JP2001021525A

JP2001021525A - バイオセンサを用いた測定方法

Info

Publication number: JP2001021525A
Application number: JP11189316A
Authority: JP
Inventors: Takashi Morita; 高志森田; Nobuyuki Yoshida; 信行吉田; Minoru Kaneko; 稔金子
Original assignee: Akebono Research and Development Centre Ltd; International Center for Environmental Technology Transfer
Current assignee: Akebono Research and Development Centre Ltd; International Center for Environmental Technology Transfer
Priority date: 1999-07-02
Filing date: 1999-07-02
Publication date: 2001-01-26

Abstract

(57)【要約】【課題】バイオセンサを用いて試料溶液中の測定対象
物質の測定を行う際に、溶液の状態や測定系の影響を受
けにくく、信頼性の高い測定を行う方法を提供する。【解決手段】電極上に生体触媒を固定してなる作用極
と対極とを有する構成のバイオセンサの各電極を測定対
象物質を含有する溶液に浸漬し、この作用極と対極との
間に矩形波のパルス電圧を印加したときの両極間に流れ
る電流を計測する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、酵素や微生物など
の生体触媒が固定された作用極と対極とを有するバイオ
センサを用いた測定対象物質濃度の測定方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】バイオセンサの測定原理は、酵素などの
生体触媒を用いることにより特定の化学物質（測定対象
物質）を識別し、識別した結果を物理化学デバイスによ
り電気信号に変換することである。各種の物理化学デバ
イスがセンサのトランスデューサとして用いられるが、
中でも最も一般的なものは電極である。すなわち、生体
触媒機能を利用して測定対象の化学物質を識別する場合
には、反応により生成あるいは消費される特定の化学物
質を電極により計測する。この電極型バイオセンサで
は、電極で電気信号に変換する方式によって、ポテンシ
オメトリとアンペロメトリとに大別される。ポテンシオ
メトリでは、定電流を作用極−対極間に流したときの電
位差を、また、アンペロメトリでは、定電圧を作用極−
対極間に印加したときの電流値を、それぞれ計測する。

【０００３】上記電気化学反応の測定において、参照極
を用いて作用極の電位を設定すれば、実験毎にバラツキ
のない再現性の良いデータが得られる。この制御にポテ
ンシオスタットを使用することが多い。電極型バイオセ
ンサでは、このポテンシオスタットを用いて作用極−対
極間に定電圧を連続的に印加しておき、生体触媒と測定
対象物質による特定の反応生成物や消費物質の酸化・還
元反応を電極で行い、その際に両極間に流れる電流値の
変化を測定する方法（アンペロメトリ）が採られること
が多い。

【０００４】反応系に定電圧を印加して測定を開始する
と、作用極上では特定の反応生成物または消費物質の酸
化・還元反応が起こるため、酸化・還元電流が流れる。
この酸化・還元電流は印加直後が最も大きく時間経過と
ともに次第に減少し一定電流値に近づく。この酸化・還
元電流が一定である状態を定常状態といい、このとき、
電極反応と生体触媒反応とが定常状態になっている。従
来の電極型バイオセンサによる測定においては、この定
常状態の電流値を計測することにより、特定の反応生成
物または消費物質の定量を行う。

【０００５】しかし、この定常状態における酸化・還元
電流は、反応溶液の状態により大きな影響を受ける。す
なわち、溶液の対流や攪拌状態、温度変化などにより電
流値が変化してしまうため、安定した測定を行うことが
困難であった。また、長時間の測定では、反応生成物が
電極表面に付着することにより電極の汚れも進行するた
め、正確な測定を行うことが困難であった。

【０００６】また、上記のような電極型バイオセンサに
より測定を行う場合には、１）１種類の試料を１つのセンサで測定する２）１種類の試料を複数の同タイプのセンサで測定する３）複数の異なる試料を１つのセンサで繰り返し測定す
る４）複数の異なる試料を複数かつ同タイプのセンサで測
定する（試料の数とセンサの数が同じである）などの方法が挙げられる。

【０００７】１）の場合、測定値の信頼性を向上させる
ために、同一試料を１つのセンサで複数回繰り返し測定
することもある。この場合、測定時間が測定回数分上乗
せされるため、長くなるという欠点がある。

