JP2000514400A

JP2000514400A - メラノーマを含む固形腫瘍の診断及び治療用ベクター

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Publication number: JP2000514400A
Application number: JP09502263A
Authority: JP
Inventors: パウエレック，ジョン，エム．; バームディーズ，デビッド; ロウ，ケネス，ビー．
Original assignee: エールユニバーシティー
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1996-06-05
Publication date: 2000-10-31
Anticipated expiration: 2016-06-05
Also published as: CN1192694A; EP0833660B1; EP0833660A1; KR19990022686A; HK1017253A1; DE69636777D1; WO1996040238A1; MX9709439A; BR9609016A; KR100435932B1; IL122407A0; US6190657B1; CN1138563C; NZ312341A; US6685935B1; EP0833660A4; ATE348634T1; CA2224075C; AU719446B2; CA2224075A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、限定されるものではないが細菌、真菌及び原生生物を含む寄生生物の株である重感染した腫瘍特異的ベクターの単離及び使用に関する。ある態様において、寄生生物は、Salmonella typhimuriumなどの細菌であるSalmonella spp.、細菌であるMycobacterium avium及び原生動物であるLeishmania amazonensisを含むがこれらに限定されるものではない。他の態様において、本発明は、固形腫瘍の治療に用いるため、重感染し、腫瘍特異的な、自殺遺伝子を含有する寄生生物株の単離に関する。

Description

【発明の詳細な説明】メラノーマを含む固形腫瘍の診断及び治療用ベクター本出願は１９９５年６月７日出願の米国特許出願第08/486,422号の一部継続出願であり、該出願はその全てをここに援用する。１．発明の分野本発明は、細菌、真菌及び原生生物を含む（但しこれに限定されない）寄生生物の重感染した（super-infective）、腫瘍特異的、弱毒株の単離及び使用に関する。特定の態様では、肉腫、癌腫及びその他の固形腫瘍癌の診断及び治療用の寄生生物には、Salmonella typhimuriumなどの細菌であるSalmonella spp.、細菌であるMycobacterium avium、及び原生動物であるLeishmania amazonensisを含む。別の態様では、本発明は重感染した腫瘍特異的な自殺遺伝子を含有する寄生生物株の単離及び使用に関する。２．発明の背景第２節及び本願に記載する全ての文献の引用及び同定は、このような文献を本発明の従来技術として認めるものと解してはならない。固形腫瘍癌の化学療法の主な問題点は、腫瘍細胞を撲滅するのに十分な濃度で医薬などの治療剤を送達し、一方同時に正常細胞への損傷を最小限にすることである。従って、多くの実験室での研究は、医薬、プロドラッグ変換酵素及び／又は遺伝子を腫瘍細胞へねらって送達するための抗体、サイトカイン及びウイルスなどの生物学的送達系を設計することに向けられてきた。Houghton and Colt，1 993，New Perspectives in Cancer Diagnosis and Management 1:65-70;de Pala zzo，et al.，1992a，Cell．Immunol．142:338-347;de Palazzo et al，1992b， Cancer Res．52:5713-5719;Weiner et al.，1993a，J．Immunotherapy 13:110-1 16;Weiner et al.，1993b，J．Immunol．151:2877-2886;Adams et al.，1993，C ancer Res．53:4026-4034;Fanger et al,，1990，FASEB J．4:2846-2849;Fanger et 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6236を参照のこと。その生物的特異性のために、このような系は理論的には腫瘍に治療剤を送達できるはずである。しかしながら、抗体、サイトカイン、及びウイルスを送達系として用いる有効性を危うくするような多数の障壁が固形腫瘍への治療剤の送達には存在することが明らかとなってきた。Jain，1994，Scintific American 7:58- 65(Jain)参照。例えば、転移性腫瘍細胞を撲滅するためには治療剤は以下の要件を満足するものでなければならない。ａ）血管系を介して腫瘍まで到達する；ｂ）腫瘍に血液供給する小血管からにじみ出す；ｃ）腫瘍マトリックスを通って移動し、血液供給から遠位にある腫瘍細胞に到達する；そしてｄ）標的腫瘍細胞と効率よく相互作用する（付着、侵襲、プロドラッグの活性化など）。抗体やウイルスは腫瘍紬胞に対する特異的認識加位を発現することができるが、これらの部位に到達するには拡散や対流の力だけに依存する。Jainによると次のように記載する；『培養皿で癌細胞を破壊する薬剤は理論的には体内でもこのような細胞を殺すことができるはずである。しかしながら、残念なことに、現存する薬物類は成人によく起こる固形腫瘍による死亡数を顕著に減少できておらず、このような腫瘍には肺、乳、腸、直腸、前立腺及び脳などの癌を含む。血液中の医薬が腫瘍中の悪性細胞の攻撃を始める前に、３つの決定的仕事を成し遂げなければならない。腫瘍中の悪性細胞近くに存在する微小血管中に入る道を造り、血管から周囲のマトリックス（間質）に出ていき、そして最後にマトリックスを通って細胞に移動しなければならない。不幸なことに、腫瘍はこれらの各工程を妨げるように発生することが多い。』 Jainは、腫瘍に血液供給する血管が不規則で巻き込まれており、そのため正常な循環組織に比べて血流が制限されることが多い、と指摘している。さらに、多くの腫瘍には血流を邪魔する異常に高い間隙圧力が存在する。Jainはさらに、循環系を介して腫瘍細胞に薬剤を輸送することを支配する２つの主要な力が対流（流体の流れによる分子の輸送）及び拡散（高濃度領域から低濃度領域への分子の移動）であるとも指摘する。腫瘍には不均一に血液循環していることが多いので、腫瘍中の多くの細胞はマトリックス中の拡散プロセスによって栄養を受け取る。 Jainと共同研究者は「分子量１５０，０００ダルトンのモノクローナル抗体を連続的に供給したところ、半径１センチで測定した腫瘍中の濃度が均一になるまでに数ヶ月を要し、その中心には血液供給がなかった」ことを示すデータを得た。２．１．細菌感染と癌細菌と癌に関しては、細菌感染をした患者では癌が退行したという多数の臨床観察が歴史的総説によって明らかにされた。Nauts et al.，1953，Acta Medica ．Scandinavica 145:1-102，(Supple．276)は以下のように記載する：『細菌生成物の注入による癌の治療は、主としてレンザ球菌による急性感染後に新生物の退行が２００年以上にわたって観察されてきた、という事実に基づいている。もしも癌が進行しすぎておらず、また感染が十分な程度と期間行われていると、腫瘍は完全に消えて患者は再発することなく保たれる。』 Shear，1950，J．A．M．A，142:383-390(Shear)は、ボストン小児病院で治療しない白血病における自然軽快の７５％は急性の細菌感染後に起きたことを観察した。Shearは以下のように記載する：『病原性及び非病原性生物は、悪性疾患の顕微的病巣の造物主による制御であろうか、また感染症の制御という点で進歩をするなかで、我々は癌の造物主による制御を取り除いてしまっているのだろうか』多数の研究室によるこれに続く証拠によって、抗癌作用のうちの少なくともあるものは宿主免疫系の刺激によって仲介され、癌細胞の免疫拒絶を増強する結果となることを示唆した。例えば、Salmonellaのようなグラム陰性菌によるリポ多糖（ＬＰＳ）内毒素の放出が、マクロファージなどの宿主免疫系の細胞による腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）の放出の引き金を引く。Christ et al.，1995，Scince 26 8:80-83参照のこと。ＴＮＦ濃度の上昇が今度はサイトカインに仲介される反応のカスケードを引き起こし、腫瘍細胞の死で最高点に達する。この点では、Cars well et al.，1975，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 72:3666-3669は、ＢＤＧを接種されたマウスの血清ＴＮＦ濃度が上昇したこと、及びＴＮＦ陽性の血清がマウスに移植した肉腫MethＡ及びその他の腫瘍の壊死をもたらしたことを示した。さらに、Klimpel et al.，1990，J．Immunol．145:711-717は、Shigella及びSalmo nellaでin vitro感染した繊維芽細胞がＴＮＦに対する感受性を増加したことを示した。上述した観察の結果、ＢＣＧ接種による癌患者の免疫感作がいくつかの癌治療プロトコルで現在用いられている。ＢＤＧ治療についての総説はSosnowski，199 4，Compr．Ther．20:695-701;Barth and Morton，1995，Cancer 75(Suppl．2):7 26-734;Friberg，1993，Med．Oncol．Tumor．Pharmacother．10:31-36を参照のこと。２．２．寄生生物と癌細胞寄生生物の天然の生物特異性及び進化適合性がある時期認識され、また新しい治療法モデルとしての特定の系が示唆されてきたが、ベクターとして寄生生物を実際に用いる報告も提案もほとんどない。この点で、Pidherney et al.，1993，Cance Letters 72:91-98（Pidherney et al.）及びAlizadeh et al.，1994，Infect．Immun．62:1298-1303(Alizadeh et al.)は、病原性浮遊アメーバであるAcanthamoeba castellaniを、培養で増殖中の腫瘍細胞に加えたとき、又はヌードマウスに直接注射したときに、メラノーマを含むヒト腫瘍細胞に対して殺腫瘍性をもつことという証拠を提出した。Pidherneyらは以下のように結論している：『病原性／浮遊アメーバ及びその無細胞生成物の殺腫瘍性を薬剤耐性又は放射線耐性の腫瘍に実際に使用できる可能性については、さらに検討を要する。』しかしながら、Pidherneyらは、このような病原性／浮遊アメーバは、細菌に寄生する浮遊性生物としてか、あるいは又は生命を脅かす髄膜脳炎又は盲目性角膜炎をもたらす日和見病原体として存在しうる、とも指摘する。従って、いかなる寄生生物であっても例えばヒト腫瘍の治療ベクターとして有効であるためには、寄生生物のベクターとしての利益が患者にとって病原体となる危険性よりも大きくなければならない。従って、Pidherneyら及びAlizadehらは腫瘍細胞に対する病原性アメーバの細胞毒性を示し、さらに薬剤耐性腫瘍及び放射線耐性腫瘍の治療にこれを用いることを示唆してはいるが、これらの生物を癌患者に注入したときの固有の病原性をどう解決するかについては何も提案していない。さらに、彼らは例えば病原性アメーバの重感染した腫瘍特異性株を単離するための遺伝子選択する方法を何ら提案しておらず、またプロドラッグ変換酵素及び／又は自殺遺伝子産物の合成と分泌を誘導しうる遺伝子を含む遺伝子構築体をアメーバゲノム中に挿入することも示唆していない。同様に、Lee et al.，1992，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 89:1847-1851(Leee t al.)及びJones et al.，1992，Infect．Immun．60:2475-2480(Jones et al.) は、野生型株よりも有意に多くHEp-2（ヒト表皮癌種）細胞に侵入しうるSalmone lla typhimuriumの変異体を単離した。この”超侵入性”変異体は、通常は野生型株がHEp-2動物細胞に侵入する能力を抑制するような細菌の好気性増殖条件下で単離された。しかしながら、Leeら及びJonesらは、このような変異体を治療ベクターとして使用することを示唆しておらず、また体内の正常細胞よりもメラノーマ又はその池の癌により感染する変異体を選択することによって腫瘍特異的細菌を単離することも示唆していない。腫瘍特異性又はその他の弱毒形を用いない場合には、Leeら及びJonesらが記載するような超侵入性Salmonella typhimurium は全体に侵入性（pan-invasive）となり、癌患者に広範な感染をもたらすであろう。さらに、腫瘍特異性の選択やその他の弱毒形態を用いない場合には、このような細菌を治療ベクターに用いることは癌患者の全体感染及び敗血症ショックの危険を増大するであろう。 Pan et al.，1995，Nature Medicaine 1:471-477(Pan et al.)は、リステリアワクチンによって発現するのと同じ抗原を発現する腫瘍細胞による致死性攻撃に対してマウスを感作するのにListeria monocytogenesを用いることを記載した。さらに、抗原特異的Ｔ細胞依存的に腫瘍発生後に免役すると樹立された腫瘍の退行を示した。しかしながら、Panらは腫瘍を標的としその中で増幅する腫瘍特異的ベクターとしてListeria monocytogenesisを使用することは示していない。むしろ、Panらは、組換えListeria monocytogenesisが外来抗原を免疫系に送達し、同抗原に対する細胞仲介性の免疫を含有させる能力をもつことを示した。 Sizemore et al.，1995，Science 270:299-302(Sizemore et al.)は、ＤＮＡ仲介性の免疫のためのＤＮＡ送達担体として弱毒Shigella細菌を用いることを記載した。Sizemoreらは、Shigellaの弱毒株が培養哺乳動物細胞に侵入し、外来遺伝子を含むＤＮＡプラスミドを細胞の細胞質に送達したことを示した。この方法の結果として該哺乳動物細胞内で外来タンパク質が生産された。腸粘膜にＤＮＡを送達するためのShigellaベクターが設訃され、その他の遺伝子免疫治療戦略と同様に潜在的な経口及び粘膜ＤＮＡ感作を提供した。しかし、Sizemoreらはこのような弱毒Shigellaを腫瘍ベクターとして用いて、腫瘍を標的とし、これによって腫瘍中で遺伝子を発現させることは示唆しなかった。むしろ、Sizemoreらは経口投与と粘膜侵入後のワクチン治療に用いることを意図していた。固形腫瘍の潜在的治療ベクターとしてClostridiumが以前に研究されたことがある。絶対嫌気性菌Clostridiumの胞子が壊死組織中で発芽する性質がよく知られている。この属の病原菌が壊死組織にうまく定着すると破傷風とガス壊痘が起こる。 Parker et al.，1947,Proc．Soc．Exp．Biol．Med.pp．461．467は、マウス中で増殖する移植可能な肉腫にClostridiumhistolyticusを直接注入すると、癌溶解（oncolysis）、即ち液体化と、腫瘍の退行が起きることを始めて示した。一般に、Clostridium仲介性の癌溶解のプロセスは、急性毒性とマウスの死によって達成される。Malmgren and Flanigan，1955，Cancer Res．15:473は、乳癌腫、肝癌、及びその他の腫瘍をもつマウスがClostridium tetani胞子を静脈注入した４８時間以内に死亡したが、一方腫瘍をもたない対照動物は４０日間無症状であったことを示した。Mose and Mose，1964，Cancer Res．24:212-216(Mose a nd Mose)は、非病原性で土壌からの単離物であるClostridium butyricum Ｍ−５５株による腫瘍の定着と癌溶解について記載した。Mose and Moseは、Carey et al.，1967，Eur．J．Cancer 3:37-46が報告したように、Ｍ−５５株の胞子をヒトに投与してもヒト病原性がないことを確立した。Clostridium・ブチリカムＭ −５５株を用いて、Mose and Moseは、胞子の静脈注入は固形腫瘍として増殖することが経験的に知られているマウスエールリッヒ腹水腫瘍の癌溶解を引き起こすことを報告した。同様の方法で調製された嫌気性胞子形成性生物、例えばBaci llus mesentericus、Bacillus subtilisは、同じ条件下で癌溶解を示さなかった。Mose and Moseは、細菌が嫌気的代謝を要求するので、Clostridiumの癌溶解性は嫌気性領域に限定されると結論した。 Gericke and Engelbart，1964，Cancer Res．24:217-221は、Ｍ−５５株の胞子を静脈内注入すると多数の異なる腫瘍の顕著な溶解をもたらすことを示したが、Clostridumtr1d1Um処置した腫瘍保持動物の生存期間は、処置しない腫瘍保持動物の生存期間よりも短かった。さらに、彼らは「転移性腫瘍がかなりな大きさに達っしない場合には、器官やリンパ節における転移には効果がなかった」ことを見いだした。 Thiele et al.，1964，Cancer Res．24:222-233は、Ｍ−５５を含む多数の非病原性Clostridium種の胞子を静脈内注入すると、腫瘍組織に局在して発芽するが、マウスの正常組織には局在、発芽しないことを示した。Thiel et al.，1964 ，Cancer Res．24:234-238は、胞子治療は癌発生の初期、即ち腫瘍がまだ小さいときに投与すると効果がないことを見いだした。胞子は十分な大きさの腫瘍の癌溶解を引き起こしたが、小さい腫瘍又は転移性腫瘍には効果がなかった。癌溶解の途中で動物が定期的に死亡した。Carey et al.，1967，Eur．J．Cancer 3:37- 46は、大きな新生物には特に好ましいが、小さい腫瘍や転移は癌溶解に耐性であると結論した。従って、胞子の発芽における質的相違は新生物及び正常組織自体の性質ではないが、大きな腫瘍の塊内に見られる生理学的及び生化学的状態と関連している。最近の分子遺伝学研究は、Clostridium属の嫌気性細菌を潜在的な腫瘍ベクターとすることに焦点を当てている。Fox et al.，1996，Gene Therapy 3:173-178 は、Clostridium発現ベクターを用いてEscherichia coliシトシンデアミナーゼ遺伝子をClostridiumbeijerinckiに形質転換し、形質転換したClostridium細菌の増殖培地上清及び細胞抽出物中にシトシンデアミナーゼの活性増大を得た。このような上清をマウスＥＭＴ６癌腫の培養物に添加すると、多分それが毒性の５ −フルオロウラシルに変換されることによって、５−フルオロシトシン感受性細胞を作り出した。同様に、Minton et al.，1996，FEMS Microbil．Rev．17:357- 364は、Escherichia coliニトロレダクターゼ遺伝子をClostridium beijerincki に挿入して、Escherichia coliニトロレダクターゼ遺伝子に対する抗体を用いて in vivoネズミ腫瘍モデル中におけるこの遺伝子の発現を検出することができた。ニトロレダクターゼ遺伝子産物は有力なアルキル化剤であるＣＢ１９５４を活性化する。上述したいずれの文献（あるいは本発明者の知るその他のいずれの文献）も、絶対嫌気性Clostridium以外の微生物を固形腫瘍のための有力な治療ベクターとして用いることを示唆していない。２．３．弱毒Salmonella種 Bacon et al.，1950，Br．J．Exp．Path．31:703-713;Br．J．Exp．Path．31: 714-724;1951，Br．J．Exp．Path．32:85-96は、マウスにおける毒力についての Salmonellaの弱毒化は栄養要求変異体、即ち増殖に必要な前駆体分子の合成能をもたない変異体を用いることによって達成できることを示した。さらに特定すると、著者らはSalmonellaのプリン要求性（Ｐｕｒ^-）栄養要求株がマウスで弱毒化されることを示した。 Hoiseth and Stocker，1991，Nature 291:238-239は、芳香族アミノ酸を必要とするSalmonella typhimurium栄養要求変異体（Ａｒｏ^-）がＣ５７ＢＬマウスにおける毒力について弱毒かされることを示した。さらに、Su et al.，1992，M icrobiol．Pathogenesis 13:465-476は、Salmonella typhimurium ＳＬ３２６１の弱毒抗原保持株であるこのようなＡｒｏ変異体の１つがワクチンとして有用であることを示した。シガトキシンＢ−サブユニット／ヘモリシンＡ（Ｃ−末端）融合タンパク質が発現されて細胞外に輸送され、その結果これらの細菌を接種したマウスに抗原特異的免疫応答を生じた。 O'Callaghan et al.，1988，Infet．Immun．56:419-423は、Ａｒｏ^-でありＰｕｒ^-でもあるSalmonella typhimuriumの性状決定を行い、これらがＢＡＬＢ／ｃマウスで顕著に弱毒化するが、静脈内注入後も数週間肝臓及び脾臓に留まることを見いだした。これらは経口又は静脈内投与するとワクチンとして無効であることが見いだされた。 Johnson et al.，1991，Mol．Microbiol．5:401-407(Johnsonetal.)は、セリンプロテアーゼである熱ショック誘導可能タンパク質IIｔｒＡにおける変異によってSalmonella毒力の弱毒化が達成されることを示した。Chabalgoity et al., 1996，Mol．Mocrobiol．19:791-801は、このような弱毒化ｈｔｒＡ^- Salmonel la tyPhimuriumが生ワクチンとして有用であることを示した。しかしながら、Baconら、Hoiseth及びStocker、O'Callaghanら、Johnsonnら、Ｓｕら（1992）、Chabalgoityら（1996）のいずれも、また下記の表４に記載するいずれの研究も、このようなSalmonella typhimuriumの無毒性変異体が固形腫瘍内で生存して増殖すること、及びこのような無毒性変異体を固形腫瘍治療用のベクターとして使用できることを示唆していない。２．４．本発明の目的治療剤を固形腫瘍に送達するための多くの物理的障壁に関速する問題点が、有効な送達系の設計に明瞭かつ困難な障害をもたらす。従って、これらの障害を克服することのできる送達系を提供することが当業界で長く求められてきた。本発明の目的は、新規送達系としてのいくつかの顕著な利点（そのいくつかを以下に記載する）をもつ寄生生物のようなより進歩した生物ベクターを使用し提供すること、並びに腫瘍治療という難問にも合致すること、である。抗生物質感受性：外部から投与された抗生物質に対して感受性であることは腫瘍特異的寄生生物ベクターにとって有利である。細菌のような寄生生物は抗生物質の投与によりその宿主内で根絶できる。このような抗生物質感受性のために、治療プロトコルの終了時に癌患者体内から寄生生物を根絶することが可能となる。生物特異性：腫瘍細胞のような標的細胞に対する特異性を示すことはベクターにとって利点である。腫瘍細胞に対するベクターの特異性が高くなればなるほど、有効な治療に必要な接種量が少なくなり、そのため癌患者に対する敗血症ショック又は全体感染の危険が少なくなる。寄生生物は高度な天然の生物特異性をもち、種々の特異的認識及び侵入メカニズムを進化させてきた。（生物特異性についての一般的議論は以下の文献を参照のこと：Falkow，1991，Cell 65:1099-110 2;Tumomanen，1993，Am．Soc．Microbiol．59:292-296）。変異体の単離と遺伝子操作：腫瘍特異的な治療ベクターとして寄生生物の設計と単離を行う上で、遺伝子操作が可能なことが寄生生物の利点である。例えば、単相ゲノムと短い世代時間をもつ寄生生物、例えばSalmnella typhimuriumや腸内侵襲性Eschericha coliなどの細菌は容易に突然変異誘発を行い、その後増殖させて所望の新しい性質をもつ株を単離することができる（一般的には次の文献を参照のこと：Neidhardt et al.，(編集),1987，Escherichis coli and Salmon ella typhimurium，Cellular and Molecular Biology．American Society for M icrobiology，pp 990-1033）。さらに、遺伝子分析及びこれらの細菌中への遺伝子構築体の安定な導入は分子遺伝学における研究者には公知である。走化性：例えば、血管系の内皮細胞によって産生されるような基底膜マトリックスを通って侵入するためにベクターを刺激する、あるいは腫瘍マトリックスによって囲まれた癌細胞を探し出すためにベクターを刺激する、といった癌細胞に対する走化性応答は腫瘍特異的ベクターにとって有利である。寄生生物及び片利共生体又は相利共生体、特にEscherichiscohやSalmonellatyphimuriumなどの細菌における走化性応答よく報告されている。走化性についての総説は、Macnab， 1992，Ann．Rev．Genet．26:131-158を参照のこと。標的細胞中での複製:標的細胞中での複製能は腫瘍特異的ベクターにとって利点である。このような能力は感染した腫瘍細胞中での治療ベクター数の増幅と、ベクタ一の治療有効性の増加をもたらす。癌細胞中でベクターの子孫が周囲又は遠位の癌細胞をさらに感染し、これにより腫瘍細胞集団内のベクター数を増幅する。嫌気性及び好気性代謝：好気性又は嫌気性条件のいずれかで侵入能及び増幅能を示すことができることが腫瘍特異的ベクターの利点である。固形腫瘍は一般に血液循環された酸素に富む領域と壊死性で酸素の少ない領域を含む。これらの両方の環境で機能的であるベクターは、どちらか一方の環境でのみ機能できるベクター、例えば絶対嫌気性細菌や絶対好気性細菌よりも大きな腫瘍細胞部分に到達できる。３．発明の要約本発明は、遺伝子及び／又は遺伝子産物を標的哺乳動物細胞へ及び／又はその中へin vitro又はin vivoで送達するための組成物及び方法を提供する。遺伝子及び／又は遺伝子産物は、細菌、真菌及び原生生物を含む微生物ベクターによって送達され、これは特定な型の標的哺乳動物細胞に特異的であるように選択及び／又は遺伝子操作されている。好ましい態様では、ベクターは好気性条件及び嫌気性条件の両方で機能し、重感染した腫瘍特異的微生物であり、肉腫、癌腫、リンパ腫又はその他の固形腫瘍癌、例えば乳癌、前立腺癌、頸癌、子宮癌、肺癌、卵巣癌、精巣癌、甲状腺癌、星状細胞腫、グリオーマ、膵臓癌、胃癌、肝臓癌、結腸癌及びメラノーマを含む（但しこれに限定されない）生殖系腫瘍及び中枢神経系の腫瘍などの診断又は治療に有用である。本発明の方法に有用なベクターは、Borrelia burgdorferi，Brucella meliten sis，Escherichia coli，腸内侵襲性Escherichia coli，Legionella pneumophil a，Salmonell typhi，Salmonella typhimurium，Shigella spp.，Streptococcus spp.，Treponema pallidum，Yersinia enterocohtica，Chlamydia trachomatis ，Listeria monocytogenies，Mycobacterium avium，Mycobacterium bovis，Myc obacterium tuberculosis，BCG，Mycoplasma hominis，Rickettsiae quintana， Cryptococcus neoformans，Histoplasma capsulatum，Pneumocystis carnii，Ei meria acervulina，Neospora caninum，Plasmodium falciparum，Sarcocystis s uihominis，Toxoplasma gondii，Leishmania amazonensis，Leishmania major， Leishmania mexacana，Leptomonas karyophilus，Phytomonas spp.，Trypanasom a cruzi，Encephahtozoon cuniculi，Nosema helminthorum，Unikaryon legeri を含むが、これに限定されない。本明細書では、Salmonella typhimuriumの語は全てのSalmonella種を含む。細菌分類学の全ての受容できる基準によって、Salmonella属の様々な”種”が実際は単一の種であることが長い間認識されてきた。この単一の種は今では”Salm onella enterica”と命名されている。F．Neidhardt(編集)，Escherichia coli and Salmonella，1996，Volume I，pp．xx，ASM Press，Washington DC参照。本発明のある態様は、細菌、真菌及び原生生物性寄生生物などの微生物の重感染し、弱毒化された、腫瘍特異的変異体を単離する方法を提供する。さらに、本発明は、メラノーマや結腸癌のような悪性及び／又は転移性固形腫瘍癌の診断及び治療にこのような微生物を使用する方法を提供する。さらに、これらの変異体寄生生物は特異的遺伝子産物を発現し、そのいくつかは感染細胞の細胞質又は小胞空間中に分泌される。本発明は、重感染した標的細胞特異的微生物を単離する方法を提供する。特定の熊様では、本発明は、S．typhimuriumを含む細菌であるSalmonella spp.、細菌であるMycobacterium avium及び原生生物であるLeishmania amazonensisのような寄生生物の重感染した腫瘍特異的な株の単離と使用を提供する。腫瘍特異的ベクターには自殺遺伝子も含む。本発明のある態様は、Salmonella typhimuriumのようなSalmonella spp.の重感染した腫瘍特異的変異体の単離方法及びこれを含む組成物、及び肉腫、癌腫、メラノーマ、結腸癌及びその他の固形腫瘍癌の診断と治療にこれを使用する方法を提供する。本発明の別の態様は、自殺遺伝子を含むSalmonella spp.の重感染した腫瘍特異的変異体の単離方法及びこれを含む組成物を提供する。特定の態様では、自殺遺伝子は、単純ヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼ又はEscher ichia coli由来のシトシンデアミナーゼ又はヒトミクロソームｐ４５０酸化還元酵素である。本発明の別の態様は、原生生物であるLeishmania amazonensisの重感染した腫瘍特異的変異体の単離方法及びこれを含む組成物、及び肉腫、癌腫、メラノーマ、結腸癌及びその他の固形腫瘍癌の診断と治療にこれを使用する方法を提供する。本発明のさらに別の熊様は、細菌であるMycobacterium aviumの重感染した腫瘍特異的変異体の単離方法及びこれを含む組成物、及び肉腫、癌腫、メラノーマ、結腸癌及びその他の固形腫瘍癌の診断と治療にこれを使用する方法を促供する。本発明のさらに別の態様は、宿主、即ちベクターによって送達される遺伝子治療を受ける患者における敗血症又はその他の合併症の危険を減少するために、寄生生物ベクターの毒性を弱毒化する方法を提供する。