移植 こうして作製した心臓弁は、ヒトや動物の成人だけでな
く、特に乳幼児あるいは子供への移植に使用することが
できる。
【００１４】本発明の心臓弁基材の基体は発泡体である
のが好ましい。発泡体の孔径は細胞が適当に接着し、増
殖すると同時に心臓弁として移植した際に血液漏れしな
いことが好ましく、その孔径は通常1mm以下、好ましく
は5〜100μｍである。基体の厚みは吸収期間あるいは縫
合のしやすさから決定され、通常5mm以下、好ましくは5
00μmから2mmである。
のが好ましい。発泡体の孔径は細胞が適当に接着し、増
殖すると同時に心臓弁として移植した際に血液漏れしな
いことが好ましく、その孔径は通常1mm以下、好ましく
は5〜100μｍである。基体の厚みは吸収期間あるいは縫
合のしやすさから決定され、通常5mm以下、好ましくは5
00μmから2mmである。
【００１５】血液漏出防止層として、好ましい素材とし
ては、生体吸収性で柔軟性を有するもの、特に、ポリ乳
酸−カプロラクトン(P(CL/LA))が望ましい。
ては、生体吸収性で柔軟性を有するもの、特に、ポリ乳
酸−カプロラクトン(P(CL/LA))が望ましい。
【００１６】血液漏出防止層の好ましい厚さとしては、
柔軟性を損なわず、かつ血液の漏出を防止できる厚さで
あることが好ましく、具体的には通常１μｍ〜５ｍｍ、
好ましくは５μｍ〜１ｍｍ、より好ましくは１０μｍ〜
１００μｍが例示される。血液漏出防止層の好ましい製
造方法として、基材の作製時に防止層も一体で作製する
等、完成時に心臓弁本体と一体化していることが好まし
いが、そのまま重ねて製造するなど分離する構造でも可
能である。
柔軟性を損なわず、かつ血液の漏出を防止できる厚さで
あることが好ましく、具体的には通常１μｍ〜５ｍｍ、
好ましくは５μｍ〜１ｍｍ、より好ましくは１０μｍ〜
１００μｍが例示される。血液漏出防止層の好ましい製
造方法として、基材の作製時に防止層も一体で作製する
等、完成時に心臓弁本体と一体化していることが好まし
いが、そのまま重ねて製造するなど分離する構造でも可
能である。
【００１７】発泡体の作製方法としては、以下の方法が
例示できる。 （１）凍結乾燥法 基材とするポリマー溶液を型に入れて凍結した後、凍結
乾燥する。凍結温度、ポリマーの濃度によって種々の空
孔径を有する発泡体が得られる。 （２）溶出法 水溶性物質を基材とするポリマー溶液に混合し、乾燥
後、当該水溶性物質を水洗によって洗い流す。水溶性物
質の粒子に応じた径を有する発泡体が得られる。本例に
おいてはシュークロースが適当に使用できる。
例示できる。 （１）凍結乾燥法 基材とするポリマー溶液を型に入れて凍結した後、凍結
乾燥する。凍結温度、ポリマーの濃度によって種々の空
孔径を有する発泡体が得られる。 （２）溶出法 水溶性物質を基材とするポリマー溶液に混合し、乾燥
後、当該水溶性物質を水洗によって洗い流す。水溶性物
質の粒子に応じた径を有する発泡体が得られる。本例に
おいてはシュークロースが適当に使用できる。
【００１８】補強材は基材となる発泡体より強度が大き
い必要がある。繊維状、不織布状、フィルム状等から選
択できる。
い必要がある。繊維状、不織布状、フィルム状等から選
択できる。
【００１９】補強材は発泡体と一体になっていることが
好ましく、その位置は内面，中心，外面のいずれでも可
能であるが発泡体の内面は血管内皮細胞との接着に関与
するため、中心あるいは外面が好ましいが、内面でも可
能である。
好ましく、その位置は内面，中心，外面のいずれでも可
能であるが発泡体の内面は血管内皮細胞との接着に関与
するため、中心あるいは外面が好ましいが、内面でも可
能である。
【００２０】播種する細胞としては、内皮細胞、平滑筋
細胞、線維芽細胞が挙げられ、これらの２種または３種
の混合培養細胞が例示でき、混合培養細胞を使用して、
組織構築を行う。好ましくは内皮細胞及び線維芽細胞を
含み、任意の構成成分としてさらに平滑筋細胞を含む混
合培養細胞を好ましく使用できる。
細胞、線維芽細胞が挙げられ、これらの２種または３種
の混合培養細胞が例示でき、混合培養細胞を使用して、
組織構築を行う。好ましくは内皮細胞及び線維芽細胞を
含み、任意の構成成分としてさらに平滑筋細胞を含む混
合培養細胞を好ましく使用できる。
【００２１】使用する細胞の培養条件、播種方法を以下
に示す。 Ａ．細胞単離、細胞培養、細胞数増大 完全清潔下に採取した血管組織を細胞培養液に浸漬し、
クリーンベンチ内でリン酸化生食を用いて洗浄する。次
に、ペトリディッシュ上で外科メスを用いて単純なexpl
