JP2001226288A - 腹膜劣化抑制剤および腹膜透析液 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】腹膜の劣化を抑制できる新規な腹膜劣化抑制剤
を提供すること。 【解決手段】本発明の腹膜劣化抑制剤は、ＨＧＦを含有
することを特徴とする。本発明の腹膜劣化抑制剤は、Ｈ
ＧＦの他に、さらに糖類を含有することが好ましい。腹
膜劣化抑制剤は、かかる糖類を、ＨＧＦ１ngに対して１
μｇ〜１０ｇ程度含有することが好ましい。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、腹膜劣化抑制剤お
よび腹膜透析液に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】腎機能が低下もしくは喪失した患者に対
して、人工透析が広く行われている。この人工透析は、
本来腎臓が果たしている血液浄化作用を腎臓に代わって
行う血液浄化療法であり、生体内から水を除去すること
によって体液の組成を一定に保つとともに、体液中の老
廃物、例えば尿素等を除去することを主な目的としてい
る。人工透析としては、ダイアライザーを含む血液体外
循環回路を用いた血液透析の他に、腹膜透析が知られて
いる。

【０００３】腹膜透析では、腹膜で囲まれた腹腔内に浸
透圧の高い腹膜透析液を貯留することによって、生体内
の余分な水と老廃物を取り除く。すなわち、腹膜透析で
は、腹腔内に貯留した腹膜透析液と体液との間に生じる
浸透圧格差により、腹膜毛細血管から腹腔内の腹膜透析
液に生体内の余分な水が移動し、これによって、生体内
の余分な水と老廃物が取り除かれる。

【０００４】この腹膜透析は、血液透析に比べて、循環
系や生体内部環境へ与える影響が少ないといった利点を
持っている。ところで、腹膜透析液を長期にわたって腹
腔内に反復貯留すると、腹膜微小血管内皮細胞が傷害を
受ける場合がある。この腹膜微小血管内皮細胞が傷害を
受けると、限外濾過能を有する腹膜微小血管が破綻す
る。この結果、腹膜の劣化がおき、腹膜透析の施行が困
難になる。

【０００５】この場合、腹膜の劣化に対する有効な治療
剤や防止剤が未だに開発されていないため、腹膜透析の
継続を断念しなければならない。

【０００６】しかしながら、腹膜透析は、前述した循環
系や生体内部環境へ与える影響が少ないといった利点に
加えて、通院の頻度が少なく、自宅や職場で行うことが
でき、患者の拘束時間が少ないといった利点を有してい
る。したがって、腹膜の劣化を抑制し、腹膜透析を長期
にわたって継続できれば、腎機能が低下もしくは喪失し
た患者に対して計り知れない利益をもたらすことができ
る。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、腹膜
の劣化を抑制できる新規な腹膜劣化抑制剤、および腹膜
透析液を提供することにある。

【０００８】

【課題を解決するための手段】このような目的は、下記
（１）〜（１１）の本発明により達成される。

【０００９】（１） ＨＧＦ（Hepatocyte Growth Fact
or）を含有することを特徴とする腹膜劣化抑制剤。

【００１０】（２） さらに糖類を含有することを特徴
とする上記（１）に記載の腹膜劣化抑制剤。

【００１１】（３） 前記糖類は、単糖類である上記
（２）に記載の腹膜劣化抑制剤。

【００１２】（４） 前記糖類は、グルコースである上
記（２）に記載の腹膜劣化抑制剤。

【００１３】（５） 前記糖類を、前記ＨＧＦ１ngに対
して１μｇ〜１０ｇ含有する上記（２）ないし（４）の
いずれかに記載の腹膜劣化抑制剤。

【００１４】（６） 腹膜透析液に配合して使用される
上記（１）ないし（５）のいずれかに記載の腹膜劣化抑
制剤。

【００１５】（７） 上記（１）ないし（６）のいずれ
かに記載の腹膜劣化抑制剤を含有することを特徴とする
腹膜透析液。

【００１６】（８） 腹膜透析液中における前記ＨＧＦ
の濃度が、０．０１〜１０００ng/mLである上記（７）
に記載の腹膜透析液。

【００１７】（９） ｐＨが４．０〜９．０である上記
（７）または（８）に記載の腹膜透析液。

【００１８】（１０） ｐＨが４．０〜６．５である上
記（７）ないし（９）のいずれかに記載の腹膜透析液。

【００１９】（１１） ０．１〜１０W/V％の濃度の糖
類を含有する上記（７）ないし（１０）のいずれかに記
載の腹膜透析液。

【００２０】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の腹膜劣化抑制剤は、ＨＧＦ（Hepatocyte Growt
h Factor、肝細胞増殖因子）を含有することを特徴とす
る。

【００２１】本発明者は、腹膜の劣化の防止を可能とす
べく、腹膜劣化防止能を有する物質を、日夜探求してき
た。そして、様々な物質を調査し、試行錯誤を重ねた結
果、本発明者は、当初肝実質細胞増殖因子として見出さ
れた（Miyazawa, K. et al.Biochem. Biophys. Res. Co
mmun. 163, 967 (1989)）ＨＧＦが、腹膜の劣化を抑
制、防止できることを、突き止めた。このＨＧＦを含有
する腹膜劣化抑制剤を患者に投与すれば、腹膜の劣化を
抑制することが可能となる。

【００２２】なお、本明細書におけるＨＧＦには、野生
型（wild type）はもちんのこと、例えばアミノ酸残基
や糖鎖等が修飾、置換、欠損、挿入もしくは付加された
改変体、誘導体、変異体（mutant type）なども含む。