このような方法には、寄生生物の突然変異誘発；増加した腫瘍特異性をもち、自殺遺伝子発現への増加した特異性とこれに付随する体内の正常な宿主細胞の感染能が減少した寄生生物変異体の単離；癌細胞分泌性産物に対する増強された走化性能をもつ変異体の単離；遺伝的に変更されたリポ多糖組成物をもつ変異体の単離；及び宿主体内の正常細胞ではなく、癌細胞中での寄生生物ベクターの特異的生存を達成するための変更した毒力遺伝子をもつ変異体の単離を含む。本発明はさらに、固形腫瘍癌の診断又は治療用の微生物ベクターの使用を含む。本発明は以下の定義、発明の詳細な説明、特定の態様の説明的実施例及び付属の図面を参照することによってよりよく理解できるであろう。４．定義弱毒化：微生物又はベクターの病原性が少なくなるように微生物又はベクターを修飾するという伝統的定義に加えて、弱毒化とは、低い力価の微生物又はベクターを患者に投与しても、より高い力価の親微生物又はベクターを投与したのと比較しうる結果をなお達成できるような微生物又はベクターの修飾も含む。弱毒化の最終的結果として、微生物又はベクターを患者に投与したときの毒性の危険とその他の副作用の危険が減少する。自殺遺伝子：自殺遺伝子とは、本発明のベクターによって標的細胞に送達され発現したときに、標的細胞及び／又はベクターの死を引き起こす遺伝子と定義される。重感染した：重感染ベクターとは、野生型ベクターと比較して標的細胞により容易に付着及び／又は感染することのできるベクターと定義される。接種のポピュレーション密度に依存して、標的細胞を検出可能に感染する重感染ベクターと野生型ベクターとの比は、４：１、好ましくは３０：１、より好ましくは９０：１に達する。より好ましくは重感染ベクターのみがin vitroの培養細胞で増殖する癌細胞又はin vivoの腫瘍に付着及び／又は感染するための時間をもつように、接種サイズ及び感染時間を少なくすることができる。腫瘍特異的：腫瘍特異的ベクターとは、ベクターが癌性の標的細胞に優先的に付着し、感染し、及び／又はその中で生存し続けるために、癌性の標的細胞と癌でない対となる細胞とを区別できるベクターと定義される。５．図面の簡単な説明図１．図１は、プロドラッグ転換酵素を発現するためのDNAカセットシステムを示す。それぞれの成分は、個々の成分を容易に置換することを可能にする特異的制限エンドヌクレアーゼ部位NotI、NciI、NcoI、SfiI又はPacIを含むプライマーを用いたPCRにより生成される。例えば、（A）はチミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ又はヒトミクロソームのp45O酸化還元酵素などのプロドラッグ転換酵素をコードする配列であり、（B）は誘導可能、構成的又は細胞特異的方法において活性であるプロモーターであり、（C）は、β-ラクタマーゼシグナル配列などのN-末端分泌シグナル配列であり、そして（D）は腸内侵襲性E.coliへモリシンＡシグナル配列などのC-末端分泌シグナル配列である。図２A-B．図２A-Bは、ヒトメラノーマ細胞系M2に感染しているSalmonellatyph imurium野生型株ATCC No.14028の顕微鏡写真である。図２A-Bに示される感染アッセイにおいて使用する前に、ATCC No.14028の開始集団をM2メラノーマ細胞に感染させ、回収することを10サイクル行った。図２A。感染したメラノーマ細胞の光学顕微鏡写真。図２B。細胞核(n)を示す細胞のDAPI染色、及び細胞内の多数の細菌(矢印)。図３A-C．図３A-Cは、ヒトメラノーマ細胞系M2へのSalmonella typhimurium野生型株ATCC No.14028の内面化過程中の顕微鏡写真である。図３A．宿主細胞の位相差顕微鏡写真。図３B．細菌の位置（矢印）を示す宿主細胞のDAPI染色、及び宿主細胞核(n)。図３C．細菌と、リソゾーム及び／又はメラノソームとの共局在化を示す宿主細胞の、リソゾーム糖タンパク質LAMP-1抗体染色。図４A-４Fは、転換酵素発現構築物の生成及びこれを用いた発現に関する。図４B．Salmonella typhimurium重感染クローン-72におけるβ-ラクタマーゼ分泌シグナル配列を含む、単純ヘルペスチミジンキナーゼ遺伝子の発現。図４A. 抗-TK モノクローナル抗体を用いたSalmonella typhimurium株のイムノブロツト解析。レーン１：プラスミドベクターp279のみを含む細菌；レーン２：TK(pHETK 2)の、細胞質に発現された形態を含む、株14028 野生型(CDC6516-60)(MO)；レーン３：TK(pHETK2)の、細胞質に発現された形態を含む、株14028クローン 72;レーン４：TK(p5-3)のβ-ラクタマーゼ融合形態を含む、株14028 野生型(MO)；レーン５：TK(p5-3)のβ-ラクタマーゼ融合形態を含む、株14028クローン72;レーン６:TK(p2lA-2)のβ-ラクタマーゼ融合形態を含む、株14028野生型(MO)；レーン７:TK(p21A-2)のβ-ラクタマーゼ融合形態を含む、株14028クローン72。相対分子量ｘ10³を左に示す。「ベクターのみ」の対照（レーン１）には、抗体反応は見られない。細胞質に発現されたTKが存在する各レーン（レーン２及び３）において、２つの主なイソフォームのタンパク質が見られる。リーダー配列を含む高分子量イソフォーム、及びリーダー配列がタンパク質分解で切断された低分子量イソフォームである。細菌がTK遺伝子β-ラクタマーゼシグナル配列融合（レーン4〜7）を発現する各レーンにおいて、タンパク質の２つの主なイソフォームも見られる。シグナル配列を含む高分子量イソフォーム、及びシグナル配列がタンパク質分解で切断された低分子量のイソフォームであり、これは、細胞質酵素のプロセスを受けた形態と同じ見かけ分子量である。図4B。図Aにおける各試料と関連する相対TK酵素活性。酵素活性は、標準アッセイにおいてリン酸化された¹²⁵IdCの全カウント数として示される(Summers and summers，1977，J．Virol．24:314-318)。試料のみのベクターからの細菌抽出物に存在する少量のバックグラウンドが存在する(レーン１)。有意に高いレベルのTK活性が、野生型、及びTK pHETK2の、細胞質の形態を含む重感染クローン72 に観察される(レーン２及び３)。同様のレベルが、野生型、及びTK p5-3のβ-ラクタマーゼシグナル配列融合イソフォームを含む重感染クローン72の両方に観察される(レーン４及び５)。低いレベルが、野生型、及びTK p21A-2のβ-ラクタマーゼシグナル配列融合イソフォームを含む重感染クローン72の両方に観察される（レーン６及び７）図4-Cは、異なる単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ分泌及び発現構築物の概略図である。図4-Dは、異なるヒトミクロソームのシトクロームp45O酸化還元酵素発現構築物の概略図である。図4-Eは、E.coliシトシンデアミナーゼ分泌及び発現構築物の概略図である。図4-Fは、異なる細菌により5-FUに転換された5-FCの量を示すグラフである。図5A-B．図5A-Bは、DBA/2Jマウスの皮下で増殖しているCloudman S91メラノーマ／マクロフぁージハイブリッド#48からの組織切片の顕微鏡写真である。腫瘍は、HSV TK遺伝子を保有するSalmonella typhlmurium重感染クローン#72であるクローン#72^5-3-2を3x10⁵ c.f.u.で２日前に接種されたマウスから摘出した。図 5A．ヘマトキシリン及びエオシンで染色した切片は、中央領域の壊死を有する腫瘍細胞を示す。矢印によって表示。図5B．Brown-Brenn染色（組織グラム染色）で染色した切片は、腫瘍の壊死領域にグラム陰性細菌を示す。矢印によって表示。光学顕微鏡下で観察すると、細菌は、黄色のバックグラウンドに対してピンク／紫に染まっている。図６．図６は、4x10⁶のSalmonella typhimurium重感染クローン72で42時間前にi.p.接種されたDBA/2Jマウスから摘出した、Cloudman S91メラノーマ／マクロファージハイブリッド#48の切片の電子顕微鏡写真である。顕微鏡写真中に見えるものは、２つのSalmonella typhimurium細菌である。多数のメラノソーム(m) 、メラノーマ細胞の特徴的な細胞下器官とともに、矢印によって表示。Salmonel laとこのようなメラノソームとの共局在化は、細菌がメラノーマ細胞の細胞質に存在することを示す。倍率＝21,000倍図７．図７は、C57BL/6Jマウスにおいて皮下で増殖しているB16F10メラノーマからの組織切片の顕微鏡写真である。腫瘍は、HSV TK遺伝子を保有するSalmonel la typhimurium重感染クローン#72の1.8x10⁵ c.f.u.で42時間前に接種されたマウスから摘出した。切片は、図８において詳述した電子顕微鏡で検査した同じ腫瘍からのものである。切片はBrown-Brenn染色（組織グラム染色）で染色し、腫瘍の壊死領域にグラム陰性細菌を示す。矢印によって表示。光学顕微鏡下で観察すると、細菌は、黄色のバックグラウンドに対してピンク／紫に染まっている。図８．図８は、HSV TK遺伝子を保有するSalmonella typhimurium重感染クローン#72の1.8x10⁵で42時間前にi.p.接種されたC57BL/6Jマウスから摘出した、B16F 10メラノーマ腫瘍からの切片の電子顕微鏡写真である。切片は、図７において詳述した光学顕微鏡で検査した同じ腫瘍からのものである。顕微鏡写真により、細胞外空間(矢印によって表示)、及び壊死の領域に多数のSalmonella typhimuriumが示される。死にかけているメラノーマ細胞の細胞質に単一の細菌も見られる。死にかけているメラノーマ細胞の細胞質にはまた、B16F10メラノーマに特徴的な多数の黒いメラノソーム(m)が含まれる。倍率＝9,750倍図９A-D.図９A-Dは、DBA/2Jマウスにおいて、種々の処理条件下でのCloudman S91メラノーマ／マクロファージハイブリッド#48腫瘍の増殖を示す。マウスを、 3x10⁵のメラノーマ細胞で横腹領域にi.C.接種した。腫瘍は8-10後には触知可能となり、何匹かのマウスに、HSV TK遺伝子を保有するSalmonella typhimurium重感染クローン#72をさらに接種した。細菌接種24時間後、マウスのいくつかの群に、2.0mgのガンシクロビルをさらにi.p.接種した。ガンシクロビルの接種は、５日の期間に渡って６回繰り返した。ポイントは、示された日における処置群あたり２〜５匹のマウスでの腫瘍のカリパス測定を表わす。mmでの測定値は、各腫瘍の長さ、幅及び高さからなり、体積をmm³で計算した。マウスの各グループに関する平均腫瘍体積は、処置の初日である０日を100%として定義した(図9A)。対照マウス：Salmonellaなし；ガンシクロビルなし(図９B)。ガンシクロビルのみ;(図9C)。Salmonellaのみ;(図９D)。Salmonella＋ガンシクロビル。図10A-B．図10Aは対照マウスを示し、図10BはSalmonella typhimuriumに感染した(7B)DBA/2Jマウスを示す。マウスを、Cloudman S91メラノーマ／マクロファージハイブリッド#48腫瘍細胞で接種(s.c.)した。触知できる腫瘍が明らかとなったところで、何匹かのマウスに、HSV TK遺伝子を含有するSalmonella typhimu riumクローン72(クローン#72^5-3-1)の3x10⁵ c.f.uを接種し(i.p.)、10日間自由に摂食摂飲させた。次に、マウスの飲料水中にさらに数日、抗生物質サルファトリム(Sulfatrim^TM)を処方し、そして写真を撮影した。描かれたマウスにおける腫瘍は、Salmonella処置及び未処置ケージ中のマウスにおいて、腫瘍進行の通常の段階の典型であった。図11A-11Hは、in vitro及びin vivoにおける腫瘍細胞に対するガンシクロビルの効果に関する。図11A-B．図11A-Bは、対照(図11A)及びSalmonella typhimurium感染(図11B)DB A/2Jマウスを示す。マウスを、Cloudman S91メラノーマ／マクロファージハイブリッド#48腫瘍細胞で接種(s.c.)した。触知できる腫瘍が明らかとなったところで、何匹かのマウスに、HSV TK遺伝子を含有するSalmonella typhimuri umクローン#72(クローン#72^5-3-2)の3x10⁵ c.f.uを接種した。対照及びSalmonel la感染マウスに、2.0mgのガンシクロビルを、４日の期間に渡って全部で５回注射(i.p.)した。次に、マウスの飲料水中にさらに数日、抗生物質サルファトリム (Sulfatrim^TM)を処方し、そして写真を撮影した。描かれたマウスは、Salmonell a処置及び未処置ケージ中のいずれのマウスにおいても、腫瘍進行の通常の段階の典型であった。図11(C-E)は、Salmonella typhimuriumクローン YS7211(図11-1A)、クローン YS7213(図11-1B)、及びクローン YS72l2(図11-1C)を接種又は接種しないマウスにおける、B16F10メラノーマの増殖に対するガンシクロビルの効果を示す。図11-Fは、10μg/ml又は25μｇ/mlのガンシクロビルの存在又は不存在下において、単層培養でのB16F10メラノーマ細胞の増殖を示すグラフである。図11-Gは、HSVチミジンキナーゼ遺伝子を保有するSalmonella typhimuriumクローン YS7211、YS721l/p5-3をガンシクロビルと共に又はガンシクロビルなしで接種した後のマウスにおいて、B16F10メラノーマの増殖に対するガンシクロビルの効果を示すグラフである。図11-Hは、HSVチミジンキナーゼ遺伝子 YS7211/p5-3を保有するSalmonella ty phimuriumクローン YS7211、YS7211/p5-3を接種した後のマウスにおいて、B16F1 0メラノーマの増殖に対するガンシクロビルの全量の効果を示すグラフである。図12A-Bは、電子顕微鏡写真である。図12Aは、BALB/c nu/nuマウスから摘出したHCT 116ヒト結腸腫瘍からの切片の電子顕微鏡写真である。マウスに、HSVTK遺伝子を保有するSalmonella typhimurium重感染クローン#72、クローン#72^5-3-2 の2.8x10⁵ c.f.u.を72時間前にi.p.接種した。顕微鏡写真には、腫瘍と会合した好中球の細胞質に多数のSalmonella typhimuriumが示される。いくつかの細菌は、矢印で示すように分裂を受けている。好中球又は多形核白血球は、その多分葉核(n)によって特徴づけられる(倍率＝21,000倍)。図12-Bは、単一細胞（恐らく好中球、上部左に見られる）内に含まれるのと同様、細胞外空間において多数のSalmonella typhimurium(矢印によって表示)を示す電子顕微鏡写真である。また、視野には、細胞残骸と共に、大きな細胞内空間によって示されるように死にかけていると思われる２つの未同定細胞も見られる。図13．図13A-Bは、ヒトメラノーマ細胞系M2へのLeishmania amazonensisの接着を示す。図13A.細胞に接着した寄生生物(矢印)を示す位相差顕微鏡写真。図13B．寄生生物DNA(矢印)を示すDAPI染色、及び宿主細胞核(n)。図14．図14A-Cは、ヒトメラノーマ細胞系M2への内在化の過程中におけるLeish mania amazonensisの顕微鏡写真である。図14A．宿主細胞に侵入しているLeishm ania trypomastigote(矢印)の位相差顕微鏡写真。図14B．寄生生物(矢印)、及び宿主細胞核(n)の位置を示すDAPI染色。図14C．細菌とリソゾームとの共局在化を示す、宿主細胞のリソゾーム糖タンパク質LAMP-1抗体染色。図15A-D．図15A-Cは、グルコースのみを添加した最小Medium56、グルコースにアデニン、ビタミンB1、イソロイシン、バリン及びウラシルを添加したMedium56 、又は腫瘍抽出物(10%)のみを添加したMedium56における、Salmonella typhimur iumクローン72及びクローン YS7212の増殖を示すグラフである。図15-Dは、培養中のヒトM2メラノーマ細胞中に侵入した後のSalmonella typhi muriumクローン72及び YS72l2の増殖を示すグラフである。図16A-Dは、Salmonella typhimurium株 YS72l(図16-A)、YS7213(図16-B)、YS7 211(図16-C)及びYS7212(図16-D)を接種又は接種しないC57B6マウスにおけるB16F 10メラノーマの増殖を示すグラフである。図17は、CDと5-フルオロシトシンとの組み合わせが、動物をシトシンデアミナーゼ発現構築物YS7212/pCD-Sec1を保有する腫瘍特異的ベクターで感染したときにB16F10肺転移を有する動物の生存を長くすることを示すグラフである。図18は、野生型及びSalmonella typhimuriumの弱毒株から単離したリポ多糖と共にインキュベートしたヒトマクロファージによるTNF-αの生産を示すグラフである。図19は、ガンシクロビル処置を施した又は施さない転移B16F10腫瘍を有するマウスに対し、HSVチミジンキナーゼ遺伝子発現するクローン YS7211及び YS7212、それぞれYS7211/p5-3及びYS7212/p5-3の効果を示す棒グラフである。６．発明の詳細な説明本発明は、肉腫、癌腫、リンパ腫又はその他の固形腫瘍癌、例えば乳癌、前立腺癌、頸癌、子宮癌、肺癌、卵巣癌、精巣癌、甲状腺癌、星状細胞腫、グリオーマ、膵臓癌、胃癌、肝臓癌、結腸癌及びメラノーマを含む（但しこれに限定されない）生殖系腫瘍及び中枢神経系の固形腫瘍癌のための新規治療及び診断王寄生生物ベクターの単離及びその使用に関する。以下に詳細に記載するのは、新規細胞内寄生生物ベクター；新規ベクターの単離方法；単離されたベクターの遺伝子操作；及び該新規ベクター及びその他のベクターを転移性腫瘍を含む固形悪性腫瘍及び腫瘍細胞の冶療又は検出に使用する方法である。６．１．新規ベクター及びその単離方法例えば細菌、真菌又は原生生物である単離されたベクターは癌細胞と癌でない対となる細胞を区別することができる。例えば、単離されたベクターはメラニン形成細胞からメラノーマ細胞を区別でき、あるいは正常な結腸上皮細胞から結腸癌細胞を区別できる。表１は本発明を決して限定するものではないが、本発明の腫瘍特異的ベクター及び／又は本発明で使用する重感染した腫瘍特異的ベクターである新規変異体株の単離にとって有用な細胞内寄生生物及び病原性微生物の代表例を列挙する。細菌であるSalmolla typhimurium、細菌であるMycobacterium avium及び原生生物であるLeishmania amazonensisのそれぞれは本発明で特に有用なベクターである。なぜなら、これらの各生物はある種の組織培養の固形腫瘍癌細胞に自然に優先的に付着し、その中に浸透するが、癌でない対となる細胞にはそうしないことを示すからである。Salmonellaのようなこれらのベクターは癌細胞と癌でない対となる細胞とを区別する天然の能力をもっているので、本発明の診断又は治療法に直接応用できる。しかしながら、”野生型”親株と比較したこの腫瘍特異的能力、ならびに重感染能力は以下の第６．１．１−６．１．４．節に記載する本発明の方法を用いることにより増強及び選択できる。６．１．１．in vitro組織培養物のサイクリングによる単離本発明のある熊様は、予め選択した標的細胞、好ましくは固形腫瘍細胞をin v itro組織培養物中、微生物で１サイクル以上感染させてサイクリングすることにより、サイクルした集団及び／又はこれに由来するクローン単離物が出発微生物集団と比べて標的腫瘍細胞の増強された感染性及び癌でない対となる細胞と比べて増強された選択性を示すように、本発明の新規ベクターを単離することである。この方法は、寄生生物又は病原体を選択し、該微生物を標的細胞として用いようと思う特定の型の固形腫瘍のin vitro組織培養系に加えることを伴う。例えば、もしもメラノーマ腫瘍を標的としたいならば、標的細胞はＭ２ヒトメラノーマ細胞でありうる。微生物が腫瘍細胞に付着及び／又は感染することができるように十分な時間、腫瘍細胞と微生物を一緒にインキュベートした後、腫瘍細胞培養物を用いた特定微生物に対して有効な抗生物質を含む緩衝液又は培地で洗浄する。抗生物質薬剤は腫瘍細胞と付着して感染を行わなかった全ての微生物を殺す。所望するならば、感染した腫瘍細胞培善物を、単離すべき微生物集団の型に依存して種々の時間、抗生物質を含む培地中でさらにインキュベートしてもよい。例えば、長時間インキュベートすると、単離された微生物集団は出発微生物集団と比べて腫瘍細胞内での増強された生存性及び／又は増殖能をもつ。さらに、単離された集団を培養して標準法によって単一コロニークローンを単離することができる。感染した動物細胞を回収して溶解し、内部にいる（internalized）微生物を遊離する。次に例えば遠心（2000xgで４分）して新しい培地に再懸濁することにより微生物を単離できる。次に単離した微生物集団を用いてさらに標的腫瘍細胞中への追加の感染サイクルを行い標的腫瘍細胞から単離することができる。生存性を確実にするために追加の感染サイクルに付す前に、単離した微生物集団をまず適当な増殖培地中で１〜２倍増時間置く。単離した微生物集団を培養して単一コロニークローンを単離、回収することもできる。単離した微生物を公知のin vit ro手法に付して、in vitro選択を受けていない”野生型”親株と比べた相対的感染能及び選択能を決定することもできる。例えば、標的腫瘍細胞に付着又は侵入した微生物の数及び／又は癌細胞と癌でない細胞を区別する能力を定量するように設訃されたアッセイを用いて、”野生型”と比べた単離微生物の相対的感染性を並列比較によって試験することができる。さらに、微生物集団密度のようなパラメータがこれらのin vitroアッセイで異なっており、試験すべきクローン又は集団の全体としての接種濃度が、癌細胞と癌でない対となる細胞とを区別する微生物の能力にどのような影響を及ぼすかを決定するうえでこれが役立つ。 in vitro組織培養物のサイクリングによって単離した重感染した腫瘍特異的ベクターの説明的例については以下の第７節を参照されたい。６．１．２．in vivo固形腫瘍のサイクリングによる単離本発明の別の態様は、in vivoで固形腫瘍を微生物でサイクリングすることによって本発明の新規ベクターを単離することである。この方法は例えば、Ｃ５７Ｂ６マウスにメラノーマ腫瘍を形成するＢ１６マウスメラノーマ細胞及びｕｎ／ｕｎマウスやその池の免疫抵抗性減弱マウスに結腸癌腫を形成するＨＣＴ１１６ヒト結腸癌腫細胞のような（但しこれに限定されない）哺乳動物の実験的腫瘍モデルを用いて行うことができる。さらに、癌患者から外科的に得られた腫瘍組織の新鮮な生検試料を用いてｎｕ／ｎｕ、ｓｃｉｄ又はその他の免疫抵抗性減弱マウスに接種できる。接種された癌細胞から増殖したマウス中のこれらの腫瘍は、 in vitro標的細胞と同様な方法で重感染した腫瘍特異的ベクターの単離のための in vivo標的として使用される。マウス又はその他のどのような動物で増殖したどのような腫瘍も、in vivoでの重感染した腫瘍特異的ベクターの単離のための標的として使用できる。例えば腫瘍細胞の皮下接種又は腫瘍塊の移植によってマウスでいったん腫瘍が樹立されたら、選択した微生物を該マウスに接種する。微生物が腫瘍と共存するようになり、及び／又は腫瘍細胞を感染する予め定められた感染期間の後、マウスを殺し、腫瘍を切り出し、重量を量り、ホモジェナイズする。少量を適切な微生物増殖培地に希釈し、適切な増殖条件下で１〜２集団倍増する期間インキュベートして、腫瘍保持マウス中に連続接種するための生存微生物の回収を確実にすることができる。さらに、もしも単離した集団が腫瘍保持マウス中で連続的接種を受けるならば、連続的接種ごとに接種物中の微生物数と感染時間を少なくして腫瘍特異的単離物の選択ストリンジェンシーを増加することができる。さらに、単離した集団を焙養して、標準法を用いて単一コロニークローンを単離することができる。単離した微生物を用いて、in vivo選択を受けていない”野生型”親株と比べた相対的感染能及び選択能を決定するためのin vitroアッセイに使用することもできる。腫瘍保持マウスでin vivo単離された重感染した腫瘍特異的ベクターの説明的例については以下の第９節を参照されたい。６．１．３．標的腫瘍細胞馴らし培地を用いるin vitro走化性による単離本発明の別の態様は、単離された微生物が腫瘍細胞分泌産物に対する走化性能力を増加するように、重感染した及び／又は腫瘍細胞特異的ベクターを単離する方法を提供する。この方法では、Adler(1973，J．General Microbilogy 74:77-9 1)の記載するように、液体対照培地又は標的腫瘍細胞で予め馴らした培地のいずれかを充填した毛細管を用いることを含む。馴らし培地とは、標的細胞を予め増殖し、次に濾過して細胞を除去しておいた培地である。毛細管の一端を炎でシールし：次いで毛細管を炎に数回素早く通し、即座に開口端を馴らし培地又は対照培地のいずれかを含むビーカー中に入れる。毛細管が冷えるとともに、液体が内部に吸引される。充填した毛細管を、培地と予め選択した微生物懸濁液を含む遠心管中に開口端を下にして挿入する。微生物が毛細管中に走化する３７℃における予め定められたインキュベーション時間の後、毛細管を鉗子で除去し、シールした端を開き、開いた毛細管を特定微生物にとって適当な栄養培地を含む遠心管中に移す。遠心中に毛細管からの微生物の定量的回収を確実にするために、特定の型の微生物にとって適切な培地で毛細管の上端を覆っておくことが重要である。例えば、4000 xgで４分、毛細管を遠心して微生物を管から出す。毛細管を除去し、微生物を再懸濁し.、少量を固体又は液体の適当な培地上に広げて定量する。対照と比べて馴らし培地を含む毛紐管に入った微生物の数の有意な増加が、馴らし培地で見られる標的細胞の分泌産物に対する陽性の走化性応答を示唆する。このin vitro法で単離された集団を用いて連続的走化性アッセイ単離を行い、あるいは単一コロニークローンを単離できる。これらのクローン又は集団を、標的癌細胞と癌でない対になる細胞とを区別する能力、ならびに重感染能において” 野生型”親株と比較することができる。腫瘍細胞馴らし培地を用いるin vitro走化性によって単離した重感染した腫瘍細胞特異的ベクターの説明的例は以下の第８節を参照されたい。６．１．４．突然変異誘発したベクターの単離重感染した腫瘍特異的微生物のための上述した全ての方法において、微生物を本発明のあらゆる単離又は選択方法に付す前に、”野生型”親微生物をまず突然変異誘発に付すことができる。例えば、細菌にニトロソグアニジン及び紫外線Ｂ照射による処理を行い、遺伝物質を修飾して微生物中の遺伝子の発現を定性的及び定量的に変更する。別の型の化学的及び高エネルギー突然変異誘発が当業者に公知である。例えば、ジメチルニトロソアミン又はエチルメタンスルホネートなどのアルキル化剤、又は臭化エチジウムなどのインターカレート剤など。別の方法としでは、遺伝子フロックを導入するためのトランスポゾン突然変異誘発や新しいプロモーターをもつ遺伝子の融合を含む。本発明のいずれかの選択法を引き続いて受ける微生物の突然変異株を作り出すために、本発明ではいかなる突然変異誘発物質を用いてもよい。突然変異誘発の説明的例については以下の第７．１．節を参照されたい。６．２．標的固形腫瘍細胞に遺伝子及び／又は遺伝子産物を送達するために選択されたベクターの遺伝子操作並びに毒力の弱毒化６．２．１．標的剖位に遺伝子及び／又は遺伝子産物を送達するための遺伝子操作重感染した腫瘍特異的ベクターを得る上記の選択方法の後、あらゆる所望の遺伝子又は遺伝子産物を標的部位、好ましくは固形腫瘍の部位、より好ましくは腫瘍細胞自体の中、腫瘍の壊死領域又は腫瘍関連のリンパ球及びマクロファージに送達するように、このようなベクターを遺伝子操作することができる。さらに、腫瘍細胞への天然の感染能をもち、及び／又は腫瘍細胞特異的である天然の微生物を遺伝的に改変できる。これらのベクターは当業者に公知の広範な種々の方法、例えば形質転換又はエレクトロポレーションによって遺伝子操作できる。本発明の好ましい態様では、ベクターは自殺遺伝子を標的腫瘍細胞に送達するように遺伝子操作される。これらの自殺遺伝子にはプロドラッグ変換酵素、例えば単純ヘルペスチミジンキナーゼ（ＴＫ）及び細菌シトシンデアミナーゼ（ＣＤ）を含む。ＴＫは非毒性基質であるアシクロビル及びガンシクロビルをリン酸化して、これらはゲノムＤＮＡに取り込まれて毒性となる。ＣＤは非毒性の５−フルオロシトシン（５−ＦＣ）を５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）に変換し、この５− ＦＵはＲＮＡに取り込まれて毒性となる。本発明が包含するプロドラッグ変換酵素の別の例には、マイトマイシンＣ及びポルフィロマイシンに作用するチトクロームｐ４５０ＮＡＤＰII酸化還元酵素（Murray et al.，1994，J．Pharmacol ．Exp．Therapeut．270:645-649）が含まれる。プロドラッグ変換酵素は悪性癌の遺伝子治療で広く用いられている（Vile and Hart，1993，Cancer Res．53:3860-3864;Moolten and Wells，1990，J．Natl． Cancer Inst．82:297-300;Wagneretal，1981，Proc，Natl．Acad．Sci．USA 78: 1441-1445;Mullen，1994，Cancer Res．54:1503-1506;Huber et al.，1993，Can cer Res．53:4619-4625;Waldman et al.，1983，J．Biol．Chem．258:11571-115 75;Mullen et al.，1992，Proc．Natl．Acad．Sci．89:33-37;Austin and Huber ，1993，Mol．Pharmacol．43:380-387）。表２はプロドラッグ変換酵素のリストである（Bagshawe，1995，Drug Dev．Res．34:220.230）。プロドラッグ変換酵素はいくつかの細菌で発現されてきた。単純ヘルペスウイルスはE．coliで発現されている（Garapin，1980，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 78;815-819;Waldman et al.，1983，J．Biol．Chem．258:11571-11575）。同様に、Simula et al.，1993，Toxicology 82:3-20は、マイトマイシンに対する感受性を与えるSalmonela typhimuriumにおけるプロドラッグ変換酵素であるチトクロームｐ４５０酸化還元酵素の発現を記載する。しかしながら、ＴＫやＣＤ酵素のようなプロドラッグ変換酵素は、Salmonella やEscherichia coliのような細菌中で合成されるときは通常は細菌から分泌されない。従って、微生物−誘導の遺伝子産物が微生物から分泌されるように発現構築体を設計する。よって、ＴＫ又はＣＤは、標的腫瘍細胞の細胞質及び標的腫瘍の間質空間内でリン酸化されたアシクロビル、ガンシクロビル、又は５−ＦＵを産生することができる。ＴＫ及びＣＤを分泌させるようにするには、例えばβ− ラクタマーゼ遺伝子由来の分泌シグナル配列を配列構築体中に導入より達成できる（Talmadge et al.，1980，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 77:3369-3373）。 β−ラクタマーゼに加えて、別のシグナル配列も本発明で使用できる。例えば、細菌はパリプラズム内及び外の培地に分泌するためのいくつかの手段をもっていることが知られている。