【０００８】２）の場合、１）と同じく測定値の信頼性
向上を目的とし、測定時間を短縮する手段として複数の
センサで同一試料を同時測定する。この場合、各センサ
間の応答特性が近似していることが測定値の信頼性向上
のための大前提である。また、この場合には、基本的に
はセンサの数だけ測定用の装置・回路も必要となる。

【０００９】３）の場合、１つのセンサで複数の試料を
測定することの長所は、応答特性が安定している点であ
る。従って、測定対象の化学物質の濃度が経時的に変化
する試料を連続測定する場合に適している。しかし、複
数の試料を断続的に測定する場合は、１）と同様に測定
時間が長くなる欠点がある。

【００１０】４）は、３）のように試料の経時変化を連
続的に測定する必要はないが、複数の試料を短時間で測
定する必要のある場合に用いられる。２）と同じく、各
センサ間の応答特性が近似していることが測定値の信頼
性向上の大前提であり、基本的にはセンサの数だけ測定
用の装置・回路も必要となる。このように、従来の測定
方法においては上記１）〜４）のいずれの場合も、測定
に時間がかかる、測定値の信頼性向上が困難である、測
定のために多くの装置や回路を必要とするなどの問題が
あった。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記観点か
らなされたものであり、バイオセンサを用いて試料溶液
中の測定対象物質の測定を行う際に、溶液の状態や測定
系の影響を受けにくく、信頼性の高い測定を行うことが
できる方法を提供することを目的とする。また、本発明
は、バイオセンサを用いて試料溶液中の測定対象物質の
複数の測定を同時に行う際に、測定時間を短縮すること
ができ、かつ、信頼性の高い測定を行うことができる方
法を提供することを目的とする。

【００１２】

【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題を
解決するために、以下のような、バイオセンサを用いた
測定方法を提供する。

【００１３】すなわち、本発明の第１の態様は、金属ま
たは炭素からなる電極上に生体触媒を固定してなる作用
極と、対極とを測定対象物質を含有する溶液に浸漬し、
この作用極と対極との間に電圧を印加したときに両極間
に流れる電流を計測することにより、前記測定対象物質
の測定を行うバイオセンサを用いた測定方法であって、
前記両極間に矩形波のパルス電圧を１回または複数回連
続して印加したときの両極間に流れる電流を計測するこ
とを特徴とする。

【００１４】すなわち、本発明によれば、作用極と対極
との間に矩形波状のパルス電圧を印加することにより、
極めて短時間の電圧の印加を行っている。これにより、
両極間に電圧が印加される時間を従来よりも大幅に短縮
することができるため、溶液や測定系の状態に影響を受
けにくい、信頼性の高い測定を行うことができる。な
お、このとき、前記パルス電圧のパルス幅は０．１〜１
０秒であることが好ましい。

【００１５】また、上記態様の方法において、前記両極
間に矩形波のパルス電圧を印加したときの両極間に流れ
る電流を計測する代わりに、両極間に矩形波のパルス電
流を流したときにこの両極間に生じる電位差を計測する
ものであってもよい。

【００１６】また、上記課題を解決するための、本発明
の第２の態様は、金属または炭素からなる電極上に生体
触媒を固定してなる作用極と、対極からなるＮ個の電極
の組を、測定対象物質を含有する試料溶液に浸漬し、こ
の作用極と対極との間に電圧を印加したときに両極間に
流れる電流を計測することにより、前記測定対象物質の
測定を行うバイオセンサを用いた測定方法であって、前
記試料溶液に前記Ｎ個の電極の組を浸漬し、前記各作用
極と対極との間に、定電圧を所定時間ずつ順次印加した
ときの各電極間に流れる電流を計測することを特徴とす
る。

【００１７】このような測定方法を用いることにより、
複数の測定を並行して行うことができるため、測定時間
を短縮することができる。

【００１８】上記第２態様の測定方法において、前記Ｎ
個の作用極には同一の生体触媒が固定されており、前記
試料溶液の数はＮであっても良い。また、前記前記Ｎ個
の作用極には異なる生体触媒が固定されており、前記試
料溶液の数は１であっても良い。

【００１９】また、上記第２態様の測定方法において、
前記Ｎ個の対極は互いに電気的に接続されていることが
好ましい。また、前記各電極の組の作用極と対極との間
に定電圧を所定時間ずつ印加する際には、同一の電源か
ら発せられた矩形波状のパルス電圧を１周期毎に前記各
電極に切り替えて印加してもよい。このとき、前記パル
ス電圧の繰り返し周期は２０秒以内であることが好まし
い。

