JP2001218582A - メダカのビテロジェニンのみを認識する抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 メダカのビテロジェニンのみを認識する抗体
の提供。 【解決手段】 メダカのビテロジェニンのみを認識する
抗体、及び該抗体とメダカの体液中のビテロジェニンと
を反応させることを特徴とするメダカのビテロジェニン
の濃度測定方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、メダカのビテロジ
ェニンのみを認識する抗体、並びに該抗体を用いた化学
物質の毒性又は環境汚染の評価方法及びメダカの雌雄判
定方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】現在、化学物質が原因であると考えられ
ている動物の生殖異常が世界各地で観察されている。例
えば、アメリカ合衆国、フロリダ州のアポプカ湖におけ
る生殖異常に関する報告が最もよく知られている。その
調査報告によると、雄ワニのペニスが正常の１／４〜１
／２の大きさに萎縮した個体が多数発見され、その一
方、雌ワニでは、正常に比べて卵巣の多卵性ろ胞、多核
卵の形成が顕著であった。その原因は、湖畔に立地する
化学工場から出されたＤＤＴ関連物質であるジコホルと
呼ばれる物質によるものであることが判明し、ジコホル
は女性ホルモンと同様の作用を有するものであることが
分かってきた。

【０００３】このように生物の内分泌系に作用し機能を
障害する化学物質は、内分泌撹乱物質（ｅｎｄｃｒｉｎ
ｅ ｄｉｓｒｕｐｔｏｒｓ）いわゆる環境ホルモンと呼
ばれ、これまでに有機塩素化合物、ビスフェノールＡ、
有機金属化合物等が内分泌撹乱作用をもつ物質として知
られている。そして、これらの物質以外の様々な未知化
合物の中にも同様の作用をもつ物質が存在するのではな
いかと疑われている。

【０００４】本来の女性ホルモンであるエストロジェン
化合物に類似の構造を持つ化学物質は、その生体内レセ
プターへの結合を示すことで、ある種のホルモン作用を
惹起することが知られている。１９５０年〜１９７０年
に米国でＤＥＳ（合成ホルモン剤）を服用した母親から
生まれた子供に多くの生殖器異常を引き起こしたのもそ
の例である。

【０００５】しかしながら、上述した化学物質は必ずし
もエストロジェンと類似の構造でない場合も多く、内分
泌撹乱物質として予測することは非常に困難であった。

【０００６】従来、化学物質の内分泌撹乱作用を評価す
る方法として、試験管内において酵母にエストロジェン
受容体を発現させ、当該化合物がその受容体に結合する
度合を測定する方法、あるいは生体内においてマウス等
に化学物質を投与し、その生殖機能等を解析する等の方
法が採用されている。しかし、前者の試験管内における
試験方法においては、化学物質の生体内での代謝物の影
響を評価できない。また、後者の生体内における試験方
法においては、観察及び解析に大量の動物を使用し、ま
た、その解析に多大な労力を要する等、問題も多い。

【０００７】ところで、内分泌撹乱作用を有する化学物
質の存在下で魚類などを飼育すると、雌特有の卵黄蛋白
前駆物質であるビテロジェニンが雄の生体中にも誘導さ
れることが知られている（Ｓｔｅｒｏｉｄｓ １９８０
Ｍａｒ；３５（３）：３１５−３２８ 、Ｌｅ Ｍｅ
ｎｎ Ｆら）。従って、ビテロジェニンの濃度を測定す
ることによって化学物質が有する内分泌撹乱作用を評価
しようとする試みがなされてきた。しかしながら、ビテ
ロジェニンは不安定な物質であるため、高速液体クロマ
トグラフィーなどの機器分析によっては正確に測定する
ことに大きな問題があった。また、免疫学的な測定につ
いても汎用的に用いられる方法がなく、ビテロジェニン
の誘導を指標とした内分泌撹乱作用の評価方法は未だ確
立されていない。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、メダカのビ
テロジェニンのみを認識する抗体、並びに該抗体を用い
た化学物質の毒性又は環境汚染の評価方法及びメダカの
雌雄判定方法を提供することを目的とする。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するため鋭意研究を行った結果、メダカ血液中よ
り精製したビテロジェニンを抗原として用いることによ
り、体液中に存在する卵巣に由来する他の関連タンパク
質には反応せず、ビテロジェニンにのみ特異的に反応す
る抗体を作製することに成功し、本発明を完成するに至
った。

【００１０】すなわち、本発明は、メダカのビテロジェ
ニンのみを認識する抗体である。該抗体はモノクローナ
ル抗体又はポリクローナル抗体のいずれかであり、受託
番号がＦＥＲＭ Ｐ−１７６６５であるハイブリドーマ
により産生されるものが挙げられる。

【００１１】さらに、本発明は、前記モノクローナル又
はポリクローナル抗体とメダカの体液中のビテロジェニ
ンとを反応させることを特徴とする化学物質の毒性又は
環境汚染を評価する方法である。化学物質としては、例
えば内分泌撹乱作用を引き起こすものが挙げられ、環境
汚染としては、当該化学物質が原因で生じる内分泌撹乱
作用によるものが挙げられる。