最も典型的な分泌配列は疎水性の膜貫通スパニングドメインを含むＮ−末端シグナル配列である。これらの配列は膜を通ってタンパク質を導く作用をし、タンパク質が膜を通過するとき、又は通過後に除去される。原核生物と真核生物のＮ−末端シグナル配列は類似しており、真核生物のＮ−末端シグナル配列は細菌の分泌配列として機能しうることが示されている。好ましい熊様では、酵素β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）をコードする遺伝子をシグナル配列の材料として用いる。このシグナル配列は、ペリプラズム内及び外の培地への分泌の両方でよく研究された細菌酵素の例である。さらに、いくつかの細菌タンパク質はＣ−末端に位置する異なる分泌シグナルを利用する。この群では腸内侵襲性E．coliのヘモリシンＡ（ｈｌｙＡ）が最もよく研究されている。このタンパク質の最後の６０アミノ酸に分泌シグナルが存在すること、及びこのドメインを別のタンパク質に移すヘへモリシンオペロン由来のアクセサリータンパク質（ｈｙｌＣ，Ａ，Ｂ，及びＤ）が存在するときには、タンパク質を培地中に直接分泌することができることが示されている（Su et al.，1992，Microbial Pathogen．13:465-476）。Pugsleyによってまとめられた分泌されたタンパク質の例示リストを表３に示す（Pugsley A．P.，1988，グラム陽性菌の外膜を通過するタンパク質分泌：Protein Transfer and Organelle B iogenesis，R.C．Dand and P.W．Robbins(編集)，Academic Press，Inc.，Harco u rt Brace Jovanovich，Publishers，San Diego，pp607-652）。本発明の他の態様において、発現構築物から発現された所望の遺伝子は、ある種の型のプロモーターの特異的な調節制御下にある。これらのプロモーターは構成的であるか、または誘導性である。前者においては、遺伝子は連続的に発現されるが、後者において遺伝子は、インデューサー分子または細胞型特異的制御の存在下に限って発現され、その場合自殺遺伝子を含む遺伝子は、これに限定されるものではないが、ある種の細胞型においてのみ発現される。さらにプロドラッグ変換酵素を含む外来遺伝子の発現は、細菌の表現型を改変することが多い。従って、外因性制御下にプロドラッグ変換酵素を発現させるのが有利である。これは腫瘍を標的にする細菌の表現型や増幅の利用させることになり、その後プロドラッグ酵素を発現する助けになるであろう。誘導プロモーターは特定の条件で遺伝子発現を誘導する。さらに、外因性の誘導プロモーターは、人工的に導入可能な化学的シグナルを含む、特定の刺激に応答する。ヒトへの使用が承認されていて外部から導入された物質を用いて、プロドラッグ酵素を発現させるのが有利であろう。細菌の「ＳＯＳ」応答（Friedberg et al.，Am.Soc.Microbiol.Press,pp.407-455,1995収載、ＤＮＡ修復と突然変異誘発）は、ヒトへの使用が承認されているマイトマイシンのような化学療法アルキル化剤を含む、種々の物質によって誘動できる応答である（Oda et al.,Mutat ion Research,147:219-229,1985;Nakamura et al.,Mutation Res.192:239-246,1 987:Shimda et al.，Carcinogenesis 15:2523-2529,1994）。このグループに属するプロモーター要素には、umuCやsulAおよびその他のものが含まれる（Shinag awa et al.,Gene 23:167-174,1983;Schnarr et al.,Biochemie 73:423-431,1991 ）。前記sulAプロモーターは、sulA遺伝子のＡＴＧおよびＡＴＧの上流に下記27 個のヌクレオチドならびに70個のヌクレオチドを含んでいる（Cole,Mol.Gen.Gen et.189:400-404,1983）。従ってそれは、外来遺伝子を発現することにも、また開始コドンのない配列用の遺伝子融合を行うにも有用である。一態様においては、例えば、遺伝子の発現は、特定の標的細胞で活性化される細菌型プロモーターによって制御される。本態様の好ましい例によれば、細菌型プロモーターはまず特定の標的細胞で活性化される。他の態様によると、例えば遺伝子の発現は、特定の腫瘍細胞においてのみ活性化される細菌型プロモーターで制御される。必要な分泌シグナル配列をもつプロモーターの制御下に遺伝子を発現する発現生成物の例を第１図に図示する。本発明の好ましい態様によれば、遺伝子の発現は、標的細胞においてのみ活性なプロモーターの制御下にある。標的腫瘍細胞において特異的または選択的に活性な微生物のプロモーターは、種々の方法で単離される。例えば一つの方法では、特異的に誘導される遺伝子の単離に、IVET（インビボ発現技術）プロモータートラップ法を使用する。この方法は、例えば、Sau3A制限酵素により生成するSal monella typhimurium ＤＮＡ挿入物のランダム・プールを取り、そのフラグメントをプロモータートラップベクターpIVETにクローニングすることによって行われる（Slauch et al.,Methods Enzymol.235:481-492,1994;Mahan et al.,Scienc e 259:686-688,1993）。クローニング部位はサイクリックＡＭＰの合成に必要な purA遺伝子プロモーターの位置にある。この代表的なプールをもう一度Salmonel la typhimuriumにトランスフェクションすると組み込み現象が誘導され、外因性 purA遺伝子の置換を生じる。組み込まれたＩＶＥＴプラスミドをもつ細菌集団を、選択した細胞型の固形腫瘍をもつ動物に感染させ、24時間後にその腫瘍から細菌を単離する。Sau3Aで制限されたＤＮＡのランダム片が腫瘍細胞内でプロモーターとして作用するプラスミドを受容したこれらの細菌だけは、生存することができる。purAの転写制御に加えて、上記Sau3Aで制限されたＤＮＡプロモーターもまた、β−ガラクトシダーゼ遺伝子の発現を制御する。腫瘍内で細菌を生存させるプロモーターの二つの型が単離され、構成および調節される。構成プロモーターは、腫瘍の内部および外部で、両遺伝子のポジティブな発現を制御し続ける。これに対し、調節されたプロモーターもはや、標的細胞以外の細胞では不活性である。腫瘍中で活性なプロモーターを特定する他の方法は、ニ次元ゲル電気泳動を使って、腫瘍特異的に誘導された微生物の遺伝子産物を特定することである。例えば、マクロファージよりもむしろメラノーマ細胞で、どの遺伝子産物が特異的または選択的に発現されるかを決定する方法は、タンデムに進行する下記三つの平行感染を含む。(1)５ｘ10⁷のクローン微生物を５ｘ10⁶のメラノーマ細胞に感染させる。(2)５ｘ10⁷のクローン微生物を５ｘ10⁶のマクロファージに感染させる。(3)５ｘ10⁷のクローン微生物をＬＢブロスの増殖相で維持する。30分間感染させた後、10μｇ/ｍｌのゲンタマイシン含有ＤＭＥＭ培地（メラノーマ細胞用）、10μｇ/ｍｌのゲンタマイシン含有ＲＰＭＩ 1640培地（マクロファージ用）およびゲンタマイシンを含有しないＬＢ培地（感染していない微生物用）で前記細胞を洗浄する。２時間後、細胞をシクロヘキサミド50ｍｇ/ｍｌで前処理して15 分間宿主細胞タンパク質合成を阻害する。次いで細胞を洗い、75μ Ci/ml ³⁵S- メチオニンを含有する標識培地（マイナスメチオニン）に30分置いた後、普通培地で１時間培養する。その後細胞を収穫して7Ｍ尿素緩衝液で変性し、等電点分画電気泳動（IEF）にかけた後、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）およびオートラジオグラフィを行う。メラノーマ細胞で特異的に発現した遺伝子産物は、微生物感染メラノーマからタンパク質のスポットとして出現するが、微生物感染マクロファージまたは微生物そのものからは現れない。分離用ＩＥＦおよびＳＤＳ-ＰＡＧＥゲルから誘導したタンパク質から作った抗血清を用いて、特異的に発現した上記微生物の遺伝子を、λgtll発現ライブラリーからクローニングする。次いでコスミドライプラリーからクローニングすると、腫瘍特異的発現遺伝子産物のプロモーター要素を含有するＤＮＡ断片が得られる。標的腫瘍紐胞で特異的または選択的に活性化されるプロモーターを単離するさらに他の方法は、トランスポゾン突然変異誘発である。トランスポゾン突然変異誘発によって、上皮細胞では生存できるが標的腫瘍細胞では生存できない能力をテストできるランダム突然変異株のプールが得られる。まず上皮細胞で持続する継続性について突然変異株のテストを行れ、これ以上生存できない突然変異株を選択する。生存している突然変異株を無作為に釣り上げ、96ウェルプレートを用いて番号を付けたアレーに置く。標的腫瘍細胞を96ウェルプレートで増殖し、それぞれを、約10:lの微生物対宿主比で30分間微生物に感染させる。次いで、洗浄し、10μｇ/ｍｌのゲンタマイシンで処理する。24時間後、プレートを洗浄して0 .4％トリパンブルーで染色し、96ウェルプレート・リーダーを用いて死滅細胞（青色）に対する生存細胞（澄明）の比を決定する。標的腫瘍細胞内で生存することができない微生物を元の番号付きプレートから回収する。次いで、遺伝子マーカーとしてトランスポゾンを使って上記遺伝子をクローニングし、上記腫瘍特異的発現遺伝子およびそのプロモーターを含有するＤＮＡを単離する。宿主に投与された場合、様々なプロドラッグまたは「自殺遺伝子」を発現することができるベクターには、宿主に対する抗生物質耐性を与えてはならない。さらに重要なのは、細菌はできるだけ多くの抗生物質感受性を維持していなければならないことである。従って、これらのベクターはいかなる抗生物質耐性マーカーも持っていてはならない。これは、選択的圧力（selective pressure）が存在しない場合に細菌発現ベクターを維持するのには難点となる可能性がある。しかしながら、抗生物質耐性に依存することなくベクターを安定に維持できる方法は数多く知られている。例えば、そういった一方法は、Donnenberg、Am.Soc.Micro biol.,Annual Meeting，Abstract B-111,p.4;DonnenbergおよびKaper、Infect.I mmun.59:4310-4317,1991;RiedおよびCollmer,Gene 57:239-246,1987に記載されているように、プロドラッグ変換酵素または他の「自殺遺伝子」を発現する、染色体に組み込まれたベクターを構築することである。他の方法としては、均衡致死系を用いて、「自殺遺伝子」またはプロドラッグ変換酵素をコードする安定なエピソームプラスミドを構築する方法がある。上記均衡致死系は、ベクターが細菌における欠損を補償する機能をコードしており、その結果ベクターの存在が細菌の生存に必要不可欠であるという事実によって定義される。このような系については、Galan et al.,Gene 94:29-35 ,1990に記載されている。この系は、プラスミドがマルチコピーであり、従って高レベルの発現を達成するという点で、染色体の組込みよりも有利である。 6.2.2.ビルレンスを弱毒化する遺伝子操作本発明に含まれる微生物の多くは、ヒトおよび動物の病気原因物質である。例えばグラム陰性菌による敗血症は、敗血症ショックの発症を伴う高死亡率により、深刻な問題になっている(R.C.Bone,Clinical Microbiol.Revs.6:57-68,1993) 。従って、これらのベクターを安全にヒトや動物の診断と治療に使用するため、病気を引き起こす微生物ベクターのビルレンスは弱毒化されている。本発明において弱毒化は、ある微生物ベクターが改変された結果その病原性が弱まるという伝統的な定義に加えて、微生物ベクターを改変した結果、誘導された微生物ベクターのより低い力価を患者に投与することでき、そしてそれでもなお、より高力価で元の微生物ベクターを投与した場合に匹敵るろ結果を達成することができるような改変も含むものである。最終目標は、このベクターを患者に投与することによって、有毒なショックやその他の副作用の危険性を減じることである。このような弱毒化微生物は種々の方法で単離される。その方法としては、微生物の抗生物質感受性株の使用、微生物の突然変異誘発、培養株中または腫瘍をもつ動物中で腫瘍特異的な重感染した微生物突然変異株の選択、マクロファージや好中球を含む、正常細胞の生存に不可欠なビルレンス因子を欠如する微生物突然変異株の選択、および改変された細胞壁リポ多糖体をもつ新規な微生物株の構築を例示することができる。例えば、セクション6.1以降に重感染した腫瘍特異的ベクターの単離法が記載されているが、これら同じ方法は弱毒化ベクターの単離法でもあり、ここで、重感染した腫瘍特異的ベクターは定義により弱毒化されていろ。上記ベクターは非常に特異的であり、かつ重感染しているので、癌でない方の対に比べ、標的腫瘍細胞に見出される感染細菌数の差は、微生物培養の希釈度が増えるにつれてますます大きくなり、より低力価の微生物ベクターを使用して陽性の結果を得ることができる。さらに微生物は、宿主細胞、特にマクロファージや好中球において、例えば、相同組替技術や化学的あるいはトランスポゾン突然変異誘発により、微生物の生存を確実にするビルレンス因子をコードしているＤＮＡ配列の欠失または破壊によって、弱毒化することができる。例えば、これら多くのビルレンス因子はサルモネラ菌においで同定されている。全部ではないがこれら研究されたビルレンス因子の多くは、マクロファージにおける生存と関連しているので、例えば酸化のようなストレスによってマクロファージ内で特異的に発現されたり、あるいは、特定の宿主細胞応答、例えば、マクロピノサイトーシスを誘導するのに使われる (Fields et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:5189-5193,1986)。第４表に、相同組替技術や化学的あるいはトランスポゾン突然変異誘発による欠失があれば弱毒化サルモネラ菌を生じる、サルモネラ菌のビルレンス因子のリストを示す。単離したベクターのさらに他の弱毒化法は、その微生物の毒性の原因になる微生物の置換基を改変することである。例えば、リポ多糖（LPS）やエンドトキシンは主に細菌性敗血症の病原性作用の原因になっている。この反応を生じるLPS の成分がリピドＡ（LA）である。1）患者に敗血症ショックを引き起こす危険性が除かれ、そして2）高レベルの細菌ベクターに耐えられるだろうから、LAの有毒作用を排除もしくは軽減すれば弱毒化された細菌が得られる。Rhodobacter（R hodopseudomonas）sphaeroideSおよびRhodobacter capsulatusは、それぞれ、実験動物で敗血症ショック反応を起こさない、かつ、エンドトキシン・アンタゴニストでもあるモノホスホリルリピドＡ（MLA）をもっている。Loppnow et al.,19 90,Infect.Immn.58:3743-3750;Takayama et al.,1989,Infect.Immun.57:1336-13 38。 Rhodobactcr sphaeroidesとその他のグラム陰性菌間の脂質代謝および脂質代謝遺伝子の遺伝組織における公知の類似性および大腸菌突然変異を相補するRhod obacter遺伝子の能力(Benning & Somerville,1992(A),J.Bacteriol.174:6479-64 87;1992(B),J.Bacteriol.174:2352-2360;Carty et al.,1994,FEMS Microbiol.Le tt.118(3)227-231)によると、例えば、サルモネラ菌およびその他の細菌を遺伝子工学的に改変してMLAを作ることができ、それによって敗血症ショックを引き起こす能力を弱めることができろ。本発明の好ましい態様は、LAよりもむしろML Aを発現し、腫瘍特異的プロモーターの制御下でHSV TKをも発現するSalmonella spp.株である。一例としてあげれば、MLAを産生する大腸菌やSalmonella typhimuriumの生成は、λ gt11またはpUC19プラスミドで生成し、大腸菌にトランスフェクションされるRhodobacter sphaeroidesから得られる10kB断片からなるDNA遺伝子ライブラリーの構築を含む。MLAを産生するクローンは、MLAを検出する、ELISAのような抗体スクリーニング法によってポジティブに選択される。他の例において、pSup erCos（後でSalmonella typhimuriumにトランスフェクトされる）のRhodobacter sphaeroidesから得られる40kB DNA断片からなるコスミドライブラリーを生成する。MLAを検出する、ELISAのような抗体スクリーニング法を使用することによって、MLAを産生するクローンがポジティブに選択される。サルモネラ菌のLPSを改変するさらに他の例としては、LPS生合成経路に突然変異を導入する方法がある。LPS生合成におけるいくつかの酵素的ステップと大腸菌およびSalmonella typhimuriumの両方でこれらを制御する遺伝子座が同定されている(Raetz,1993,J.Bacteriol.175:5745-5753および本文献中の引用)。Salmon ella tyPhimuriumと大腸菌の突然変異株数種がLPS経路において遺伝子的傷害や酵素的傷害により単離されている。そのような突然変異株の一つ、firAは、酵素 UDP-3-O（R-30ヒドロキシミリストイル）-グリコシルアミン N-アシルトランスフェラーゼ（これはエンドトキシン生合成の第三ステップを調節する）をコードする遺伝子内の突然変異である(Kelley et al.,1993,J.Biol.Chem.268:19866-19 874)。このタイプの突然変異をもつSalmonella typhimuriumおよび大腸菌株は、７番目の脂肪酸、ヘキサデカン酸を含む点で、野生型のリピドＡとは異なるリピドＡを産生する (Roy & Coleman,1994,J.Bacteriol.176:1639-1646)。ロイおよびコールマンは、エンドトキシン生合成の第三ステップをブロックすろことに加え、firAがリピドＡ生合成の第六ステップを調節しているリピドA4’キナーゼの酵素活性も減少させることを示した。上記菌株が当分野に公知の方法いずれかで弱毒化されている場合、弱毒化された表現型の安定性は重要であり、そうなれば患者の治療中にそれらがもっとビルレントな表現型に戻ってしまうことはない。そのような安定性は、例えば、エピスタシス的によりもむしろ染色体レベルでの欠失やその他の非可逆性突然変異によりビルレンス遺伝子を破壊するが、または「自殺遺伝子」を細菌の染色体へ安定に組み込むことによって得ることができる。弱毒化された表現型を確実にするさらに他の方法は、二以上の方法で、例えば、firA突然変異（Hirvas et al.,1991,EMBO J.10:1017-1023）のようなリピドＡ産生経路における突然変異およびBochner,1980,J.Bacteriol.143:926-933に記載されているごとく、ウラシル生合成、プリン生合成およびアルギニン生合成のような一またはそれ以上の栄養要求性または代謝物要求性に対する一またはそれ以上の突然変異で弱毒化されるような細菌を遺伝子工学的に作り出すことである。本発明のさらに好ましい態様において、選択的に腫瘍を標的としてプロドラッグ変換酵素を発現する細菌ベクターは、ウラシル、芳香族アミノ酸、イソロイシンおよびバリン要求性であり、改変されたリピドＡを合成する。 6.3.インビトロ癌診断および単離されたベクターおよびその他のベクターを用いる固形癌のインビボ治療 6.3.1.インビトロ癌診断本発明の一態様は、限定的ではないがメラノーマを含む、固形腫瘍癌のインビトロ診断法および固形腫瘍癌を検出するための診断用キットに本発明のベクターを使用する方法を提供する。上記キットは、さらに腫瘍特異的な弱毒化されていないベクターを含んでもよい。上記インビトロ診断法および診断用キットは、ベクターの癌でない対となる部分よりも癌性細胞に対して高くなる特異性に基づく。以下の例は限定するために示すものではないが、例えば、患者から固形腫瘍の疑いがある細胞の生検試料を採取する。腫瘍生検試料をすりつぶし単一細胞の浮遊液になるまで消化する。浮遊液のアリコートと癌でない対となる対照細胞とを培養し、本発明の腫瘍特異的ベクターに感染させる。インキュベーション期間後、癌でない対となる対照細胞と対比して、生検試料細胞に付着および/または感染した腫瘍特異的微生物の数を、当業者に公知の方法で測定する。癌でない対となる対照細胞に比べ、標的細胞に関連して見出されたベクターの数が大きければ、その標的細胞は癌であることを示している。例えば、癌でない対となる対照細胞にくらべて、ベクターの数が約５乃至10倍であれば腫瘍細胞に感染しているであろうことを示している。癌でない対となる対照細胞は、腫瘍細胞が誘導される正常細胞である。例えば、メラノーマ細胞に対して癌でない対となる対照細胞はメラノサイト細胞であり、結腸癌について対となる対照細胞は結腸上皮細胞である。一態様において、その比はベクター/標的細胞の数として決定される。他の態様では、感染後、細胞を固定化してDNAを認識する染色処理か抗体処理を行うと、標的細胞の細胞質にあるベクターDNAが可視化される。標的細胞の細胞質にDNAが存在するということは、標的細胞の生検試料が癌性であることを示している。本発明の一態様において診断法は、癌細胞の疑いがある細胞試料を腫瘍特異的ベクターまたは微生物に曝すことからなる。本発明の診断法はまた、比較対照として、癌でない対となる細胞試料を腫瘍特異的ベクターまたは微生物に曝すことからなる。微生物が癌細胞に付着および/または感染することができる時間培養した後、癌性である疑いのある細胞と癌でない対となる対照細胞について、微生物またはベクターの感染力を対比することが出来る。本発明の診断用キットは有効量の腫瘍特異的ベクターを含む。上記キットはさらに、適当量の癌でない対となる対照細胞も含むことが出来る。このベクターおよび／または細胞は、固体または液体媒体に凍結、凍結乾燥または増殖状態で提供してもよい。本診断用キットはさらに、不活性成分およびバイアルや包装成分などの、当業者に周知であるその他のキット成分を含んでもよい。ある種の態様において、本発明の診断法に有用なベクターはさらに、腫瘍特異的な、弱毒化されているかあるいは弱毒化されていないベクターを含んでいてもよい。他の態様において、本発明のキットは腫瘍特異的な、弱毒化されているかあるいは弱毒化されていないベクターを含んでいてもよい。メラノーマに限定されるものではないがこれを含む固形腫瘍癌のインビトロの例については、セクション22,25および26参照。 6.3.2. 固形腫瘍のインビボ治療インビボの癌治療に使用するベクターは本発明のベクターのサブセットである。インビボ治療用のベクターは、宿主に投与されたときにそのベクターが宿主に対して弱い毒性であるように、また宿主の系から根絶するのが容易であるよう、弱毒化されている。好ましい態様において、上記ベクターは重感染しており、弱毒化されていて、標的腫瘍細胞に特異的であろ。さらに好ましい態様において、上記ベクターは広範囲の抗生物質に感受性でもある。さらに、上記単離されたベクターは、プロドラッグ変換酵素やその他遺伝子のような、標的腫瘍において、またはその近傍でベクターにより発現分泌される「自殺遺伝子」をコードすることができる。この遺伝子は構成、誘導あるいは細胞型特異的プロモーターの制御下にあってもよい。好ましい態様において、自殺遺伝子は、ベクターが標的腫瘍細胞の細胞質を侵襲している場合にだけ発現分泌され、それによって自殺遺伝子の発現による効果を腫瘍の標的サイトに制限する。好ましい態様において、ベクターは宿主に投与されると、HSV TK遺伝子を発現する。TK遺伝子の同時発現および宿主に対するガンシクロビルの投与により、ガンシクロビルは微生物のペリプラズムにおいてリン酸化されており、ヌクレオチド三リン酸へ自由に透過できる。リン酸化されたガンシクロビル、すなわち有毒な偽DNA前駆体は、容易に微生物のペリプラズムから細胞質そして宿主細胞の核を通って宿主細胞のDNAへ入り込み、そうすることによって宿主細胞を死滅させる。本発明の他の態様は、単離弱毒化された本発明のベクターで固形腫瘍癌を治療する方法を提供することにある。例えばある患者が、インビトロ診断法を含む当分野に公知の何らかの方法により、固形腫瘍癌と診断される。治療に用いるベクターは、標的細胞系を使う本発明の方法を用いるかまたは標的組織のマウスモデル腫瘍を使って予め単離しておいてもよい。他の態様においては、生検腫瘍細胞を、重感染していて患者の腫瘍に特異的なベクターを単離する選択アッセイに使用する。好ましい態様において、上記ベクターは、セクション6.2.2.に記載のごとく、例えば、ビルレンス因子を欠如させるか自殺遺伝子を発現させる、あるいはその両方を行って遺伝子工学的に改変される。さらに、治療成功後の患者の体内から上記ベクターを確実に根絶するため、あるいはまた、単離したベクターの投与のせいで患者が合併症を体験したかどうかについて、単離したベクターを抗生物質感受性について分析する。患者、例えば獣医が対象とする動物や臨床的な使用のためヒトに投与する場合、上記ベクターは単独で使用することができる。また水や水溶液、生理食塩水のような生理学的キャリアおよびその他の生理学的に許容できる賦形剤と併用してもよい。一般に、その用量は約１乃至１ｘ10⁸c.f.u./kg、好ましくは約１乃至１ｘ10²c.f.u./kgの範囲である。本発明のベクターは、以下の例示に限定されるものではないが、経口、局所を含む、また静脈内注射、腹腔内注射、皮下注射、筋肉内注射、腫瘍内注射、すなわち腫瘍に直接注入するなどを含む注射（例示に限定されない）を含む、種々の経路によって投与できる。以下一連の実施例は例示のために示すものであり、本発明の範囲を限定するものではない。 7.実施例：重感染した腫瘍特異的Salmonella tyPhimuriumのインビトロ単離 7.1.重感染した腫瘍特異的クローン単離前の突然変異誘発最小培地56プラスグリセロール（0.5％）中37℃でSalmonella typhimurium株 #14028の培養物をOD⁶⁰⁰＝0.3になるまで指数増殖させた後氷上で冷却した。その一部を取り出し、LB寒天培地で培養物のコロニー形成単位（c.fu.）を測定できるようにした。培養物を洗浄し、クエン酸ナトリウム（0.1M,pH5.5）に再浮遊させて、新しいニトロソグアニジン（NG,50μｇ/ml,20分、37℃）と一緒にインキュベートした後、遠心分離で一度洗浄し、培地56に再浮遊、冷却した後再びそのアリコートを取り出して、LB寒天プレートで培養物のc.f.u.を測定できるようにした。NG処理した細菌の他のアリコートをLBブロスに希釈（1:5）して静止期まで増殖し、12％グリセロール中−80℃で凍結保存した。残りの細菌は紫外線照射した(用量＝50J/m²,λ＝254nm)。一部を取り出して、 LBブロスに1:4希釈して静止期まで増殖し測定した。NG処理した細菌の他の一部をLBブロスに希釈（1:5）して静止期まで増殖させた他のアリコートを使って、L B寒天プレートで培養物のc.f.u.を測定し、12％グリセロール中−80℃で凍結保存した。突然変異誘発工程を行ったところ、株の突然変異数に以下の４基準による増加が生じた。1）突然変異誘発を行った後の細菌の生存減少(ニトロソグアニジン＝６倍、ウルトラバイオレットＢ照射＝400倍)、2）オーキソトロフィックな（栄養要求性）突然変異株の頻度の上昇(2％)、3）マルトース突然変異株の頻度の上昇(2％)、4）ガラクトース突然変異株の頻度が（0.5％）に上昇。 7.2.癌細胞に特異的な重感染したSalmonella typhimurium クローン♯70および♯71の単離セクション7.1に記載されたように、ニトロソグアニジンとUV照射でSalmonell a typhimurium野生型株♯14028の集団に突然変異を誘発させた。簡単に説明すれば、この菌株を最小培地56プラスグリセロール中37℃でOD⁶⁰⁰＝0.3になるまで指数増殖させた後氷上で冷却した。洗浄し、ニトロソグアニジン50μｇ/mlと一緒にクエン酸ナトリウムに再浮遊させた後、20分間37℃でインキュベートした。細菌を遠心分離で一度洗浄し、培地56に再浮遊させた。次いで50J/m²,λ=254nmの用量で細菌に紫外線照射を行った。サルモネラ菌感染に先だって、ペニシリン（100単位/ml）およびストレプトマイシン（100μｇ/ml）を含有するDMEM細胞培養培地４mlに約２ｘ10⁵cells/flask で、ヒトメラノーマ細胞をComing Tissue Cultureフラスコ（25cm²）へ接種した。37℃で一夜インギュベートした後通気（5％CO₂）してインキュベーターの湿度調整を行った。翌日予め加温した10％ウシ胎児血清を含有するが抗生物質を含まないダルベッコ最小必須細胞培養培地（DMEME/FBS）で２回この細胞を洗浄した。 LB寒天上37℃で一夜あるいは液体培養でSalmonella typhimuriumの突然変異集団を培養した。翌日プラチナループを使ってこの細菌をLBブロスまたは DMEM/FBSへ移し、OD⁶⁰⁰=0.1（約２ｘ10⁸c.f.u./ml）の濃度に調整して37℃でローター上にてさらに増殖させた。所望の集団濃度に増殖後(600nmの光学濃度でモニター)、細菌をDMEM/FBS中10⁶c.f.u./mlの濃度に希釈し、37℃でさらに20分間培養した。突然変異を誘発した細菌の集団を、培養したヒトM2メラノーマ細胞へ感染させてこのメラノーマ細胞から単離する、一回サイクルにかけた。突然変異誘発された集団の部分を寒天上でクローン化増殖させ、Salmonella typhimuriumのクローン２０個を別々に単離し、各クローンのヒトM2メラノーマ細胞に対する感染力についてテストを行った。上記細菌をComing Tissue Cultureフラスコ25cm²の動物細胞培養物へ４ml/flaskずつ添加し、通気（5％CO₂/95％air）して湿度を調整したインキュベーター中動物細胞と一緒に37℃でインキュベートした。動物細胞と共に15分間培養した後、この細菌含有培地を注ぎ流して、ゲンタマイシン硫酸塩（20μｇ/ml）と、細胞外細菌を殺すが細胞内細菌は殺さない抗生物質を含有する加温したDMEME/FBSで培養物を穏やかに洗浄した。ゲンタマイシン硫酸塩含有培地を注ぎ流し、新鮮なDMEM/FBS/ゲンタマイシン硫酸塩培地を追加し、37℃で6 0分間細胞をインキュベーションした。60分間のゲンタマイシン硫酸塩インキュベーション後、培地を注ぎ流してDMEM/FBS（ゲンタマイシン硫酸塩を含まず）で１回、フラスコを洗浄した。そしてCa⁺⁺/Mg⁺⁺を含まない生理食塩水（4ml）中１ mM EDTAまたはEDTA/トリプシン溶液（シグマ・ケミカルズ、１ｘ）を添加した。 EDTAまたはEDTA/トリプシン溶液で37℃、20分間インキュベーションした後、フラスコを振盪して動物細胞を浮遊させ、定量するためにアリコートを取り出した。動物細胞はCoulter Counter（Coulter Electronics社）で定量し、細菌はアリコートをLB寒天に平板固定して37℃でインキュベーションした後コロニーを数えることによって定量した。定量化は感染（ゲンタマオシン耐性）細菌／10⁶動物細胞の数であらわした。二個のコロニー"70"および"71"は、突然変異誘発野生型株（データ表示せず）より５乃至10倍の感染力で、メラノーマ細胞に重感染していることがわかった。クローン70および71についても、以下に挙げる培養したヒト細胞に対する相対的特異性を評価した：第４（Ａ）表に記載の、M2メラノーマ細胞および正常ヒトメラノサイト；"CaCo"結腸癌細胞および正常ヒト結腸上皮♯1790。 ^* 癌細胞：対応正常細胞 + 結果は３回繰り返し感染の平均値±SDをあらわす。