【００２０】

【発明の実施の形態】以下、図面に基づいて、本発明の
実施の形態を説明する。

【００２１】〈第１実施形態〉本発明の第１実施形態に
よる測定方法は、金属または炭素からなる電極上に生体
触媒を固定してなる作用極と、対極とを測定対象物質を
含有する溶液に浸漬し、この作用極と対極との間に電圧
を印加したときに両極間に流れる電流を計測することに
より、前記測定対象物質の測定を行うバイオセンサを用
いた測定方法であって、前記両極間に矩形波のパルス電
圧を１回または複数回連続して印加したときの両極間に
流れる電流を計測することを特徴とする。

【００２２】（１）バイオセンサまず、本発明の第１実施形態による測定方法において用
いられるバイオセンサについて説明する。本発明で用い
られるバイオセンサは、金属または炭素からなる電極上
に生体触媒を固定してなる作用極と、対極とを測定対象
物質を含有する溶液に浸漬し、この作用極と対極との間
に電圧を印加したときに両極間に流れる電流を計測する
ことにより、前記測定対象物質の測定を行うものであ
り、従来より一般に使用されているものを用いることが
できる。すなわち、本発明においてバイオセンサとは、
測定対象物質とこの測定対象物質に対して選択的に反応
する生体触媒との間で起こる生体触媒反応によって消費
・生成する化学物質の量を電気化学的に測定することに
より、測定対象物質を測定するものであれば、特に限定
されない。ここで、生体触媒とは、測定対象物質に対し
て選択性よく反応する酵素や微生物細胞またはその破砕
物若しくは抽出物などが挙げられる。また、測定とは、
測定対象物質の検出および定量を含む。

【００２３】例えば、酵素をその基質（測定対象物質）
を含む試料溶液中に存在させると、基質が酵素と接触さ
れることにより酵素反応が生じる。この酵素反応により
消費または生成する化学物質の量は、試料溶液中の基質
の濃度に依存する。従って、酵素反応による化学物質の
消費／生成量を電気化学的に測定することにより、試料
溶液中の基質の量を定量することができる。このような
測定対象物質と酵素の組み合わせとしては、例えば、グ
ルコース濃度を測定する場合には、酵素としてグルコー
スオキシダーゼを用いることができる。このように、測
定対象物質と選択的に反応する酵素を適宜選択して用い
ることが好ましい。

【００２４】また、微生物を有機化合物を含む試料溶液
に存在させると、微生物は特定の有機化合物をエネルギ
ー獲得のために代謝する。この過程において、微生物に
よって消費される試料溶液中の溶存酸素の濃度変化、す
なわち微生物の呼吸活性変化を測定することにより、試
料溶液中の有機化合物濃度を測定することができる。ま
た、微生物が有機化合物を代謝する際に、呼吸鎖の電子
伝達系に電子の移動が起こる。この際、代謝される有機
化合物濃度と移動する電子との量には相関がある。従っ
て、この移動する電子の量、すなわち微生物の酸化還元
活性変化を測定することによって微生物の周りに存在す
る有機化合物の濃度を測定することができる。このよう
な測定対象物質と微生物との組み合わせとしては、例え
ば、グルコース濃度を測定する場合には、微生物として
シュードモナス・フルオレセンス（Pseudomonas fluore
scens）を用いることができる。また、ＢＯＤ測定の場
合には、微生物として、大腸菌、バチルス属、グルコノ
バクター属あるいはシュードモナス属に属する細菌、放
線菌などの前核微生物や、トリコスポロン属に属する酵
母等の真核微生物を挙げることができる。

【００２５】上述したような、酵素や微生物などの生体
触媒による反応において消費または生成される化学物質
の量や移動される電子の量を電気化学的に測定するため
に、上記構成を有するバイオセンサを試料溶液に浸漬
し、このバイオセンサの作用極と対極との間に矩形波状
のパルス電圧を１回または複数回連続して印加し、両極
間に流れる電流を計測する。