【００２３】本発明の腹膜劣化抑制剤は、ＨＧＦの他
に、さらに糖類を含有することが好ましい。この場合の
糖類には、例えば腹膜劣化抑制剤が液中に溶解している
場合、該液中に溶解している糖類を含む。後述するよう
に、本発明者は、糖類が加わると、ＨＧＦが有する細胞
活性低下防止作用が高まることを発見した。このような
糖類としては、例えば、グルコース、ガラクトース、マ
ンノース、フルクトース等の単糖類、スクロース、マル
トース、ラクトース、トレハロース等の二糖類、グリコ
ーゲン、マルトオリゴ糖、イソマルトオリゴ糖、オリゴ
グリコシルスクロース、フラクトオリゴ糖、ガラクトオ
リゴ糖等の多糖類、マルチトール、エリスリトール、キ
シリトール等の糖アルコールなどが挙げられる。

【００２４】その中でも特に、糖類としては、単糖類が
より好ましい。単糖類は、水への溶解度も高く、患部細
胞まで効率よく到達でき、しかも、細胞内に浸透しやす
い。さらにその中でも、本発明の腹膜劣化抑制剤が含有
する糖類としては、グルコースが最適である。後述する
実施例からも分かるように、腹膜劣化抑制剤がグルコー
スを含有していると、ＨＧＦの細胞活性維持作用が大き
く増大する。

【００２５】このように、腹膜劣化抑制剤が糖類を含有
する場合、腹膜劣化抑制剤は、かかる糖類を、ＨＧＦ１
ngに対して１μｇ〜１０ｇ程度含有することが好まし
く、０．１〜５００mg程度含有することがより好まし
い。糖濃度をこの範囲内とすると、ＨＧＦが有する細胞
活性低下防止作用を最も効率よく高めることができる。
なお、腹膜劣化抑制剤は、糖類を含有していなくてもよ
い。また、腹膜劣化抑制剤は、他の成分を含有していて
もよい。

【００２６】このような腹膜劣化抑制剤は、液状、すな
わち液に溶解した状態であることが好ましい。これによ
り、本発明の腹膜劣化抑制剤を、腹膜組織内（目的部
位）に効率よくデリバリーできるようになる。なお、腹
膜劣化抑制剤（ＨＧＦ）を溶解させる液としては、例え
ば、薬液（例えば、生理食塩水、Ｌｏｃｋｅ液、Ｒｉｎ
ｇｅｒ液、Ｔｙｒｏｄｅ液、Ｅａｒｌｅ液、Ｋｒｅｂｓ
液、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ液、ＰＢＳ等の等張液、腹膜透析
液、腹腔洗浄液など）、水（純水、蒸留水、滅菌水な
ど）等が挙げられる。なお、腹膜劣化抑制剤は、患者へ
の投与時に液に溶解させてもよい。また、腹膜劣化抑制
剤を、粉末、顆粒等の状態で目的部位に直接投与しても
構わない。

【００２７】本発明の腹膜劣化抑制剤は、腹腔内に直接
投与することが好ましい。腹腔内に直接投与すれば、本
発明の腹膜劣化抑制剤を、目的部位である腹膜組織に選
択的かつ効率よくデリバリーすることができる。しか
も、腹腔内に直接投与すれば、特殊なデリバリー方法を
用いて腹膜劣化抑制剤をデリバリーしなくても、効果的
に薬効が得られるようになる。また、投与後に患部に到
達するまでのＨＧＦのロスが極めて少ない。さらには、
腹腔内に直接投与すると、腹膜劣化抑制剤はしばらく腹
腔内に滞留するので、患者に対して低侵襲であり、投与
量も少なくて済む。加えて、他の臓器、生体組織に与え
る影響を最小限に留めることができる。

【００２８】腹膜劣化抑制剤を腹腔内に直接投与する方
法としては、例えば、腹膜透析液に混ぜて腹膜透析時に
腹腔内に投与する方法、液状の腹膜劣化抑制剤を、腹膜
透析用カテーテルを介し、腹腔内に直接投与する方法な
どが挙げられる。

【００２９】なお、腹膜劣化抑制剤がＲｉｎｇｅｒ液等
の等張液に溶解したものであると、等張液の浸透圧は生
体の浸透圧に近いので、生体組織に対して与える負担が
最小限のものとなる。また、腹膜劣化抑制剤が腹膜透析
液に溶解したものであると、腹膜透析を行うついでに患
者に対して腹膜劣化抑制剤を投与することができ、患者
に対して別途腹膜劣化抑制剤を投与する手間が省ける。
なお、本発明の腹膜劣化抑制剤は、例えば、腹膜透析時
に腹膜透析液に混注する形態の薬剤（粉末、液体など）
としても提供できる。

【００３０】前述したように、本発明の腹膜劣化抑制剤
は、比較的少ないＨＧＦ量で薬効が得られる。このた
め、腹膜劣化抑制剤が液に溶解している場合、かかる液
中のＨＧＦの濃度は、好ましくは例えば０．０１〜１０
００ng/mL程度とすることができ、より好ましくは例え
ば０．１〜１００ng/mL程度とすることができ、さらに
好ましくは例えば０．５〜５０ng/mL程度とすることが
できる。なお、液中のＨＧＦの濃度をこの範囲外として
も構わない。腹膜劣化抑制剤が液に溶解している場合、
かかる液のｐＨは、後述する理由と同様の理由から、例
えば、４．０〜９．０程度とすることができる。さらに
は、かかる液のｐＨは、４．５〜６．５程度とすること
ができる。後述するように、本発明の腹膜劣化抑制剤
は、液のｐＨをこのような低ｐＨにしても、好適にその
効果を発揮できる。

【００３１】なお、腹膜劣化抑制剤は、腹腔内に直接投
与しなくてもよい。例えば、本発明の腹膜劣化抑制剤
を、透析用カテーテルを介さずに、静脈注射により投与
してもよい。以上、本発明の腹膜劣化抑制剤の投与法の
例を示したが、腹膜（患部）で腹膜劣化抑制剤が作用す
れば、投与方法は特に限定はしない。