細菌のクローン#70および#71は、正常メラノサイトおよび正常結腸上皮細胞に比べると、メラノーマ細胞および結腸癌細胞に対して強い侵襲傾向を示した。 7.3．インビトロ細胞培養循環によるSalmonella typhimurium重感染クローン#72 の単離セクション7.1.に記載のごとく、ニトロソグアニジンとウルトラバイオレットＢ照射により、サルモネラ菌野生型株#14028に突然変異を誘発させた。突然変異を誘発させた細菌５ｘ10⁸の出発集団を、OD⁶⁰⁰=0.450まで増殖し、DMEM/FBSで５ｘ10⁷c.f.u./mlの濃度に希釈して、ヒトM2メラノーマ細胞に15分間感染させた。感染細菌をメラノーマ細胞から単離してもう一度新鮮な感染していないメラノーマ細胞集団に感染させた。細菌感染の第二ラウンドも再び単離し、さらにヒトM2メラノーマ細胞への感染サイクルを実施して、ヒトM2メラノーマ細胞から単離した。このようなサイクルを４回行った後、14028^pop-1と呼ぶメラノーマサイクル細菌集団は次いで寒天平板培養に付した。それぞれ100個のクローンを釣り上げ、野生型細菌に比べた場合のM2メラノーマ細胞感染力をテストした。14028^pop-1の選択プロセスおよび選択された集団サブクローンの結果を第５表に示す。さらに14028^pop-1のアリコートをM2メラノーマ細胞でさらに２回のサイクルを実施した。次いでこの6X-サイクル集団を、正常ヒトメラノサイトに対して７サイクルのネガティブ選択に付した。6X-サイクル集団を正常ヒトメラノーマに加え、15分間インキュベーションした。上清を集め、次いで正常ヒトメラノサイトの新鮮培養液にもどした。このネガティブ選択処理は７回行った。この6X-7Xサイクル集団を再び正常M2メラノーマ細胞に加えてメラノーマ細胞を15分間感染させた。そして細菌をM2細胞から回収した。この6X-6X-IXサイクル集団を14028^pop ^-2 と呼ぶ。 14028^pop-1と呼ぶ４回サイクルSalmonella typhimuriumの混成集団は、最初の野生型細菌突然変異誘発集団の感染力を超えて３倍に増加した感染力を示した。サルモネラ菌の14028^pop-1集団から単離したクローン100個のうち、#6および#72 の２個のクローンは、メラノーマ細胞に対して有意に重感染していることがわかった。残りの細菌クローンは、野生型株と同じ程度かそれ以下の感染力を示した。第５表に示す実験において、15分間の感染時間で、突然変異誘発野生型株に比べると、クローン#6は約25倍、クローン#72は約55倍以上感染性であった。大腸菌のK-12株、#CSH 101は野生型Salmonella typhimuriumより少なくとも二桁弱い感染性を示し、したがって、ある種の動物細胞に対するS.typhimuriumの自然感染力を実証した。 + 結果は３回繰り返し感染の平均値±SDをあらわす。第５表に示すいくつかの実験を通して、クローン#72のメラノーマ細胞に対する感染力は、野生株のそれを超えて５倍から90倍まで変化した。この変化は、メラノーマ細胞感染前の細菌増殖濃度に依存しているように思われたので、野生型とクローン#72間の相対的感染力に及ぼす集団濃度の影響を測定した。野生型S.typhimuriumおよび重感染したクローン#72とをLB寒天平板に薄く張って増殖させた。プラチナループで培養物の何カ所かを取り、約２ｘ10⁸c.f.u./ml （OD⁶⁰⁰=0.1）の濃度でLBブロスに接種した。次いでこの培養液を37℃のローターにおき、光学濃度を集団濃度の関数としてモニターした。指定の光学濃度で、細菌のアリコートを取り、メラノーマ増殖培地（DMEM/10％FBS）で１ｘ10⁵c.f.u /mlの濃度に希釈してヒトM2メラノーマ細胞に感染させた。記載したように感染力測定を行った。結果を第６表に示す。 + 結果は２回繰り返し行った実験の平均値をあらわす。２回の変動は<±15％であった。上記結果は、細菌株の感染力は両方とも、感染前にあっては非常に細菌集団濃度に依存することを示しているが、クローン#72は、低い集団濃度の野生型株よりも比例的に感染性が高かった。第５表および第６表の結果は、位相および光学鏡検法によっても確認された。鏡検法は、第２図、第３図に示すように、"M10"とよぶSalmonella typhimurium の10xメラノーマサイクル集団の重感染力を明らかにした。さらに。野生型株140 28とクローン72は、感染前の嫌気性条件下で増殖させた場合、ヒトM2メラノーマ細胞を同等によく感染することもわかった。しかしながら、これらの株を好気性条件下に増殖させると、14028株は感染力を強く抑制されたのに対し、クローン7 2は誘導された状態のままであった。従って、クローン72は嫌気性増殖条件下でも好気性増殖条件下でも感染しており、好気性増殖条件下の野生型に比べて、重感染していた。 7.4 ．癌細胞に対するS.tvphimuriumの優先的選択性：野生型株対重感染したクローン#72 ヒトM2メラノーマ細胞、正常ヒトメラノサイト、結腸癌細胞および正常結腸上皮の相対感染力について、セクション7.3で単離した重感染Salmonella typhimuriumクローン#72と非突然変異誘発野生型株#14028とを比較した。結果を第７表に示す。+ 結果は３回繰り返し感染の平均値±SDをあらわす。^* 癌細胞：対応正常細胞二細菌株はそれぞれ、正常細胞に比べヒト癌細胞により侵襲性を示した。クローン#72は、野生型株と比べた場合、全例において重感染していた。さらに、クローン#72は、正常メラノサイトに比べ、野生型株よりもヒトメラノーマ細胞に対してさらに高レベルの侵襲特異性を有意に示した。 7.5．種々の培養ヒト癌に対するSalmonella typhimurium野生型株14028 および重感染したクローン72の感染力一連の他の実験において、培養で増殖する様々のヒト癌に対するクローン72および野生型株14028の相対的感染力を測定した。使用した実験手法はセクション7.2 .に記載されている。結果を第７（Ａ）表に示す。結果は3-9回繰り返した個別感染の平均値±SDをあらわす。野生型株14028もクローン#72も培養試験したヒト癌細胞のそれぞれに感染することができた。野生型株に比べ、クローン72はすべての例において重感染していた。しかしながら、ヒト肺癌系HTB57は、試験した他の癌細胞系と比較した場合、S almonella typhimuriumに対して有意に低い受容性を示した。さらに他の実験セットにおいて、ヒト肺癌HTB57系をマウスに移植した。１ｘ10⁷HTB57細胞を移植した10nu/nuマウスのうち10例すべてにおいて、腫瘍の「取り込み」は数ヶ月後でさえも全く観察されなかった。これら細胞が腫瘍として増殖した場合にサルモネラ菌感染受容性であるかどうかは測定しなかった。 7.6．検討要約すると、前記結果は以下のことを示している。a) S.typhimuriumの感染力は細菌の集団濃度依存性であり、b) 重感染したクローン#72は、細菌集団の全濃度において、そして特に好気性増殖条件下では低集団濃度において、メラノーマ細胞の感染力を増加させ、この点で野生型株と異なっている。細菌集団の低濃度における感染力は、腫瘍特異的ベクターとしてクローン#72を使用する場合の利点となる。癌患者への細菌接種をより低いc.f.u.に抑えられ、その結果、患者に敗血症ショックを起こす危険性を減少させられるからである。さらに前記結果は、S.typhimuriumの重感染した腫瘍特異的突然変異株の単離方法も示すものである。そのような突然変異株は、細菌によってメラノーマ感染力を増強する方法により単離されたクローン#6,#70,#71および#72であらわされる。上記結果はさらに、培養した正常ヒト細胞よりもヒト癌細胞に特異性を発揮することを示している。さらに、クローン72は元々ヒトメラノーマ細胞系M2に対する重感染力で選択されたのであるが、さらに、野生型株14028と比較した場合、ヒト結腸癌細胞および形質転換したマウスマクロファージに対しても重感染していることがわかった(第７表参照)。単離された突然変異クローンの重感染および腫瘍特異性は、細菌が弱毒化されていることを表しており、また、ヒト癌の診断・治療における腫瘍特異的ベクターとしてそのようなサルモネラ菌のクローン使用に対する明白な利点を提供するものである。 8.実施例：インビトロにおけるメラノーマの分泌生成物に対する走化性によるSalmonella typhimurium突然変異株の選択メラノーマ細胞は、Cloudman S91マウスメラノーマ細胞とDBA/2Jマウスからの腹腔マクロファージ間のポリエチレングリコール誘導融合物から単離した、人工的産生ハイブリッド系である。ここで使用したハイブリッド細胞系は、Cloudman S91メラノーマ細胞/マクロファージハイブリッド#48と称される。このハイブリッド細胞系は、DBA/2Jマウスにおいて急速に増殖する転移腫瘍を生成した(Pawel ek et al.,1995,J.Invest.Dermatol.104:605)。10％ウシ胎児血清を含有し抗生物質不含のDMEM/FBS培地をいれた75cm²の培養フラスコ中、５ｘ10⁶のCloudman S 91メラノーマ細胞/マクロファージハイブリッド#48を、通気して湿度調整したインキュベーターで30℃にて培養した。DMEM/FBSを含有するがメラノーマ細胞を含有しない対照フラスコも平行して培養した。72時間後、培地を取り出して、0.45 μのフィルターで無菌的に濾過した後４℃で保存した。上記のSalmonella typhimurium重感染クローン#72をニトロソグアニジンおよびUVによる突然変異誘発にかけた。突然変異誘発処理により、野生型株#14028の突然変異を誘発させた際に上記したと同様、クローン#72の突然変異数が増加した。さらにクローン72のこの突然変異誘発集団（"72^mut"）は、メラノーマ細胞分泌生成物すなわちメラノーマ馴らし培地に対する高走化性をもつ突然変異株を選択するのに使用した。潜在走化性誘引物質を毛細管に入れる方法はアドラー法から改変した(Adler,1 973,J.General Microbiology 74:77-91)。アドラーに記載されたように、上記の対照培地およびメラノーマ馴らし培地を２λ毛細管（"Microcaps",Drummond Sci entific Co.）に入れた。その一端を焼いて密閉した。次いでこの毛細管を数回素早く炎に通した後直ちに、その開端を下にして対照馴らし培地またはメラノーマ馴らし培地１mlを含有する10mlのビーカーに突っ込んだ。毛細管が冷えるにつれ(約10分間)、液体が１cm引き上げられた。 LB培地中37℃で増殖するSalmonella typhimuriumを遠心分離して集め、10⁸ c.f.u./mlの濃度を含む対照DMEM/FBS培地に再浮遊させた。アリコート（200μｌ ,２ｘ10⁷c.f.u.）をベックマン・マイクロフュージ・チューブに1.5mlずつピペット計量した。充填した毛細管（上記）は次いでその開端を下にしてSalmonella typhimuriumを含有するベックマン・マイクロフュージ・チューブに挿入し、37 ℃でインキュベーションすることにより測定を開始した。30乃至60分後、ピンセットで毛細管を取り出し密閉端をワイヤカッターで破砕した後、毛細管を３mlの LBブロス含有15mlの円錐遠心分離管へ移した。以下に記載する遠心分離工程によって定量的な細菌回収を確実にするためには、毛細管の上部先端がLBブロスで覆われていることが重要であった。次いで遠心分離管内の毛細管を遠心分離（1000 xg、４分）して菌を毛細管外へ移動させた。渦巻きを起こして再び菌を浮遊させ、アリコートをLB寒天培地に撒いて定量した。対照馴らし培地に比ベて、メラノーマ馴らし培地含有毛細管に入っている菌の数が有意に増加したことは、メラノーマ分泌生成物に対するその菌の走化性反応を示した。前記の突然変異誘発重感染したSalmonella typhimurium"72^mut"のアリコートを37℃のローターに置き、600nmの波長で0.4-0.6の光学濃度まで増殖させて上記の走化性工程に付した。次々にメラノーマ馴らし培地を供給しながら走化性サイクル工程を４回繰り返した。４サイクル後に得られた集団を#72^pop-2とした。４回目のサイクル終了後、菌混合集団のアリコートをグリセロール中に凍結した。次いで、第４サイクルから得られたSalmonclla typhimurium混合集団のさらに他のアリコートを、対照培地およびメラノーマ馴らし培地に対する相対的走化性についてサイクルされていない突然変異誘発クローン72（"72^mut"）の混合集団と比較した。結果を第８表に示す。 + 結果は４回繰り返し毛細管の平均値±SDをあらわす。テストした菌集団は両方とも、メラノーマ馴らし培地に対してより強い選択性比4:1を発揮して、対照馴らし培地よりもメラノーマ馴らし培地に対して正の走化性反応を示した。メラノーマ馴らし培地に対する集団#72^pop-2の走化性反応は、集団#72^mutに比べて統計学的に有意ではなかったが、対照培地については集団 #72^pop-2の走化性反応は集団#72^mutに比べて統計学的に有意差があった。従って、対照培地含有毛細管に入る集団#72^pop-2の傾向は有意に減少した。以上の結果は、集団#72^pop-2は一般に運動性では有効性がおちることを示唆しているが、メラノーマ馴らし培地に曝すと、集団#72^pop-2は対照集団と同等の走化性反応を示した。第８表の細菌の集団#72^pop-2および集団72^mutによって発現される異なった走化性表現型のメカニズムがどうであれ、上記結果は、細菌をメラノーマ馴らし培地に順次曝していぐ選択工程によって表現かとを改変できることを示している。これらの実験で単離した、突然変異を誘発し走化性をサイクルした細菌の混合集団は、メラノーマ馴らし培地に対する走化性反応について、多様な表現型を発現する同様に多様な突然変異株を含有するようである。 9. 実施例：担腫瘍マウスにおいてインビボサイクルによる Salmonella typhimurium の腫瘍特異的突然変異株の単離 Cloudman S91メラノーマ/マクロファージハイブリッド細胞系#48からDBA/2Jマウスに接種した腫瘍細胞を、弱毒化した腫瘍特異的Salmonella typhimuriumの選択用標的腫瘍として使用した。セクション7.1に記載のごとく、重感染したSalmo nella typhimuriumクローン#72をニトロソグアニジンとUVBで突然変異誘発し、クローン#72から誘導した突然変異誘発集団を作った。突然変異誘発工程により、野生型株#14028を突然変異誘発した場合と同様、クローン#72の突然変異数が増加した。マウスの肩および脾腹領域に合計４カ所、１カ所につき0.1mlの生理食塩水に10⁶個の細胞濃度で、Cloudman S91メラノーマ細胞/マクロファージハイブリッド#48細胞をDBA/2Jマウスに接種した(皮下)。８日から10日後、触診でわかる腫瘍になったので、重感染したクローン#72から誘導した突然変異誘発サルモネラ菌集団をマウスに接種した(腹腔内)。感染２時間後、マウスを屠殺し、腫瘍を取り出して計量し、テフロンホモジナイザーで５vol (vol/wt)のLBブロスにホモジネートした。次いでホモジネートのアリコートをLBブロス中約1:4に希釈し、37℃のローターに入れて、担腫瘍マウスへ順次接種する生菌を確実に回収するため、1-2倍集団になるまで（OD⁶⁰⁰でモニターすべきである）インキュベーションした。この工程をマウスへの感染後腫瘍からの回収の４サイクルまで繰り返した。各サイクルの始めに、腫瘍特異的突然変異株選択のストリンジェンシーを高めるために、接種菌の数と感染時間をその前のサイクルよりも減らした。４サイクル後に回収した集団を#72^pop-1とした。この工程の結果を下記第９表に示す。 ^* 感染サルモネラ菌は各サイクルにつき別々の4-8個の腫瘍からプールした。上記結果は、インビボで感染菌を腫瘍から回収できることを示している。接種された菌より少ない菌しか単離されなかったことから、以上の結果はまたインビボのサイクル工程が集団増加を生じたことも示している。 10．実施例：メラノーマ細胞内でのSalmonella typhimuriumの増殖標的組織内で遺伝子誘導ベクターを増殖させると、標的組織内で遺伝子を増幅できると同時に接種ベクターの力価を減少させ、従って宿主に敗血症ショックを起こす危険を減らすことができる。以下の実験は、Salmonella typhimuriumがメラノーマ細胞で増殖することを示す。 10.1．培養ヒトM2メラノーマ細胞での増殖以下に示すように、Salmonella typhimuriumは約30乃至60分という倍増時間の培養でヒトM2メラノーマ細胞内で増殖することがわかった。野生型サルモネラ菌株#14028および重感染クローン#72は、組織培養フラスコ25cm²につき２ｘ10⁵メラノーマ細胞を入れた、10⁶細菌c.f.u./ml培地のヒトM2メラノーマ細胞の培地へ別々に導入した。１時間後ゲンタマイシン（20μｇ/ml）を加えて、外部のインターナリゼーションを起こしていない（not intemalized）菌を殺してメラノーマ細胞を収穫し、指示点における内部へ取り込まれた菌数を測定した。結果を第 10表に示す。 + 数値は２回および３回繰り返し行った測定の平均値を、繰り返し測定の変動値<±25％で示す。 10.2. マウスで成長させたメラノーマ腫瘍の増殖 DBA/2Jマウスに４カ所（左右の肩と脾腹）10⁶Cloudman S91メラノーマ/マクロファージハイブリッド#48細胞を皮下接種した。触診でわかる腫瘍の出現後(8-10 日)、さらに２ｘ10⁸Salmonella typhimuriumを接種した(腹腔内)。テストしたサルモネラ菌は野生型#14028と重感染クローン#72であった。細菌接種４時間後と2 1時間後、眼窩出血させメトファン麻酔により安楽死させた。無菌的に腫瘍および肝臓を取り出し、無菌食塩水（0.9％）で洗浄して計量した後、LBブロスで5:1 （vol:腫瘍重量）の割合にホモジネートした。ホモジネートをLB平板に固定し37 ℃で一夜インキュベーションした後細菌コロニーを数えることによって細菌を定量した。数値は平均値±S.D.を表す。菌株をマウスで４時間および21時間インキュベーションした結果を、それぞれ第11（Ａ）表および11（Ｂ）表に示す。サルモネラ菌の接種４時間後、野生型クローン14028、クローン72両方とも細菌は血流や肝臓よりも腫瘍中の方が少なかった。しかしながら21時間で、腫瘍中には非常に多くのサルモネラ菌が観察され、重感染した突然変異クローン72について、組織１ｇに対する細菌比は、肝臓中のそれに対し腫瘍中では4000:1であった。細菌接種21時間後、腫瘍のサルモネラ菌数は野生型サルモネラ菌株およぼクローン72両方とも同様であり、最初に接種されたサルモネラ菌総数よりはるかに多かった。これは、野生型菌株もクローン72菌株も腫瘍内で増殖したことを示している。従って、Salmonella typhimuriumがメラノーマ細胞に感染しメラノーマ細胞内で増殖する能力は、第10表からわかるように細胞培養において、および第11 (Ａ)、11 （Ｂ）表からわかるようにマウスで成長する腫瘍中の両方で発現された。野生型菌株14028は肝臓中クローン72のそれより高い感染力を示した。野生型サルモネラ菌による高い肝臓感染力は、高濃度の細菌接種物（>10⁹c.f.u./マウス、データ表示せず）でクローン72による致死率よりも高い、DBA/2Jマウスに対して観察された野生型株の致死率と一致した。セクション15.2の第18表からわかるように、B16F10メラノーマをもつC57BL/6Jマウスで同様の結果が観察された。これらの結果は合わせて、インビトロ増加した腫瘍特異性で菌株または他の寄生生物を選択すれば、インビボで弱毒化された宿主毒性をもつ突然変異株が得られることを示している。 10.3. 担腫瘍マウスにおけるSalmonella typhimuriumの分布以下の実験は、サルモネラ菌が倍数移植（multiply-implantcd）皮下メラノーマ腫瘍かあるいは自然の転移をもつ動物の腫瘍に対して局在出来ること、そしてその腫瘍内で増殖できることを示す。 10.3.1. Cloudman S91 メラノーマ腫瘍への直接接種後のサルモネラ菌の分布 DBA/2Jマウスの４カ所（左右の肩と脾腹）に10⁶Cloudman S91メラノーマ/マクロファージハイブリッドサイトを皮下接種した。接種から8-10日後に触診でわかる腫瘍が出現した。各動物を選択し、４腫瘍（左右の肩と脾腹）のうち２腫瘍に７ｘ10⁴または７ｘ10⁶c.f.u.細菌/腫瘍にて、Salmonella typhimurium重感染クローン#72を直接接種した。細菌接種21時間後、マウスはメトファンで安楽死させた。腫瘍および肝臓を無菌的に取り出し、無菌食塩水（0.9％）で洗浄して計量した後、5:1（vol:腫瘍重量）の割合にホモジネートした。ホモジネートをLB平板に固定し37℃で一夜インキュベーションした後、細菌のコロニーを数えることによって細菌を定量した。結果を第12表に示す。要約すれば、特定の腫瘍に重感染Salmonella typhimuriumクローン#72を直接接種した２日後、そのサルモネラ菌は遠位の、接種されていない腫瘍中で観察することが出来た。腫瘍中に見出されたサルモネラ菌の量は、マウスに接種したサルモネラ菌の量をはるかに超えており、これは上記サルモネラ菌が腫瘍内で増殖したことを証明するものである。上記結果は、Salmonella typhimuriumが腫瘍内で増殖し、循環系を介してその腫瘍を排出し、遠位腫瘍まで運んでその遠位腫瘍内で増殖できることを示している。 10.3.2． Cloudman S91 メラノーマ転移におけるサルモネラ菌の分布本実験は、上記細菌が固形腫瘍の自然転移を標的にできることを示す。 DBA/2Jマウスの尾部に、１ｘ10⁵のCloudman S91メラノーマ細胞を皮下接種した。約４週間後、尾部に一次腫瘍の可視証拠なしで軟性組織転移（〜0.5g）が発生した。２ｘ10⁵c.f.u.のS.typhimuriumクローン72を腹腔内接種した。接種48時間後にマウスを屠殺し、肝臓と腫瘍を取り出してLuriaブロスにホモジネートした後、LB寒天平板の系列希釈によりS.typhimuriumを定量した。第12（Ａ）表に示す結果は、Salmonella typhimuriumクローン72が転移性腫瘍内で標的増殖ができることを示している。 ^* 結果は動物一匹の測定値を表す。 11. 実施例：野生型Salmonella typhimurium株14028および重感染した突然変異クローン72の抗生物質感受性 11.1. インビトロでの感受性テスト野生型Salmonella tyPhimurium株14028および重感染した突然変異クローン72 の抗生物質感受性を調べた結果、現在細菌感染の治療に使われている12の相異なる抗生物質に対してそれぞれ感受性であることがわかった。臨床実験室で見られるように、抗生物質の感受性を測定するスタンダードな方法に従い、上記細菌のテストを行った。その結果、患者は微生物耐性の抗生物質を投与されなくて済む。ディスク拡散感受性法キット（Disc Diffusion Susceptibility Technique Ki t：Remel Corp.,Lenexa,Kansas）を使って、上記菌株の抗生物質感受性をテストした。結果を第13表に示す。 11.2. インビボでテストした感受性マウスに細菌を腹腔内注射し、半数のマウスを抗生物質エンロフロキサシン（ enrofloxacin）で処理した後、マウス生存に及ぼすエンロフロキサシン（シプロフロキサシンの活性同族体）の効果を観察することによって、Salmonella typhi muriumクローン72の抗生物質に対する感受性をテストした。６週令のC57B6雌性マウスにSalmonella typhimuriumクローン72 10⁵cfuを腹腔内接種した。細菌接種４日後、マウスのうち３匹にはさらに100μｇ/0.1mlBAYTR IL^RM （エンロフロキサシン）を腹腔内接種し、飲料水に25μｇ/mlのBAYTRIL^RM を添加した。４日後、全マウスにBAYTRIL^RMを含有しない新鮮な飲料水を与えた。合計して21日後、生存マウスをすべて安楽死させ実験を終了した。結果を以下の第13（Ａ）表に示す。細菌だけを摂餌し抗生物質を摂取しなかったマウスは、接種して平均９日後には死亡した。細菌の摂餌に続いて抗生物質で処理したマウスは少なくとも21日間生存し、実験終了時にサルモネラ菌の毒性症状を示さなかった。従って、上記結果は明らかに、抗生物質エンロフロキサシン処理でサルモネラ菌による死亡からマウスを救済できることを示している。これらの結果は、前記ディスク拡散感受性法による、Salmonella typhimurium株 14028およびクローン72の抗生物質感受性を示す第13表の結果と一致している。所望により抗生物質を導入することによって前記細菌を除くことができるので、以上の結果は、抗生物質感受性細菌をヒト腫瘍治療のベクターとして使用する利点をさらに強調するものである。 12. 実施例：メラノーマ細胞における細菌タンパク質の発現増強本発明の好ましい一態様において、単離した重感染ベクターは、例えば、HSV TK遺伝子をもつSalmonella typhimuriumクローン72^5-3-2であり、宿主の正常細胞と比ベて、この遺伝子は癌性標的細胞で特異的に誘導される。細菌が上皮細胞に対比してマクロファージを侵襲する場合、pagBおよびpagCを含むいくつかのサルモネラ菌プロモーター遺伝子がより高いレベルで相対的に誘導されることが報告されている(Miller et al.,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:5054-5058;Mill er et al.,1992,Infect.Immun.60:3763-3770;Alpuche Aranda et al.,1992,Proc .Natl.Acad.Sci.USA 89:10079-10083)。サルモネラ菌がメラノーマ細胞を侵襲するときにこれらのプロモーターも活性化されるかどうかをテストするために、我々はβ−ガラクトシダーゼ・リポーター遺伝子に融合したサルモネラ菌含有プロモーター構築物を使用した。 25cm²のコーニング組織培養フラスコに、ヒトM2メラノーマ細胞(Cunningham e t al.,1992,Science,255:325-327)、ヒト上皮1790細胞およびマウス・マクロファージ細胞系J774細胞（American Type Culture Collection）を１ｘ10⁶宿主細胞の濃度で接種した。細胞は、DMEM培地１mlにつき５ｘ10⁷のSalmonellatyphimu rium#14028で１時間感染させた。新鮮培地で洗浄した後、外部のインターナリゼーションを起こしていないサルモネラ菌を殺すためにゲンタマイシン50μｇ/ml を培地に加えてさらに６時間培養した。次いでメラノーマ細胞を等張1mM EDTA溶液中基体から掻き取って収穫した。細胞をペレット化し、PBSに再浮遊させ、メラノーマ細胞内に見つかった細菌を定量するために、アリコートを取り出した。メラノーマ細胞の残りは、β−ガラクトシダーゼ活性の測定に供した。以下に示すSalmonella typhimuriumのクローン３個を使用した。i）β−ガラクトシダーゼが構成的に発現された14028株、ii） β−ガラクトシダーゼがpag Bプロモーターの活性化によって発現された14028株、そしてiii） β−ガラクトシダーゼがpagCプロモーターの活性化によって発現された14028株。従って、β− ガラクトシダーゼ活性の測定によって、メラノーマ細胞におけるpagBおよびpagC プロモーター誘発の分析を行った。結果を第14表に示す。 pagBおよびpagC両方のサルモネラ菌プロモーターはヒトメラノーマ細胞で誘導された。メラノーマ細胞における誘導レベルは、上皮細胞系またはマクロファージ細胞系のどちらよりも高かった。これらのデータは、pagBまたはpagCプロモーターが、HSV TKやE.coliシトシンデアミナーゼのような遺伝子をメラノーマ細胞特異的に発現するのに使用することができることを示している。 13. 実施例：プロドラッグ変換酵素のクローニングおよび発現以下のセクションは、本発明の方法および組成物に有用なプロドラッグ変換酵素の発現に有用な系を示す。 13.1. Salmonella typhimurium における単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼのクローニングと発現単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（HSV TK）は、メラノーマ腫瘍の増殖阻害において有効なプロドラッグ変換酵素であることが知られている（Bonnekoh et al.,1995,J.Invest.Derm.104:313-317)。従って、β−ラクタマーゼシグナル配列をもつHSV TK遺伝子を、Salmonella typhimurium野生型株14028および、またその野生型株から誘導される重感染した腫瘍特異性突然変異クローン両方へ挿入する工程を行った。PCR による単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼのクローニングアルカリ細胞溶解、フェノール/クロロホルム抽出およびエタノール沈殿により、ベクターpHETK2（Garapin et al.,1981,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:815-81 9）のプラスミドDNAを作った。単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼの完全配列に基づくPCRプライマー（McKnight,1980,Nuc.A.Res.8:5949-5964）は以下の通りである。前進プライマー5'-GATCATGCATGGCTTCGTACCCCGGCC-3'（配列番号：1）および復帰プライマー5'-CTAGATGCATCAGTGGCTATGGCAGGGC-3'（配列番号：2）；これは各プライマーの5'末端に付加した配列GATCATGCAT（配列番号：１の一部）またはCTAGATGCAT（配列番号：２の一部）（NsiI部位、スペーサー）をもつ、公開されている配列の塩基310-328（前進）および塩基1684-1701（復帰）に相当する。それぞれの反応混合物は、50ngのDNAテンプレート、各プライマーを10pmols ずつ、100mMのデオキシヌクレオチド三リン酸、1.5mMMg⁺⁺およびTaqポリメラーゼ（Perkin Elmer Cetus,Norwalk,CT）0.5単位を含有していた。94℃で１分、50 ℃で15秒、55℃で１分そして72℃で２分のサイクルを35回行って増幅した。増幅したDNAを精製し、pBluescript II KS+にクローニングしてT3およびT7プライマーでシークエンシングを行って正しいDNAがクローニングされたことを確認するか、または、β−ラクタマーゼシグナル配列(Tamadge et al.,1980,Proc.Natl.A cad.Sci.USA 77:3369-3373)を与えるPst1で切断したp279にクローニングした。［α-³²P］dCTPを使用するランダムプライミング（Boehringer Mannheim,Indian apolis,IN）により、元のテンプレートから得られたプローブを用いて形質転換株をスクリーニングした。イムノブロッティングによって陽性のクローンをさらにスクリーニングした。SDS-PAGE およびイムノブロッティング H.Neurath,R.Hill編、The Proteins,第３版、vol.1,Academic Press,New York ,pp.179-223に収載の、WebcrおよびOsbom,1975，「タンパク質とドデシル硫酸塩：ポリアクリルアミドゲルにおける分子マス測定および関連工程」に従い、菌細胞溶解物にドデシル硫酸塩−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）を行った。