ant technique に準じて組織の裁断を行う。約１−２ｍ
ｍ2大の細組織片を均等にディッシュ上に分配し、約２
０分後、組織がディッシュ下面に強固に接着した後に培
養液を加える。培養液は、Dulbecco's Modified Eagles
Media (DMEM)に10%牛胎児血清と1%の抗生物質溶液（Ｌ
−グルタミン29.2mg/ml、ペニシリンＧ 1000u/ml、スト
レプトマイシン硫酸塩10,000μg/ml）を補填したものを
使用する。血管壁細胞は、５−７日後に、細胞が組織か
らディッシュ上に移動し始め、さらに１週間後には混合
細胞コロニーがexplant組織片の周囲に形成される。そ
の２〜３週後に、混合細胞はディッシュ上でコンフルエ
ントの状態を形成する。直ちに0.25%トリプシンにてPas
sageを行い、75cm2の培養フラスコ上での培養を開始す
るが、概ねこのフラスコがconfluentになると約二百万
個の細胞を得たことになる。５％ＣＯ2、９５％Ｏ2の環
境下で細胞培養を行い、１０×１０ 6個の細胞数を得る
まで培養を続ける。培養液は４−５日ごとに交換する
が、予備実験の結果では細胞のdoubling timeは、約４
８時間である。尚、経過中の細胞数の算定はトリパンブ
ルーによる古典的なexclusion法に従って行う。 Ｂ．細胞隔離、内皮細胞純化 混合細胞がコンフルエントに達し、ある程度の細胞数が
得られた段階で、以下の手順に従い、FACSを用いて混合
細胞から内皮細胞を選別分離する。BiomedicalTechnolo
gies社のDil-acetylated LDL(蛍光色素マーカー）（以
下Dil-Ac-LDL）を混合細胞培養液中に1μg/mlの濃度で
添加し、２４時間のincubationを行う。このマーカーは
内皮細胞、マクロファージに特有なスキャベンジャー経
路を通過して細胞内に取り込まれる。２４時間後にtrip
sinizeを行い、混合細胞浮遊液を作成し、セルソーター
(FACS machine: Bectin Dickenson社製）を使用してソ
ートする。細胞は、その大きさと蛍光発光に基づいてDi
l-Ac-LDL陽性と陰性に選別される。分離後これらを別々
に培養し、内皮細胞が二百万個になるまで継続する。 Ｃ．組織構築 組織を構築する第１段階は、in vitroにおける細胞播種
である。具体的には、生分解性の心臓弁基材に約１００
万個／１cm2のDil-Ac-LDL陰性の線維芽細胞を播種す
る。
に示す。 Ａ．細胞単離、細胞培養、細胞数増大 完全清潔下に採取した血管組織を細胞培養液に浸漬し、
クリーンベンチ内でリン酸化生食を用いて洗浄する。次
に、ペトリディッシュ上で外科メスを用いて単純なexpl
ant technique に準じて組織の裁断を行う。約１−２ｍ
ｍ2大の細組織片を均等にディッシュ上に分配し、約２
０分後、組織がディッシュ下面に強固に接着した後に培
養液を加える。培養液は、Dulbecco's Modified Eagles
Media (DMEM)に10%牛胎児血清と1%の抗生物質溶液（Ｌ
−グルタミン29.2mg/ml、ペニシリンＧ 1000u/ml、スト
レプトマイシン硫酸塩10,000μg/ml）を補填したものを
使用する。血管壁細胞は、５−７日後に、細胞が組織か
らディッシュ上に移動し始め、さらに１週間後には混合
細胞コロニーがexplant組織片の周囲に形成される。そ
の２〜３週後に、混合細胞はディッシュ上でコンフルエ
ントの状態を形成する。直ちに0.25%トリプシンにてPas
sageを行い、75cm2の培養フラスコ上での培養を開始す
るが、概ねこのフラスコがconfluentになると約二百万
個の細胞を得たことになる。５％ＣＯ2、９５％Ｏ2の環
境下で細胞培養を行い、１０×１０ 6個の細胞数を得る
まで培養を続ける。培養液は４−５日ごとに交換する
が、予備実験の結果では細胞のdoubling timeは、約４
８時間である。尚、経過中の細胞数の算定はトリパンブ
ルーによる古典的なexclusion法に従って行う。 Ｂ．細胞隔離、内皮細胞純化 混合細胞がコンフルエントに達し、ある程度の細胞数が
得られた段階で、以下の手順に従い、FACSを用いて混合
細胞から内皮細胞を選別分離する。BiomedicalTechnolo
gies社のDil-acetylated LDL(蛍光色素マーカー）（以
下Dil-Ac-LDL）を混合細胞培養液中に1μg/mlの濃度で
添加し、２４時間のincubationを行う。このマーカーは