【００３２】前述したように、腹膜劣化抑制剤を腹膜透
析液に混ぜて腹膜透析時に腹腔内に投与（腹膜透析液に
配合して使用）すれば、腹膜透析を行うついでに患者に
対して腹膜劣化抑制剤を投与することができ、患者に対
して別途腹膜劣化抑制剤を投与する手間が省ける。そこ
で、以下、本願第２の発明である腹膜透析液について述
べる。

【００３３】本発明の腹膜透析液は、前述したような腹
膜劣化抑制剤を含有することを特徴とする。本発明の腹
膜透析液は、腹膜透析を行うという腹膜透析液本来の機
能に加えて、腹膜の劣化を抑制できるという効果を併せ
持つ。

【００３４】この場合、腹膜透析液中のＨＧＦの濃度
は、前記と同様の理由から、０．０１〜１０００ng/mL
程度とすることが好ましく、０．１〜１００ng/mL程度
とすることがより好ましく、０．５〜５０ng/mL程度と
することがさらに好ましい。

【００３５】このような腹膜透析液のｐＨは、例えば、
生理的に許容範囲内のもの（例えば４．０〜９．０程
度）とすることができる。ところで、腹膜透析では、一
般的に、腹膜透析液のｐＨを低くすれば低くするほど、
腹膜が劣化しやすいことが知られている。ところが、前
記腹膜劣化抑制剤は、後述するように、低ｐＨ条件下で
も腹膜組織細胞の細胞傷害保護作用と細胞活性維持作用
が好適に得られる。したがって、本発明の腹膜透析液で
は、腹膜透析液のｐＨを低くしても、前記腹膜劣化抑制
剤の薬効により、腹膜の劣化を引き起こしにくい。この
ため、本発明では、腹膜透析液のｐＨを比較的低く（例
えば４．０〜６．５程度、特に４．８〜６．０程度）し
ても、好適に腹膜の劣化を防止できる。

【００３６】腹膜透析液は、糖類を含有することが好ま
しい。前述したように、糖類が加わると、ＨＧＦの細胞
活性維持作用が高まるからである。このとき、腹膜透析
液中の糖類の濃度は、０．１〜１０W/V％程度とするこ
とが好ましく、１〜５W/V％程度とすることがより好ま
しい。糖濃度をこの範囲内とすると、腹膜透析液中のＨ
ＧＦは、腹膜劣化防止能を極めて顕著に発揮することが
でき、腹膜透析による腹膜の劣化をさらに好適に防止で
きるようになる。

【００３７】以上述べた腹膜劣化抑制剤および腹膜透析
液に用いられるＨＧＦは、例えば、以下のようにして得
ることができる。以下に示すように、遺伝子工学的手法
によりＨＧＦ遺伝子を細胞内に導入し、かかる細胞にＨ
ＧＦを産生させ、このＨＧＦを精製すると、安定かつ大
量にＨＧＦを得ることが可能である。なお、例えば医薬
品等として問題が無い純度が得られれば、本発明は、Ｈ
ＧＦの調製方法を特に限定するものではない。

【００３８】［１］まず、ＨＧＦをコードし得るＤＮＡ
（ＨＧＦ ＤＮＡ）を用意する。

【００３９】［２］次に、用意したＨＧＦ ＤＮＡを例
えばプラスミドに組み込む等して、ＨＧＦ発現用ベクタ
ーを構築する。このとき好適に用いられるベクター（プ
ラスミド）を数例例示すると、例えば、pSVL発現ベクタ
ー、pSG発現ベクター、pKCR発現ベクター、pCAGGS発現
ベクター、pAdD26SVpA発現ベクター等の哺乳動物発現用
ベクターなどが挙げられる。なお、宿主細胞中でＨＧＦ
を産生できれば、ベクターは、これらの発現ベクターに
限定はしないことは言うまでもない。

【００４０】［３］次に、得られた発現ベクターを宿主
細胞にトランスフェクションし、ＨＧＦを発現可能な形
質転換細胞を得る。この時使用する宿主細胞には、コス
(COS)1細胞、コス7細胞、チャイニーズハムスター卵巣
細胞（CHO)等の哺乳動物細胞を用いることが望ましい。
なお、活性型もしくは活性型に変換可能なＨＧＦが得ら
れれば、宿主細胞には、哺乳動物細胞以外の細胞、例え
ば、昆虫細胞、酵母、原核生物等を用いても構わない。

【００４１】好適なトランスフェクションの方法として
は、例えば、リポフェクチン（ギブコBRL社製）等のリ
ポソームを用いる方法、リン酸カルシウム法（Chen, C.
et al. Mol. Cell. Biol. 7, 2745 (1987))、DEAE-デ
キストラン法（Maes, R. et al.Biochem Biophis Acta
134, 269 (1967))、エレクトロポレーション法などが挙
げられる。トランスフェクションの方法は、発現ベクタ
ーが効率良くトランスフェクションされれば、他の方法
でもよい。以上述べた方法以外にも、例えば、バキュロ
ウィルスベクター（例えばBacPAK8やBacPAK9(東洋紡社
製）など）等のウィルスベクターを用いて形質転換細胞
を作成してもよい。本発明者はSf9等の昆虫細胞の系
で、活性を有するＨＧＦが効率良く大量に得られること
を確認している。

【００４２】［４］次に、得られた細胞（形質転換細
胞）を培養し、かかる細胞にＨＧＦを産生させる。この
場合の培地としては、MEM（ミニマムエッセンシャル培
地）、α-MEM、 RPMI1640培地、DME培地（ダルベッコ改
変イーグル培地）、F12/DME培地、フィッシャー培地、
ウイリアム培地などを例として挙げることができる。必
要に応じて、培地に添加物を加えてもよい。