イムノブロッティングは、Towbin et al.,1979,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76:435 0-4354に従って行った。一次抗TK抗体は一般に1:1000希釈で使用した。二次抗マウス抗体は、1:7,500希釈で使用したアルカリホスファターゼコンジュゲート（P romega,Madison,WI）であり、続いてニトロブルーテトラゾリウム（NBT）および 5-ブロモ-4-クロロインドリルリン酸塩（BCIP）比色分析法（Promega）が行われた。チミジンキナーゼの測定 12,000ｘｇで30秒間マイクロフュージ遠心分離した対数期細菌培養液１mlをペレット化して細菌の溶解物を作った。ペレットおよび上清は別々に保存した。上清は12,000ｘｇで10分間遠心分離してさらに澄明にした。ペレットは、１mg/ml リソゾームおよび1％（v/v）のトリトンX-100含有リン酸緩衝生理食塩水100μｌに再浮遊させてさらに処理し、急速凍結乾燥のサイクルを３回行った。得られた物質を12,000ｘｇで２時間遠心分離して澄明にした。SummersおよびSummers,197 7,J.Virol.24:314-318に記載の測定法改変版を用いて、チミジンキナーゼ活性を測定した。反応混合物を37℃で１時間インキュベーションした後、DE81濾紙（Wh atman）に結合させ、洗浄し、関連する放射活性をガンマカウンターで測った。サルモネラ菌形質転換 O'CallaghanおよびCharbit,1990,Mol.Gen.Genet.223:156-158に記載されたエレクトロポレーションにより、サルモネラ菌株の形質転換を行った。サルモネラ菌にトランスフェクトしたプラスミドとしては、pHETK2（Garapin et al.,1981, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:815-819）,p279（Talmadge et al.,1980,Proc.Natl .Acad.Sci.USA77:3369-3373）およびβ−ラクタマーゼ融合物から単離した二つ別個のp5-3およびp2lA-2（p5-3およびp21A-2の図第4-C図参照。これらのプラスミドは"pTK Sec 1."と表示されている）を例示することができる。形質転換した Salmonella typhimuriumは、野生型14028および重感染したクローン72であった。二つ別々のβ−ラクタマーゼ-TK遺伝子融合構築体を単離し、Salmonella typh imurium14028野生型およびクローン72で発現させた。イムノブロット分析および対応する酵素活性測定を第4A図および第4B図に示す。すべてのTKを含むベクター３個、すなわち、細胞質で発現させたpHETK2、β−ラクタマーゼ融合p5 -3およびp21A-2はイムノブロットアッセイおよび酵素アッセイで検出することが出来た。培養上清からは相対的に低い酵素活性しか回収されなかった。イムノブロット分析はシグナル配列処理を含むので、Salmonella typhimuriumのペリプラズムスペースへの分泌が期待される。 13.2. 様々なプロモーターおよび分泌シグナルを用いる単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼの発現システム多くの構築体を作り他のプロモーターおよび他の分泌シグナルを用いてTKを発現させた。 13.2.1． LacI プロモーターの下Staphylococcus rotein A融合としての発現上記セクション13.1に記載のPCR法によって単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼを増幅し、pBluescriptのPstI部位へクローニングした。このTKクローンをbluescriptから分泌ベクターpEZZ18(Promega,Madison,WI;Nilsson and Abraha msen,1990,Methods in Enzymology 185:144-161)のBamHIおよびHindIII部位へサブクローニングした。これは、lacIプロモーターの下でStaphylococcus protein Aとのインフレーム融合を生じた。このプラスミドをpTK-Sec2と呼び、第4C図に図示する。プラスミドpTK-Sec2は、イムノブロットで測定するとチミジンキナーゼを発現する。 13.2.2． Serratia marcesens chitinase シグナル配列およびプロモーターのクローニング Serratia marcesens chitinase I（Jones et al.,1986,EMBO J.5:467-473）のプロモーターおよびシグナル配列をPCRによりクローニングした。前進および復帰プライマーは以下の配列をもっていた。CTAGACTAGTTTGTCAATAATGACAACACCC(前進)(配列番号：3)およびGATCGGATCCTTGCCCGGCGCGGCGGCCTG(復帰)(配列番号：4) 。これらプライマーはそれぞれ、SpeIおよびBamHI部位を含んでいる。得られた生成物をpSP72にクローニングし、DNAシークエンシングによって確認した。このプラスミドをpSP-CHTとよび、同じく第4-C図に図示する。 13.2.3．キチナーゼプロモーター制御下キチナーゼシグナル配列融合としての発現 BamHIおよびHindIIIを用いて、pBluescriptの単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼをpSP-CHTベクターへサブクローニングした。これは、キチナーゼプロモーターの下キチナーゼシグナル配列とのインフレーム融合を生じた。このプラスミドをpTK-Sec3と呼び、同じく第4-C図に図示する。プラスミドpTK-Sec3は、イムノブロット、で測定するとチミジンキナーゼを発現する。 13.3 外因性誘導可能なプロモーターを用いる細菌でのp450酸化還元酵素プロドラッグ変換酵素の発現前進プライマー(CTAGAAGCTTATAAGGGTTGATCTTTGTTGTC)(配列番号：5)および復帰プライマー(GTACGATATCCAGAACGATGTGCATAGCCTG)(配列番号：6)を用いて、sulA プロモーター要素(GENBANK#V00358;Cole 1983)をE.coliゲノムDNAからクローニングした。上記プライマーにはそれぞれ、HindIIIおよびEcoRV部位が組み込まれている。PCR条件は、95℃で１分、55℃で１分そして72℃で１分のサイクル35回であった。生成物をpSP72にクローニングしT7プライマーでシークエンシングして、正しいDNAが得られたことを確認した。クローニングしたDNA断片は公表されている配列と100％同一であった。 Yamano et al.,1989,Molecular Phamlacol.35:83-88に記載されたcDNAの第一開始ATG（最初の11ヌクレオチドを欠失）を持たないpBluescriptのEcoRI部位にあるNADPH依存チトクロームp450酸化還元酵素(p450 OR)cDNAクローンを、上記のごとく得られたsulAプロモーターをp450酸化還元酵素遺伝子のHindIIIおよびEco RVサイトにクローニングすることにより、sulAプロモーターおよび開始配列と融合させた。得られた融合体はsulAプロモーターからなり、このプロモーターは、 sulA ATG（メチオニン）およびこれに続く９個のアミノ酸(YTSGYAHRS)(配列番号：7)ならびにDNAポリリンカーおよびPCRプライマー(SGYRIP)(配列番号：8)から導入されてさらにp450 ORの第二アミノ酸（Ｇである）へ続く６個のアミノ酸を含む。この構築体pSP-SAD4-5を第4-D図に図示する。 13.4．細菌増殖に及ぼすプロドラックのp450酸化還元酵素変換発現の効果ある菌株が低濃度のマイトマイシンに感受性であることはすでに報告されている(Shiba et al.,1959,Nature 183:1056-1057)。従って、sulA::p450 OR発現プラスミドの存在または不存在下で特定菌株の感受性を比較するため、以下の実験を行った。構築体が機能的であれば、p450 OR遺伝子の存在が予想され、細菌増殖の減少を生じるマイトマイシンの活性化増強をもたらすはずである。この実験に使用した sulA::p450 OR発現プラスミドは、pBluescript（pBS）のバックボーンにあり、そしてβ−ガラクトシダーゼ転写ユニットを持っていることを除けば、pSP-SAD4 -5（セクション13.3）と同様である。この構築体も同じく第4-D図に図示する。このpBSプラスミドを発現構築体の存在下および不存在下、エレクトロポレーションによってEscherichia coli DH5αへトランスフェクションして正しいプラスミドを含むクローンを得、プラスミド単離およびDNA制限分析によって確認した。プラスミド含有株二個のそれぞれについて、新鮮な４時間（後期log）培養菌を100μｇ/mlのアンピシリン含有LBに1:100希釈してプラスミドの存在について選択し、250rpms、37℃で増殖させた。マイトマイシンＣを0.0、0.1および0.5μ ｇ/mlの量で培養菌に添加した。パーキンエルマーのダブルビーム分光測光器を用いて、２時間および18時間点において600nmで光学濃度を測定した。結果を第14（A）表に示す。 pBS含有E.coli株DH5αおよびsulA::p450 ORについてドラッグの不存在下、２時間および18時間の増殖を比較すると、構築体の存在は増殖速度を一部阻害するが、18時間で高い最終ODに到達することは阻害しないことがわかる。これらのデータはまた、pBSバックボーンプラスミドだけをもっている菌はより高いマイトマイシン濃度で一部が阻害されるだけであることを示している。しかしながら、 sulA::p450構築体をもつ菌は、マイトマイシンの両濃度で、初期および後期時点において有意な阻害を示す。これらのデータは、sulA::p450構築体の存在によって与えられる、マイトマイシンに対する強力な用量応答を示している。 13.5. Salmonella thimurium におけるシトシンデアミナーゼの発現 E.coliシトシンデアミナーゼ（CD）は、遺伝子治療に有用で効果的なプロドラッグ変換酵素であることが報告されている(Hirschowitz et al.,1995,Human Gen e Therapy 6:1055-1063;Huber et al.,1993,Cancer Res.53:4619-4626;Huber et al.,1994,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:8302-8306;Moolten,1994,Cancer Gene T her.1:279-287;Mullen et al.,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:33-37;Mullen et al.,1994,Cancer Res.54:1503-1506;Trihn et al.,1995,Cancer Res.55:4808 -4812)。CDは、毒性のない5-フルオロシトシン（5-FC）を毒性化合物である5-フルオロウラシル（5-FU）に変換する機能をもつ。サルモネラ菌は内因性CDをもっているが、その発現は異化代謝産物抑制的（catabolite repressed）である(Wes t and O'Donovan,1982,J.Bacteriol.149:1171-1174)。腫瘍内部で確実にCDを発現させるため、構成的に活性なβ−ラクタマーゼプロモーターを用いる発現ベクターCDを以下に記載するようにクローニングした。CD のクローニングおよび発現 E.coliシトシンデアミナーゼの完全配列（Humber et al.,1993,Cancer REs.53 :4619-4629）に基づくPCRプライマーは、前進プライマー： 5'-GATCATGCATGTGGAGGCTAACAGT-3'(配列番号：9)および復帰プライマー：5'-CTA GATGCATCAGACAGCCGCTGCGAAGGC-3'(配列番号：10)であった。これらのプライマーは、公表された配列に対応し、各プライマーの5'末端にNsiI部位およびスペーサーである付加配列GATCATGCAT（配列番号：9の一部）またはCTAGATGCAT（配列番号：10の一部）をもっている。それぞれ25μｌの反応混合物はDNAテンプレート5 0ng、各プライマー10pmols、100mMのデオキシヌクレオチド三リン酸、1.5mM Mgおよび0.5単位のTaqポリメラーゼ（Perkin Elm er Cetus,Norwalk,CT）を含有していた。94℃で１分、50℃で15分、55℃で１分そして72℃で２分のサイクルを35回行って増幅した。アガロースゲル上で増幅したDNAを精製し、正しいサイズのバンドを、1）pBluescript II KS+にクローニングしてT3およびT7プライマーでシークエンシングを行って正しいDNAがクローニングされたことを確認する、および2）β−ラクタマーゼシグナル配列および構成β−ラクタマーゼプロモーターを与えるPstlで切断したp279にクローニングした。この第二の構築体をpCD-Seclと称し、第4-E図に図示する。[α-³²P]dCTPで標識したオリゴヌクレオチドプローブを用いて、形質転換株をスクリーニングした。以下に示す抗CD抗体を使用するイムノブロソティングによって陽性のクローンをさらにスクリーニングした。シトシンデアミナーゼの一次抗体 CDをpBIuescriptからpGEXＩへサブクローニングし、IPTGを用いて発現させた。この発現タンパク質は不溶性であり封入体に存在することがわかった。0.1％w /vトリトンX-100で洗浄することにより、封入体からCD-グルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）融合タンパク質を精製し、再びペレット化してSDS−PAGEサンプル緩衝液に再浮遊させた。この物質を３mmの分離用10％ポリアクリルアミドゲルで分離し、４℃において3M酢酸カリウムで可視化した後切り取った。精製したバンドをホモジネートしてフロインド完全（０日）および不完全（14日）アジュバントと一緒にDBA2Jマウスへ腹腔内注射した。６週間後、マウスを出血させた。クローン化CDに対する血清抗体結合能をイムノブロットにより確認した。ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド電気泳動(SDS-PAGE) およびイムノブロットドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）は、Ｈ．ノイラスおよびＲ．ヒル編集の「蛋白質」第３版第１巻（アカデミックプレス、ニューヨーク、１７９−２２３頁）収戴の１９７５年ウェーバーおよびオズボム著の「蛋白質およびドデシル硫酸ナトリウム：ポリアクリルアミドゲルを用いた分子質量測定および関連方法」に記載された方法に従い溶菌液を用いて行ない、イムノブロットは、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡの第７６巻、４３５０−４３５４頁（１９７９年）記載のタウビン等の方法に従って行った。上記記載の一次抗ＣＤ抗体は概ね５００倍希釈で用いた。二次抗マウス抗体はアルカリ性ホスファターゼ接合体（プロメガ社製、ウイスコンシン州マデイソン）の７５００倍希釈液として用い、次いでニトロブルー・テトラゾリウム（ＮＢＴ）および５−ブロモ−４−クロロ−インドリルホスフェート（ＢＣＩＰ）比色検出（プロメガ社製、ウイスコンシン州マディソン）に供した。ＣＤ酵素測定法溶菌液は５０ｍｌの一晩培養した培養菌を３、０００ｘｇで１０分間ペレット状にして、2.5ｍｌのＰＢＳに再度懸濁して調製した。細胞は超音波処理し、残渣はマイクロフュージ中で12、000ｘg、10分間ペレット化処理して除去した。酵素測定はＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡの第８９巻、３３−３７頁（１９９２年）記載のミューレン等の方法を改変して行なった。１０μｌの細胞抽出物を１μ１の［Ｈ³］−５ＦＣ(μCI／μｌ)と37℃で培養した。１μｌの培養液をコダック１３２５４微結晶ニトロセルロースＴＬＣプレート（ニューヨーク州、ロチェスター、イーストマンコダック社）の上に垂らし、９５：５の比率のブタノール:水を非標識５ＦＣおよび５ＦＵマーカーと共に用いて分離した。プレートはマーカーレーンの分離に基づいて切断し、液体シンチレーション計数管を用いて定量した。サルモネラの形質転換サルモネラ菌株の形質転換はＭｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．第２２３巻、１５６−１５８頁（１９９０年）中にオキャラガンとシャービットにより書かれたエレクトロポレーション法により行なった。サルモネラに移入したプラスミドはｐ２７９及びｐＣＤ −Ｓｅｃｌであった。移入したSalmonella typhimuriumの菌株は１８節以降に記載されているＹＳ７２１株、ＹＳ７２１１株、ＹＳ７２１２株及びＹＳ７２１３株であった。移入した大腸菌の菌株はＤＨ５α株及びＫＬ４９８(Δcod)株であった。 CD 発現構造を有するサルモネラのバイオディストリビューションＣＤ発現構造ｐＣＤ−Ｓｅｃ１を有するSalmonella typhimuriumのクローンＹＳ７２１２をＬＢ培地で吸光度（OD₆₀₀）０．８まで生長させた。１．０ｘ１０⁶ 個の細菌を、細菌の移入の１６日前に２ｘ１０⁵個のＢ１６メラノーマ細胞を移植されたＣ５７／Ｂ６マウスに腹腔内接種した。細菌の移入後２日目に、マウスは死亡し、細菌の有無を調べるために腫瘍と肝臓を均質化法と連続希釈液の平板固定法によって測定した。ｐＣＤ−Ｓｅｃ１の発現生成物はイムノブロット分析法により抗ＣＤ抗血清に結合した。このクローンをＣＤを持たない大腸菌ＫＬ４９８株に移入したところ、第４−Ｆ図に示すように、５ＦＣから５ＦＵへの転換によって測定されたように高い酵素発現度を示すことが分かった。第４−Ｆ図はまたクローンされたＣＤ発現プラスミドが、内在性ＣＤをコードする野生型半数体を発現する大腸菌ＭＧ１６５５株よりも高い転換率レベルを示すことを表している。１４．実施例：マウスのメラノーマ腫瘍中におけるSalonella typhimurium クローン＃７２^5-3-2の増殖第１０．２節におけると同様の一連の実験において、DBA・２Ｊマウス（約１０週齢）に３ｘ１０⁵個のクラウドマンＳ９１メラノーマ/マクロファージ＃４８細胞を右から左にかけての肩及び脇腹の各４カ所に接種した(皮下)。組織培養物からの腫瘍細胞をマウスに接種後１０−１２日目、腫瘍は触診かのうであった。腫瘍細胞接種(皮下)の２週間後、腫瘍のできているマウスに７２^5-3-2と名付けたβ−ラクタマーゼシグナル配列を有するHSV TK遺伝子を含む２ｘ１０⁵c.f.u. のSalmonella typhimuriumクローン７２を更に接種した(腹腔内)。抗生物質での治療を行うことなく細菌の感染後２日目と１０日目、典型的な腫瘍のできている動物は死亡し、彼等の腫瘍と肝臓をホモジェナイズしてサルモネラの細胞１グラムあたりのc.f.u.を定量した。また、感染後１０日目に細菌の個々のクローンを肝臓及び腫瘍のホモジェネートから単離し、遺伝子マーカーｘｙｌ^neg（キシロース代謝不能、クローン＃７２の特徴）及びｔｅｔ^res（抗生物質テトラサイクリン耐性）の試験を行った。接種されたSalmonella typhimuriumクローン＃７２^5-3-2のゲノタイプはｘｙｌ^neg及びｔｅｔ^resであった。HSV TK遺伝子はｔｅｔ^resマーカーを有したプラスミドで運ばれたのだから、サルモネラのｔｅｔ^res クローンはHSV TK遺伝子を有していると仮定された。結果は表１５及び１６に示す。感染の２日後、腫瘍には平均１．５ｘ１０⁹個／ｇ腫瘍のサルモネラと２．０ｘ１０⁵個／ｇ肝臓のサルモネラが含まれており、腫瘍と肝臓の平均比率は約７，５００：１であった。感染の１０日後(表１６)、腫瘍には平均２．９ｘ１０⁹サルモネラ／腫瘍１ｇと２．７ｘ１０⁵サルモネラ／肝臓１ｇが含まれており、比率は１１，０００：１(腫瘍：肝臓)で、感染後１−２日目に見られた細菌の分布と類似していた。これらの結果はサルモネラは、腫瘍のできているマウスに一度接種される（腹腔内）と、循環器系に入り込み、腫瘍細胞に感染し、、腫瘍内で増殖して区分された形式でそこに存在することを示している。結果は更に、感染後１０日目調べた細菌のクローンは全て接種されたクローン＃７２^5-3-2とのそれらの遺伝的関係を証明するｘｙｌ^negであったこと及び２７／３３個のクローンは宿主菌内にプラスミドを含むＨＳＶＴＫの高い保持度（８２％）を示すＴＥＴ^resであったことを示している。ここに記載していない実験において、同じプラスミドが腫瘍ができているマウス中に感染の４２時間後１００％保持されているのが分かった。表１４，１５及び１６中に要約した上記実験を続けていく中で、メラノーマのできているマウスにおけるサルモネラ感染は合計で４週間続けられた。サルモネラ中毒の症状（震え、艷を消失した体毛）を緩和するため、最終の２週間は動物を抗生物質の上に置いた。この様な抗生物質処理はマウスの飲料水に最終濃度が１５ｍｌ Sulfatrim^TM／５００ｍｌ飲料水の１５ｍｌ Su1fatrim^TM小児用懸濁液（シャイン・ファーマシューティカル社製、スルファメトキサゾール４０ｍｇ／ｍｌ及びトリメトプリム８ｍｇ／ｍｌ含有）を含有させてなる。実験の終わりに、生き残ったマウスは安楽死により死亡させ、腫瘍と肝臓を除去した。それらの組織の一部（１−２ｍｍ³）を組織検査のためホルマリンに固定して染色した。残りの部分は重量を量り、組織１ｇ当たり５ｍｌのＬＢブロス中でホモジナイズし、ＬＢ寒天平板上のサルモネラの数を定量した。結果は表１７に示す。切除したメラノーマ腫瘍は重量が死んだ対照動物の５−１０ｇの腫瘍に比べて平均１ｇ少なかった(データは記載されていない)。これらの腫瘍は、接種後１日目、２日目及び１０日目に見られた腫瘍感染菌の数と同じく、平均１．４ｘ１０⁹ 個／ｇ腫瘍のサルモネラを含有していることが分かった。しかしながら、肝臓中のサルモネラの数は４週間の感染中に増加したため、肝臓に関して腫瘍中の細菌の平均比率は、表１４，１５及び１６に見られる１０日目までの感染期間について得られた比率と比較して、２８：１まで減少した。１５．実施例：生体内のメラノーマ中のSalmonella typhimuriumの顕微鏡的検出１５．１．ＤＢＡ／２Ｊマウス中で増殖するクラウドマンＳ９１メラノーマ中のSalmonella typhimuriumの検出腫瘍のできているマウスにおけるサルモネラ感染の組織病理学を検討するために、サルモネラ感染をしているあるいはしていない安楽死させたマウスから典型的なメラノーマ腫瘍を摘出した。それらの組織の一部（１−２ｍｍ³）をホルマリンで固定し、包埋して薄切りにし、切片はヘマトキシリン及びエオシンあるいは組織検査用のグラム染色液で染色した。これらの検討の結果は第５Ａ−Ｂ図に示す。第５Ａ−Ｂ図はＤＢＡ／２Ｊマウスの皮下で増殖しているクラウドマンＳ９１メラノーマ／マクロファージ雑種＃４８メラノーマからの組織切片の顕微鏡写真である。腫瘍は２日早く３ｘ１０⁵ c.f.u.接種されたマウスから切除した。腫瘍の一部を計量し、腫瘍１ｇ当たり５ｍｌのＬＢ培地に浸け、すり合わせガラスホモジナイザーでホモジナイズして、腫瘍のホモジネートをＬＢ−寒天培養平板に、腫瘍中のSalmonella typhimuriumの量を定量するために種々の希釈度で塗布した。細菌の定量によって、腫瘍には１．４ｘ１０⁹個／ｇのサルモネラが含まれていることが明らかにされた。第５Ａ図中、ヘマトキシリンとエオシンで染色された切片は、矢印で示された壊死領域を伴う腫瘍の断面を表している。第５Ｂ図中、組織グラム染色液で染色された切片は、腫瘍の壊死領域のある領域におけるグラム陰性菌を表している。光学顕微鏡で見ると、黄色の背景に対して細菌はピンク色／紫色に染まっている。サルモネラ感染した壊死領域は、組織グラム染色液には染まらないがメラミン含有メラノソームによって検出できる死んだ腫瘍細胞で囲まれていた(第６図を参照のこと)。これらの結果は、細菌は腫瘍のできている宿主に循環器系を経由して導入された場合、固形腫瘍の壊死領域がサルモネラにとって利用しやすいということを表している。追加的な一連の分析において、サルモネラ感染したマウス中で増殖しているクラウドマンＳ９１メラノーマ／マクロファージ雑種＃４８メラノーマ腫瘍の切片を電子顕微鏡で調べた。実験を開始するに当たり、マウスに８ｘ１０⁵個の腫瘍細胞を皮下接種した。触診可能な腫瘍塊が１１日後に検出され、その時点でマウスに３．６ｘ１０⁶c.f.u.のS.typhimurium過感染性クローン＃７２を腹腔内接種した。接種の４２時間後、マウスをメトフェンで安楽死させた。腫瘍は無菌法で摘出した。腫瘍中の細菌の定量により、４２時間目の摘出で腫瘍には約７．５ｘ１０⁹／ｇ個のS．typhimuriumが含まれていることが明らかとなった。対照的に、同じマウスから摘出した肝臓中のS.typhimuriumの濃度は約２．０ｘ１０⁷／ｇで、腫瘍中対肝臓中の細菌の比率は約４００：１であった。腫瘍の第２番目の部分は１−２ｍｍ３の小片に切断し、６時間４℃で1／2強度のカーノフスキー(Karnovsky)固定液で固定し、次いでカコジル酸緩衝液で一晩洗浄した。腫瘍組織はカコジル酸緩衝液中で2時間1％O_sO₄及び1.5％フェロシアン化カリウムを用いて後固定シ、スパー(Spurr)樹脂中に包埋した。超薄切片は酢酸ウラニル及びクエン酸鉛で染色した。染色した切片は、ツァイス109電子顕微鏡で観察した。第6図に示したものは、メラノーマ細胞の細胞質中に存在する特殊副細胞小器官である多数のメラノソームを伴う二つの別個のS.typhimuriumを含むメラノーマ腫瘍内の視域の電子顕微鏡写真である。メラノソームを伴う細菌の存在はS.typhimuriumがマウスの血流を介してメラノーマ細胞の細胞質に入ったことを証明するものである。電子顕微鏡写真中のS.typhimuriumは、マウスを実験的に感染させた後に腸の上皮細胞中に以前にあらわれたもの(竹内:1967年、Am．J．Pathol.、第50巻、10 9−136頁)と同一のようである。要約すると、i)光学顕微鏡検査はSalmonella typhimuriumがDBA/2Jマウス中で増殖するクラウドマンS91メラノーマの壊死領域に存在することを明らかにし、また;ii)電子顕微鏡検査はSalmonella typhlmuriumがメラノーマ腫瘍細胞の細胞質内にも存在することを明らかにした。 15.2． C57BL／6Jマウス中に増殖したマウスB16F10メラノーマ腫瘍内の Salmonella typhimurlum の分布 C57BL／6Jマウス(11−13週齢)に2個所づつ(肩及び脇腹)、一個所当たり3.5x10⁵ 個のB16F10マウスメラノーマ細胞を皮下接種した。触診可能な腫瘍が現れた後( 約２週間)、動物に更に以下の三菌種の約105個の菌を腹腔内接種した:i)野生型大腸菌K-12菌株 #CSH101;ii）Salmonella typhimurium 14028菌株;及びiii)HSV チミジンキナーゼ遺伝子72^5-3-2を有する変異体Salmonella typhimurium過感染性クローン72。感染のおよそ２日後、マウスはメトフェンによる麻酔で安楽死させた。腫瘍と肝臓を無菌的に除去し、滅菌した０．９％ＮａＣｌですすぎ、計量し、５：１の割合（容量ブロス：重量腫瘍）でＬＢブロス中でホモジナイズした。ホモジナイズに先だって、細胞の１−２ｍｍ³の大きさの小片を典型的な腫瘍から除去し、１／２強度のカルノフスキー固定液で固定し、電子顕微鏡で分析処理をした。ホモジネート中の細菌のはＬＢ平板に塗布し、３７℃で一晩培養し、細細菌ののコロニーを計数して定量した。結果は以下の通りである。ｉ）野生型大腸細菌は、接種された動物の腫瘍及び肝臓の両方で相対的に少数で、濃度が平均すると＜１０³／ｇ腫瘍及び＜１０²／ｇ肝臓であることが分かった。ii）野生型S．typhimuriumは腫瘍と肝臓の両方において大腸菌よりも有意に多数で、感染細菌が２ｘ１０⁷−６ｘ１０⁸c.f.u.／ｇ腫瘍及び４ｘ１０⁸c.f.u.／ｇ肝臓の範囲をとることが分かった。野生型S．typh imuriumを接種された２匹のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの一匹は死亡したが、恐らく殺細菌のによるショックと思われる。iii）S.typhimurium過感染性クローン７２もまた腫瘍及び肝臓の両方において大腸細菌のに比べて有意に多数であり、更に、クローン７２S.typhimurium／ｇ肝臓の数は野生型S.typhimurium ／ｇ肝臓の数よりも有意に少なかったことが分かった。結果は下記の表１８に詳記する。要約すると、Salmonella typhimuriumはＢ１６Ｆ１０メラノーマ腫瘍内において感染し増殖するという能力の点において大腸菌に勝る自然な能力を示している。更に、過感染性クローン７２^5-3-2はＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスでの肝臓の感染が軽減されるという点においてその野生型親株１４０２８よりも優れた性質を示している。即ち、野生型菌株１４０２８は肝臓に対してクローン７２^5-3-2よりもより大きな感染性を示したのである。野生型サルモネラによる肝臓への高い感染性は、ＤＢＡ／２Ｊマウスに対する野生型菌株の観察された大きな致死性及び表１１Ｂに見られるクローン７２によって生じるよりも大きなＤＢＡ／２Ｊマウスにおける肝臓の感染性と一致ししていた。同時に、表１１Ｂ及び１８に記載の結果は、増強された生体外腫瘍特異性を有する細菌あるいはその他の寄生菌の菌株の選択によって弱められた生体内宿主毒性を有する変異菌株を生じることができるということの第一の証拠を提供している。１５．３．Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス中で増殖するＢ１６Ｆ１０メラノーマ内の Salmonella typhimurium の顕微鏡による検出典型的なＢ１６Ｆ１０メラノーマ腫瘍をサルモネラに感染しているあるいはしていない安楽死させたマウスから摘出した。組織の一部（各１−２ｍｍ³）をホルマリン中で固定し、包埋して切断し、該切片はヘマトキシリン及びエオシンあるい組織検査用組織グラム染色液のいずれかで染色した。これらの研究の結果は第７Ａ−Ｂ図に示した。第７Ａおよび７Ｂ図はＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの皮下で増殖しているＢ１６Ｆ１０メラノーマから採った組織切片の光学顕微鏡写真である。腫瘍はHSV TK遺伝子を有するSalmonella typhimurium過感染性クローン７２^5-3-2 を２ｘ１０⁵c.f.u.接種されているマウスから摘出した。腫瘍内の細菌の定量により、腫瘍には、細菌感染後２日目の摘出で、１ｇ当たり約９ｘ１０⁸c.f.u .のS．typhimuriumが含まれていることが明らかになった。対照的に、同じマウスからの肝臓中のS．typhimurium濃度は約２，０ｘ１０⁵／ｇで、腫瘍対肝臓中の細菌の比率は約４００：１であった。第７図：組織グラム染色液で染色された切片は腫瘍内の壊死領域中のグラム陰性細菌を示す。感染した壊死領域は組織グラム染色液で染まっていないが色素沈着したメラノソームがあるために茶色く見える死んだメラノーマ細胞に囲まれている。光学顕微鏡で見ると、細菌は、黄色い背景に対して、ピンク色／紫色に染まっている。結果は、細菌が腫瘍のできている宿主に循環器系を経由して導入される場合、Ｂ１６メラノーマ腫瘍の壊死領域がサルモネラにとって利用しやすいということを表している。