【００１２】メダカ（Ｃｙｐｒｉｎｏｄｏｎｉｄａｅ）
は、トウゴロウイワシ目の一科で、熱帯から温帯地方の
淡水に住み短命である。環境の影響を受けやすく環境指
標動物と言われており、化学物質の毒性又は環境汚染を
評価する対象として適切である。またさらに、メダカは
体長が数ｍｍから大きくても数ｃｍであり、大量に生産
することも比較的可能であるため、環境評価への工業的
利用が可能である。

【００１３】さらに、本発明は、前記モノクローナル又
はポリクローナル抗体とメダカの体液中のビテロジェニ
ンとを反応させることを特徴とするメダカの雌雄判定方
法である。

【００１４】さらに、本発明は、前記モノクローナル又
はポリクローナル抗体を含む、化学物質の毒性又は環境
汚染を評価するためのキットである。

【００１５】以下、本発明を詳細に説明する。

【００１６】

【発明の実施の形態】本発明は、メダカの雌特有の卵黄
蛋白であるビテロジェニンを特異的に認識することがで
きるモノクローナル又はポリクローナル抗体に関するも
のであり、該抗体をメダカの体液中のビテロジェニンと
反応させることにより、ビテロジェニンを簡便かつ高感
度に測定することを可能とするものである。その結果、
本発明により化学物質の毒性（特に内分泌撹乱作用の強
度）を評価し、ある地域における内分泌撹乱物質の汚染
状況を把握し、さらにメダカの雌雄を判別することが可
能となる。

【００１７】本発明者らは、メダカ血清から純粋に精製
したビテロジェニンを抗原として動物を免疫することに
より、体液中に遊離して存在するビテロジェニンの他の
構成成分とは反応せず、ビテロジェニンを特異的に認識
するモノクローナル又はポリクローナル抗体が得られる
と考えた。これにより、体液中に存在する卵巣に由来す
る他の関連タンパク質の影響を受けることなく、正確に
ビテロジェニン濃度の測定が可能になるものと考えた。
また、本発明者らは、複数の魚類のビテロジェニンをス
クリーニングに用いることにより、メダカのビテロジェ
ニンを特異的に認識するモノクローナル又はポリクロー
ナル抗体を得ることができると考えた。そこで、本発明
では、メダカのビテロジェニンのみを認識する抗体を作
製するとともに、該抗体を用いて、簡便かつ正確で、高
速液体クロマトグラフィーなどに比べて高感度なビテロ
ジェニンの測定法を確立する。そして、本発明の抗体を
用いて化学物質が有する毒性（内分泌撹乱作用）の強度
を検討する。この強度は、内分泌撹乱作用を有する化学
物質により生体内のビテロジェニン濃度が有意に上昇す
るか否かを測定することにより評価することができる。

【００１８】さらに、本発明者は、ビテロジェニン濃度
を指標としてメダカの雌雄判別が可能であると考えた。
そこで、本発明では、上記モノクローナル又はポリクロ
ーナル抗体をビテロジェニンと反応させてビテロジェニ
ン濃度を測定することにより、メダカの雌雄判別法を確
立する。

【００１９】１．ビテロジェニンの調製 本発明のモノクローナル又はポリクローナル抗体を作製
するにあたり、動物を免疫するため、およびメダカのビ
テロジェニンを特異的に認識するハイブリドーマを選択
するために、純粋なビテロジェニンを調製する必要があ
る。このタンパク質は、以下のようにして調製すること
ができる。

【００２０】（１）ビテロジェニンの調製 ビテロジェニンは、卵黄に含まれるリンタンパク質の前
駆体であり、肝臓で大量に作られ血中に分泌される。本
発明においては、メダカから採取した血液を遠心分離に
かけて血清を調製し、さらに遠心分離やゲルろ過カラム
クロマトグラフィーなどを適宜組み合わせることにより
ビテロジェニンを精製することができる。

【００２１】精製されたビテロジェニンは、ビテロジェ
ニンを特異的に認識する抗体を作製するための免疫に用
いられる。また、メダカのビテロジェニンを特異的に認
識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの
スクリーニングなどにも用いられる。

【００２２】２．メダカのビテロジェニンのみを認識す
るモノクローナル又はポリクローナル抗体の作製 本発明のモノクローナル又はポリクローナル抗体は、通
常は、メダカのビテロジェニンに結合し得る抗体分子全
体を意味するが、メダカのビテロジェニンに結合し得る
限り、その断片（例えば、Ｆａｂ又はＦ（ａｂ’）₂断
片）であってもよい。

【００２３】本発明のモノクローナル又はポリクローナ
ル抗体は、種々の方法によって製造することができる。
このような抗体の製造法は当該分野で周知である［例え
ばＳａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ
（１９８９）を参照］。