【００２６】作用電極は金属または炭素からなる電極上
に生体触媒を固定させたものである。金属または炭素か
らなる電極は、上述の酵素や微生物などの生体触媒によ
る反応において消費または生成される化学物質から電子
の授受を行う。また、微生物が有機化合物を代謝される
際に移動する電子を受け取る。これにより、生体触媒に
よる反応を電気信号に変換する。このような電極の材質
としては、安定であり、かつ、導電性が大きく、生体触
媒に対して実質的に無害であればよく、例えば、白金、
金、銀などの金属、またはグラファイト、カーボンなど
の炭素素材が挙げられる。このような材質のうち、測定
対象物質や生体触媒との組み合わせにより最適な素材が
選択される。また、電極の形状としては特に制限はない
が、棒状、筒状、シート状が挙げられる。

【００２７】上述の電極上に生体触媒を固定させるため
の具体的方法としては、金属電極表面に官能基を介して
生体触媒を固定する方法、生体触媒を含むゲル膜を金属
電極接着する方法、金属電極端に透析膜を被せ、金属電
極と透析膜の間に生体触媒を入れる方法などが挙げられ
る。また、生体触媒の懸濁液をアセチルセルロース等の
薄膜上で吸引濾過し、この薄膜上に生体触媒を膜状に集
菌し、アセチルセルロース膜の外側から透析膜で覆うよ
うにして金属電極に被せてもよい。また、金属電極と生
体触媒との接触面積は大きいことが好ましい。

【００２８】本発明の測定方法に用いられるバイオセン
サは、上記作用電極と対極とを有し、必要に応じてさら
に参照電極を有するものであってもよい。対極の素材と
しては、白金、金、銀、カーボン等が挙げられる。バイ
オセンサを測定対象の試料溶液に浸漬し、作用極と対極
との間に電圧を印加したときに、電極反応が進行するに
従って、電極表面での消費物質の濃度は減少し、また反
応生成物の濃度が増加するなどして対極の電極電位が設
定した値からずれてしまうことがある。そこで、Ａｇ／
ＡｇＣｌ電極などの参照電極を試料溶液に浸漬し、参照
電極を電位設定の基準として作用電極の電位を設定する
ことが好ましい。

【００２９】（２）測定方法次に、上記バイオセンサを用いた本発明の測定方法の説
明を行う。本発明の第１実施形態による測定方法は、測
定対象物質を含有する試料溶液中に上記構成のバイオセ
ンサの作用極および対極を浸漬し、この両極間に矩形波
のパルス電圧を１回または複数回連続して印加したとき
の両極間に流れる電流を計測することを特徴とする。

【００３０】パルス電圧は、直流をＯＮ／ＯＦＦするこ
とにより生ずる電圧であり、電圧が急峻に立ち上がり、
一定の時間経過した後、急峻に元に戻るものをいう。本
発明において用いられるパルス電圧は、図１（ａ）に例
示するような波形を有する矩形波（方形波ともいう）で
ある。図１（ａ）では、４００ｍＶの直流電圧を印加す
ることにより、電圧が急峻に立ち上がった状態で０．５
秒間保持された後に（これを「パルス幅」という）、印
加終了するこことにより、電圧が急峻に元に戻ってお
り、電圧の立ち上がり、立ち下がりが１秒の周期で繰り
返されている。このようなパルス電圧の周期を「繰り返
し周期」という。なお、本発明のパルス電圧は、矩形波
が１回だけ孤立して発生するようなパルス電圧（インパ
ルス）も含むが、安定した計測を行うためには、図１の
ように周期的に繰り返されるパルス電圧を用いることが
好ましい。また、矩形波は、図１（ａ）のように、その
波形が対称である（すなわち、パルス幅が繰り返し周期
の１／２である）もの以外に、パルス幅が繰り返し周期
の１／２とならない、いわゆる非対称矩形波（非対称方
形波ともいう）も含む。このようなパルス電圧の発生
は、一般のパルス発生器を用いて行うことができる。

【００３１】上記矩形波のパルス電圧を作用極と対極と
の間に印加すると、作用極上では特定の反応生成物また
は消費物質の酸化・還元反応が起こり酸化・還元電流が
流れ、図１（ｂ）のような波形の電流が得られる。図１
（ｂ）に示すように、上記パルス電圧を印加すると、両
極間に流れる電流は印加直後が最も大きく、時間経過と
ともに減少し一定電流値に近づいていく。この電流値が
一定である状態を定常状態といい、このとき、電極反応
速度および生体触媒反応速度が定常状態となっている。