上記腫瘍の第２番目の部分は１−２ｍｍ³の小片に切断し、６時間４℃で１／２強度のカーノフスキー(Karnovsky)固定液で固定し、次いでカコジル酸緩衝液で一晩洗浄した。腫瘍組織はカコジル酸緩衝液中で２時間１％ＯＳＯ₄及び１．５％フェロシアン化カリウムを用いて後固定シ、スパー(Spurr)樹脂中に包埋した。超薄切片は酢酸ウラニル及びクエン酸鉛で染色した。染色した切片は、第８図に描いたツァイス109電子顕微鏡で観察した。第８図の電子顕微鏡写真は、壊死領域内の矢印で示した細胞外空間中の非常に多くのSalmonellatyphimuriumを示している。死にかけているメラノーマ細胞の細胞質内に単一の細菌も見られる。死にかけているメラノーマ細胞の細胞質にもＢ１６Ｆ１０メラノーマの特徴である非常に多くの黒色メラノソームが含まれている。電子顕微鏡写真中のS.typhimuriumは、マウスを実験的に感染させた後に腸の上皮細胞中に以前にあらわれたもの(竹内;1967年、Am．J．Pathol.、第50巻、10 9−136頁)と同一のようである。要約すると、i)光学顕微鏡検査はSalmonella typhimuriumが感染したＢ１６Ｆ１０マウス中で増殖するＢ１６Ｆ１０メラノーマの壊死領域に大量に存在することを明らかにし、また;ii)電子顕微鏡検査はSalmonella typhimuriumがメラノーマ腫瘍細胞の細胞質内にも存在することを明らかにした。サルモネラは腫瘍の結合した好中球内にも観察された。 16．実施例:メラノーマ腫瘍のできているマウスの治療のための過感染性腫瘍特異性遺伝子送達Salmonella typhimuriumの利用１６．１．クラウドマン５９１メラノーマの治療構造的にβ−ラクタマーゼシグナル配列を有するヘルペスシンプレックスウィルスチミジンキナーゼ遺伝子を発現するSalmonella typhimurium過感染性変異株７５^5-3-2をマウスのメラノーマの遺伝子治療に用いた(第４−Ｃ図参照)。ＤＢＡ／２Ｊマウス（およそ１０週齢）はそれぞれの左右の肩と脇腹にわたる４個所おのおのに３ｘ１０⁵個のクラウドマンＳ９１メラノーマ／マクロファージ雑種細胞を接種（腹腔内）を受けた。腫瘍は、腫瘍細胞の接種後１０−２０日目に触診可能であった。腫瘍細胞の接種後２週間後に、腫瘍のできているマウスに７２^5-3-2と名付けられたβ−ラクタマーゼ分泌シグナル配列を有するHSVチミジンキナーゼ遺伝子を含むS． typhimuriumクローン７２を２ｘ１０⁵c.f.u.更に接種した（腹腔内）。細菌の接種から１２時間後、何匹かのマウスに等張生理食塩水に２．５ｍｇのガンシクロヴァー(ganciclovir・ナトリウム（Cytovene^TM；カリフォルニア州、パロアルト、シンテックス・ラボラトリー社製）を溶かしたものを更に接種した（腹腔内）。これらの同じマウスはこの供与量のガンシクロヴァーを３日間かけて４回接種された。対照の腫瘍のできているマウスもガンシクロヴァーの接種を受けたが、細菌の接種は受けなかった。別の組の腫瘍のできているマウスには細菌を接種したが、ガンシクロヴァーは接種しなかった。時間をいろいろ変えて、上記のように処理した適当なマウスのグループに、最終濃度が１５ｍｌ Sulfatrim^TM／５００ｍｌ飲料水のSulfatrim^TM小児用懸濁液（シャイン・ファーマシューティカル社；スルファメトキサゾール４０ｍｇ／ｍｌ及びトリメトプリム８ｍｇ／ｍｌを含有）を投与した。結果は以下の通りであった。１）ガンシクロバー及び抗生物質処理（飲料水へのSulfatrim^TMの添加）は受けているが細菌の投与は受けていないメラノーマ腫瘍のできている対照マウスは急速に増殖する腫瘍を展開したが、その腫瘍は第９図に示したカリパス計測による測定で３，４日毎にまずサイズが倍加した。これらのマウスはガンシクロヴァー処理にはほとんどあるは全く副作用を示さなかったが、これは酵素を転換する適切なチミジンキナーゼがない場合のマウスにおけるガンシクロヴァー前駆薬剤の最少毒性に関する先の報告書（ボンネコン等、１９９５年、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ.、第１０４巻、３１３−３１７頁）を裏付けている。腫瘍細胞の接種後３０日目までに、このグループの全てのマウスに塊状の皮下腫瘍（５−１０ｇ）ができ、メラノーマで死亡した。２）腫瘍のできているマウスの一つのグループは、抗生物質を投与されることなく合計で１０日間細菌接種を受けたが、ガンシクロヴァー投与は受けなかった。これらのマウスは、対照マウスの腫瘍に比してサイズが有意に縮小した腫瘍を有していた(第１０図)。腫瘍のサイズの縮小に対するサルモネラのみの効果が、以下に記載のように、腫瘍に対するサルモネラとガンシクロヴァーを足した場合の効果が観察された数日後に明らかとなった。しかしながら、『サルモネラのみ』のグループ内の全てのマウスはサルモネラ感染の症状（震え、艶の消失した体毛）を呈し、その５０％が感染後５−１０日間の間に死亡した。残りのマウスは濃度が１５ｍｌ／飲料水５００ｍｌの抗生物質Sulfatrim^TM（シャイン・ファーマシューティカル社、経口懸濁液）で処理した。この処理でマウス集団におけるサルモネラ感染の臨床的症状は２４−４８時間以内に軽減した。このプロトコールによって生存マウスは対照マウスよりも有意に小さい腫瘍を有し、全ての対照マウスがメラノーマで死亡した３０日の期間が過ぎても生存していた。３）腫瘍のできているマウスのもう一つのグループは、４日間の処理期間の間にガンシクロヴァーと細菌の両方の投与を受けた。約５０％のマウスが、この処理の１−２日間の間に死亡したが、これは明らかにガンシクロヴァーがマウス体内のサルモネラクローン７２^5-3-2によって発現されたHSV TKに因り有毒なリン酸化形に転換したことに因るものであった。この時点で、ガンシクロヴァー処理は中止され、生存マウスはサルモネラ感染を抑制するため抗生物質のSulfatri m^TM上に置かれた。抗生物質を無使用でのサルモネラ暴露の合計時間は４日間であった。このプロトコールによる生存マウスは対照マウスよりも有意に小さい腫瘍を有し、全ての対照マウスがメラノーマで死亡した３０日の期間が過ぎても生存していた(第１１図)。更なる一連の実験において、腫瘍の進行は処理済み及び未処理の腫瘍のできているマウスでカリパスを用いて測定された。上記のクラウドマンＳ９１メラノーマ／マクロファージ雑種＃４８メラノーマ腫瘍のできているマウスのグループにヘルペスシンプレックスウィルスチミジンキナーゼ遺伝子７２^5-3-2を有するのS almonella typhimurium過感染性クローン７２を３ｘ１０⁵c.f.u.接種した(腹腔内)。細菌の接種から２４時間後、マウスに更に２．０ｍｇの供与量でガンシクロヴァーを５日にわたって合計６回接種した。マウスは次いで、その飲料水に１５ｍｌ／５００ｍｌのSulfatrim^TMと２０μｇ／ｍｌのBaytril^TM(マイルズ社)の組み合わせを添加した抗生物質処理を受けた。ベイトリル^TM即ちエンフロキBサシンとは１−シクロプロビル−７−（４−エチル−１−ピペラジニル）−６−フルオロ−１，４−ヂヒドロ−４−オキソ−３−キノリンカルボン酸である。腫瘍の成長は腫瘍の長さ、幅及び高さを小児用カリパス計測で査定し、腫瘍生物学の学問では公知の技法で１立方ミリメートル中の腫瘍の量として計算した。結果は半対数目盛上にプロットし、発生時間、即ち、体積が一回倍になるのに要する時単位の時間を計算した。次の式が用いられた。発生時間＝０．６９（ｔ）／Ｉｎ(Ｔ１／Ｔ２)、式中ｔは曲線の直線部分上の初期腫瘍体積（Ｔ１）及び最終腫瘍体積（Ｔ２）の間の時単位の時間に等しい。結果を第９図及び表１９に示す。未処理の対照マウス及びガンシクロヴァーで処理したがサルモネラを感染させていないマウスにおける腫瘍の平均倍加時間は相似していて、それぞれ８３時問と９４時間であった。サルモネラで５日間処理したしたがガンシクロヴァー処理はしなかったマウスの腫瘍は平均速度１２５時間で倍加した。サルモネラで５日問処理しかつガンシクロヴァー処理したマウスの腫瘍は１０日間の測定期間中成長を見せず、またいくつかの症例では処理によって退縮した。要約すると、ａ）ガンシクロヴァー及び抗生物質処理は受けたがサルモネラ処理は受けていない対照の腫瘍のできているマウスは腫瘍細胞接種後３０日以内に塊状腫瘍のため死亡した。ｂ）サルモネラのみの処理を受け、次いで抗生物質処理を受けたマウスは対照マウスに凌駕する腫瘍成長速度の低減と生存の延長を示した。ｃ）ガンシクロヴァーとサルモネラの組み合わせ処理を受け、次いで抗生物質処理を受けたマウスは対照マウスに比べてほとんどあるいは全く腫瘍の成長を示さず、また対照マウスを凌駕する生存の延長を示した。結果は、ヘルペスシンブレックスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子を発現するSalmonella typhimuri umはメラノーマ腫瘍内でガンシクロヴァーをリン酸化形に転換することができ、従って腫瘍のサイズを縮小し、マウスの生存を延長させたということを示している。１６．２．Ｂ１６Ｆ１０メラノーマの処理Ｃ５７Ｂ６マウスの左肩部位に、培養物からの５ｘ１０⁵個のＢ１６Ｆ１０メラノーマ細胞を皮下接種した。腫瘍移植後８日目に、マウスの何匹かに２ｘ１０６c.f.u.の各々HSV TK遺伝子を有する弱毒化したSalmonella typhimuriumの菌株ＹＳ７２１，ＹＳ７２１１，ＹＳ７２１２あるいはＹＳ７２１３（１８節以降を参照のこと）を腹腔内接種した。腫瘍接種後１１日目に、マウスの各グループ（ｎ＝５あるいはｎ＝１０）にＧＣＶ（ガンシクロヴァー・ナトリウム、Cytovene^TM 、シンテックス・ラボラトリー社、カリフォルニア州パロアルト）を以下のプロトコールの下で腹腔内接種した：ａ）総供与量＝７．５ｍｇ／マウス（１１日目２．５ｍｇ、１２日目１．２５ｍｇ、１８日目２．５ｍｇ、１９日目１．２５ｍｇ）：ｂ）総供与量＝５．０ｍｇ／マウス（１１日目２．５ｍｇ、１２日目２．５ｍｇ）；ｃ）総供与量＝３．７５ｍｇ／マウス（１１日目２．５ｍｇ、１２日目１．２５ｍｇ）；ｄ）総供与量＝２．５ｍｇ／マウス（１１日目１．２５ｍｇ、１２日目１．２５ｍｇ）；ｅ）総供与量＝１．２５ｍｇ／マウス(１１日目１．２５ｍｇ)。腫瘍移植後１８日目（細菌接種後１０日目）に、全てのマウスは飲料水に０．２ｍｇ／ｍｌのエンロフロキサシン系抗生物質(BAYTRIL^TM)を添加して投与され、この抗生物質の補給は２週間続行された。腫瘍の成長はカリパス計測によって査定され、１立方ミリメートル中の量として計算された。マウスは、その腫瘍の計測の合計、即ち、長さ＋幅＋高さが６０ｍｍに達した時点あるいは瀕死の状態（無表情、飲水停止）になった時点で安楽死処分され、死亡として記載された。得られた結果は表１９（Ａ）の第１１Ｃ−Ｈ図に示した。腫瘍細胞接種後の死亡時間Ｂ１６Ｆ１０メラノーマのできているマウスに対する各種処理のプロトコールによる結果は以下の通りであった。１）細菌接種をしていない腫瘍のできているマウスに対するＧＣＶの効果メラノーマ細胞は接種されているが細菌は細菌は接種されていないマウスを腫瘍接種後１１−１２日目に、実験によっては、３．７５−１０ｍｇ／マウスの供与量でＧＣＶで処理した。全ての試験において、ＧＣＶ処理はしたが細菌処理はしていないマウスは腫瘍の量の若干の減少をみせたが、それは、第１１Ｃ−Ｅ図に示すように、ＧＣＶ処理の５日間の間は顕著であり、そして実験の継続期間中持続した。ＧＣＶはまた、表１９（Ａ）に略述したように、非処理の対照マウスのそれと比較して若干であるが再現性のある増加を引き出した。細菌処理をしていないＧＣＶのこれらの効果は、検討された範囲を超えた投薬量によるものではなかった。これらの結果は、実験において使用されたＢ１６Ｆ１０細胞がＧＣＶを有毒なリン酸化形に転換する能力を有していたのかもしれないことを示している。この様な見解と一致して、第１１−Ｆ図に示すように、培地に２５μｇ／ｍｌのＧＣＶを補給すると培養物中のＢ１６Ｆ１０メラノーマ細胞の増殖が有意に抑制されるが、１０μｇ／ｍｌでは駄目であることが分かった。クラウドマンＳ９１メラノーマ／マクロファージ雑種４８ができているが細菌を接種されていないＤＢＡ／２Ｊマウスに対するＧＣＶの同様の効果は表１９に報告されている。２）細菌処理されているがHSV TKプラスミドを含有していない腫瘍のできているマウスに対するＧＣＶの効果腫瘍のできているマウスにHSV TK遺伝子を含有しないサルモネラ菌株ＹＳ７２１１，ＹＳ７２１２及びＹＳ７２１３を接種し、次いでＧＶＣで処理すると、ＧＶＣに仲介された腫瘍成長の抑制が明らかであった。ＧＣＶによって達成された腫瘍抑制は、たとえ対照マウスにおけるＢ１６Ｆ１０腫瘍に対するＧＣＶの抑制効果を考慮に入れたとしても、細菌のみによる場合に見られるそれよりも有意に大きかった。このことはSalmonella typhimuriumが、恐らく内性ホスホトランスフェラーゼ酵素によってHSV TK遺伝子無しでＧＣＶを有毒なリン酸化形に転換することができたことを示している(リトラー等、１９９２年、Ｎａｔｕｒｅ、第３５８巻、１６０−１６２頁；サリヴァン等、１９９２年、Ｎａｔｕｒｅ、第３５８巻、３６２−３６４頁)。この見解と一致したのが、表１９（Ａ）に示した、腫瘍成長を抑制することに加えて細菌とＧＣＶ処理のいくつかの組み合わせが非常に有毒で、マウスの生存時間を短縮するという表１９（Ａ）に示した結果である。毒性は、肝臓あるいは骨髄といった正常細胞に住み着いたそれらの細菌によるリン酸化ＧＣＶの生産が原因だったかもしれない。３） HSV TKプラスミドを含有する細菌で処理された腫瘍のできているマウスに対するＧＣＶの効果第１１−Ｇ図に示すように、HSV TKプラスミド含有サルモネラクローンＹＳ７２１１（ＹＳ７２１１／ｐ５−３）を接種された腫瘍のできているマウスは、たとえＧＣＶ処理がなされていなくとも腫瘍成長の抑制と生存の延長を示した。更に、腫瘍とＹＳ７２１１／ｐ５−３両方を有し、加えて３．７５ｍｇのＧＣＶで処理をしたマウスはＧＣＶがない場合に見られた以上に有意な腫瘍成長の抑制を示した。ＹＳ７２１１／ｐ５−３をベクターとして用いると、第１１−Ｈ図に示すように、腫瘍移植後２８日目に測定するとＧＣＶに仲介された腫瘍抑制が供与量作用的に明らかであった。腫瘍抑制は、ＹＳ７２１１／ｐ５−３は接種されたがＧＣＶ処理はされていないマウスと比較すると、いくつかのカテゴリーのＧＣＶ処理された腫瘍のできているマウスについての平均生存時間が増加したことと相互関係にあった。要約すると：１）サルモネラを接種されていない腫瘍のできているマウスでは、ＧＣＶは腫瘍に対し小さな抑制効果を有していたが、それは生存の延長の短いことと相互関係にあった。２） HSV TKプラスミド非含有サルモネラを接種された腫瘍のできているマウスは、細菌処理をされていないマウスに見られるもの以上に、ＧＣＶに反応して顕著な腫瘍抑制を示した。また、ＧＣＶと細菌処理の組み合わせのいくつかはマウスに対して非常に有毒であるが、、恐らく肝臓あるいは骨髄のような腫瘍外組織に存在する細菌によるＧＣＶの有毒形への転換によるものであろう。３） HSV TKプラスミド含有サルモネラを接種された腫瘍のできているマウスもまたＧＣＶに反応して強い腫瘍抑制を示した。これらの実験にでは、ＧＣＶのリン酸化における内在性のサルモネラ酵素と比べてのHSV TKの相対的貢献度を評価することはできなかった。しかしながら、HSV TK発現プラスミドヲ含有するベクタークローンを用いると、ＧＣＶに仲介された腫瘍抑制及び生存延長は供与量依存的に表された(第１１−Ｈ図参照)。１７．実施例：ＮＵ／ＮＵマウス中で成長したヒトの腫瘍内における Salmonella typhimurium の局在以下の実験は、実験動物中のヒトの腫瘍内におけるサルモネラの局在を証明する。１７．１．ヒトの結腸腫瘍内におけるサルモネラの局在ＮＵ／ＮＵ（ＢＡＬＢＣ）マウス（９−１０週齢）の二つの区域（肩と脇腹）にそれそれ１．５ｘ１０⁷個のＨＣＴ１１６ヒトの結腸癌腫細胞を皮下接種した。触診可能な血管化腫瘍が現れてから(約２週間)、マウスに更にＨＳＶチミジンキナーゼ遺伝子を有するSalmonella typhimurium過感染性クローン７２^5-3-2 を３ｘ１０⁵腹腔内接種した。感染から３．５時間、２１時間及び７２時間後、マウスをメトフェンで麻酔をかけて安楽死させた。腫瘍と肝臓を無菌的に摘出し、無菌ＮａＣｌ（０．９％）で濯ぎ、計量し、５：１の割合でＬＢブロスとホモジナイズした(容量ブロス：重量腫瘍)。７２時間目に、ホモジナイゼーションに先立って、切片（１−２ｍｍ³）を典型的な腫瘍から切り取り、１／２強度のカルノフスキー固定液で固定し、電子顕微鏡を用いて分析処理をした。ホモジネート中の細菌はＬＢ平板に塗布し、３７℃で一晩培養し、細菌のコロニーを計数して定量した。結果は以下の通りであった。３．５時間目と２１時間目は、たとえホモジネートを希釈せずにＬＢ寒天平板に塗布した場合でも、腫瘍あるいは肝臓には微々たる程度の細菌が存在していた。しかしながら、３日後、３／６のマウスが結腸腫瘍中にサルモネラを高いレベルで示したが、細菌性腫瘍：肝臓の比は３６，０００：１に及んだ。これらのマウスのデータは下記の表２０に要約してある。第１２−Ａ図示したのはマウスＡ（表２０）から摘出したＨＣＴ結腸腫瘍の切片の電子顕微鏡写真で、その切片中のサルモネラの数は６．９ｘ１０⁸／腫瘍１ｇであることが分かり、感染細菌の腫瘍：肝臓の比率は２６，５００：１であった。顕微鏡写真に写っているのは腫瘍が結合した好中球の細胞質中の空泡内の数多くのSalmonella typhimuriumである。細菌のいくつかは、矢印で示したように分裂をしている。好中球、即ち、多形核白血球は多葉核（ｎ）を特徴としている。腫瘍結合好中球内のサルモネラはまた、本明細書に既に記載したように、感染したＢ１６Ｆ１０メラノーマ内にも見られる。腫瘍のできているマウスの感染に伴う結腸とメラノーマ腫瘍結合好中球の両方における細菌の存在は、サルモネラが腫瘍細胞に対する宿主細胞免疫応答を刺激したのかもしれないことを示唆している。腫瘍免疫の増強は、寄生菌の腫瘍特異的治療用ベクターとしての利用においてこの様にもう一つの潜在的利点なのである。１７．２．各種ヒト腫瘍内のサルモネラの局在ＮＵ／ＮＵ（ＢＡＬＢＣ）マウス（９−１２週齢）の左肩領域に１−１．５ｘ１０⁷個のＡ５４９ヒト肺癌種細胞、ＨＣＴ１１６ヒト結腸癌腫細胞、ＣＲＬ１６１１ヒト腎癌腫細胞あるいはＨＴＢ５２ヒト肝癌細胞(American Type Cultu re Collection)を皮下接種した。触診可能な腫瘍が現れたら、マウスに更にヒトの肺、肝臓及び腎臓腫瘍のできているマウスにはSalmonella typhimuriumクローン７２そしてヒトの結腸腫瘍のできているマウスにはクローン７２^5-3-2を２− ５ｘ１０⁵c.f.u.腹腔内接種した。クローン７２^5-3-2はＨＳＶチミジンキナーゼ転写単位を有している。マウスの殺処分の６６−６９時間後、腫瘍と肝臓を摘出し、計量した。腫瘍は５容量ブロス／１含水重量ｇの組織中でホモジナイズした。ホモジネートはＬＢ寒天平板上で系列希釈して細菌数を定量した。結果は表２０（Ａ）に記載してあり、ｎ＝３−４のマウスについての平均±標準偏差を表している。表２０−Ａに示したように、ＮＵ／ＮＵマウスに腹腔内接種をすると、Salmon ella typhimuriumクローン７２は肺、結腸、腎臓及び肝臓のヒト癌腫を的として、それらの癌腫の中で増殖することができて、常にではないが、一般的に１０⁸ −１０⁹／腫瘍１ｇに達した。用いたＢＡＬＢ／ＣＮＵ／ＮＵマウスでは、皮膚は無毛で半透明であった。従って、全ての腫瘍が血管化したことが目視的に測定するができた。サルモネラに感染した腫瘍の含水重量の範囲は、肺癌種で２２０−６００ｍｇ、結腸癌腫で１６０−６００ｍｇ、肝癌腫で７０−１２０ｍｇ、そして腎癌腫で４０−２５０ｍｇであった。細菌のコロニーを、クローン７２の接種後９６時間目の腎癌腫と肝癌腫のできているマウスから得た肝臓と腫瘍のホモジネートから無作為に採取し、重複平板培養で表現型を検査した。検査した全てのホモジネート中、５０／５０コロニーがＡｄｅ^-及びＸｙｌ^negであることが分かった。これはクローン７２の表現型と一致した。結果は更に、Salmonella typhimuriumの派生菌は腫瘍の由来あるいは大きさとは関わりなく広範な固形腫瘍のための治療用ベクターとして役に立つという見解を支持している。いくつかの研究において、Salmonellaクローン７２及びその派生菌は、Ｃ５７Ｂ６マウス中のＢ１６Ｆ１０メラノーマの場合の大きな壊死領域を伴う４−８ｇの腫瘍と同様に、ＮＵ／ＮＵマウス中のヒトの腫瘍の場合４０− １００ｍｇもの小さな高度に血管化された腫瘍を的とし、その中で増幅した。小さな血管化された腫瘍を的とし、その中で増殖する能力は、治療用腫瘍ベクターとしてのSalmonella typhimuriumの別の利点を示している。１７．３．ヒトの肺癌種Ａ５４９内のSalmonella typhimuriumの電子顕微鏡写真による局在マウスの左肩区域に５ｘ１０⁶個のＡ５４９細胞を皮下接種した。６週間後、腫瘍は触診可能となり、マウスは６６時間３ｘ１０⁶のSalmonella typhimurium クローン７２を腹腔接種された。マウスを殺処分し、腫瘍の一部をホモジナイズし、１．６ｘ１０⁹個／ｇのSalmonella typhimuriumが含まれているのを発見した。腫瘍の中心部分を電子顕微鏡写真解析のために以下のように下準備した。主要部分を１−２ｍｍ³の細片に切断し、１／２強度のカルノフスキー固定液に４ ℃で６時間固定し、次いでカコジル酸緩衝液中で一晩洗浄した。腫瘍組織はカコジル酸緩衝液中で2時間1％O_SO₄及び1.5％フェロシアン化カリウムを用いて後固定シ、スパー(Spurr)樹脂中に包埋した。超薄切片は酢酸ウラニル及びクエン酸鉛で染色した。染色した切片は、ツァイス109電子顕微鏡で写真撮影した。比較の目的で、第12−B図の電子顕微鏡写真中のS.typhimuriumは、マウスを実験的に感染させた後に腸の上皮細胞中に以前にあらわれたもの(竹内;1967年、Am．J．P athol.、第50巻、109-136頁)と類似しているようであることに注目すべきである。第12−B図に示したものは、上部左に見える単細胞―恐らく好中球であろう― 内に含まれていると同様の細胞外空間の矢印で示した多数のSalmonella typhimu riumである。同様に視域に見えるものは、細胞片と共に大きな細胞内空間で示されているように、死にかけているように見える二つの身元不明の細胞である。１８．実施例：栄養要求性突然変異体への突然変異によるSalmonella Typhimuri umの弱毒化下記の研究は、クローン７２（例えば、上記第15.2項参照）の菌力の低下がPur^-表現型に基づくことを証明する。また、下記では、Ade^-,Ilv^-,Arg^-,Aro^- ,及びUra^-の表現型のそれぞれ異なる組み合せを発現する（栄養求性突然変異体として分離された非病原性の誘導体）クローン７２についてさらに分析する。１８．１栄養要求性突然変異体への突然変異クローン７２は栄養要求性突然変異に関して検査され、増殖するためにはアデニン及びビタミンB1が必要であることが分り、これはプリン生合成経路において突然変異が起こったことを示した(Pur^-)。監視されたクローン７２の弱毒化が、Ade^-の突然変異に基づくものであるかないかを証明するために、次のような実験をデザインした。第7.1項に記載されているように、紫外線照射及びニトロソグアニジンによって野生型菌株14028の集団及びクローン７２の集団の突然変異を誘発した。突然変異が誘発された菌株14028の集団からは３つ別のPur^-栄養要求性突然変異体のクローンが分離され、これらをクローンN,Q,及びTと示した。突然変異が誘発されたクローン７２の集団からは３つ別のPur⁺復帰突然変遺体のクローンが分離され、これらをクローンR,U,及びWと示した。各C57B/6マウスの腹腔内にそれぞれ得られた菌株のSalmonella typhimu riumを２ｘ１０⁶c.f.u注入した。マウスは自由に飲み食べできるようにさせ、かごの中の死んだ或は死に掛けているマウスについて監視を行った。死に掛けているマウス（無関心、飲むことを止める）は安楽死させ、死んだマウスと一緒にカウントした。細菌の注入から10日又は30日間後には生き残った動物も安楽死させた。結果は表20（Ｂ）に開示する。結果はn=8-12匹の動物の平均±SD 表20（Ｂ）に示されているように、クローン７２は野生型菌株14028よりも弱毒化していた。しかし、クローン７２の３つのPur^-復帰突然変異体（U、W 、及びT）は14028とほぼ同様の菌力を発現した。逆に、菌株14028から分離した３つのPur^-栄養要求性突然変異体（T、N、及びQ）は14028又はクローン７２によりも弱毒化していた。クローン７２からさらに栄養要求性突然変異体を分離した結果、よリ弱毒化したものが得られた。例えば、クローンYS721はクローン７２のイソロイシン・バリンを要求する誘導体（Ilv^-）であり、このクローンYS721はクローン７２よりもかなり弱毒化していた。同様に、クローンYS7211（Arg^-）YS7212(Ura^-) 、YS7213（Aro^-）等のクローンYS721の栄養要求性突然変異誘導体はYS721自体よりも著しく弱毒化していた。１８．２重感染表現型クローン７２はこれの栄養要求性突然変異のプリン要求性体とは遺伝子的に別のものであることを示す証拠第18.1項に記載された各種のSalmonella typhimurim Pur^-及びPur⁺の菌株は培地で人M2黒色種細胞に感染できるか検定した。使用された試験管内の感染検定は第18.1項に記載されている。結果は表20（Ｃ）に開示する。結果は３重感染の平均±SDである。細菌は、稀釈及び感染検定する前にOD₆₀₀＝0 .600までLBの肉汁中培養した。表20（Ｃ）に示されているように、野生型14028に比べ、クローン７２は人M2黒色種細胞に重感染することが見られた。どの14028Pur^-誘導体も感染力については菌株14028とはたいした差は無かった。また、各クローン７２Pur⁺誘導体はクローン７２自体と同じような重感染力を発現した。このような結果は、マウスでの菌力の低下につながるプリン要求性を発現するクローン７２が遺伝子的にクローン７２の重感染表現型とは別のものであることを証明する。要するに、このような結果は、突然変異又はプリン栄養要求性突然変異からの復帰等はクローン７２の重感染表現型の発現を起こさないことを証明する。１８．３ Salmonena typhimurimクローン７２の弱毒化された誘導体の重感染表現型の保持下記の実験により、第18.1項で開示された、クローン７２の栄養要求性突然変異誘導体の感染力を試験管内で検定した。評価されたSalmonellaのクローンの表現型は上記第18.1項の表20（Ｂ）に示されている。第10.1項記載の感染検定を使用した。結果は表20（Ｄ）に開示する。結果は10-19別感染の平均±SDである。細菌は、稀釈及び感染検定する前にOD₆₀₀ ＝0.5までLBの肉汁中培養した。 M2黒色種への感染力について、YS721、YS7211、及びYS7212のSalmonena typhimurimクローンは、クローン７２よりもはある程度低いが、野生型菌株140 28に比べ重感染し、これは重感染表現型を分部的保持することを示す。これに対して、クローンYS7213（Ade^-、Ilv^-、Aro^-）は、M2黒色種への感染力が野生型菌株14028と比べ30倍低く、感染力がかなり衰えていることが分る。１８．４栄養添加物又はB16F10黒色種の抽出物中でのPUR^- 又はURA^-Salmonella typhimurimの突然変異体の成長腫瘍抽出物を次のように調整した。B16F10黒色種腫瘍細胞（5x10⁵）を6 8週目のメスC57B6マウスの皮下に移植した。３から４週間後にマウスを殺し、腫瘍を無菌状態で切除し、迅速に−２０℃の温度で凍結した。合計５１ｇのプールされた凍結腫瘍を４℃で解凍し、１時間冷たい状態で255mlの水(５vol)の中で、キャプされたバーテス（Virtis）細胞ホモジナイザーにより激しくホモジナイズした。得られたホモジネートを10％としてトリクロロ酢酸(ＴＣＡ)と混合し、15 分間氷につけ、ベックメン（Beckman）J21遠心機により15分間約20,000ｘｇで４ ℃の温度で分離した。続きの工程は常温で行った。透明であり、無色の上清分別 (300ml)を無水エーテルの１ボリューム(300ml)の中１分間手で振り抽出した。抽出する間に、混合を落ち着かし、エーテル、抽出されたＴＣＡ、腫瘍から抽出されたエーテル溶解化合物などを含む上層を吸引し、認可された環境保護工程に従って捨てた。５回の抽出サイクルの中で、蒸留水のｐＨと同じようにｐＨが（最初）１から（最後）4-5まで上がった。これはＴＣＡが効果的に除去されたことを意昧する。水層を窒素の流れによって15分間泡立てた。この間、エーテルの臭いが無くなった。次に液体を0.2ミクロンのフィルターによって濾過し、アリクウットに分割し、検定に直接使用したか、又は、後に使用するために-20℃で保存した。野生型菌株14028、これの栄養要求性突然変異誘導クローン７２（Pur^- 、ビタミンＢ1^-）及びYＳ7212（Ade^-、ビタミンＢ1^-、Ilv^-、Ura^-）を一晩ルリア（Luria）肉汁に35℃で斜面培養させた。次の日に、0.1ｍｌの栽培を10ｍｌの培地56(0.037 M KH₂PO₄,0.06 M Na₂HPO₄,0.02％MgSO₄-7H₂O,0.2％(NH₄)₂SO₄,0.0 01％Ca(NO₃)₂,0.00005％FeSO₄-7H₂O)に稀釈し、さらにこれに0.2μｇ/mlビタミンＢ1,33μｇ/mlアデニン，50μｇ/mlウラシル，83μｇ/mlイソロイシン，83μ ｇ/mlバリン，0.3％グルコースを追加し、これをロータに37℃で一晩培養させた。次の日に、栽培を遠心沈により収集し、プレーン培地56(1ｍｌ栽培に９ｍｌ培地56)に再懸濁した。これら懸濁液のアリクウット(0.25ｍｌ)を次にように追加成分を含めた培地56に加えた。 A.培地56及びグルコース； B.培地56及びグルコース、ビタミンＢ１、アデニン、イソロイシン、バリン、とウラシル；及び C.培地56及び腫瘍抽出物(10％)。細菌を37℃の渦巻状水溶液器に置き、成長をOD₆₀₀の関数として分光計によって計測した。全て栽培の最初の光学濃度は0.005-0.07の範囲であった。図15A-Cに示されているように、野生型菌株14028は３つの培地（基本的の培地56及びグルコースも含む）ではほぼ同じ率で成長した。野生型とは異なり、クローン72又はクローンYS7212は培地56及びグルコースでは成長できなかった。これは寒天の複製プレートで初めに監視された栄養要求性を示す。しかし、クレーン72及びクローンYS7212は培地56及び10％腫瘍抽出物の中では成長することができた。同じように調整した肝臓抽出物もクレーン72及びクローンYS7212の成長を支持することができた。発明者らは特定の仕組みに限定されたくはないが、しかし、Salmonella の栄養要求性突然変異菌株の成長は栄養物の利用性に基づくので、腫瘍の環境が理論的には栄養物を提供することができることにおいて(例えば、腫瘍の壊死部分又は活発に分裂細胞中で)、このような栄養要求性突然変異体は腫瘍ベクターとして有利であると考える。従って、Salmonellaの栄養要求性突然変異体などの突然変異は試験管内では菌力が低下するものの、これの集団選択及び増殖を固形腫瘍中で行うことができる可能性がある。 18.5培養ヒトM2メラノーマ細胞中でのSalmonella Typhymurium PUR^-及びURA^-変異体の増殖この節では培養M2メラノーマ細胞の内部環境がこれらの栄養要求性クローンの要求するものを与えることができることが示されている。なぜならば、クローン 72及びクローンYS7212は好気的条件下で培養したM2メラノーマ細胞中に侵入した後、数回の分裂を行い得るからである。 Salmonella typhimuriumクローン72及びYS7212をO.D.