【００２４】（１）抗体産生細胞の採取 前記のようにして調製したメダカのビテロジェニンを抗
原として、哺乳動物、例えばラット、マウス、ウサギな
どに投与する。抗原の動物１匹当たりの投与量は、アジ
ュバントを用いないときは０．１〜１００ｍｇであり、
アジュバントを用いるときは１〜１００μｇである。ア
ジュバントとしては、フロイント完全アジュバント（Ｆ
ＣＡ）、フロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）、水
酸化アルミニウムアジュバント等が挙げられる。免疫
は、主として静脈内、皮下、腹腔内等に注入することに
より行われる。また、免疫の間隔は特に限定されず、数
日から数週間間隔、好ましくは２〜５週間間隔で、１〜
１０回、好ましくは２〜５回免疫を行う。そして、最終
の免疫日から１〜６０日後、好ましくは１〜１４日後に
抗体産生細胞を採集する。抗体産生細胞としては、脾臓
細胞、リンパ節細胞、末梢血細胞等が挙げられるが、脾
臓細胞又は局所リンパ節細胞が好ましい。

【００２５】（２）細胞融合 ハイブリドーマを得るため、抗体産生細胞とミエローマ
細胞との細胞融合を行う。抗体産生細胞と融合させるミ
エローマ細胞として、マウスなどの動物の一般に入手可
能な株化細胞を使用することができる。使用する細胞株
は、未融合の状態ではＨＡＴ選択培地（ヒポキサンチ
ン、アミノプテリン及びチミジンを含む）中で生存でき
ず、抗体産生細胞と融合した状態でのみ生存できる薬剤
選択性を有するものが好ましい。ミエローマ細胞として
は、例えばＰ３Ｘ６３−Ａｇ．８．Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）、
ＮＳ−Ｉなどのマウスミエローマ細胞株が挙げられる。

【００２６】次に、上記ミエローマ細胞と抗体産生細胞
とを細胞融合させる。細胞融合は、血清を含まないＤＭ
ＥＭ、ＲＰＭＩ−１６４０培地などの動物細胞培養用培
地中で、１×１０⁶〜２．５×１０⁶個／ｍｌの抗体産生
細胞と２×１０⁵〜２×１０⁶個／ｍｌのミエローマ細胞
とを混合し（抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞比
５：１が好ましい）、細胞融合促進剤存在のもとで融合
反応を行う。細胞融合促進剤として、平均分子量１００
０〜６０００ダルトンのポリエチレングリコール等を使
用することができる。また、電気刺激（例えばエレクト
ロポレーション）を利用した市販の細胞融合装置を用い
て抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることも
できる。

【００２７】（３）ハイブリドーマの選別及びクローニ
ング 細胞融合処理後の細胞から目的とするハイブリドーマを
選別する。その方法として、細胞懸濁液を例えばウシ胎
児血清含有ＲＰＭＩ−１６４０培地などで適当に希釈
後、マイクロタイタープレート上に３×１０⁵個／ｗｅ
ｌｌ程度まき、各ウエルに選択培地を加え、以後適当に
選択培地を交換して培養を行う。その結果、選択培地で
培養開始後、１４日前後から生育してくる細胞をハイブ
リドーマとして得ることができる。

【００２８】次に、増殖してきたハイブリドーマの培養
上清中に、目的とする抗体が存在するか否かをスクリー
ニングする。ハイブリドーマのスクリーニングは、通常
の方法に従えばよく、特に限定されるものではない。例
えば、ハイブリドーマとして生育したウエルに含まれる
培養上清の一部を採集し、酵素免疫測定法、放射性免疫
測定法等によってスクリーニングすることができる。

【００２９】融合細胞のクローニングは、限界希釈法等
により行い、最終的にモノクローナル抗体産生細胞であ
るハイブリドーマを樹立する。

【００３０】以上のようにして、本発明のモノクローナ
ル抗体を産生するハイブリドーマとして３Ｃ１、３Ｈ５
が得られる。このうち、３Ｃ１は「Ｍｏｕｓｅ−Ｍｏｕ
ｓｅｈｙｂｒｉｄｏｍａ ３Ｃ１」と称し、工業技術院
生命工学工業技術研究所（茨城県つくば市東１丁目１番
３号）に、平成１１年１１月２９日付でＦＥＲＭＰ−１
７６６５として寄託されている。

【００３１】（４）モノクローナル抗体の採取 樹立したハイブリドーマからモノクローナル抗体を採取
する方法として、通常の細胞培養法又は腹水形成法等を
採用することができる。

【００３２】細胞培養法においては、ハイブリドーマを
１０％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ−１６４０培地、ＭＥ
Ｍ培地又は無血清培地等の動物細胞培養培地中で、通常
の培養条件（例えば３７℃、５％ＣＯ₂濃度）で７〜１
４日間培養し、その培養上清から抗体を取得する。

【００３３】腹水形成法の場合は、ミエローマ細胞由来
の哺乳動物と同種系動物の腹腔内にハイブリドーマを約
１×１０⁷個投与し、ハイブリドーマを大量に増殖させ
る。そして、１〜２週間後に腹水を採集する。

【００３４】上記抗体の採取方法において抗体の精製が
必要とされる場合は、硫安塩析法、イオン交換クロマト
グラフィー、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフ
ィーなどの公知の方法を適宜選択して、又はこれらを組
み合わせることにより精製することができる。

【００３５】本発明のモノクローナル又はポリクローナ
ル抗体は、メダカのビテロジェニンと特異的に反応する
が、コイ、マダイ、マミチョグなど他の種のビテロジェ
ニンとは反応しない性質を有する。