【００３２】定電圧を作用極−対極間に印加したときの
両極間に流れる電流は、主に、電極表面の電気二重層を
充電するための電流（非ファラデー電流）と、反応物質
の拡散速度によってその大きさが決定される電流（拡散
律速の電流）とからなる。バイオセンサによる測定で必
要な電流値は後者、すなわち拡散律速の電流である。し
かし、この拡散律速の電流値は、溶液の状態により大き
な影響を受ける。すなわち、溶液の対流や攪拌状態、温
度変化などにより電流値が変化する。このことから、溶
液の攪拌状態等の影響を極力受けない測定を行うために
は、電圧印加後の測定時間は短い方がよい。特に、測定
時間は非ファラデー電流が終了した時点直後が理想的で
あると考えられる。それには印加後から０．１秒も要し
ないことが一般に知られている。本発明では、作用極−
対極間に矩形波のパルス電圧を印加したときの両極間に
流れる電流を計測することにより、両極間への電圧の印
加時間を極めて短くすることができるため、溶液の攪拌
状態が測定値に与える影響を受けにくい、安定した測定
を行うことができる。

【００３３】ここで、パルス電圧のパルス幅は、上記拡
散律速に対応する電流が得られる幅であればよいので、
非ファラデー過程の電流が終了するために必要十分な時
間、すなわち、０．１秒以上であればよい。好ましいパ
ルス幅は０．１〜１０秒であり、さらに好ましくは２〜
７秒である。なお、最適なパルス幅はバイオセンサの感
度や測定対象物質の種類および濃度等によって変化する
ので、パルス幅を上記範囲で変化させ、各パルス幅にお
いて両極間に流れる電流をそれぞれ測定し、好ましい電
流値を得られるときのパルス幅を選択することにより最
適なパルス幅を設定することができる。

【００３４】また、好ましいパルス電圧の大きさや繰り
返し周期も上述のような因子によって変化するため、パ
ルス電圧の条件を変化させて測定し、好ましい電流値を
得られるときの条件を選択すればよい。なお、図１
（ｂ）に示すように、パルス電圧が遮断されたとき（印
加が終了したとき）、両極間に流れる電流は急峻に立ち
下がった後に、時間経過とともに増加して一定の値（電
圧印加前の値）に近づいていく。従って、パルス電圧の
繰り返し周期が短すぎると、電圧遮断時の電流値が一定
の値になる前に次の印加が行われてしまうため好ましく
ない。

【００３５】また、上記作用極−対極間に矩形波のパル
ス電圧を印加したときの両極間に流れる電流を計測する
際には、図１（ｂ）に示すように、パルス電圧を遮断す
る直前の電流値を計測すれば、より安定な電流値を得る
ことができるため好ましい。このような電流値を計測す
るためには、オシロスコープやレコーダ等を用いて電流
の波形を観測するとよい。

【００３６】このように、本発明の測定方法を用いれ
ば、バイオセンサを用いて測定対象物質を測定する際
に、作用極と対極との間に矩形のパルス電圧を印加する
ことによって、攪拌状態や温度、振動など溶液に与えら
れる影響を低減することができる。従って、溶液の状態
を一定に保つための攪拌機構などを用いなくても、安定
した測定を行うことができる。また、本発明の測定方法
を用いれば、電圧の印加時間が短縮されるため、電極反
応による電極表面の汚れも低減させることができ、長時
間にわたって安定な測定を行うことができる。

【００３７】〈第２実施形態〉本発明の第２実施形態で
は、上記第１実施形態の測定方法を利用して、複数の測
定を短時間に、しかも装置や回路類を大幅に増加させず
に行うことができる測定方法を提供する。

【００３８】図２は、本実施形態の測定方法に用いられ
るバイオセンサの一例を示しており、（ａ）は上面図、
（ｂ）は側面図、（ｃ）は（ａ）のＡ−Ａ線に沿った断
面図を、それぞれ示している。図２に示すように、本実
施形態で用いられるバイオセンサは、基板２０上に形成
された測定セル１０と、作用極２１ａ〜２１ｃ、対極お
よび参照極２２ａ〜２２ｃとからなる複数の電極の組を
有している。測定セル１０は測定対象物質を含有する試
料溶液を入れるためのセル１０ａ，１０ｂ，１０ｃから
なり、これら各セルは各試料溶液が混合しないように、
互いに隔離されている。各セル１０ａ〜１０ｃの底部に
該当する基板２０上には、導体からなる作用極２１ａ〜
２１ｃと対極および参照極２２ａ〜２２ｃとからなる電
極の組が固定されている。作用極２１ａ〜２１ｃには、
第１実施形態で説明したような生体触媒が固定されてい
る。これら各電極の材質は、上記第１実施形態で述べた
ものを用いればよい。なお、図２では、対極と参照極と
を共通の一体で示している。以下、この対極と参照極の
組を単に「対極２２ａ〜２２ｃ」と表記する場合もあ
る。