内皮細胞、マクロファージに特有なスキャベンジャー経
路を通過して細胞内に取り込まれる。２４時間後にtrip
sinizeを行い、混合細胞浮遊液を作成し、セルソーター
(FACS machine: Bectin Dickenson社製）を使用してソ
ートする。細胞は、その大きさと蛍光発光に基づいてDi
l-Ac-LDL陽性と陰性に選別される。分離後これらを別々
に培養し、内皮細胞が二百万個になるまで継続する。 Ｃ．組織構築 組織を構築する第１段階は、in vitroにおける細胞播種
である。具体的には、生分解性の心臓弁基材に約１００
万個／１cm2のDil-Ac-LDL陰性の線維芽細胞を播種す
る。
【００２２】濃縮細胞浮遊液のポリマー上への播種直後
は、３０−６０分間培養皿上でクリーンベンチ内に放置
し、その後約５０ｍｌの培養液を添加する。培養液は基
本的に毎日交換し、７日後、外科的移植の一日前に内皮
細胞の細胞浮遊液（約二百万個）でさらなる播種を行
い、この作業で単一層の内皮細胞化を図る。
は、３０−６０分間培養皿上でクリーンベンチ内に放置
し、その後約５０ｍｌの培養液を添加する。培養液は基
本的に毎日交換し、７日後、外科的移植の一日前に内皮
細胞の細胞浮遊液（約二百万個）でさらなる播種を行
い、この作業で単一層の内皮細胞化を図る。
【００２３】上記のＡ．〜Ｃ．は、心臓弁作製の際の細
胞採取、培養、播種方法を例示するものである。
胞採取、培養、播種方法を例示するものである。
【００２４】
【実施例１】（１）バルサルバ洞及び血液漏出防止層を
有する基体の作製 直径20mmのバルサルバ洞１を有する外筒用型に乳酸−カ
プロラクトン共重合体(モル比50:50)からなるフィルム
（厚さ約150μｍ）を挿入後、その内側に円筒状のポリ
グリコール酸製の不織布を挿入した。内側から内型をは
めた後、間隙に乳酸−カプロラクトンからなる共重合体
（モル比50：50）のジオキサン溶液（５％）を流し込
み、-30℃で凍結後20℃で２４時間凍結乾燥した。乾燥
後取り出した基体は発泡体構造で、芯材に繊維状強化材
が組み込まれ、その外面にフィルム状の血液漏出防止層
を有していた（図２：断面写真１）。 （２）弁尖の作製 直径18mmのテフロン製試験管に円筒状のポリグリコール
酸製の織物をはめた。これを直径20mmの円筒状型に入
れ、間隙に乳酸−カプロラクトンからなる共重合体（モ
ル比50：50）のジオキサン溶液（５％）を流し込み、-3
0℃で凍結後20℃で２４時間凍結乾燥した。取り出した
弁尖は発泡体構造で、芯材に繊維状強化材が組み込まれ
た構造をしていた(図３：断面写真２)。図１に示す三尖
弁４を作製する場合は、末端を三方から内側に折り込
み、中央部で縫合したのち、100℃３時間真空下で熱セ
ットする。熱セットが完了した後縫合糸を切断した。
有する基体の作製 直径20mmのバルサルバ洞１を有する外筒用型に乳酸−カ
プロラクトン共重合体(モル比50:50)からなるフィルム
（厚さ約150μｍ）を挿入後、その内側に円筒状のポリ
グリコール酸製の不織布を挿入した。内側から内型をは
めた後、間隙に乳酸−カプロラクトンからなる共重合体
（モル比50：50）のジオキサン溶液（５％）を流し込
み、-30℃で凍結後20℃で２４時間凍結乾燥した。乾燥
後取り出した基体は発泡体構造で、芯材に繊維状強化材
が組み込まれ、その外面にフィルム状の血液漏出防止層
を有していた（図２：断面写真１）。 （２）弁尖の作製 直径18mmのテフロン製試験管に円筒状のポリグリコール
酸製の織物をはめた。これを直径20mmの円筒状型に入
れ、間隙に乳酸−カプロラクトンからなる共重合体（モ
ル比50：50）のジオキサン溶液（５％）を流し込み、-3
0℃で凍結後20℃で２４時間凍結乾燥した。取り出した
弁尖は発泡体構造で、芯材に繊維状強化材が組み込まれ
た構造をしていた(図３：断面写真２)。図１に示す三尖
弁４を作製する場合は、末端を三方から内側に折り込
み、中央部で縫合したのち、100℃３時間真空下で熱セ
ットする。熱セットが完了した後縫合糸を切断した。
【００２５】尚、複合化に際しては、図６に示すように
シート状の基体２を用い、上記と同様にバルサルバ洞１
と三尖弁４を一体縫合した後に筒状の基体としてもよ
い。 （３）複合化 弁尖を筒状とした基体２に挿入し、バルサルバ洞１の辺
縁をポリグリコール酸縫合糸にて一体縫合し、更に他端
を円筒状に一体縫合して弁６を有する本発明の心臓弁基
材３を得た（図４，図５）。 （４）細胞の培養 A．細胞単離、細胞培養、細胞数増大 生後２０日のDover子羊より全身麻酔下に約2 cmの大腿