【００４３】培養は、通常、３０〜４０℃くらいで、
０．１〜１０％程度の二酸化炭素存在下、１〜７日程度
行われるが、細胞が生育すれば培養条件はこれに限定し
ない。なお、培養細胞は形質転換細胞でなくてもよく、
例えば、ＨＧＦを産生する能力を元来有する細胞を培養
することにより、ＨＧＦを産生させてもよい。

【００４４】［５］培養を行った後、培養上清を回収
し、ＨＧＦを含有する試料を得る。これ以外にも、例え
ば、牛、羊、豚や蚕等のトランスジェニック生物の組
織、臓器、血液などから、ＨＧＦを含有する試料を得て
もよい。さらには、通常の生物の臓器や組織、血液など
から、ＨＧＦを含有する試料を得てもよい。

【００４５】［６］次に、試料を精製することにより、
ＨＧＦを得ることができる。例えば、クロマトグラフィ
ー法、低分子の除去操作等を行うことにより、試料を精
製することができる。この場合のクロマトグラフィー法
としては、例えば、ゲル濾過クロマトグラフィー法、Ｓ
−セファロース等のイオン交換樹脂を用いたイオン交換
クロマトグラフィー法、抗ＨＧＦ抗体、ヘパリン等のア
フィニティー担体を用いたアフィニティークロマトグラ
フィー法などが挙げられる。また、低分子の除去法とし
ては、例えば、蒸留水、リン酸緩衝液、生理食塩水等に
よる透析、限外ろ過、ゲル濾過などが挙げられる。な
お、例えば医薬品等として適切な純度のＨＧＦが得られ
れば、他の精製法でＨＧＦを精製しても構わない。

【００４６】得られたＨＧＦに適当な添加剤や補助剤を
加えてもよい。このようにして、腹膜劣化抑制剤を得る
ことができる。得られた腹膜劣化抑制剤は、例えば、フ
ィルターを用いた濾過滅菌などの除菌処理を施し、次い
でバイアル等の容器に封入（または貯留）して、保存す
ることができる。また、容器に入れた後、例えば、腹膜
劣化抑制剤を凍結乾燥等して、固体状にしてもよい。こ
れにより、腹膜劣化抑制剤の長期保存が容易となる。本
発明者は、通常の凍結乾燥では、ＨＧＦの活性が低下し
にくいことを確認している。その後、腹膜劣化抑制剤を
形成して錠剤にしてもよい。

【００４７】

【実施例】☆☆ＨＧＦの調製☆☆ 以下のようにしてＨＧＦを調製した。なお、以下に記載
の方法は、ＨＧＦの調製法の一例にすぎない。

【００４８】＜１＞ＨＧＦのｃＤＮＡの調製 ＜１．１＞まず、ＨＧＦのｃＤＮＡの塩基配列（Nature
342，440−443 (1989); Miyazawa, K. et al. Bioche
m. Biophys. Res. Commun. 163, 967 (1989)参照）を基
に、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）用のプライ
マーを合成した。具体的には、翻訳領域の５’末端（翻
訳開始点）から上流に４７〜８２番目の塩基を含む領域
（５’プライマー）と、３’末端側の終止コドンから下
流に１〜３７番目の塩基を含む領域（３’プライマー）
を基に、それぞれのプライマーを合成した。

【００４９】＜１．２＞次に、ヒト卵巣腫瘍由来細胞Ｈ
ＵＯＣＡ−III（ちなみに同様の細胞はＦＥＲＭ ＢＰ
−２３１１として寄託されている）からＳＤＳ・フェノ
ール法によりＲＮＡを調製し、このＲＮＡを鋳型として
M-MLV逆転写酵素を用いて、ｃＤＮＡを合成した。

【００５０】＜１．３＞次に、上記＜１．１＞で合成し
たＰＣＲ用のプライマーを用いてＰＣＲ法を行い、上記
＜１．２＞で合成したｃＤＮＡを増幅し、ＰＣＲ産物を
得た。

【００５１】＜１．４＞次に、このＰＣＲ産物８５μＬ
に、１０μＬの１０ｘＢａｍＨｌ反応用緩衝液（１．５
Ｍ ＮaＣl、６０ｍＭ トリス緩衝液／ｐＨ７．９、６０
ｍＭＭgＣl₂）と５μＬの制限酵素ＢａｍＨｌ（１５uni
ts／μｌ；ニッポンジーン社製）とを加えて、３７℃で
１時間保温し、ＰＣＲ産物の消化を行った。

【００５２】＜１．５＞次に、この消化物に対して、ア
ガロースゲル電気泳動を行った。その結果、約２.３Ｋ
ｂのＤＮＡ断片が１本だけ確認された。ターゲットとす
るＨＧＦ遺伝子の予想鎖長は約２．３Ｋｂである（上記
＜１．１＞に示した文献参照）から、このＤＮＡ断片が
ＨＧＦのｃＤＮＡであると考えられる。

【００５３】＜１．６＞次に、泳動ゲルから２．３Ｋｂ
のＤＮＡバンド部分を切り出し、ゲル中のＤＮＡを、Se
phaglas Band Prep Kit（アマシャムファルマシアバイ
オテク（以下単に「ファルマシア」という）社製）を用
いて精製した。これにより、ＨＧＦのｃＤＮＡを得た。