【００３９】各作用極２１ａ〜２１ｃは、導線２３を介
して各端子ＷＥ１〜ＷＥ３にそれぞれ接続されている。
各対極２２ａ〜２２ｃも同様に、導線２３を介して各端
子ＣＥ１〜ＣＥ３にそれぞれ接続されている。端子ＷＥ
１〜ＷＥ３は、これら各端子ＷＥ１〜ＷＥ３の１個の端
子を一定時間毎に順次切り替えて電源に接続するための
切替装置を介して、矩形波のパルス電圧を発生するため
の単一の電源（図示せず）に接続されている。従って、
上記３組の作用極２１ａ〜２１ｃは電気的に互いに分離
され独立した状態となっている。この切替装置として
は、例えば半導体スイッチやリレーなど一般的なものを
用いることができる。

【００４０】各端子ＷＥ１〜ＷＥ３は、さらに、これら
各端子に流れる電流を測定するための測定器（図示せ
ず）に接続されている。なお、パルス電圧を発生する電
源としては、例えばパルス発生器を用いることができ、
また、測定器としては、オシロスコープやレコーダ等を
用いることができる。

【００４１】また、端子ＣＥ１〜ＣＥ３は、上記電源に
接続されている。これら参照極ＣＥ１〜ＣＥ３は互いに
電気的に接続された状態で電源に接続されていてもよい
し、端子ＷＥ１〜ＷＥ３と同様に、切替装置を介して上
記電源に接続されていてもよい。なお、端子ＣＥ１〜Ｃ
Ｅ３を電源に接続する際に切替装置を用いる際には、各
作用極およびこれに対応する対極が同時に電源に接続さ
れるように端子の切り替えを行う必要がある。また、各
対極２２ａ〜２２ｃが基板２０上で電気的に互いに接続
されていてもよい。

【００４２】セル１０ａ〜１０ｃの中には同一の試料溶
液が同量ずつ添加されていても良いし、濃度などが異な
る別の溶液が同量添加されていても良い。セルの数は３
に限らずさらに多くても良い。このときは、当然セルの
数に対応して電極の数も増加する。また、１つのセルに
対して複数の電極の組が固定されていてもよい。また、
図２では複数のセル１０ａ〜１０ｃが形成されている
が、これに限らず、単一のセルに複数の電極の組が固定
されていてもよい。このとき、各作用極に互いに異なる
生体触媒が固定されていれば、単一の試料溶液に対して
複数種類の測定対象物質の測定を並行して行うことがで
きる。

【００４３】また、図２においては、各作用極２１およ
び各対極２２は基板２０上に別個に形成されているが、
例えば特開平８−２２６９１０号公報や特開平１０−２
４６７１７号公報に示すように作用極と対極とが一体に
形成された構造を有するものであってもよい。

【００４４】測定は、各セル１０ａ〜１０ｃに試料溶液
を入れ、電源から発生されたパルス電圧を各作用極２１
−対極２２間に所定時間ずつ順次印加したときの各電極
間に流れる電流を計測することにより行う。

【００４５】以上のような構成により、金属または炭素
からなる電極上に生体触媒を固定してなる作用極と、対
極からなる３組の電極の組を、測定対象物質を含有する
試料溶液に浸漬し、この作用極と対極との間に電圧を印
加したときに両極間に流れる電流を計測することによ
り、前記測定対象物質の測定を行うためのバイオセンサ
が得られる。

【００４６】次に、上記構成のバイオセンサを用いた本
実施形態の測定方法を説明する。

【００４７】本発明の測定方法は、上記のように構成さ
れたバイオセンサの３個の試料溶液のそれぞれに、作用
極２１と対極２２の組を浸漬し、前記各電極の組の作用
極と対極との間に、定電圧を所定時間ずつ順次印加した
ときの各電極間に流れる電流を計測することを特徴とす
る。