動脈を深部大腿動脈を温存して採取した。完全清潔下に
採取した組織を細胞培養液に浸漬し、クリーンベンチ内
でリン酸化生食を用いて洗浄した。次に、ペトリディッ
シュ上で外科メスを用いて単純なexplant techniqueに
準じて組織の裁断を行った。約１-２ mm2大の細組織片
を均等にディッシュ上に分配し、約２０分後、組織がデ
ィッシュ下面に強固に接着した後に培養液を加えた。こ
の際、組織片がディッシュから剥がれないように注意し
た。
シート状の基体２を用い、上記と同様にバルサルバ洞１
と三尖弁４を一体縫合した後に筒状の基体としてもよ
い。 （３）複合化 弁尖を筒状とした基体２に挿入し、バルサルバ洞１の辺
縁をポリグリコール酸縫合糸にて一体縫合し、更に他端
を円筒状に一体縫合して弁６を有する本発明の心臓弁基
材３を得た（図４，図５）。 （４）細胞の培養 A．細胞単離、細胞培養、細胞数増大 生後２０日のDover子羊より全身麻酔下に約2 cmの大腿
動脈を深部大腿動脈を温存して採取した。完全清潔下に
採取した組織を細胞培養液に浸漬し、クリーンベンチ内
でリン酸化生食を用いて洗浄した。次に、ペトリディッ
シュ上で外科メスを用いて単純なexplant techniqueに
準じて組織の裁断を行った。約１-２ mm2大の細組織片
を均等にディッシュ上に分配し、約２０分後、組織がデ
ィッシュ下面に強固に接着した後に培養液を加えた。こ
の際、組織片がディッシュから剥がれないように注意し
た。
【００２６】培養液はDulbecco's Modified Eagles Med
iaに10%牛胎児血清と1 %の抗生物質溶液（Ｌ−glutamin
e 29.2mg/ml 、ペニシリンＧ 1000u/mlと Streptomycin
硫酸塩 10,000μg/ml）を補填したものを使用した。
iaに10%牛胎児血清と1 %の抗生物質溶液（Ｌ−glutamin
e 29.2mg/ml 、ペニシリンＧ 1000u/mlと Streptomycin
硫酸塩 10,000μg/ml）を補填したものを使用した。
【００２７】羊の血管壁細胞は5-7日後に、細胞が組織
からディッシュ上に移動し始め、さらに一週間後には混
合細胞コロニーがexplant組織片の周囲に形成された。
さらに２-３週後に、混合細胞はディッシュ上でコンフ
ルエントの状態になった。直ちに0.25%トリプシンにてP
assageを行い、75ｃｍ2の培養フラスコ上での培養を開
始したが、概ねこのフラスコが コンフルエントになる
と約二百万個の細胞を得たことになる。５％CO2、95% O
2の環境下で細胞培養を行い、10 x 10 6個の細胞数を得
るまで培養を続けた。培養液は4-5日毎に交換した。細
胞のdoublling timeは約４８時間であった。 B. 細胞隔離、内皮細胞純化 混合細胞がコンフルエントに達し、ある程度の細胞数が
得られた段階で以下の手順に従って、FACS を用いて、
混合細胞から内皮細胞を選別分離した。 Biomedical T
echnologies社のDil-acethylated LDL(fluorescent mar
ker)(以下 D-Ac-LDL)を混合細胞培養液中に１μg/mlの
濃度で添加し、２４時間のインキュベーションを行っ
た。このマーカーは内皮細胞、マクロファージに特有な
scavenger pathwayを通過して細胞内に取り込まれる。
２４時間後に tripsinizeを行い混合細胞細胞浮遊液を
作成し、 セルソーター（FACS machine: Bectin Dicken
son社製,Mountainview, California)を使用してソート
した。細胞は細胞の大きさと蛍光発光に基づいてDil-Ac
-LDL陽性と陰性に選別される。内皮細胞は陽性で混合培
養の約5-8%程度認めた。分離後これらを別々に培養し、
内皮細胞が二百万個になるまで継続した。尚、経過中の
細胞数の算定はトリパンブルーによる古典的な exclusi
on法に従った。 C．弁葉組織構築 基体の内面並びに弁尖基材に約二千万個のDil-Ac-LDL陰
性のmyofibroblastを播種(seeding)した。濃縮細胞浮遊
液のポリマー上への播種(seeding)直後は、３０−６０
分間培養皿上でクリーンベンチ内に放置し、その後約５
０mlの培養液を添加した。培養液は 基本的に毎日交換
し、７日後、動物への移植一日前に内皮細胞の細胞浮遊
液（約二百万個）でさらなる播種(seeding)を行い、こ
の作業で単一層の内皮細胞化を図り、心臓弁本体の基体