₆₀₀=0.8、または約10⁹cf u/mlとなるまで増殖させた。2種の株をヒトM2メラノーマ細胞の培地に上記7.2節で述べたように、10⁶cfu/mlとなるように添加した。感染15分後、真核細胞培養物を新鮮な培地及びゲンタマイシン(10μｇ/ml)含有する培地で洗った。6時間以上にわたり1時間ごとにSalmonella/10⁶メラノーマ細胞の定量のために第7.2節に記載のとおり、処理した。さらに、対照としてメラノーマ細胞を含まないが細菌を含むフラスコを、メラノーマ細胞を含有する本実験用フラスコと同時に処理した。結果は図15-Dに示す。対照として用いたSalmonellaを含むがメラノーマ細胞を含まないフラスコでは6時間以上経過しても生きた細菌が認められなかった。このことはゲンタマイシン処理と組み合わされた洗浄処理は、動物細胞内への移動による保護がなかった生きた細菌全てがうまく排除されたことを示している。これに対して、M2メラノーマ細胞の存在下ではSalmonella typhimuriumクローン72 及びYS7212は、それぞれ非常によく増加し、その数は2時間ごとに2倍になりつつ 6時間以上にわたり増加した。位相差及び電子顕微鏡での分析では、メラノーマ細胞は感染したSalmonellaを空胞の中にコンパートメント化してしまうことができることを示している。これらの結果はメラノーマ細胞中のSalmonellaの増殖のネットの速さは定常状態機能であり、要求される栄養素の供給をメラノーマ細胞が行うことによって栄養要求株の増殖を刺激し、またその抗菌機構によって栄養要求株の増殖を抑制もすることを示している。 18.6 Bl6 メラノーマを有するC57B6マウス体内のSalmonella typhimurium自家栄養性弱毒化株の生体内分布これらの研究はYS721、YS7213、YS7211、及びYS7212クローンのin vivoでの腫瘍を標的とする能力及び腫瘍中で増殖する能力を示している。 C57B6マウス(雌,6-8週令)の皮下(左側腹部)に、B16F10マウスメラノーマ細胞を2.5-5.0 x 10⁵個接種した。腫瘍が約0.5gに達したとき(腫瘍接種14-16日後)、そのマウスの腹腔内にさらに指定の株のS．typhimuriumを接種した。菌接種量は 14028株及び72株では4 x 10⁵cfu/マウス、YS721、YS7211、YS7212、及びYS7213 株では2-4 x 10⁶cfu/マウスとした。菌接種の40及び96時間後にマウスを屠殺し、腫瘍と肝臓を無菌的に摘出し、滅菌食塩液(0.9%)で洗浄し、重量を測定し、LB ブロス中に5:1の比で(容量：腫瘍重量)ホモゲナイズした。菌数の計測はそのホモゲネートをLBプレート上に蒔き、37℃で一晩インキュベートして、細菌のコロニー数を数えることにより行った。結果は表20(E)に4-7匹の動物の平均±SDで示す。全例で初回接種時の10-1000倍の数のSalmonella typhimuriumが認められたことに示されるとおり、供試の各株とも腫瘍細胞を標的とし、腫瘍中で種々の度合いで複製することが可能であった。さらに、全例において腫瘍：肝臓比(菌数/g 組織重量)は少なくとも35:1でありいくつかの例では10⁴に近い値であった。表20 (E)に示した、本研究に用いられた腫瘍の重量は0.5-2.0gの範囲であった。供試の全菌株及び試験条件においてクローン72は最も高い腫瘍：肝臓比を接種40時間後に示した。さらにSalmonella typhimurium14028株はクローン72及びその派生株と同様に、より大きなB16F10メラノーマ細胞、例えば4-8gのものも標的とすることができ、その中で増殖することができた。さらに、第10.3.2節及び表12Aに示すとおり、クローン72はわずか40mgのヒト固形腫瘍を標的としその中で増殖することができる。しかし、クローン72及び野生株である14028の双方ともC57B6マウス、特に腫瘍を有するマウスに対して非常に毒性が強かった。例えば、B16F10 メラノーマを有するC57B6マウスに14028株及び72株を注射したときの、菌接種後平均生存期間は、それぞれ2.1±0.4日間(n=6)、及び4.7±0.5日間(n=9)であった。従って、これらの株の96時間時の生体内分布は測定しなかった。同様に、クローンYS721では、14028やクローン72に比べると弱毒化されてはいるが、メラノーマを有するマウスに毒性がある。例えばB16F10メラノーマを有するC57B6マウスにクローン721を注射したときの平均生存期間は8.1±0.2日間(n=11)であった。S almonellaクローンYS7211、YS7212、及びYS7213、それらは調べたもののうちで最も毒性が少ないものだが、その各クローンとも、接種96時間後10⁹cfu/g腫瘍重量の菌の密度を示し、その際の腫瘍：肝臓の比はそれぞれ253:1、220:1、5900:1 であった。 18.7 腫瘍を有するマウス中でのSalmonella typhimurium栄養要求株のインキュベーション後の表現型の安定性栄養要求性表現型の遺伝的復帰が起こると、理論的には、前もって弱毒化した株の毒性が増加する結果となりうる。それ故、腫瘍を有するマウス中への接種後のYS7211、YS7212、及びYS7213株の栄養要求性表現型の安定性を調べた。 YS7211、YS7212、またはYS7213のいずれかの株接種40時間後の動物の肝臓及び腫瘍のホモゲネートから得たSalmonella typhimuriumをLBプレートから採取し、最小寒天培地に種々の組み合わせで栄養素を添加したプレートで複製させた。添加した栄養素は、イソロイシン、バリン、アデニン/ビタミンB1、アルギニン、ウラシル、芳香族アミノ酸類、及びブドウ糖である。3種の株のそれぞれにおいて、腫瘍からと肝臓のホモゲネートから回収した細菌クローン(50/50)は、最初に接種した株から期待される表現型を現し、このことはここでの試験条件ではこれらの株は遺伝的に安定であり、事実上復帰を起こさないことを示している。しかしながら、ここで試験に用いた栄養要求株はこれらの研究を通じて全く安定であったというわけではないことは明記すべきである。いくつかの場合には遺伝的復帰体が認められ、それはYS7211株において最も顕著で、Arg^-からArg⁺への復帰が認められた。例えば、96時間前にチミジンキナーゼ遺伝子を含むプラスミドをもつクローンYS7211を接種された腫瘍を有するマウスでは、その肝臓から単離された細菌の50のうち50とも、Pur^-、Ilv^-、及びArg^-であったが、このことは、マウスの体内で復帰突然変異及び変異体の選択的な増殖が行われていることを示している。クローンYS7211、YS7212、及びYS7213の栄養要求性表現型がマウスにおいてかなり安定であるという知見はこれらの株を接種されたマウスが長期間生存可能であったということからも支持されるものである。 18.8 Salmonella typhimurium の栄養要求性変異株を接種された、腫瘍を有する C57B6マウスにおける腫瘍増殖の抑制及び生存の増加 C57B6マウス(雌、5-7週令)の左肩領域の皮下に、培養液中で増殖させた5ｘ10⁵ 個のB16F10メラノーマ細胞を接種した。腫瘍細胞接種8日後にそのマウスにさらに2-4 x 10⁶ cfuのSalmonella typhimurium YS721、 YS7211、YS7212、またはYS 7213株を腹腔内に接種した。腫瘍の増殖は定期的に長さ、幅及び高さをキャリパーを用いて測定して評価し、腫瘍の体積をmm³で計算した。腫瘍増殖の結果は表1 6A-Dに5匹中5匹が生存した群について5匹の平均±SDで表した。表16A-Dでデータをプロットした際、ある群で1匹以上の動物が死亡した時点以降は生存動物の平均腫瘍サイズは示していない。動物への腫瘍移植33日以後は、その時点でクローンYS7211で処置された腫瘍を有する動物が5匹中5匹とも生存していたとしても腫瘍の計測は中止した。動物の飲食は自由に行わせた。菌接種の23日後(実験#1)または10日後(実験#2)に、対照のマウス、菌処置マウスとも、Baytril^TM(エンロフロキサシン0.2mg/ml飲料水) を投与し、この抗菌剤を計2週間維持投与した。実験#1ではマウスが瀕死状態(大儀そうな状態、飲水の停止)または死亡に至った時点に注目した。結果は表20(F) に各試験条件での平均生存日数±SDで示す。実験#2においては、腫瘍が4gの大きさになった時点で屠殺し、実験#1に記載したようなその他の死亡と併せて死亡したものとして計算した。生存期間の計算に２つの実験で異なる方法を用いたため、実験#2においては対照群の生存期間(26日間)は実験#1の場合(28日間)に比べやや短いものとなった。上記の結果は5匹の動物の平均±SDを示す。図16A-Dは、５ x 10⁵B16F10メラノーマ細胞をC57B6マウスの皮下に接種した後の経過時間に対する腫瘍の体積(mm³)の平均±SDを示す。Salmonellaの4種の株の全てすなわちYS721、YS7211、YS7212、及びYS7213株において、動物での腫瘍増殖の抑制が認められた。クローンYS721はAde^-及びIlv^-栄養要求性で弱毒化されているが、それにも関わらず腫瘍を有するマウスに対して毒性があり、その結果、対照とした菌接種を受けていない腫瘍を有するマウスと比べて生存期間の延長は認められなかった。対照としたマウスの死亡が明らかに腫瘍が極めて大きくなったこと(4-8g)によるのに対し、クローンYS721を接種した腫瘍を有する動物の死亡は細菌の毒性によるものと考えられた。なぜならそれらの動物では腫瘍の負荷は小さく、それ自体では生命を脅かすものとは考えられないからである。死亡時に腫瘍は触知不可能から0.5g未満の大きさであった。これに対し、腫瘍を有するマウスをクローンYS7211、YS7212、またはYS7213株、各々はYS721株ほど毒性は強くないが、それらで処置したものでは、腫瘍増殖の抑制に加え、生存期間の有意の延長が認められた。個々のSalmonellaクローンによる腫瘍増殖の抑制度は表16A-Dに示すとおり、それらのクローンの生存期間延長能(表20(F)に示す)と相関していた。腫瘍が1g(1000mm³)に達するまでの平均期間は、対照群で約18日、YS7213及びYS7211で処置された群が31日、YS7212で処置された群が45日(外挿した値)であった。このことは平均の生存期間と相関しており、腫瘍を有する対照動物では26日であるのに対し、クローンYS7213、YS7211 、及びYS7212ではそれぞれ38、41、及び55日であった。供試したSalmonellaの弱毒化株のうちでは、腫瘍増殖抑制及び生存期間延長に対する効力の強い順にYS7212>YS7211>YS7213であった。抗菌剤による治療、すなわちエンロフロキサシンを接種後10日目に投与したものと23日目に投与したものとを比べると、早く開始した場合はSalmonellaを接種した腫瘍を有する動物の生存期間の延長が認められたが、対照群では認められなかった。 18.9 シトシンデアミナーゼを発現している栄養要求性Salmonella typhimurium の抗腫瘍活性 B16F10の実験的転移モデルを、１ x 10⁵個のB16F10細胞をC57B6マウスに、外側尾静脈から注入することにより作製した(Day 0)。シトシンデアミナーゼ発現構築物(CD構築物については図4Eを参照せよ)(約1 x10⁷ CFU/ml)を持つYS7212菌懸濁液0.2mlのアリコートをDay 5にマウス腹腔内に注射した。Day 7に5-フルオロシトシン(5-FC)0.4mlアリコートをPBS中に10mg/mlとなるように溶解したもの( 最終投与量：200mg/kg)を、マウス腹腔内に注射した。動物の死亡は毎日記録した。結果は図17に示す。 CDと5-フルオロウラシルの組み合わせはB16F10の肺転移を有するSalmonella発現動物の生存を延長させることを図17は明瞭に示している。 19．実施例：リポ多糖生合成過程の変異によるSalmonella typhimuriumの弱毒化 LPSの経路に遺伝的及び酵素的に損傷を持つ(Raetz，1993，J.Bacteriol．175: 5745-5753)Salmonella typhimuriumとE．coliの変異体数種を単離した。そのような変異体の一つであるfirA^-変異は、エンドトキシン生合成の第三ステップを調節するUDP-3-O(R-30ヒドロキシミリストイル)-グリコシアミン N-アシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子内の変異である(Kelleyら，1993，J.Biol.Ch em．268:19866-19874)。このタイプの変異を有するSalmonella typhimuriumとE. coliの株は、野生型のリピドAとは異なるリピドAを産生し、そのリピドAは7番目の脂肪酸、ヘキサデカン酸を持ち(Roy and Coleman，1994，J．Bacteriol．176: 1639-1646)、リピドA 4'キナーゼ活性が減弱している。 firA-変異体のヒト単球によるTNFα産生の誘発能及びマウスの固形腫瘍を標的とする能力について検討した。 19.1 Salmonella typhimurium firA^- の、ヒト単球によるTNFα産生の誘導能 Salmonella typhimuriumのSH5014株及びそのfirA^-派生体であるSH7622についてはHirvasら，1991，EMBO J．10:1017-1023が述べている。これらの株の遺伝型は次のとおりである。 SH5014株 ilv-1178 thr-914his-6116 metA22 metE551 trpB2 xyl-404 Hl-b H2- e,n,x flaA66 rpsLl120 rfaJ4041; SH7622株 ilv-1178 thr-914 his-6116 metA22 metE551 trpB2 xyl-404 Hl-b H2 -e,n,x flaA66 rpsL1120 rfaJ4041 ssc-1(firA^ts) Salmonella typhimurium firA^-株SH7622の派生体の一つをとりSH7622-64と名付け、本節及び下記の第19.2節の実験のfirA^-株として用いた。SH7622-64は抗生物質ノボビオシンに対する超高感受性とfirA^-株の特徴である温度感受性の増殖の故に選択した。 Salmonella typhimurium14028株、その派生体であるクローン72、クローンYS7 212、及びクローンYS7213、及びSH5014とそのfirA^-派生体であるクローンSH7622 -64から次のとおりLPSを抽出した。それらの菌をLBブロス中で0.D.₆₀₀=0.9または約2x 10⁹ cfu/mlとなるまで増殖させた。菌体を遠心して集め、10¹²個の細菌を含むペレットとし、ペレットを取り出し-20℃で凍結保存した。LPSを抽出するため、ペレットを18.3mlの水に再懸濁し、15mlの再蒸留フェノールを加えた(水: フェノール，55:45，vol/vol)。混合液を振盪ウオーターバス(69-70℃)中に1時間置いて単相混合液とし、次いで氷上で冷却した。冷却すると混合液は主としてタンパク質を含むフェノール相とリポ多糖類及び核酸を含む水相(Galanos，C.,L uderitz，O.，およびWestphal，O.，1969)に分離した。水相を凍結乾燥し、白色のふわふわした凍結乾燥品をLPSのソースとして用いた。LPSの重量を測定し、1m g/mlの濃度に水で溶解し、下記のヒトマクロファージとのインキュベーションでの希釈のストック液として用いた。ヒトマクロファージは下記のとおり調製し、全ての操作は室温で行った：健康なヒトボランティアから血液60mlをヘパリンを入れた試験管中に採取した。15ml のCorning Plastic Centrifuge遠心管中の4mlのIsolymph^TM(密度-1.077g/ml,9.0 ｇジアトリゾン酸ナトリウム、及び5.7ｇFicoll400^TM/100ml; Pharmacia Fine C hemicals，A.B．Uppsala，Sweden)上に血液7mlアリコートを重層し、2000x gで4 5分間遠心した。赤血球はIsolymph^TM層を通ってペレットとなり、好中球及びその他の細胞はこのインターフェースの上に独立したバンドを形成して沈降し、リンパ球/マクロファージバンドの上に血清がその黄色によって認められる。各遠心管から血清をピペットで除去し、プールして約30mlの総液量とし、下記の培地への添加用に保存した。リンパ球/マクロファージバンドをプールして約15m lの総液量とし、40mlのRPMI 1640培地で希釈し、1000xgで5分間遠心した。濁った上清を棄て、約0.2mlの白色の細胞ペレットを得た。その細胞ペレットを、15% ヒト血清(上述)、ペニシリン(100単位/ml)、及びストレプトマイシン(100μｇ/m l)を添加したRPMI 1640培地50mlで再懸濁した。60mlの全血からのリンパ球及びマクロファージの生細胞の回収を血球計測器で調べたところ、約7 x 10⁷個の細胞であった。リンパ球及び単球を含む細胞を24ウエルのCorning Tissue Culture Plateに0.5ml/ウエルずつ分け、通気湿潤インキュベーターで37℃15分間インキュベートした。翌日、培養物を無血清のRPMI 1640培地(抗生物質含有)で2度洗った。2度の洗いの間に、リンパ球及び他の付着性細胞の除去を容易とするため、37℃のインキュベーターで培養物を1時間インキュベートした。付着性細胞は、全てが血中の単球から由来したものではないかもしれないが、大多数が血中の単球の状態から培養皿と接触したことによって分化したマクロファージであった。例えば、培養中にプレーティングして48時間後の付着性細胞群中のマクロファージの比率を求めるために組織化学的アッセイを行うと、その細胞群は非特異的エステラーゼ、それは単球及びマクロファージをリンパ球及び他の細胞から見分ける際のマーカーとして通常用いられる酵素であるが、その発現が陽性な細胞が100%であった。これらの結果は、以下のLPSチャレンジで用いる細胞は全てではないかもしれないが大多数は単球由来であることを示していた。上述の2度目の洗いの後、無血清で抗生物質を含有し指定された濃度のLPSを含むRPMI 1640培地を細胞に添加し37℃の通気湿潤インキュベーターで一晩置いた。20時間後、ウエルプレート培養物をBeckman GS-25で8000x g、10分間遠心し、上清をとり、QUANTIKINE^TMヒトTNF-αイミュノアッセイキット#DTA50(R&D Syste ms，Minneapolis，MN，USA)を用いてTNF-α含量を測定した。ヒトマクロファージによるTNF-αの産生量pg/mlを、培地中に添加したLPSの量pg/mlの関数としてプロットしたものを図18に示す。 14028株及びその派生体であるクローン72、クローンYS7212、及びクローンYS7 213、及びSH5014株は全てヒトマクロファージによるTNF-α産生をLPSの濃度の用量依存性に誘導した。これらの各株からのLPSの濃度が100pg/ml(0.1ng/ml)と低い場合においてもTHF-α産生を刺激し、10³ pg/ml及び10⁴ pg/mlの濃度ではさらに産生刺激が増加し、マクロファージによるTNF-α産生を600-800pg/mlのレベルまで誘導した。このLPSによって誘導されたTNF-αのレベルは敗血症ショック症候群の患者、及びE．coliのLPSを投与されたヒトボランティアで認められる循環血液中のT、NF-αのレベル(Morrisonら，1994，ASM News 60:479-484)と同等であった。これに対して、firA^-株SH7622-64からのLPSはマクロファージによるTNF -α産生刺激がはるかに弱く、それは10⁴pg/mlの濃度で初めて検出された。用量- 反応の比較では、SH7622-64株からのLPSは、マクロファージTNF-α産生刺激において、firA⁺の親株であるSH5014株からのLPSと比較すると約1%の効力しか持たない。さらに、これらの結果は、ヒトマクロファージの刺激によって評価するとき、YS7212及びYS7213株はそれぞれ野生型14028株のLPSと同等のLPSを産生することを示している。 19.2 firA^- 変異を有するSalmonella typhimuriumによる腫瘍ターゲテイング M27マウス肺腫瘍細胞またはB16F10マウスメラノーマ細胞(5 x 10⁵)をC57B6マウスの皮下に移植した。腫瘍が触知可能なとき、SH7622-64をLBブロス中で37℃ で密度が約10⁹ cfu/ml (OD₆₀₀=0.8)となるまで増殖させた。5-10 x 10⁶ cfuのアリコートをとり、腫瘍を有するマウスに接種した。菌接種の48時間後(M27肺) 及び96時間後(B16F10メラノーマ)に、動物を屠殺し、腫瘍と肝臓を摘出し、重量を量り、LBブロス5ml/g組織の比率でホモゲナイズした。ホモゲネートはLB寒天プレート上で段階希釈して菌数を定量した。結果を表20(G)に示す。上記の結果はそれぞれ1匹の動物から得たものである。表20(G)に示すとおり、SH7622-64株はマウスの腹腔内に接種されたとき、B16F 10メラノーマ及びM27肺腫瘍のどちらの内部にも移行することができた。これらの結果、及びこの特定のfirA^-株からのLPSがヒトマクロファージのTNF-α誘導能を顕著に抑制するという第19.1節で示した結果を組み合わせると、エンドトキシン生合成の変異によって弱毒化されたSalmonellaはin vivoでの腫瘍ベクターとして用いうることを示している。 20．実施例：マウスのルイス肺癌におけるクローンYS721及びYS7211の腫瘍特異的集積この実施例は栄養要求性の変異体SalmonellaクローンYS721及びYS7211が肺ガンに移行することを示している。ルイス肺ガンの実験モデルは5x10⁵個の細胞をC57B6マウスの皮下にDay 0に注射することによって作製した。0.2ml細菌懸濁液(約1 x 10⁷CFU/ml)のアリコートをDay 14にマウスの腹腔内に注射した。Day 16に腫瘍及び肝臓を摘出し、ホモゲナイズし、細菌数を段階希釈プレーティングで求めた。相対分布量を求めた結果を表20(H)に示す。これらの腫瘍及びその他に非常に高いレベルの細菌数が移動していたことは栄養要求性の変異株が、ある範囲の腫瘍モデルに腫瘍特異的集積能を保持していることを示している。 21．実施例：B16F10メラノーマ転移腫瘍の治療転移は固形腫瘍の治療の際の主要な問題点の一つである。大きな腫瘍は検出でき外科的に除去しうるのに対し、より小さな転移は未処置のものの貯蔵所となりしばしば死の原因となる。それ故、有効な癌の治療とは、転移腫瘍に対して有効なものでなければならない。 B16F10の実験的転移モデルを1x10⁵個の細胞をDay 0にC57B6マウスの外側尾静脈から注射することにより作製した。0.2ml YS7211/p5-3及びYS7212/p5-3細菌懸濁液(YS7211及びYS7212それぞれが、HSVチミジンキナーゼ発現プラスミドを持つ )(約1 x 10⁷CFU/ml)のアリコートをDay 5にマウスに腹腔内注射した。ガンシクロビル0.1mlアリコートをPBSで22mg/mlとしたもの(最終投与量：100mg/kg)をDay 7にマウスに腹腔内注射した。腫瘍の進行は定期的に屠殺し肺を調べることによりモニターした。Day 28に全動物を屠殺し、正常及び腫瘍を有する肺の重量を測定した。図19は、HSVチミジンキナーゼ遺伝子を持ったYS7212(YS7212/p5-3)を動物に接種し、さらにGCVで処置することにより、B16F10の肺転移の数と程度を減じることを明瞭に示している。 22．実施例：Salmonella typhimuriumを用いる、組織生検中のメラノーマの診断本発明の方法によるメラノーマの診断はSalmonella typhimuriumを用いて、例えば次のように行いうる：メラノーマの疑いのある生検標本の一部を食塩加トリス緩衝液(TBS)中でハサミで細かく刻み、Ca⁺⁺/Mg⁺⁺を含まずトリプシン、コラゲナーゼ、及びEDTA(Sigma Chemicals)を含む食塩液中で37℃で60分間インキュベートして組織を個々の細胞に解離させる。次いで、細胞を洗い、遠心して解離酵素を含まないようにした細胞を1ml DMEM/10% FBS中に再懸濁し、ウエルにカバースリップのある24ウエルのCorning組織培養チャンバーに添加する。次いで、細胞を通気(5%CO₂/95%空気)湿潤インキュベーター中で37℃で3時間インキュベートし、カバースリップに付着させる。生検した細胞の付着が完了した後、弱毒化した重感染性のメラノーマ特異的な Salmonella typhimurium(10⁶-10⁷cfu/ml)を添加する。Salmonella typhimurium 及び生検して得た細胞を共に37℃で15分間インキュベートし、Salmonella typhi muriumによるメラノーマ細胞への感染を起こさせ、感染していない細胞を除去するためTBSで洗った。次いで、3%ウシ血清アルブミン中に0.01%サポニンを含む液で5分間処理して細胞を透過性とし、2.5mg/mlの4'-6ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)及びサポニン(0.01%)をTBS中に含有する液で10分間ＤＮＡを染色し、TBSで洗い、1,4-ジアザビシクロ(2,2,2)オクタン(DABCO，Kodak)を含有するMo wiol(Calbiochem)にマウントし、位相差及び蛍光顕微鏡で観察する。生検した細胞の細胞質中のDAPI染色の存在は、それらがメラノーマ細胞であること、すなわちメラノーマ特異的S.typhimuriumの感染を受ける細胞はメラノサイトではなくメラノーマ細胞であることを示している。 23．実施例：Listeria monocytogenesによるメラノーマ腫瘍のターゲティング本実施例はメラノーマを有する動物にListeria monocytogenesを投与すると、腫瘍細胞を標的とし、その細胞中で増殖することを示している。 C57B6マウスの左側腹部の皮下に5 x 10⁵個のB16F10メラノーマ細胞を接種した。腫瘍が約1-2 gに達したとき(腫瘍細胞移植後16日)、７ x 10⁵ cfuのListeria monocytogenes野生型43251株を腹腔内に接種した。マウスへの接種前にListeria 培養をOD₆₀₀が0.25となるまでLB培地中で一晩行った。指定された時点で動物を屠殺し、腫瘍と肝臓を摘出し、ホモゲナイズし、菌数をLBプレート上で段階希釈して定量した。腫瘍はListeria monocytogenesの接種24、48、及び96時間後に分析した。結果を表20(I)に示す。上記の結果は3回測定の平均±SDで表されている。表20(I)に示すとおり、腫瘍内の細菌数はこの実験期間中で約100倍上昇し、このことは野生型Listeria monocytogenesが腫瘍を標的にすることができ、その内部で増殖しうることを示している。Listeria monocytogenes43251株はC57B6マウス中で毒性を有し、７ x 10⁵cfuを腹腔内に接種すると接種後約5日で死亡させた。 24．実施例：Leishmania amazonensisは腫瘍細胞特異性を示す 24.1Leishmania amazonensis はin vitroのヒトメラノーマ細胞に特異的に付着する Leishmania amazonensisトリポマスチゴートは高度に生体特異的と考えられており、マクロファージ以外のほとんどいかなる細胞にも感染し得ない。ヒトのメラノーマは何らかのマクロファージ様形質を発現することが知られているので、Leishmania amazonensisが培養液中のヒトメラノーマ細胞に入ることができるか調べた。Leishmania amazonensisトリポマスチゴートを、加熱不活化したウシ胎児血清を15%含むSchneider's Drosophila培地(GIBCO BRL)中で24℃で寄生菌が対数増殖期の後期となるまで(通常3日から4日)増殖させた。L．amazonensis感染のアッセイに用いた動物細胞は、C57B6マウスに注射すると非転移性腫瘍を形成するマウスメラノーマ細胞系統(B16/F1)、2種類のヒト転移性メラノーマ細胞系統(M2及びM2-A7)、及び陰性対照としてヒト包皮線維芽細胞、HFFである。これらの異なる種類の細胞を24ウエルのガラスカバースリップまたはプラスチックのLa b-Tec^R(Nunc)スライド上で、 HFF細胞には10%ウシ胎児血清含有のMEM培地で、B 16 /F1細胞には10%ウマ血清含有のHam's F10培地で、M2及びM2-A7細胞には10mM HEP ESで緩衝化した10%ウシ胎児血清を含有するDMEMで増殖させた。 Leishmania寄生菌は5%のヒト正常血清と共に約1時間プレインキュベートし、培養した細胞に0.5から5.0x10⁶個寄生菌/mlで32℃で約2時間感染させた。インキュベーション後、細胞を食塩加リン酸緩衝液で2度洗い、3%パラホルムアルデヒドで、4℃で約30秒固定した。抗Leishmanial抗体を、固定化細胞を3%ウシ血清アルブミン(BSA)を含有するPBS中で通常希釈(1:100,000)としたものと共に約1時間インキュベートした。洗浄後、蛍光物質をコンジュゲートさせた抗マウス抗体(B oehringer Mannheim)を、通常希釈条件(1:500)の細胞と共に約1時間インキュベートし、次いで細胞から洗い落とした。次いで、食塩加リン酸緩衝液(TBS)中に0 .02%サポニン(Sigma，脂質を除去し、抗体の貫入をさせるために用いる洗浄剤) を含む液で10分間処理して細胞を透過性とし、5.0mg/mlのDAPI(Sigme)及びサポニン0.02%をTBS中に含有する液でＤＮＡを染色した。TBSで細胞を洗い、DABCO(K odak，蛍光の発光を保持するための化合物)を含有するMowiol(CalBiochem)を用いてガラススライドにマウントした。内部化した寄生菌の存在は、宿主細胞膜透過性がない条件では抗Leishmaniaモノクローナル抗体と反応しないことによって調べた。生きた寄生菌を添加した直後の倒立位相差顕微鏡を用いた観察では、これらの細胞系統のうち、運動性寄生菌は転移性メラノーマ細胞に遭遇したときのみ直ちに付着した。このことは転移性細胞がLeishmaniaに対する適当な受容体を持っている可能性を示唆している。これらの結果を図13に示す。 Leishmania寄生菌が内部化したか否かを調べるため、M2ヒトメラノーマ細胞を増殖させ、Leishmaniaで感染させ、上述のように3%パラホルムアルデヒドを用いて4℃で30分間、透過性を高めることなく固定し、洗い、Leishmania表面タンパク質に対するモノクローナル抗体、その後ローダミンをコンジュゲートさせた抗マウス抗体で免疫染色した。食塩加トリス緩衝液(TBS)で洗った後、3%BSA中に0. 01%サポニンを含む液で5分間処理して細胞を透過性とし、2.5mg/mlの4'-6ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)及びサポニン(0.01%)をTBS中に含有する液で1 0分間ＤＮＡを染色し、TBSで洗い、1,4-ジアザビシクロ(2,2,2)オクタン(DABCO, Kodak)を含有するMowiol(Calbiochem)にマウントし、位相差及び蛍光顕微鏡で観察した。このやり方は全ての寄生菌を検出し、内部化されたもの(非透過性の細胞では抗体染色では近付くことができない)と、内部化されず付着しているものとを区別する。寄生菌はM2細胞によって内部化された(ここにデータは示していない)。内部化はメラノーマ細胞の3%に起こるものと見積もられた。これらの知見は、a)生きた Leishmania寄生菌はメラノーマ細胞に入り込むことができ、b)おそらくメラノーマ細胞のサブポピュレーションの一つのみがこのプロセスに関わっている、ことを示している。 