【００５４】＜２＞ＨＧＦ発現プラスミドの構築 上記＜１＞で得られたＨＧＦのｃＤＮＡをほ乳動物細胞
用発現ベクターに組み込んだ。

【００５５】まず、発現ベクターｐＣＤＬ−ＳＲα２９
６（Takebe,Y.et al. Mol. Cell. Biol. 8, 466 (198
8).）のプロモーター領域の下流にBgl2認識部位を設け
た後、この発現ベクターを制限酵素Sal1で消化した。次
に、このSal1消化断片とｐＳＧ５（フナコシ社製）のf1
oriを含むSal1消化断片とを結合させて、ｐＧＭベクタ
ーを構築した。次に、このｐＧＭベクターを制限酵素Bg
l2で消化し、この消化断片にＨＧＦのｃＤＮＡのBamH1
断片（上記＜１＞参照）を結合することにより、ｐＧＭ
／ＨＧＦベクター、すなわちＨＧＦ発現プラスミドを作
製した。

【００５６】＜３＞宿主細胞へのトランスフェクション 得られたＨＧＦ発現プラスミドを、ＤＥＡＥ―デキスト
ラン法により、ＣＯＳ１細胞にトランスフェクションし
た。まず、直径９０mmのシャーレに、６×１０⁵個のＣ
ＯＳ１細胞をまき、一晩、３７℃、５％二酸化炭素存在
下で培養した。この培養した細胞を燐酸緩衝液（ＰＢ
Ｓ）で２回洗浄した後、シャーレに５μgのｐＧＭ／Ｈ
ＧＦベクターを含む４ｍＬのＤＥＡＥ―デキストラン培
地（ＤＭＥＭ培地／５０mM トリス pH７.４／０.４ mg/
mL ＤＥＡＥ―デキストラン）を加え、３７℃で２.５時
間保温することにより、ｐＧＭ／ＨＧＦベクター、すな
わちＨＧＦ発現プラスミドを細胞内に取り込ませた。

【００５７】＜４＞形質転換細胞の培養 トランスフェクション後、得られた形質転換細胞を燐酸
緩衝液（ＰＢＳ）で２回洗浄し、シャーレに５％牛胎児
血清を含むＤＭＥＭ培地を１０ｍＬ加えた後、５％二酸
化炭素存在下、３７℃で、形質転換細胞を３日間培養し
た。

【００５８】＜５＞培養終了後、培養上清を回収した。

【００５９】＜６＞ＨＧＦの精製 回収した培養上清、すなわち試料中に含まれているＨＧ
Ｆを、ヘパリンアフィニティークロマトグラフィーによ
り精製した。

【００６０】このシステムには島津社製のLC7A型高速液
体クロマトグラフを用い、カラムにはＴＳＫ−Ｈｅｐａ
ｒｉｎ ５ＰＷカラム（東ソー）を使用した。まず、カ
ラムを０.５Ｍ塩化ナトリウム／１０mM燐酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．４、次工程および次々工程も同じ）で平衡化した
後、培養上清すなわち試料をカラムにかけ、ＨＧＦを担
体に吸着させた。次に、０.５Ｍ塩化ナトリウム／燐酸
緩衝液でカラムを洗浄した後、流速０.５mL/分、燐酸緩
衝液存在下で、６０分間かけて０.５Ｍから２.０Ｍまで
の塩濃度勾配をかけることにより、ＨＧＦを溶出させ
た。そして、溶出時間２０〜２２分の画分を、ＨＧＦ溶
出画分とした。その後、得られた溶出画分（溶出時間２
０〜２２分の画分）を、０.０１％の3-[(3-Cholamidopr
opyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate（ＣＨＡＰ
Ｓ）を含む１０mM燐酸緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で
一晩透析することにより、ＨＧＦの精製品を得た。

【００６１】得られた精製品がＨＧＦであることを、抗
ＨＧＦ抗体を用いたウエスタンブロットにより確認し
た。まず、得られた精製品に対して、Laemmliらの方法
（Laemmli. et al. Nature 277, 680 (1970)）に従い、
８.５％ポリアクリルアミドゲル上でＳＤＳポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動を行った。この時、分子量マーカ
ーとして、ウサギ筋肉由来ホスホリラーゼ（分子量９
７,４００ダルトン）、ウシ血清アルブミン（分子量６
６,２００ダルトン）、オボアルブミン（分子量４５,０
００ダルトン）を用いた。泳動終了後、ゲルを０.０１
Ｍ ３−シクロヘキシルアミノプロパンスルホン酸／１
０％メタノール（以後、ＣＡＰＳ緩衝液と称す）に浸
し、緩衝液の置換を行った。次に、このゲルの上に、予
めＣＡＰＳ緩衝液で親水化したポリビニルジフルオリド
膜（ＰＶＤＦ膜、ファルマシア社製）をかぶせ、さらに
１００mV(CV)の電圧を１.５時間かけることにより、ゲ
ル中のタンパク質を膜にブロッティングした。ブロッテ
ィング後、膜を３％ウシ血清アルブミン−ＴＴＢＳ（２
０mM Ｔｒｉｓ／０.１５Ｍ ＮａＣｌ／０.１％ Ｔｗｅ
ｅｎ２０）に浸し、室温で２時間振盪した。振盪後、膜
上にブロッティングされたタンパク質と一次抗体とを反
応させるために、２０mg/mL抗ＨＧＦ抗体（特殊免疫研
究所製）／３％ウシ血清アルブミン−ＴＴＢＳに膜を浸
し、室温で２時間振盪した。タンパク質と一次抗体とを
反応させた後、膜をＴＴＢＳで３回洗浄し、二次抗体と
反応させた。二次抗体には、アルカリフォスファターゼ
標識した抗マウス抗体（ストラタジーン社製）を３％ウ
シ血清アルブミン−ＴＴＢＳで５０００倍希釈したもの
を用いた。二次抗体との反応終了後、膜をＴＴＢＳで３
回洗浄し、picoblue immunoscreening kit(anti-mouse)
（ストラタジーン社製）により発色させた。その結果、
抗ＨＧＦ抗体と反応した分子量６６,０００ダルトンの
バンドが観察されたことから、得られた精製品がＨＧＦ
であることが確認された。