の内面、バルサルバ洞及び弁尖を繊維芽細胞及び内皮細
胞で覆ってなる心臓弁を得た。 D. 動物実験 上記C.で作製した心臓弁を子犬の心臓弁と置換したとこ
ろ、置換直後においても血液漏れがなく、その後も抗凝
固剤の使用無しに良好な開存性を得、組織培養心臓弁と
しての十分な機能を果たしていることを確認した。
からディッシュ上に移動し始め、さらに一週間後には混
合細胞コロニーがexplant組織片の周囲に形成された。
さらに２-３週後に、混合細胞はディッシュ上でコンフ
ルエントの状態になった。直ちに0.25%トリプシンにてP
assageを行い、75ｃｍ2の培養フラスコ上での培養を開
始したが、概ねこのフラスコが コンフルエントになる
と約二百万個の細胞を得たことになる。５％CO2、95% O
2の環境下で細胞培養を行い、10 x 10 6個の細胞数を得
るまで培養を続けた。培養液は4-5日毎に交換した。細
胞のdoublling timeは約４８時間であった。 B. 細胞隔離、内皮細胞純化 混合細胞がコンフルエントに達し、ある程度の細胞数が
得られた段階で以下の手順に従って、FACS を用いて、
混合細胞から内皮細胞を選別分離した。 Biomedical T
echnologies社のDil-acethylated LDL(fluorescent mar
ker)(以下 D-Ac-LDL)を混合細胞培養液中に１μg/mlの
濃度で添加し、２４時間のインキュベーションを行っ
た。このマーカーは内皮細胞、マクロファージに特有な
scavenger pathwayを通過して細胞内に取り込まれる。
２４時間後に tripsinizeを行い混合細胞細胞浮遊液を
作成し、 セルソーター（FACS machine: Bectin Dicken
son社製,Mountainview, California)を使用してソート
した。細胞は細胞の大きさと蛍光発光に基づいてDil-Ac
-LDL陽性と陰性に選別される。内皮細胞は陽性で混合培
養の約5-8%程度認めた。分離後これらを別々に培養し、
内皮細胞が二百万個になるまで継続した。尚、経過中の
細胞数の算定はトリパンブルーによる古典的な exclusi
on法に従った。 C．弁葉組織構築 基体の内面並びに弁尖基材に約二千万個のDil-Ac-LDL陰
性のmyofibroblastを播種(seeding)した。濃縮細胞浮遊
液のポリマー上への播種(seeding)直後は、３０−６０
分間培養皿上でクリーンベンチ内に放置し、その後約５
０mlの培養液を添加した。培養液は 基本的に毎日交換
し、７日後、動物への移植一日前に内皮細胞の細胞浮遊
液（約二百万個）でさらなる播種(seeding)を行い、こ
の作業で単一層の内皮細胞化を図り、心臓弁本体の基体
の内面、バルサルバ洞及び弁尖を繊維芽細胞及び内皮細
胞で覆ってなる心臓弁を得た。 D. 動物実験 上記C.で作製した心臓弁を子犬の心臓弁と置換したとこ
ろ、置換直後においても血液漏れがなく、その後も抗凝
固剤の使用無しに良好な開存性を得、組織培養心臓弁と
しての十分な機能を果たしていることを確認した。
【００２８】
【発明の効果】本発明によれば、機械弁、異種生体弁、
同種弁に代わる人工心臓弁を提供できる。また、全体を
生体吸収性高分子で構成しているので、組織再生後に消
失し、異物として体内に残存しない。特に小児において
は成長が期待できる。
同種弁に代わる人工心臓弁を提供できる。また、全体を
生体吸収性高分子で構成しているので、組織再生後に消
失し、異物として体内に残存しない。特に小児において
は成長が期待できる。
【００２９】さらに、血液漏出防止層の存在により置換
直後においても血液漏れを防止することができた。
直後においても血液漏れを防止することができた。
【図１】三尖弁を示す。
【図２】心臓弁基材の断面を示す図面代用写真である。
【図３】心臓弁基材の断面を示す図面代用写真である。
【図４】本発明の人工心臓弁の断面図を示す。
【図５】本発明の人工心臓弁の平面図を示す。
【図６】シート状の基体２のバルサルバ洞１に三尖弁４
を一体縫合した図を示す
を一体縫合した図を示す
１ バルサルバ洞 ２ 心臓弁本体 ３ 心臓弁基材 ４ 三尖弁 ５ 頂部 ６ 弁 ７ 血液漏出防止層
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 新岡 俊治 東京都新宿区河田町８番１号 学校法人東 京女子医科大学内 (72)発明者 今井 康晴 東京都新宿区河田町８番１号 学校法人東 京女子医科大学内 Ｆターム(参考） 4C081 AB17 BA11 BA12 CA081 CD091 CD121 CD151 DA02 EA03 4C097 AA27 BB01 CC03 DD01 DD05 DD15 EE03 MM03 SB01