【００３６】また、本発明のモノクローナル抗体のサブ
タイプは、市販のタイピングキットにより調べた結果、
ＩｇＧ１である。

【００３７】３．ビテロジェニンの濃度測定方法 本発明においては、前記モノクローナル又はポリクロー
ナル抗体を用いて、メダカの体液（例えば血漿、血清、
メダカ磨砕液など）のビテロジェニンの濃度を測定（定
量）することができる。

【００３８】例えば、メダカの血清をプレートにコーテ
ィングした後、前記モノクローナル又はポリクローナル
抗体を加えて反応させる。プレートを洗浄後、さらに西
洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識した抗マウス
ＩｇＧ抗体をプレート上の本発明のモノクローナル又は
ポリクローナル抗体に結合させる。その後、発色基質を
加えて発色させ吸光度を測定することにより、試料中の
ビテロジェニン濃度を測定することができる。

【００３９】４．化学物質の毒性又は環境汚染の評価 本発明においては、前記３のようにして測定されたビテ
ロジェニンの濃度の上昇を指標として化学物質の毒性又
は環境汚染を評価することができる。

【００４０】例えば、雄のメダカを評価対象となる化学
物質の存在下で飼育した後、血液などを採取し、試料中
に含まれるビテロジェニンを本発明のモノクローナル又
はポリクローナル抗体と反応させてビテロジェニン濃度
を測定する。得られた測定値の大小により、化学物質の
毒性（例えば内分泌撹乱作用の強度）を評価することが
できる。すなわち、評価対象となる化学物質（例えばＰ
ＣＢ，ビスフェノールＡ、フタル酸エステル）の存在下
で雄のメダカを飼育し、経時的に血清中のビテロジェニ
ン濃度を測定し、対照のメダカから得られた血清中のビ
テロジェニン濃度と比較する。その結果、ビテロジェニ
ン濃度が対照と比較して高い場合は、評価対象となる化
学物質は、内分泌撹乱作用を有すると判断される。

【００４１】また、ある濃度のエストロジェン存在下で
飼育したときのビテロジェニン濃度と、評価対象となる
化学物質存在下で飼育したときのビテロジェニン濃度と
を比較することにより、評価対象となる化学物質の内分
泌撹乱作用の強度をエストロジェンと相対化して評価す
ることが可能である。すなわち、ある濃度（例えば１０
０ｐｐｍ）のエストロジェン存在下で飼育したときのビ
テロジェニン濃度が、内分泌撹乱作用の強度が不明であ
ってエストロジェンと同濃度（例えば１００ｐｐｍ）で
ある化学物質の存在下で飼育したときのビテロジェニン
濃度よりも１０分の１である場合は、当該化学物質の内
分泌撹乱作用はエストロジェンに対して１０倍強いと判
断することができる。

【００４２】なお、ビテロジェニン濃度は、前記３の方
法により測定することができる。

【００４３】５．内分泌撹乱作用を有する化学物質によ
る環境汚染状態を評価する方法本発明においては、評価
対象となる河川や湖沼などに生息する雄のメダカの体液
中のビテロジェニンを本発明のモノクローナル又はポリ
クローナル抗体と反応させてビテロジェニンの濃度を測
定することにより、内分泌撹乱作用を有する化学物質に
よるその環境の汚染状態を評価することができる。その
測定結果が対照と比較して高い場合には、何らかの内分
泌撹乱作用を有する化学物質によって、その環境が汚染
されていると判断できる。

【００４４】なお、ビテロジェニン濃度は、前記３の方
法により測定することができる。

【００４５】６．メダカの雌雄を判別する方法 本発明においては、前記のモノクローナル又はポリクロ
ーナル抗体をメダカの体液中のビテロジェニンと反応さ
せてビテロジェニン濃度を測定することにより、メダカ
の雌雄を判別することが可能である。例えば、メダカの
血液を採取し、そのビテロジェニン濃度を測定し、検出
できなければ雄、濃度が高ければ雌と判断できる。

【００４６】なお、ビテロジェニン濃度は、前記３の方
法により測定することができる。

【００４７】但し、メダカの雌雄判定をするには、化学
物質によって汚染されていない実験室又は養殖場などか
ら捕獲されたメダカを用いることが必要である。

【００４８】７．化学物質の毒性若しくは環境汚染の評
価用、又はメダカの雌雄判定用キット 本発明のモノクローナル又はポリクローナル抗体は、１
Ｍ〜１０Ｍの公知緩衝液（ｐＨ７〜８）で希釈して０．
０１μｇ／ｍｌ〜５μｇ／ｍｌの濃度にし、化学物質の
毒性若しくは環境汚染の評価用、又はメダカの雌雄判定
用キットとして用いることができる。緩衝液としては、
リン酸緩衝液、マクラーレン緩衝液、トリス緩衝液、ベ
ロナール緩衝液、グリシン緩衝液等が挙げられる。

【００４９】また、本発明のモノクローナル又はポリク
ローナル抗体を担体に固定化して使用することもでき
る。担体としては、セファロースなどが挙げられる。例
えば、本発明のモノクローナル又はポリクローナル抗体
を担体に結合させ、緩衝液中に分散させ、あるいはカラ
ムに詰めることにより使用することができる。