【００４８】すなわち、電源から発生されたパルス電圧
は、切替装置によって切り替えられることにより、各作
用極２１−対極２２間に所定時間ずつ印加される。図３
に各セルの電極に印加される電圧の波形の例を示す。こ
の図３に示すように、電源から発生されたパルス電圧
は、第１組目の電極間に一定時間印加された後、次の１
組の電極間に同時間だけ印加されていく。本実施形態で
は、セル１０ａへの印加が終了後セル１０ｂへ印加さ
れ、セル１０ｂへの印加が終了後セル１０ｃへ印加され
て測定が終了する。従って、電源からは一定のパルス電
圧が発生されるが、２以上の作用極２１と対極（参照
極）２２との間に同時に印加されることはない。このよ
うにして、各電極の組の作用極と対極との間に定電圧が
所定時間ずつ順次印加される。このときの各電極間に流
れる電流をそれぞれ計測することにより、３つの試料溶
液の測定を行うことができる。

【００４９】第１組目の電極間（本実施形態においては
作用極２１ａ−対極２２ａ間）にパルス電圧を印加する
タイミングとしては、各セル内の化学反応が定常状態に
近くなるまで待った後印加を開始することが、安定した
測定を行うために好ましい。また、各電極へのパルス電
圧の印加時間（すなわち、各電極間への定電圧の印加時
間）は、各セルに流れる電流値を測定できる時間であれ
ば特に限定されないが、各電極間への印加時間を同一と
し、測定可能な範囲でできる限り短くすることが好まし
い。およその目安として数秒以内、できれば各１秒以内
に順次印加／印加終了／印加・・・を繰り返し、複数組
のセル内の反応が大きく異ならないようにすることが望
ましい。従って、同一の電源から発せられた矩形波状の
パルス電圧を１周期毎に前記各電極に切り替えて印加す
れば、各セルにおける測定時間のずれを防ぐことができ
るため好ましい。このとき、パルス電圧の繰り返し周期
は２０秒以内であることが好ましく、１秒以内であるこ
とがさらに好ましい。

【００５０】なお、上記したバイオセンサの装置および
回路の構成は、本発明の第２実施形態の測定方法を実現
するための一例であって、第１組目の電極間に一定電位
を一定時間印加することができ、かつ、そのとき流れる
電流値を検出でき、さらに、一定時間後に第１組目の印
加を終了した後に、第２組目、第３組目・・・の電極に
対して第１組目の電極と同一の処理を次々に行えるもの
であればよい。

【００５１】従って、本実施形態によれば、第１実施形
態の測定方法を用いて複数の試料溶液の測定を行うた
め、攪拌状態や温度、振動など溶液に与えられる影響を
低減させて安定した測定を、複数の試料溶液や測定対象
物質に対しても行うことができる。また、本実施形態で
は、単一または複数の試料溶液について複数の測定を同
時に行うことができるため、測定時間を短縮することが
できる。さらに、本実施形態では、定電位を印加する電
源の数を減少されることができ、攪拌機構を必要としな
いため、装置の小型化が可能となる。

【００５２】

【実施例】以下に、実施例を挙げて本発明を具体的に説
明するが、本発明はこれらの実施例にのみ限定されるも
のではない。

【００５３】〈実施例〉試料溶液として、１００ｍＭの
リン酸緩衝液（ｐＨ＝７）、０．１ｍＭのフェロシアン
化カリウムおよび４０ｍＭのフェリシアン化カリウムを
含む溶液を用いた。金からなる電極を作用極および対極
として、上記試料溶液に浸漬させた。ＯＰアンプを用い
て交流電源から矩形波のパルス電圧を印加できる回路を
作製し、作用極および対極をこの回路に接続した。これ
により、図１（ａ）に示すような矩形波のパルス電圧を
作用極−対極間に印加した。図示したように、このとき
のパルス電圧の高さ（印加電圧）は４００ｍＶ、パルス
幅は０．５秒、繰り返し周期は１秒であった。

【００５４】上記パルス電圧を両極間に印加したときの
電流値を、マグネティックスターラを用いて試料溶液の
攪拌を行った場合と、試料溶液の攪拌を行わない場合と
についてそれぞれ測定した。電流の測定は、パルス電圧
が遮断される直前の値を計測して行った。その結果を図
４および表１に示す。