【００６２】☆☆以下、本発明を、具体的実施例に沿っ
て説明する。以下に示す実施例では、グルコース濃度が
糖濃度に対応している。以下の実施例で使用した腹膜微
小血管内皮細胞は、次のようにして用意した。まず、Ｓ
Ｄラット雄の腹膜から微小血管を摘出した。次に、かか
る微小血管から、腹膜微小血管内皮細胞を酵素法により
分離した。次に、得られた腹膜微小血管内皮細胞を、Hu
-Media-MvG（微小血管内皮細胞増殖用低血清液体培地、
クラボウ社製）を用い、ゼラチンコートプレート上に
て、３７℃、５％二酸化炭素存在下で培養した。

【００６３】（実施例１） ＨＧＦによる腹膜微小血管
内皮細胞の傷害保護作用 以下のようにして、ＨＧＦによる腹膜微小血管内皮細胞
の傷害保護作用を調べた。

【００６４】（１−１）まず、ラット腹膜微小血管内皮
細胞を、５００００細胞／穴の細胞濃度で４８穴プレー
トにまき、１０％牛胎児血清／ＤＭＥ培地で１晩培養し
た。 （１−２）次に、プレート上の細胞が７０〜８０％コン
フルエントになったことを確認した後、細胞を、試験液
で洗浄した。試験液には、腹膜透析液（バクスター社製
「PD-4 1.5」、ｐＨ５．２、グルコース濃度１．３６W/
V％）、またはリンゲル液（テルモ社製「ソルラク
ト」、ｐＨ６．８、糖不含）を用いた。

【００６５】（１−３）次に、これらの細胞を、ＨＧＦ
（腹膜劣化抑制剤）を１０ng/mL含有させた試験液に４
時間暴露した。なお、糖の量は、ＨＧＦ１ngあたりに換
算すると、それぞれ、１．３６mg（PD-4 1.5）、０ｇ
（リンゲル液）である。 （１−４）暴露後、試験液上清中の乳酸脱水素酵素（LD
H)をCytotoxity Detection kit（ロシュ・ダイアグノス
ッティックス社製）にて測定し、細胞傷害を調べた。

【００６６】得られた結果を図１に示す。さらには、比
較対照として、前記（１−３）で試験液にＨＧＦを含有
させなかった以外は前記と同様の実験を行った。これら
の結果も併せて図１に示す。

【００６７】（実施例２） ＨＧＦによる腹膜微小血管
内皮細胞の活性低下防止作用 以下のようにして、ＨＧＦによる腹膜微小血管内皮細胞
の活性低下防止作用を調べた。

【００６８】（２−１）まず、ラット腹膜微小血管内皮
細胞を、５００００細胞／穴の細胞濃度で４８穴プレー
トにまき、１０％牛胎児血清／ＤＭＥ培地で１晩培養し
た。 （２−２）次に、プレート上の細胞が７０〜８０％コン
フルエントになったことを確認した後、細胞を、試験液
で洗浄した。試験液には、腹膜透析液（テルモ社製「ぺ
リトリック135」、グルコース濃度１．３５W/V％）、腹
膜透析液（テルモ社製「ぺリトリック250」、グルコー
ス濃度２．５０W/V％）、腹膜透析液（テルモ社製「ぺ
リトリック400」、グルコース濃度４．００W/V％）、ま
たはリンゲル液（テルモ社製「ソルラクト」、糖不含）
を用いた。

【００６９】（２−３）次に、これらの細胞を、ＨＧＦ
（腹膜劣化抑制剤）を１０ng/mL含有させた試験液に３
０分間暴露した。なお、糖の量は、ＨＧＦ１ngあたりに
換算すると、それぞれ、１．３５mg（ぺリトリック13
5）、２．５０mg（ぺリトリック250）、４．００mg（ぺ
リトリック400）、０mg（リンゲル液）である。 （２−４）次に、試験液を０．３mM WST-1、０．０２mM
1-Methoxy PMSを含むフェノールレッド不含１０ng/mL
ＨＧＦ／１０％牛胎児血清／ＤＭＥ培地に交換し、培養
を継続した。

【００７０】（２−５）３時間培養後、培養上清を９６
穴プレートに１００μＬ分取し、４５０nm − ６９０nm
の吸光度を測定した。得られた結果を図２に示す。さら
には、比較対照として、前記（２−３）および（２−
４）でＨＧＦを含有させなかった以外は前記と同様の実
験を行った。また、試験液の代わりにフェノールレッド
不含ＤＭＥ培地を用いたことと、実験中（前記（２−
３）、（２−４））培地にＨＧＦを一切含有させなかっ
たこと以外は、前記と同様の実験を行った。これらの結
果も併せて図２に示す。

【００７１】（実施例３） 様々なｐＨの腹膜透析液に
対するＨＧＦによる腹膜微小血管内皮細胞の傷害保護作
用 腹膜透析液は、生理条件に比べてｐＨが低いものが多
い。そして、この低ｐＨが、腹膜透析液による血管内皮
細胞の傷害の一因と考えられる。そこで、様々なｐＨの
腹膜透析液を用いて、ＨＧＦによる腹膜微小血管内皮細
胞の傷害保護作用を調べた。

【００７２】（３−１）まず、ラット腹膜微小血管内皮
細胞を、５００００細胞／穴の細胞濃度で４８穴プレー
トにまき、１０％牛胎児血清／ＤＭＥ培地で１晩培養し
た。 （３−２）次に、プレート上の細胞が７０〜８０％コン
フルエントになったことを確認した後、細胞を、試験液
で洗浄した。試験液には、テルモ社製ぺリトリック１３
５（グルコース濃度１．３５W/V％）をベースに、ｐＨ
を４．８、５．８、６．８にそれぞれ調整した腹膜透析
液を用いた。