【００５０】

【実施例】以下、実施例により本発明をさらに具体的に
説明する。但し、本発明はこれら実施例にその技術的範
囲が限定されるものではない。

【００５１】〔実施例１〕モノクローナル抗体の調製 （１）抗原の調製 （ｉ）ビテロジェニン １７β−エストラジオール処理したメダカ個体より採取
した腹水を２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）と混合
し、同緩衝液で平衡化したＨ２カラム（４６×１００ｍ
ｍ）に添加した。２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）
と１．５Ｍ塩化ナトリウム含有−２０ｍＭトリス緩衝液
（ｐＨ８．０）とのグラディエント法により流速５ｍｌ
／分で溶出した。腹水サンプルを添加してから５分後に
得られたピークを精製ビテロジェニンとした。

【００５２】（２）動物の免疫 ０．５ ｍｇ／ｍｌの抗原（ビテロジェニン）を、等量
のフロイントアジュバントと混合してエマルジョンを作
製したのち、Ｂａｌｂ／ｃマウスの背中皮内に２００μ
ｌ／匹ずつ免疫した。２週間おきに追加免疫（２００μ
ｌ／匹）を行い、初回免疫から３回免疫した後に眼窩よ
り採血を行い、抗体価の確認を行った。

【００５３】（３）抗体価の測定 ５μｇ／ｍｌのメダカビテロジェニンを含むＰＢＳ溶液
を１００μｌ／ｗｅｌｌずつＥＬＩＳＡプレートに加
え、４℃で一晩静置し固相化した。５ｍｇ／ｍｌのＢＳ
Ａを含有するＴｗｅｅｎ−ＰＢＳを２００μｌ／ｗｅｌ
ｌ加え、室温で１時間静置しブロッキングした。この
後、１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含有するＴｗｅｅｎ−ＰＢ
Ｓで希釈した抗血清を１００μｌ／ｗｅｌｌ加え、室温
で２時間反応させた。さらに、１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを
含有するＴｗｅｅｎ−ＰＢＳで希釈したＨＲＰ標識抗マ
ウスＩｇＧヤギ抗体を１００μｇ／ｗｅｌｌ加え、室温
で１時間反応させた。

【００５４】次に、２ｍｇ／ｍｌ ＯＰＤ（ｏ−ｐｈｅ
ｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏ
ｒｉｄｅ）を１００μｌ／ｗｅｌｌ加え、室温で３分間
発色反応を行い、４９０ｎｍの吸光度をマイクロプレー
トリーダーによって測定した。

【００５５】（４）細胞融合および抗体産生ハイブリド
ーマのクローニング 抗体価の上昇が確認されたマウスの脾臓細胞とミエロー
マ細胞Ｐ３Ｕ１とを、５：１の割合でポリエチレングリ
コール法により細胞融合し、ＨＡＴ選択培地で、ハイブ
リドーマの選択培養を行った。細胞融合１０日目にハイ
ブリドーマ培養上清を回収し、抗体価の測定を行った手
法と同様の手法でＥＬＩＳＡを行い、メダカビテロジェ
ニンとの反応性が陽性である株のスクリーニングを行っ
た。

【００５６】上記スクリーニングで陽性となったハイブ
リドーマの細胞数を測定後、１個／ｗｅｌｌとなるよう
に９６ウェルプレートにまきこみ（サブクローニン
グ）、１０日後にシングルコロニーのウェルのみ再度ス
クリーニングを行った。同様にして、スクリーニングで
陽性となったハイブリドーマについて再度サブクローニ
ングを行い、性質が１００％一致するまでスクリーニン
グ操作を続けた。

【００５７】その結果、メダカビテロジェニンに対して
特異的な抗体産生細胞２株（３Ｃ１、３Ｈ５）を得た。
また、本発明のモノクローナル抗体のサブタイプは、市
販のタイピングキットによりＩｇＧ１であることを確認
した。

【００５８】なお、ハイブリドーマ３Ｃ１（名称：「Ｍ
ｏｕｓｅ−Ｍｏｕｓｅ ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ３ｃ
１」）は、工業技術院生命工学工業技術研究所（茨城県
つくば市東１丁目１番３号）に、平成１１年１１月２９
日付でＦＥＲＭ Ｐ−１７６６５として寄託されてい
る。

【００５９】〔実施例２〕本発明のモノクローナル抗体
の種特異性に関する検討 メダカビテロジェニンのみを認識する本発明のモノクロ
ーナル抗体産生細胞株３Ｃ１、３Ｈ５について、種特異
性に関して検討を行った。

【００６０】抗原として用いるメダカのビテロジェニン
は、メスの血漿から精製した。また、マダイ、マミチョ
グ、コイのビテロジェニンは、１７β−エストラジオー
ルで処理したオスの血漿でまた、コイはメスの血清で確
認した。