【００５５】〈比較例〉実施例で用いた電極をポテンシ
オスタットに接続して、実施例で用いた試料溶液に浸漬
した。両極間には４００ｍＶの定電圧を連続して印加し
た。このときの両極間に流れる電流を、マグネティック
スターラを用いて試料溶液の攪拌を行った場合と、試料
溶液の攪拌を行わない場合とについてそれぞれ測定し
た。その結果を図５および表１に示す。

【００５６】

【表１】図４、５から分かるように、実施例においてパルス電圧
を用いて測定した場合は、比較例と同様の良好な応答特
性が得られた。また、表１より、比較例では攪拌の有無
により測定電流の変化が約４倍と大きく変動することに
対し、実施例では攪拌の有無による測定値への影響が１
０％と非常に小さいことが分かった。このように、パル
ス電圧を作用極−対極間に印加して測定を行う方法は、
溶液の攪拌状態に影響を受けにくい、良好な方法である
ことが分かった。

【００５７】

【発明の効果】本発明によれば、バイオセンサを用いて
試料溶液中の測定対象物質の測定を行う際に、溶液の状
態や測定系の影響を受けにくく、信頼性の高い測定を行
うことができる。また、本発明によれば、バイオセンサ
を用いて複数の試料溶液中の測定対象物質の測定を同時
に行う際に、測定時間を短縮することができ、かつ、信
頼性の高い測定を行うことができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の第１実施形態において、作用極−対
極間に印加されるパルス電圧の波形および作用極−対極
間に流れる電流の波形を示す図

【図２】本発明の第２実施形態で用いられるバイオセ
ンサの構成を示す図

【図３】本発明の第２実施形態で電源から発生される
パルス電圧および各セルの電極に印加される電圧の波形
を示す図

【図４】実施例の測定方法を用いて測定を行ったとき
の結果を示すグラフ

【図５】比較例の測定方法を用いて測定を行ったとき
の結果を示すグラフ

【符号の説明】１０測定セル２０基板２１作用極２２対極および参照極２３導線

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者吉田信行埼玉県羽生市東５丁目４番71号株式会社曙ブレーキ中央技術研究所内 (72)発明者金子稔埼玉県羽生市東５丁目４番71号株式会社曙ブレーキ中央技術研究所内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】金属または炭素からなる電極上に生体触
媒を固定してなる作用極と、対極とを測定対象物質を含
有する溶液に浸漬し、この作用極と対極との間に電圧を
印加したときに両極間に流れる電流を計測することによ
り、前記測定対象物質の測定を行うバイオセンサを用い
た測定方法であって、前記両極間に矩形波のパルス電圧
を１回または複数回連続して印加したときの両極間に流
れる電流を計測することを特徴とする測定方法。
【請求項２】前記パルス電圧のパルス幅は０．１〜１
０秒であることを特徴とする請求項１記載の測定方法。
【請求項３】金属または炭素からなる電極上に生体触
媒を固定してなる作用極と、対極からなるＮ個の電極の
組を、測定対象物質を含有する試料溶液に浸漬し、この
作用極と対極との間に電圧を印加したときに両極間に流
れる電流を計測することにより、前記測定対象物質の測
定を行うバイオセンサを用いた測定方法であって、前記
試料溶液に前記Ｎ個の電極の組を浸漬し、前記各作用極
と対極との間に、定電圧を所定時間ずつ順次印加したと
きの各電極間に流れる電流を計測することを特徴とする
測定方法。
【請求項４】前記Ｎ個の作用極には同一の生体触媒が
固定されており、前記試料溶液の数はＮであることを特
徴とする請求項３記載の測定方法。
【請求項５】前記前記Ｎ個の作用極には異なる生体触
媒が固定されており、前記試料溶液の数は１であること
を特徴とする請求項３記載の測定方法。
【請求項６】前記Ｎ個の対極は互いに電気的に接続さ
れていることを特徴とする請求項３〜５のいずれか一項
に記載の測定方法。
【請求項７】前記各電極の組の作用極と対極との間に
定電圧を所定時間ずつ印加する際には、同一の電源から
発せられた矩形波のパルス電圧を１周期毎に前記各電極
に切り替えて印加することを特徴とする請求項３〜６の
いずれか一項に記載の測定方法。
【請求項８】前記パルス電圧の繰り返し周期は２０秒
以内であることを特徴とする請求項７記載の測定方法。