【００７３】（３−３）次に、これらの細胞を、ＨＧＦ
を１０ng/mL含有させた試験液に３０分間暴露した。な
お、糖の量は、ＨＧＦ１ngあたりに換算すると、すべ
て、１．３５mgである。 （３−４）次に、試験液をフェノールレッド不含１０％
牛胎児血清／ＤＭＥ培地に交換し、培養を継続した。

【００７４】（３−５）３．５時間培養後、培養上清中
のLDHをCytotoxity Detection kitにより測定し、細胞
傷害を調べた。得られた結果を図３に示す。さらには、
比較対照として、前記（３−３）で試験液にＨＧＦを含
有させなかった以外は前記と同様の実験を行った。ま
た、試験液の代わりに１０％牛胎児血清（ＦＣＳ）／Ｄ
ＭＥ培地を用い、実験中（前記（３−３））、培地にＨ
ＧＦを一切含有させなかった以外は、前記と同様にし
て、実験を行った。これらの結果も併せて図３に示す。

【００７５】（実施例４） 様々なｐＨの腹膜透析液に
対するＨＧＦによる腹膜微小血管内皮細胞の活性低下防
止作用 様々なｐＨの腹膜透析液を用いて、ＨＧＦによる腹膜微
小血管内皮細胞の活性低下防止作用を調べた。

【００７６】（４−１）まず、ラット腹膜微小血管内皮
細胞を、５００００細胞／穴の細胞濃度で４８穴プレー
トにまき、１０％牛胎児血清／ＤＭＥ培地で１晩培養し
た。 （４−２）次に、プレート上の細胞が７０〜８０％コン
フルエントになったことを確認した後、細胞を、試験液
で洗浄した。試験液には、テルモ社製ぺリトリック１３
５をベースに、ｐＨを４．８、５．８、６．８にそれぞ
れ調整した腹膜透析液を用いた。

【００７７】（４−３）次に、これらの細胞を、ＨＧＦ
を１０ng/mL含有させた試験液に３０分間暴露した。 （４−４）次に、試験液をフェノールレッド不含１０％
牛胎児血清／ＤＭＥ培地に交換し、培養を継続した。

【００７８】（４−５）３．５時間培養後、培養上清
に、上清中の濃度が０．３mMとなるようにWST-1を、上
清中の濃度が０．０２mMとなるように1-Methoxy PMS
を、それぞれ添加した。

【００７９】（４−６）次に、９６穴プレートにこの培
養上清を１００μＬ分取し、４５０nm − ６９０nmの吸
光度を測定した。得られた結果を図４に示す。さらに
は、比較対照として、前記（４−３）でＨＧＦを含有さ
せなかった以外は前記と同様の実験を行った。また、試
験液の代わりに１０％牛胎児血清／ＤＭＥ培地を用い、
実験中（前記（４−３））、培地にＨＧＦを一切含有さ
せなかった以外は、前記と同様にして、実験を行った。
これらの結果も併せて図４に示す。

【００８０】（実施例５） 急性毒性試験 非臨床試験におけるＨＧＦの毒性ＬＤ₅₀は、１mg/Kg
（ラット）以上であった。

【００８１】（まとめ）以下、結果を考察する。

【００８２】図１に示すように、ＨＧＦを含有していな
い腹膜透析液に暴露した腹膜微小血管内皮細胞では、吸
光度すなわちＬＤＨ濃度が高かった。これは、細胞が大
きな傷害を受けたことを意味する。これに対し、ＨＧＦ
を含有する腹膜透析液に暴露した細胞では、ＬＤＨ濃度
が低いものとなっていた。これは、細胞が受けた傷害が
小さいことを意味する。これらの結果から、ＨＧＦを投
与することにより、腹膜微小血管内皮細胞の傷害を抑制
できたことが確認された。

【００８３】ＨＧＦを含有していないリンゲル液に暴露
した腹膜微小血管内皮細胞では、吸光度すなわちＬＤＨ
濃度は低かった。本来リンゲル液は、浸透圧、ｐＨ、塩
濃度等が生理的条件に近いので、リンゲル液が細胞に与
えるダメージは極めて小さい。しかし、この場合でも、
ＨＧＦを投与することにより、ＬＤＨ濃度が若干低下し
た。かかる結果からも、ＨＧＦを投与することにより、
腹膜微小血管内皮細胞の傷害を抑制できることが推測で
きる。なお、かかる結果から、本発明が、リンゲル液
等、生体にダメージを与えにくいものにＨＧＦを添加す
ることを妨げるものでないことは、言うまでもない。

【００８４】ところで、腹膜透析による腹膜の劣化は、
主として、腹膜透析液により腹膜微小血管内皮細胞が傷
害を受け、腹膜微小血管が破綻することにより引き起こ
されることが知られている。

【００８５】そして、ＨＧＦを投与すれば、腹膜微小血
管内皮細胞の傷害を抑制できる。したがって、ＨＧＦを
投与すれば、腹膜微小血管内皮細胞の傷害により引き起
こされる腹膜微小血管の破綻、さらには、腹膜の劣化を
抑制できることは、容易に推察できる。

【００８６】図２に示すように、ＨＧＦを含有していな
い試験液に暴露した腹膜微小血管内皮細胞では、吸光
度、すなわちミトコンドリアデヒドロゲナーゼによりＷ
ＳＦ１から変換されるFormazan濃度が低かった。これ
は、細胞活性が低いことを意味する。これに対し、ＨＧ
Ｆを含有する腹膜透析液に暴露した細胞では、吸光度が
高くなっていた。これは、細胞の活性が高いことを意味
する。これらの結果から、ＨＧＦを投与することによ
り、腹膜微小血管内皮細胞の活性が高まることが確認さ
れた。腹膜微小血管内皮細胞の活性が高まることも、腹
膜の劣化の抑制に寄与するものと考えられる。