【００６１】５μｇ／ｍｌのそれぞれの魚種のビテロジ
ェニンを含むＰＢＳ溶液を１００μｌ／ｗｅｌｌずつＥ
ＬＩＳＡプレートに加え、４℃で一晩静置し固相化し
た。５ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含有するＴｗｅｅｎ−ＰＢ
Ｓを２００μｌ／ｗｅｌｌ加え、室温で１時間静置しブ
ロッキングした。この後、１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含有
するＴｗｅｅｎ−ＰＢＳで希釈した抗血清を１００μｌ
／ｗｅｌｌ加え、室温で２時間反応させた。さらに、１
ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含有するＴｗｅｅｎ−ＰＢＳで希
釈したＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧヤギ抗体を１００μｇ
／ｗｅｌｌ加え、室温で１時間反応させた。次に、２ｍ
ｇ／ｍｌ ＯＰＤ（ｏ−ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉ
ｎｅ ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）を１００μｌ
／ｗｅｌｌ加え、室温で３分間発色反応を行い、４９０
ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダーによって測定
した。

【００６２】その結果、本発明のモノクローナル抗体
は、メダカのビテロジェニンとは反応するが、他の種の
ビテロジェニンとは反応性を示さないことを確認した
（図１）。

【００６３】また、各種の魚から得られた血漿を７％ア
クリルアミドゲルで電気泳動を行い、ゲル上のタンパク
質をニトロセルロース膜に転写した。転写されたニトロ
セルロース膜をブロックエース（雪印乳業）中で、室温
で１時間振盪した。この後、５倍希釈ブロックエースで
希釈した抗体溶液（３Ｃ１）にニトロセルロース膜を浸
し、室温で２時間振盪した。ニトロセルロース膜を０．
０５％Ｔｗｅｅｎ含有ＰＢＳ（Ｔ−ＰＢＳ）に１０分間
振盪し、膜の洗浄を行った。さらに、Ｔ−ＰＢＳを交換
し、同様の洗浄操作を２回行った。膜の洗浄後、５倍希
釈ブロックエースで５０００倍に希釈したＨＲＰ標識抗
マウスＩｇＧヤギ抗体溶液にニトロセルロース膜を浸
し、室温で１時間振盪した。続いて、上記と同様に膜の
洗浄操作を行った。ニトロセルロース膜をトリス塩化ナ
トリウム緩衝液ですすいだ後、ＥＣＬ検出システム（ア
マシャム）を用いて、抗原抗体反応を検出した。

【００６４】その結果、本方法においても本発明のモノ
クローナル抗体は、メダカのビテロジェニンとは反応す
るが、他の種のビテロジェニンとは反応性を示さないこ
とを確認した（図２）。従って、本発明の２種のモノク
ローナル抗体産生細胞は、メダカのビテロジェニンに特
異的な抗体を産生するハイブリドーマであることが分か
った。

【００６５】〔実施例３〕ビテロジェニンの測定系の検
討 本発明のモノクローナル抗体を用いて試料中のビテロジ
ェニンを測定するため、サンドイッチＥＬＩＳＡ法を適
用した。

【００６６】すなわち、ハイブリドーマ３Ｃ１により産
生される本発明のモノクローナル抗体５μｇ／ｍｌを含
むリン酸緩衝液（ＰＢＳ）溶液を５０μｌ／ｗｅｌｌず
つ入れ、４℃で一晩コーティングした。抗体溶液を除去
した後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳ（Ｔ−ＰＢＳ）
で３回洗浄後、０．５％ＢＳＡを含むＴ−ＰＢＳで１時
間ブロッキングした。洗浄後、１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡを
含むＴｗｅｅｎ−ＰＢＳで段階希釈した精製メダカビテ
ロジェニンを５０μｌ／ｗｅｌｌずつ入れ、室温で２時
間反応させた。上記と同様の洗浄操作を３回繰り返した
後、２μｇ／ｍｌＨＲＰ標識抗メダカビテロジェニンウ
サギＩｇＧ抗体を５０μｌ／ｗｅｌｌずつ加え、室温で
１時間反応した。

【００６７】上記と同様の洗浄操作を５回繰り返した
後、２ｍｇ／ｍｌのＯＰＤ（ｏ−フェニレンジアミン）
を含むクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）を１００μｌ／ｗ
ｅｌｌずつ入れ、１５分間反応させた。反応後、２Ｎ硫
酸を５０μｌ／ｗｅｌｌ添加して反応を止め、４９０ｎ
ｍの吸光度を測定した。

【００６８】この結果、本測定系において測定限界が４
ｎｇ／ｍｌであり、高感度にメダカのビテロジェニンを
測定することが可能であることが確認された（図３）。

【００６９】〔実施例４〕水槽中に内分泌攪乱物質を暴
露したメダカの血清中ビテロジェニン濃度の測定 ヒメダカを水槽中にオス１０尾、試験群として２群お
き、それら水槽中に１７βーエストラジオールを５ｐｐ
ｍの濃度で暴露した群と暴露しない群とに分けた。

【００７０】暴露開始後、２週間後のヒメダカから血清
を分離し、それぞれの群を実施例２に記載の電気泳動法
により、血清中ビテロジェニンを検出した。その結果、
１７βーエストラジオールを暴露した群において、強い
ビテロジェニンのバンドを検出できた（図４）。