Claims (8)
- 【請求項１】心臓弁本体および該本体の外面を覆う血液
漏出防止層を有する生体吸収性材料からなる心臓弁基
材。 - 【請求項２】血液漏出防止層がフィルムである請求項１
記載の人工心臓弁基材。 - 【請求項３】心臓弁本体が、筒状の基体の内部に弁尖を
備え、かつバルサルバ洞を形成してなる請求項１に記載
の心臓弁基材。 - 【請求項４】心臓弁本体の外面にフィルムを貼着して血
液漏出防止層を形成することを特徴とする心臓弁基材の
製造方法。 - 【請求項５】心臓弁本体を生体分解吸収性高分子溶液に
浸漬後乾燥してフィルム状の血液漏出防止層を形成する
ことを特徴とする心臓弁基材の製造方法。 - 【請求項６】外面にフィルム状の血液漏出防止層を備え
た筒状の基体にバルサルバ洞を形成する工程および基体
の内部に弁尖を形成する工程を含むことを特徴とする心
臓弁基材の製造方法。 - 【請求項７】請求項１〜３のいずれかに記載の人工心臓
弁基材に内皮細胞及び繊維芽細胞を同時に又は別々に播
種し、心臓弁組織を再生することを特徴とする心臓弁の
再生方法。 - 【請求項８】生体吸収性材料からなる心臓弁本体の内
面、バルサルバ洞及び弁尖を繊維芽細胞及び内皮細胞を
含む生体細胞層で覆ってなる心臓弁。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000052035A JP4314421B2 (ja) | 2000-02-28 | 2000-02-28 | 心臓弁基材およびその製造方法、並びに心臓弁の再生方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000052035A JP4314421B2 (ja) | 2000-02-28 | 2000-02-28 | 心臓弁基材およびその製造方法、並びに心臓弁の再生方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001238900A true JP2001238900A (ja) | 2001-09-04 |
| JP4314421B2 JP4314421B2 (ja) | 2009-08-19 |
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|---|---|---|---|
| JP2000052035A Expired - Fee Related JP4314421B2 (ja) | 2000-02-28 | 2000-02-28 | 心臓弁基材およびその製造方法、並びに心臓弁の再生方法 |
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| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP4314421B2 (ja) |
Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2004208908A (ja) * | 2002-12-27 | 2004-07-29 | Gunze Ltd | 再生医療用基材 |
| JP2008516819A (ja) * | 2004-10-20 | 2008-05-22 | エシコン・インコーポレイテッド | 医療器具用の強化された吸収性複層布およびその製造方法 |
| JP2009533568A (ja) * | 2006-04-10 | 2009-09-17 | エシコン・インコーポレイテッド | 医療器具に使用するための吸収性強化複層布および製造方法 |
| JP2011025002A (ja) * | 2009-07-02 | 2011-02-10 | Japan Health Science Foundation | 弁付人工血管及び弁付人工血管用柱状芯基材並びに弁付人工血管の製造方法 |
| JP2014195699A (ja) * | 2004-05-05 | 2014-10-16 | ダイレクト フロウ メディカル、 インク． | 現場形成支持構造を備えたステントレス心臓弁 |
| US9358318B2 (en) | 2004-10-20 | 2016-06-07 | Ethicon, Inc. | Method of making a reinforced absorbable multilayered hemostatic wound dressing |