【００８７】特筆すべきは、糖類を含有していないリン
ゲル液に比べて、糖類を含有する腹膜透析液に細胞を暴
露した方が、ＨＧＦによる細胞の活性作用が高まってい
たことである。しかも、糖濃度が増大するにつれ、細胞
の活性も高まっていた。これに対し、ＨＧＦを含有しな
い腹膜透析液およびリンゲル液では、細胞活性はほぼ一
定であった。かかる結果から、ＨＧＦとともに糖を投与
すると、すなわちＨＧＦに糖が加わると、ＨＧＦが有す
る腹膜微小血管内皮細胞の活性を高める作用が、さらに
増大することが分かる。

【００８８】図３に示すように、ＨＧＦを含有していな
い腹膜透析液に暴露した腹膜微小血管内皮細胞では、ｐ
Ｈが低くなるにつれ、細胞傷害が大きくなっていた。こ
れに対し、ＨＧＦを含有する腹膜透析液に暴露した細胞
では、ｐＨが４．８または５．８の場合でも、細胞傷害
が小さかった。しかも、これらの細胞では、中性域（ｐ
Ｈ６．８）でＨＧＦ不含の腹膜透析液に準ずる程度にま
で、細胞傷害が抑制されていた。中性域（ｐＨ６．８）
の腹膜透析液においても、ＨＧＦを投与することによ
り、細胞傷害が若干抑制されていた。

【００８９】これらの結果から、腹膜透析液が細胞の劣
化を引き起こしやすい低ｐＨのものであっても、ＨＧＦ
を投与すれば、好適に腹膜微小血管内皮細胞の細胞傷害
を抑制できることが分かる。ゆえに、低ｐＨの腹膜透析
液でも、ＨＧＦを投与すれば、極めて好適に腹膜の劣化
を抑制できることが容易に推測できる。なお、かかる結
果から、本発明が、中性域の腹膜透析液にＨＧＦを添加
することを妨げるものでないことは、言うまでもない。

【００９０】図４に示すように、ＨＧＦを含有していな
い腹膜透析液に暴露した腹膜微小血管内皮細胞では、ｐ
Ｈが低くなるにつれ、細胞活性が低下していた。これに
対し、ＨＧＦを含有する腹膜透析液に暴露した細胞で
は、ｐＨが４．８または５．８の場合においても、細胞
活性が大きく高められていた。中性域（ｐＨ６．８）の
腹膜透析液においても、ＨＧＦを投与することにより細
胞活性が若干高められていた。これらの結果から、低ｐ
Ｈの腹膜透析液でも、ＨＧＦを投与すれば、好適に細胞
活性の低下を抑制できることが分かる。したがって、低
ｐＨの腹膜透析液でも、ＨＧＦを投与すれば、極めて好
適に腹膜の劣化を抑制できることが推測できる。

【００９１】

【発明の効果】以上述べたように、本発明によれば、腹
膜の劣化を抑制することができる。ゆえに、本発明によ
れば、腹膜透析をより長期にわたってより健全に施行す
ることが可能となる。よって、本発明は、例えば腎機能
が低下もしくは喪失した患者等に、多大な利益をもたら
すことができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例における腹膜微小血管内皮細胞の細胞傷
害の程度を示すグラフである。

【図２】実施例における腹膜微小血管内皮細胞の細胞活
性の程度を示すグラフである。

【図３】実施例における腹膜微小血管内皮細胞の細胞傷
害の程度を示すグラフである。

【図４】実施例における腹膜微小血管内皮細胞の細胞活
性の程度を示すグラフである。

フロントページの続き (72)発明者 梅山 一大 神奈川県足柄上郡中井町井ノ口1500番地 テルモ株式会社内 Ｆターム(参考） 4C077 AA06 BB01 EE03 GG09 KK01 KK11 PP21 PP29 4C084 AA02 BA44 DB62 MA05 NA14 ZA812 ZC212

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ＨＧＦ（Hepatocyte Growth Factor）を
   含有することを特徴とする腹膜劣化抑制剤。
2. 【請求項２】 さらに糖類を含有することを特徴とする
   請求項１に記載の腹膜劣化抑制剤。
3. 【請求項３】 前記糖類は、単糖類である請求項２に記
   載の腹膜劣化抑制剤。
4. 【請求項４】 前記糖類は、グルコースである請求項２
   に記載の腹膜劣化抑制剤。
5. 【請求項５】 前記糖類を、前記ＨＧＦ１ngに対して１
   μｇ〜１０ｇ含有する請求項２ないし４のいずれかに記
   載の腹膜劣化抑制剤。
6. 【請求項６】 腹膜透析液に配合して使用される請求項
   １ないし５のいずれかに記載の腹膜劣化抑制剤。
7. 【請求項７】 請求項１ないし６のいずれかに記載の腹
   膜劣化抑制剤を含有することを特徴とする腹膜透析液。
8. 【請求項８】 腹膜透析液中における前記ＨＧＦの濃度
   が、０．０１〜１０００ng/mLである請求項７に記載の
   腹膜透析液。
9. 【請求項９】 ｐＨが４．０〜９．０である請求項７ま
   たは８に記載の腹膜透析液。
10. 【請求項１０】 ｐＨが４．０〜６．５である請求項７
    ないし９のいずれかに記載の腹膜透析液。
11. 【請求項１１】 ０．１〜１０W/V％の濃度の糖類を含
    有する請求項７ないし１０のいずれかに記載の腹膜透析
    液。