【００７１】〔実施例５〕内分泌系攪乱化学物質の生体
への影響度の測定結果 水槽にエストラジオールを０，０．０３，０．１，０．
３，１ｐｐｂの濃度となるように溶解し、雄メダカをそ
れぞれの濃度で５〜６匹ずつ、２週間飼育して暴露した
後、その血液を採取し、遠心処理後の血清を実施例２に
示す測定系で測定したところ、下記表のようにエストラ
ジオール濃度に依存して、ビテロジェニン濃度も上昇し
た。このことから、本測定系でエストロジェン様の活性
を有する内分泌系攪乱化学物質の生体への影響度を測定
できることが判明した。

【表１】 Ｎ．Ｄ 測定限界以下

【００７２】 〔実施例６〕メダカＶｇ測定用ＥＬＩＳＡキット及び使用方法の説明 （キット内容） （１）抗体固相化抗体マイクロプレート １枚 （２）メダカＶｇ標準品 ３００μＬ×２本 （３）検体希釈液 ３０ｍＬ×２本 （４）ビオチン化抗メダカＶｇ抗体（×１００） ７０μＬ×１本 （５）ＨＲＰ−ストレプトアビジン（×５００） ２０μＬ×１本 （６）基質液 １５ｍＬ×１本 （７）ＯＰＤ（オルトフェニレンジアミン） ２錠 （８）濃縮洗浄液（×２０） ３０ｍＬ×１本 （９）反応停止液 ６ｍＬ×１本

【００７３】（測定原理）メダカＶｇに特異的な抗体を
用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法（図５参照）

【００７４】（使用方法） （１）試薬調製 （イ）抗体固相化マイクロプレート アルミシートから使用するウェルだけ取り出し、洗浄液
を３００μＬ／ウェル加え、室温で１０〜６０分間静置
する。 （ロ）標準液 メダカＶｇ標準液は６４ｎｇ／ｍＬの標準液となってお
り、この原液を検体希釈液で２倍段階希釈し、３２、１
６、８、４、２、１ｎｇ／ｍＬの各濃度を調製する。 （ハ）ビオチン化抗メダカＶｇ抗体（×１００） ビオチン化抗メダカＶｇ抗体（×１００）３０μＬを検
体希釈液３ｍＬで希釈すると４８ウェル分のビオチン化
抗メダカＶｇ抗体溶液を調製することができる。 （ニ）ＨＲＰ−ストレプトアビジン（×５００） Ｐ−ストレＨＲプトアビジン（×５００）６μＬを検体
希釈液３ｍＬで希釈すると４８ウェル分のＨＲＰ−スト
レプトアビジン溶液を調製することができる。 （ホ）発色液 室温に戻した基質液６．５ｍＬにＯＰＤ錠を１錠溶解す
る。（４８ウェル分） （ヘ）洗浄液 濃縮洗浄液（×２０）を室温に戻し、塩類が沈殿してい
ないかを確かめる。濃縮洗浄液（×２０）３０ｍＬを精
製水５７０ｍＬで希釈して用いる。希釈した洗浄液は冷
蔵で１４日間安定する。

【００７５】（２）試料の調製 メダカ血清は検体希釈液にて１０倍以上に希釈して使用
する。

【００７６】（３）測定操作方法 （イ）ウェル内の洗浄液を捨て、ペーパータオルなどの
上でプレートを叩きよく水気を取り、速やかに次のステ
ップに進む。 （ロ）ウェルに標準液（６４〜０ｎｇ／ｍＬ）及び検体
を５０μＬずつ加え、室温で２時間インキュベートす
る。 （ハ）反応終了後、ウェル内の反応液を捨て、洗浄液を
少なくとも３００μＬずつ分注し、デカントで除去す
る。この操作をさらに２回繰り返した後、ペーパータオ
ルなどの上でプレートを叩きよく水気を取り、速やかに
次のステップに進む。 （ニ）各ウェルにビオチン化抗メダカＶｇ抗体を５０μ
Ｌずつ加え、室温で１時間インキュベートする。 （ホ）反応終了後、同様の洗浄操作を行う。 （ヘ）各ウェルにＨＲＰ−ストレプトアビジンを５０μ
Ｌずつ加え、室温で１時間インキュベートする。このと
き基質液を室温に戻しておく。 （ト）反応終了後、同様の洗浄操作を行う。 （チ）各ウェルに発色液を１００μＬずつ加え、室温で
５分間反応させる。 （リ）各ウェルに反応停止液を５０μＬずつ加え、酵素
反応を停止させる。各ウェルの酵素反応時間が一定にな
るよう、発色液と同様にシステマティックに添加する。 （ヌ）プレートリーダーで４９０あるいは４９２ｎｍの
吸光度」を測定する。 （ル）図６に示す標準曲線より、メダカＶｇの濃度を算
出する。

【００７７】〔実施例７〕抗メダカビテロジェニンポリ
クローナル抗体の作製 （免疫抗原の調製） 初回免疫抗原としてメダカビテロジェニンの０．６ｍｇ
をフロイントの完全アジュバント（ＦＣＡ ： Ｆｒｅ
ｕｎｄ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ａｄｊｕｖａｎｔ）と１：
１の割合にて混合し、均一エマルジョンを作製し抗原液
とする。２回目〜４回目免疫抗原としてメダカビテロジ
ェニンの０．２ｍｇをフロイント不完全アジュバント
（ＦＩＡ ： Ｆｒｅｕｎｄ ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ
ａｄｊｕｖａｎｔ）と１：１の割合にて混合し、均一エ
マルジョンを作製し抗原液とする。