| US9439997B2 (en) | 2004-10-20 | 2016-09-13 | Ethicon, Inc. | Reinforced absorbable multilayered hemostatis wound dressing |
| US10130463B2 (en) | 2007-08-23 | 2018-11-20 | Dfm, Llc | Translumenally implantable heart valve with formed in place support |
| US10478299B2 (en) | 2010-05-19 | 2019-11-19 | Dfm, Llc | Low crossing profile delivery catheter for cardiovascular prosthetic implant |
-
2000
- 2000-02-28 JP JP2000052035A patent/JP4314421B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2004208908A (ja) * | 2002-12-27 | 2004-07-29 | Gunze Ltd | 再生医療用基材 |
| JP4596731B2 (ja) * | 2002-12-27 | 2010-12-15 | グンゼ株式会社 | 再生医療用基材 |
| JP2014195699A (ja) * | 2004-05-05 | 2014-10-16 | ダイレクト フロウ メディカル、 インク． | 現場形成支持構造を備えたステントレス心臓弁 |
| JP2008516819A (ja) * | 2004-10-20 | 2008-05-22 | エシコン・インコーポレイテッド | 医療器具用の強化された吸収性複層布およびその製造方法 |
| JP2012122187A (ja) * | 2004-10-20 | 2012-06-28 | Ethicon Inc | 医療器具用の強化された吸収性複層布およびその製造方法 |
| KR101256360B1 (ko) * | 2004-10-20 | 2013-04-30 | 에디컨인코포레이티드 | 의료 장치에 사용하기 위한 강화된 흡수성 다층 직물 및 이의 제조방법 |
| US9358318B2 (en) | 2004-10-20 | 2016-06-07 | Ethicon, Inc. | Method of making a reinforced absorbable multilayered hemostatic wound dressing |
| US9439997B2 (en) | 2004-10-20 | 2016-09-13 | Ethicon, Inc. | Reinforced absorbable multilayered hemostatis wound dressing |
| JP2009533568A (ja) * | 2006-04-10 | 2009-09-17 | エシコン・インコーポレイテッド | 医療器具に使用するための吸収性強化複層布および製造方法 |
| US10130463B2 (en) | 2007-08-23 | 2018-11-20 | Dfm, Llc | Translumenally implantable heart valve with formed in place support |
| JP2011025002A (ja) * | 2009-07-02 | 2011-02-10 | Japan Health Science Foundation | 弁付人工血管及び弁付人工血管用柱状芯基材並びに弁付人工血管の製造方法 |
| US10478299B2 (en) | 2010-05-19 | 2019-11-19 | Dfm, Llc | Low crossing profile delivery catheter for cardiovascular prosthetic implant |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP4314421B2 (ja) | 2009-08-19 |
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