【００７８】（免疫）ウサギ（日本白色種：Ｊａｐａｎ
ｅｓｅ Ｗｈｉｔｅ）の背部皮内に１ｍＬずつ、２週間
に１回の間隔で４回に渡り、数十カ所に接種する。４回
目免疫後１週間を経て、ウサギより全採血を実施し、抗
メダカビテロジェニン抗血清を得る。

【００７９】（抗メダカビテロジェニンポリクローナル
抗体の精製（ＩｇＧ精製））ＰＢＳに平衡化されたＰｒ
ｏｔｅｉｎ Ｇ アフィニティーカラム（Ａｍｅｒｓｈ
ａｍ 社）に、抗メダカビテロジェニン抗血清を加え
て、ＩｇＧ 画分を吸着させ、その他の血清成分をＰＢ
Ｓ にて洗浄する。次に吸着画分を０．１ＭＧｌｙｃｉ
ｎｅ ／ ＨＣ１ ｐＨ３．０ にて溶出する。得られ
たＩｇＧを速やかに中性に戻し、ＰＢＳにて一晩透析す
る。これを抗メダカビテロジェニンポリクローナル抗体
とする。

【００８０】

【発明の効果】（１）本発明により、メダカのビテロジ
ェニンのみを認識する抗体、並びに該抗体を用いた化学
物質の毒性の測定方法、環境汚染の評価方法及びメダカ
の雌雄判定方法が提供される。

【００８１】（２）本発明の抗体はメダカに特異的であ
り、他の卵巣に由来する関連タンパク質の影響を受けず
正確な測定が可能である。従って、本発明の抗体は、化
学物質の毒性の測定方法、環境汚染の評価方法及びメダ
カの雌雄判定方法に有用である。

【００８２】（３）メダカは環境に対して敏感ないわゆ
る環境指標動物であり、かつ狭いエリアでその大量生産
が可能であるため、化学物質の毒性や環境汚染の評価の
ための工業的利用価値が大である。

【図面の簡単な説明】

【図１】 ハイブリドーマ３Ｃ１が産生するモノクロー
ナル抗体の反応性を示す図である。

【図２】 ハイブリドーマ３Ｈ５が産生するモノクロー
ナル抗体の種特異性を示す図である。

【図３】 ハイブリドーマ３Ｃ１が産生するモノクロー
ナル抗体のサンドイッチＥＬＩＳＡ法におけるメダカの
ビテロジェニンに対する反応性を示す図である。

【図４】 水槽中に内分泌攪乱物質を暴露した雄メダカ
血清中のビテロジェニン濃度を示す図である。

【図５】 メダカＶｇに特異的な抗体を用いたサンドイ
ッチＥＬＩＳＡ法を示す説明図である。

【図６】 メダカＶｇの標準曲線を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） //(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ (72)発明者 有薗 幸司 熊本県熊本市月出３丁目１番100号 熊本 県立大学内 (72)発明者 井口 泰泉 神奈川県横浜市金沢区瀬戸22−２ 横浜市 立大学内 (72)発明者 井出 剛 熊本県上益城郡益城町田原2081−10 株式 会社クマモト抗体研究所内

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 メダカのビテロジェニンのみを認識する
   抗体。
2. 【請求項２】 前記抗体がモノクロナール抗体又はポリ
   クローナル抗体のいずれかである請求項１記載のメダカ
   のビテロジェニンのみを認識する抗体。
3. 【請求項３】 受託番号がＦＥＲＭ Ｐ−１７６６５で
   あるハイブリドーマにより産生される、メダカのビテロ
   ジェニンのみを認識する抗体。
4. 【請求項４】 請求項１ないし３のいずれかに記載の抗
   体とメダカの体液中のビテロジェニンとを反応させるこ
   とを特徴とする、メダカのビテロジェニンの濃度測定方
   法。
5. 【請求項５】 請求項１ないし３のいずれかに記載の抗
   体とメダカの体液中のビテロジェニンとを反応させ、該
   反応により測定されたビテロジェニンの濃度の上昇を指
   標として化学物質の毒性又は環境汚染を評価する方法。
6. 【請求項６】 化学物質が内分泌撹乱作用を有するもの
   である請求項５記載の化学物質の毒性又は環境汚染を評
   価する方法。
7. 【請求項７】 環境汚染が内分泌撹乱作用を有する化学
   物質によるものである請求項５記載の化学物質の毒性又
   は環境汚染を評価する方法。
8. 【請求項８】 請求項１ないし３のいずれかに記載の抗
   体とメダカの体液中のビテロジェニンとを反応させるこ
   とを特徴とするメダカの雌雄判定方法。
9. 【請求項９】 請求項１ないし３のいずれかに記載の抗
   体を含む、化学物質の毒性又は環境汚染の評価用キッ
   ト。
10. 【請求項１０】 請求項１ないし３のいずれかに記載の
    抗体を含む、メダカの雌雄判定用キット。