24.2 メラノーマによるLeishmaniaの内部化後のリソゾームの融合 Leishmaniaによるマクロファージへの侵入の通常の経過ではリソゾームはファゴソームと融合する。Leishmaniaがメラノーマ細胞に侵入する際にもこのことが起こるか否かを調べるため、寄生菌とリソゾームの糖蛋白質(lgp)マーカーを共に局在(co-localize)させた。細胞の免疫染色をヒトリソゾーム糖蛋白質LAMP-1 に対するモノクローナル抗体を用いた後、ローダミンをコンジュゲートさせた抗マウス抗体を用いたこと以外は、上述の方法と同様に細胞を増殖させ、感染させ、固定した。TBSで洗った後、細胞のＤＮＡを2.5mg/mlのDAPI、10分間で染色し、TBSで洗い、DABCO含有のMowiolにマウントし、位相差及び蛍光顕微鏡で観察した。LAMP-1と共に局在させた寄生菌を図14A-Cに示す。共局在させることによって寄生菌の内部化が確証され、Leishmaniaがメラノーマ細胞に内部化されたときにリソゾームの融合が起こっていることを示している。要約すれば、Leishmania amazonensisの野生型はヒトメラノーマ細胞への侵入能があり、このことはこれまで報告されていなかったことである。 25．実施例：Leishmania amazonensisによるヒト組織生検中のメラノーマの診断本発明の方法によるメラノーマの診断はLeishmania amazonensisを用いて、例えば次のように行いうる：メラノーマの疑いのある生検標本の一部を食塩加トリス緩衝液(TBS)中でハサミで細かく刻み、Ca⁺⁺/Mg⁺⁺を含まずトリプシン、コラゲナーゼ、及びEDTAを含む食塩液中で37℃で60分間インキュベートして組織を個々の細胞に解離させる。次いで、細胞を洗い、遠心して解離酵素を含まないようにする。細胞を1ml DMEM/10%FBS中に再懸濁し、ウエルにカバースリップのある24 ウエルのCorning組織培養チャンバーに添加する。次いで、細胞を通気(5%CO₂)湿潤インキュベーター中で37℃で約3時間インキュベートし、カバースリップに付着させる。生検した細胞の付着が完了した後、本発明の方法に従って単離されたメラノーマ特異的なLeishmania amazonensisプロマスチゴート株を添加する。寄生菌と生検して得た細胞を共に37℃で約2時間インキュベートし、Leishmania amazonensi sによるメラノーマ細胞への感染を起こさせ、感染していない寄生菌を除去するためTBSで洗う。次いで、3%ウシ血清アルブミン中に0.01%サポニンを含む液で5 分間処理して細胞を透過性とし、2.5mg/mlの4'-6ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)及びサポニン(0.01%)をTBS中に含有する液で10分間ＤＮＡを染色し、 TBSで洗い、1,4-ジアザビシクロ(2,2,2)オクタン(DABCO，Kodak)を含有するMowi ol(Calbiochem)にマウントし、位相差及び蛍光顕微鏡で観察する。生検した細胞の細胞質中のDAPI染色の存在は、それらがメラノーマ細胞であることを示している。 26．実施例：Mycobacterium aviumを用いるヒト組織生検中のメラノーマの診断 Mycobacterium aviumはメラノーマ細胞とは会合するが正常なメラノサイトとは会合しない。このメラノーマ細胞を識別する能力は、メラノーマの診断と治療におけるMycobacterium aviumのベクターとしての能力を示している。Mycobacteri uma viumを用いるメラノーマの診断は次のように行う：メラノーマの疑いのある生検標本の一部を食塩加トリス緩衝液(TBS)中でハサミで細かく刻み、Ca⁺⁺/Mg⁺⁺ を含まずトリプシン、コラゲナーゼ、及びEDTAを含む食塩液中で37℃で60分間インキュベートして組織を個々の細胞に解離させる。次いで、細胞を洗い、遠心して解離酵素を含まないようにする。細胞を1ml DMEM/10%FBS中に再懸濁し、24ウエルのプレートの12mmのガラスカバースリップに1ウエルあたり細胞1x10⁵個プレーティングする。次いで、細胞を通気(5%CO₂)湿潤インキュベーター中で37℃で3 時間インキュベートし、カバースリップに付着させる。生検した細胞の付着が完了した後、本発明の方法に従って単離されたメラノーマ特異的なMycobacterium aviumを添加する。この細菌と生検して得た細胞を共に37℃で15分間インキュベートし、Mycobacterium aviumによるメラノーマ細胞への感染を起こさせる。感染していない菌を除去するためTBSで洗う。次いで、3 %ウシ血清アルブミン中に0.01%サポニンを含む液で5分間処理して細胞を透過性とし、2.5mg/mlの4'-6ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)及びサポニン(0. 01%)をTBS中に含有する液で10分間ＤＮＡを染色し、TBSで洗い、1,4-ジアザビシクロ(2,2,2)オクタン(DABCO，Kodak)を含有するMowiol(Calbiochem)にマウントし、位相差及び蛍光顕微鏡で観察する。生検した細胞の細胞質中のDAPI染色の存在は、それらがメラノーマ細胞であることを示している。 27．微生物の寄託下記の微生物は1995年6月1日付でAmerican Type Culture Collection(ATCC)， Rockville，MD，USAに寄託され、下記の受託番号が割り当てられている。微生物 ATCC 受託番号クローン #70 55686 クローン #71 55685 クローン #72 55680 クローン #72^5-3-2 97179 個体群 #72^POP-1 55684 個体群 #72^POP-2 55683 個体群 #14028^POP-1 55681 個体群 #14028^POP-2 55682 下記の微生物は1996年5月29日付でAmerican Type Culture Collection(ATCC) ，Rockville，MD，USAに寄託され、下記の受託番号が割り当てられている。微生物 ATCC 受託番号クローン YS721 クローン YS7211 クローン YS7212 クローン YS7213 下記のプラスミドは1996年5月29日付でAmerican Type Culture Collection(AT CC)，Rockville，MD，USAに寄託され、下記の受託番号が割り当てられている。微生物 ATCC 受託番号 pTK-Sec3 pCD-Sec1 pSP-SAD4-5 ここに公開された特定の実施態様は本発明のいくつかの態様を説明することを意図したものであるので、ここに記述されクレームされた本発明はこれらの実施態様の範囲に限定されるものではない。事実、ここに示しかつ記述した事柄に加えて本発明にいろいろな改変を加えることは当業者であれば前記の記述から明らかである。そのような改変は本発明の特許請求の範囲に包含されるものとする。ここに引用された多数の参照文献は参考としてその全体を本明細書中に組み込むこととする。

【手続補正書】【提出日】平成１０年３月１９日（１９９８．３．１９）【補正内容】（Ｉ）請求の範囲を別紙の通り改める。（ＩＩ）明細書の124頁及び第130頁を別紙のとおり改める。請求の範囲１．下記の菌株から選ばれる、生物学的に純粋な微生物の培養物。２．pTK-Sec3と称され、ATCC受託番号が97592である、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子をコードするプラスミド。３．pCD-Sec1と称され、ATCC受託番号が97593である、E.coliシトシンデアミナーゼ遺伝子をコードするプラスミド。４．pSP-SAD4-5と称され、ATCC受託番号が97591である、ヒトp450酸化還元酵素遺伝子をコードするプラスミド。５．固形腫瘍癌を有する患者に腫瘍細胞特異的微生物の単離された集団の有効量を投与することを含む、固形腫瘍癌の治療方法。６．腫瘍細胞特異的微生物の単離された集団が、重感染した腫瘍細胞特異的微生物の単離された集団である請求項５記載の方法。７．重感染した腫瘍細胞特異的集団が、弱毒化されたものである請求項６記載の方法。８．弱毒化された集団が、改変した脂質Ａ分子である請求項７記載の方法。９．弱毒化された集団が、非弱毒化集団と比較して少ない程度にTNF-α発現を誘導する請求項７記載の方法。 10.腫瘍細胞特異的微生物の単離された集団が、Borrelia burglorferi,Brucella melitensis,Escherichia coli,腸内侵襲性Escherichia coli,Legionella pneum ophila,Salmonella typhi，Salmonella typhimurium，Shigella spp.，Treponem a pallidum，Yersinia enterocohtica，Chlamydia trachomatis，Listeria mo nocytogenies，Mycobacterium avium，Mycobacteriumbovis，Mycobacterium tu berculosis，Mycoplasma hominis，Rickettsiae quintana，Streptococcus spp. ，Cryptococcus neoformans，Histoplasma capsulatum，Pneumocystis carnii， Eimeria acervulina，Neospora caninum，Plasmodium falciparum，Sarcocystis suihominis，Toxoplasma gondii，Leishmania amazonensis，Leishmania ma jor，Leishmania mexacana，Leptomonas karyophilus,Phytomonas spp.,Trypan asoma cruzi,Encephahtozoon cuniculi，Nosema helminthorum及びUnikaryon le geriからなる群から選ばれるものである請求項５記載の方法。 11．重感染した腫瘍細胞特異的微生物の単離された集団が、Salmonella typhimu rium株＃14028^POP-1、Salmonella typhimurium株＃14028^P0P-2、Salmonella t yphimurium株＃72^POP-1及びSalmonella typhimurium株＃72^POP-2からなる群から選ばれるものである請求項５又は６記載の方法。 12．重感染した腫瘍細胞特異的微生物の単離された集団が、 (a) 固形腫瘍癌の細胞培養物を、微生物に、該微生物が腫瘍細胞に感染することができるように十分な時間曝し、そして、 (b) 感染した細胞培養物から、重感染した腫瘍細胞特異的微生物の集団を単離することにより生産されるものである請求項６記載の方法。 13．腫瘍細胞特異的微生物の単離された集団が、 (a) 微生物を、腫瘍細胞馴らし培地に、該微生物が腫瘍細胞馴らし培地に向かって走化性をもたらすのに十分な時間曝し、そして、 (b) 腫瘍細胞馴らし培地に向かって走化性を有する微生物の集団を単離することにより生産されるものである請求項５記載の方法。 14．重感染した腫瘍細胞特異的微生物の単離された集団が、 (a) 固形腫瘍細胞癌を有する哺乳動物を、微生物に、該微生物が腫瘍細胞に感染することができるように十分な時間曝し、そして、 (b) 感染した腫瘍細胞から、重感染した腫瘍細胞特異的微生物の集団を単離することにより生産されるものである請求項６記載の方法。 15．ステップ(a)の前に微生物を突然変異誘発にかけることをさらに含む、請求項12、13又は14記載の方法。 16．(c) ステップ(a)及び(b)を所望の回数繰り返すことをさらに含む、請求項12 、13又は14記載の方法。 17．固形腫瘍細胞癌がメラノーマの癌である請求項５、12、13又は14記載の方法。 18．固形腫瘍癌が結腸腺癌である請求項５、12、13又は14記載の方法。 19．固形腫瘍癌が、肺癌、肝臓癌、腎臓癌、前立腺癌及び乳癌からなる群から選ばれるものである請求項５、12、13又は14記載の方法。 20．腫瘍細胞特異的微生物の単離された集団の単一コロニークローンの有効量を、固形腫瘍癌を有する患者に投与することを含む、固形腫瘍癌の治療方法。 21．腫瘍細胞特異的微生物の単離された集団の単一コロニークローンが、重感染した腫瘍細胞特異的微生物の単離された集団の単一コロニークローンである請求項20記載の方法。 22．重感染した腫瘍細胞特異的単一コロニークローンが弱毒化されたものである請求項20記載の方法。 23．弱毒化クローンが、改変したリピドＡ分子を発現するものである請求項22記載の方法。 24．弱毒化クローンが、非弱毒化集団と比較して少ない程度にTNF-α発現を誘導するものである請求項20記載の方法。 25．腫瘍細胞特異的微生物の単離された集団の単一コロニークローンが、Borrel ia burgdorferi，Brucella melitensis，Escherichia coli,腸内侵襲性Escheric hia coli,Legionella pneumophila,Salmonella typhi,Salmonella typhimurium, Shigella spp.,Treponema pallidum，Yersinia enterocohtica，Chlamydia trac homatis，Listeria monocytogenies，Mycobacterium avium，Mycobacterium bov is，Mycobacterium tuberculosis，Mycoplasma hominis，Rickettsiae quintana ，Streptococcus spp.，Cryptococcus neoformans，Histoplasma capsulatum，P neumocystis carnii,Eimeria acervulina,Neospora caninum,Plasmodium falcip arum，Sarcocystis suihominis，Toplasma gondii，Leishmania amazonensis，Leishmania major，Leishmania mexacana，Leptomonas karyoph ilus,Phytomonas spp.,Trypanasoma cruzi,Encephahtozoon cuniculi，Nosema h elminthorum及びUnikaryon legeriからなる群から選ばれるものである請求項20 記載の方法。 26．重感染した腫瘍細胞特異的微生物の単離された集団の単一コロニークローンが、Salmonella typhimurium株＃70、Salmonella typhimurium株＃71、Salmon ella typhimurium株＃72、Salmonella typhimurium株＃72^5-3-2、Salmonella typhlmurium株 YS721、Salmonella typhimurium株 YS7211、Salmonella typhimu rium株 YS7212及びSalmonella typhimurium株 YS7213からなる群から選ばれるものである請求項20又は21記載の方法。 27．重感染した腫瘍細胞特異的微生物の単離された集団の単一コロニークローンが、 (a) 固形腫瘍癌の細胞培養物を、微生物に、該微生物が腫瘍細胞に感染することができるように十分な時間曝し、 (b) 感染した細胞培養物から、重感染した腫瘍細胞特異的微生物の集団を単離し、そして、 (c) ステップ(b)で単離された集団を、単一コロニークローンが得られるように培養することにより生産されるものである請求項21記載の方法。 28．腫瘍細胞特異的微生物の単離された集団の単一コロニークローンが、 (a) 微生物を、腫瘍細胞馴らし培地に、該微生物が腫瘍細胞馴らし培地に向かって走化性をもたらすのに十分な時間曝し、 (b) 腫瘍細胞馴らし培地に向かって走化性を有する微生物の集団を単離し、そして、 (c) ステップ(b)で単離された集団を、単一コロニークローンが得られるように培養することにより生産されるものである請求項20記載の方法。 29．重感染した腫瘍細胞特異的微生物の単離された集団の単一コロニークローンが、 (a) 固形腫瘍細胞癌を有する哺乳動物を、微生物に、該微生物が腫瘍細胞に感染することができるように十分な時間曝し、 (b) 感染した腫瘍細胞から、重感染した腫瘍細胞特異的微生物の集団を単離し、そして、 (c) ステップ(b)で単離された集団を、単一コロニークローンが得られるように培養することにより生産されるものである請求項21記載の方法。 30．ステップ(a)の前に微生物を突然変異誘発にかけることをさらに含む、請求項27、28又は29記載の方法。 31．(d) ステップ(c)の前に、ステップ(a)及び(b)を所望の回数繰り返すことをさらに含む、請求項27、28又は29記載の方法。 32．固形腫瘍細胞癌がメラノーマの癌である請求項20、27、28又は29記載の方法。 33．固形腫瘍癌が結腸腺癌である請求項20、27、28又は29記載の方法。 34．固形腫瘍癌が、肺癌、肝臓癌、腎臓癌、前立腺癌及び乳癌からなる群から選ばれるものである請求項20、27、28又は29記載の方法。 35．単一コロニークローンが遺伝子工学的に作り出されたものである請求項20又は21記載の方法。 36．単一コロニークローンが自殺遺伝子を発現するものである請求項35記載の方法。 37．自殺遺伝子が、pTK-Sec3、pCD-Sec1及びpSP-SAD4-5からなる群から選ばれるプラスミドによってコードされるものである請求項36記載の方法。 38．単一コロニークローンが、p450酸化還元酵素、HSVチミジンキナーゼ、E.col iシトシンデアミナーゼ、カルボキシペプチダーゼG2、β-グルクロニダーゼ、ペニシリン-V-アミダーゼ、ペニシリン-G-アミダーゼ、β-ラクタマーゼ、β-グルコシダーゼ、ニトロレダクターゼ及びカルボキシペプチダーゼＡからなる群から選ばれる自殺遺伝子を発現するものである請求項36記載の方法。 39．自殺遺伝子が、HSVチミジンキナーゼ及びE.coliシトシンデアミナーゼからなる群から選ばれるものである請求項37又は38記載の方法。 40．自殺遺伝子の発現が、構成プロモーターにより調節されるものである請求項 36記載の方法。 41．自殺遺伝子の発現が、誘導プロモーターにより調節されるものである請求項 36記載の方法。 42．自殺遺伝子の発現が、特異的標的細胞中で活性化される細菌型プロモーターにより調節されるものである請求項36記載の方法。 43．自殺遺伝子の発現が、特異的腫瘍細胞中で活性化される細菌型プロモーターにより調節されるものである請求項42記載の方法。 44．固形腫瘍癌の診断方法であって、 (a) 癌細胞であると疑われる細胞の生検試料を、腫瘍特異的微生物に、該微生物が癌であると疑われる細胞に感染できるように十分な時間曝し、 (b) 癌でない対となる対照細胞の試料を、腫瘍特異的微生物に同じ時間曝し、そして、(c)癌であると疑われる細胞及び癌でない対となる対照細胞について微生物の感染力を比較することを含む方法。 45.微生物が、Borrelia burgdorferi,Brucella melitensis,Escherichia coli, 腸内侵襲性Escherichia coli，Legionella pneumophila，Salmonella typhi，Sa lmonella typhimurium,Shigella spp.,Treponema pallidum,Yersinia enterocoh tica，Chlamydia trachomatis，Listeria monocytogenies，Mycobacterium aviu m，Mycobacterium bovis，Mycobacterium tuberculosis，Mycoplasma hominis， Rickettsiae quintana，Streptococcus spp.，Cryptococcus neoformans，Hi stoplasma capsulatum，Pneumocystis carnii，Eimeria acervulina，Neospo ra caninum，Plasmodium falciparum，Sarcocystis suihominis，Toxoplasma gondii，Leishmania amazonensis，Leishmania major，Leishmania mexaca na，Leptomonas karyophilus，Phytomonas spp.,Trypanasoma cruzi，Encepha htozoon cuniculi，Nosema helminthorum及びUnikaryon legeriからなる群から選ばれるものである請求項44記載の方法。 46．微生物が、Salmonella typhimurium株＃14028^POP-1、Salmonella typhimur ium株＃14028^POP-2、Salmonella typhimurium株＃72^P0P-1、Salmonella typhi murium株＃72^POP-2、Salmonella typhimurium株＃70、Salmonella typhimuriu m株＃71、Salmonella typhimurium株＃72、Salmonella typhimurium株＃72^5- ^3-2 、Salmonella typhimurium株 YS721、Salmonella typhimurium株 YS7211、Sa lmonella typhimurium株 YS7212及びSalmonella typhimurium株 YS7213からなる群から選ばれるものである請求項44記載の方法。 47．微生物が、 (a) 固形腫瘍癌の細胞培養物を、微生物に、該微生物が腫瘍細胞に感染することができるように十分な時間曝し、そして、 (b) 感染した細胞培養物から、重感染した腫瘍細胞特異的微生物の集団を単離することにより生産されるものである請求項44記載の方法。 48．微生物が、 (a) 微生物を、腫瘍細胞馴らし培地に、該微生物が腫瘍細胞馴らし培地に向かって走化性をもたらすのに十分な時間曝し、そして、 (b) 腫瘍細胞馴らし培地に向かって走化性を有する微生物の集団を単離することにより生産されるものである請求項44記載の方法。 49．微生物が、 (a) 固形腫瘍細胞癌を有する哺乳動物を、微生物に、該微生物が腫瘍細胞に感染することができるように十分な時間曝し、そして、 (b) 感染した腫瘍細胞から、重感染した腫瘍細胞特異的微生物の集団を単離することにより生産されるものである請求項44記載の方法。 50． (c) ステップ(b)で単離された集団を、単一コロニークローンが得られるように培養することをさらに含む、請求項47、48又は49記載の方法。 51．ステップ(a)の前に微生物を突然変異誘発にかけることをさらに含む、請求項47、48又は49記載の方法。 52．ステップ(a)及び(b)を所望の回数繰り返すことをさらに含む、請求項47、48 又は49記載の方法。 53．固形腫瘍細胞癌がメラノーマの癌である請求項44、47、48又は49記載の方法。 54．固形腫瘍細胞癌が結腸腺癌である請求項44、47、48又は49記載の方法。 55．固形腫瘍癌が、肺癌、肝臓癌、腎臓癌、前立腺癌及び乳癌からなる群から選ばれるものである請求項44、47、48又は49記載の方法。 56．微生物が遺伝子工学的に作り出されたものである請求項44記載の方法。 57．腫瘍特異的微生物の有効量を含む診断用キット。 58．腫瘍特異的微生物が、重感染した腫瘍特異的微生物である請求項57記載の診断用キット。 59．癌でない対となる対照細胞をさらに含む、請求項57記載の診断用キット。 60.微生物が、Borrelia burgdorferi,Brucella melitensis,Escherichia coli, 腸内侵襲性Escherichia coli,Legionella pneumophila，Salmonella typhi，Sal monella typhimurium,Shigella spp.，Treponema pallidum，Yersinia enteroco htica，Chlamydia trachomatis,Listeria monocytogenies,Mycobacterium avium ，Mycobacterium bovis,Mycobacterium tuberculosis,Mycoplasma hominis，Ric kettsiae quintana，Streptococcus spp.，Cryptococcus neoformans，Histo plasma capsulatum，Pneumocystis carnii，Eimeria acervulina，Neospora caninum，Plasmodium falciparum，Sarcocystis suihominis，Toxoplasma gondii，Leishmania amazonensis，Leishmania major， Leishmania mexacana，Leptomonas karyophilus，Phytomonas spp.,Trypanas oma cruzi,Encephahtozoon cuniculi,Nosema helminthorum及びUnikaryon l egeriからなる群から選ばれるものである請求項57記載の診断用キット。 61．微生物が、Salmonellat yphimurium株＃14028^POP-1、Salmonella typhimur ium株＃14028^POP-2、Salmonella typhimurium株＃72^POP-1、Salmonella typhi murium株＃72^P0P-2、Salmonella typhimurium株＃70、Salmonella typhimurium 株＃71、Salmonella typhimurium株＃72、Salmonella typhimurium株＃72^5-3 ^-2 、Salmonella typhimurium株 YS721、Salmonella typhimurium株 YS7211、Sal monella typhimurium株 YS7212及びSalmonella typhimurium株 YS7213からなる群から選ばれるものである請求項58記載の診断用キット。 62．微生物が遺伝子工学的に作り出されたものである請求項58記載の診断用キット。 63．固形腫瘍癌が転移癌である請求項５、12、13又は14記載の方法。 64．固形腫瘍癌が転移癌である請求項20、27、28又は29記載の方法。 65．固形腫瘍癌が転移癌である請求項44、47、48又は49記載の方法。下記のプラスミドは1996年５月29日付でAmerican Type Culture Collection(A TCC),Rockville,MD,USAに寄託され、下記の受託番号が割り当てられている。ここに公開された特定の実施態様は本発明のいくつかの態様を説明することを意図したものであるので、ここに記述されクレームされた本発明はこれらの実施態様の範囲に限定されるものではない。事実、ここに示しかつ記述した事柄に加えて本発明にいろいろな改変を加えることは当業者であれば前記の記述から明らかである。そのような改変は本発明の特許請求の範囲に包含されるものとする。ここに引用された多数の参照文献は参考としてその全体を本明細書中に組み込むこととする。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 35/04 Ａ６１Ｐ 35/04 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ロウ，ケネス，ビー. アメリカ合衆国 06437 コネチカット州ガルフォード，ウエストレイクアベニュー 1211

Claims

【特許請求の範囲】１．下記の菌株から選ばれる、生物学的に純粋な微生物の培養物。２．pTK-Sec3と称され、ATCC受託番号がである、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子をコードするプラスミド。３．pCD-Sec1と称され、ATCC受託番号がである、E.coliシトシンデアミナーゼ遺伝子をコードするプラスミド。４．pSP-SAD4-5と称され、ATCC受託番号がである、ヒトp450酸化還元酵素遺伝子をコードするプラスミド。５．固形腫瘍癌を有する患者に腫瘍細胞特異的微生物の単離された集団の有効量を投与することを含む、固形腫瘍癌の治療方法。６．腫瘍細胞特異的微生物の単離された集団が、重感染した腫瘍細胞特異的微生物の単離された集団である請求項５記載の方法。７．重感染した腫瘍細胞特異的集団が、弱毒化されたものである請求項６記載の方法。８．弱毒化された集団が、改変した脂質Ａ分子である請求項７記載の方法。９．弱毒化された集団が、非弱毒化集団と比較して少ない程度にTNF-α発現を誘導する請求項７記載の方法。 10．腫瘍細胞特異的微生物の単離された集団が、Borrelia burgdorferi，Bruc ella melitensis，Escherichia coli，腸内侵襲性Escherichia coli，Legionell a pneumophila，Salmonella typhi，Salmonella typhimurium，Shigellaspp.，T reponema pallidum，Yersinia enterocohtica，Chlamydia trachomatis，Lister ia monocytogenies，Mycobacterium avium，Mycobacterium bovis，Mycobact erium tuberculosis，Mycoplasma hominis，Rickettsiae quintana，Streptococ cus spp.，Cryptococcus neoformans，Histoplasma capsulatum，Pneumocystis carnii，Eimeria acervulina，Neospora caninum，Plasmodium falciparum，Sar cocystis suihominis，Toxoplasma gondii，Leishmania amazonensis，Leishman ia major，Leishmania mexacana，Leptomonas karyophilus，Phytomonas spp.， Trypanasoma cruzi，Encephahtozoon cuniculi，Nosema helminthorum及びUnika ryon legeriからなる群から選ばれるものである請求項５記載の方法。 11．重感染した腫瘍細胞特異的微生物の単離された集団が、Salmonella typhi murium株 #14028^pop-1、Salmonella typhimurium株 #14028^pop-2、Salmonella t yphimurium株 #72^pop-1及びSalmonella typhimurium株 #72^pop-2からなる群から選ばれるものである請求項５又は６記載の方法。 12．重感染した腫瘍細胞特異的微生物の単離された集団が、 (a) 固形腫瘍癌の細胞培養物を、微生物に、該微生物が腫瘍細胞に感染することができるように十分な時間曝し、そして、 (b) 感染した細胞培養物から、重感染した腫瘍細胞特異的微生物の集団を単離することにより生産されるものである請求項６記載の方法。 13．腫瘍細胞特異的微生物の単離された集団が、 (a) 微生物を、腫瘍細胞馴らし培地に、該微生物が腫瘍細胞馴らし培地に向かって走化性をもたらすのに十分な時間曝し、そして、 (b) 腫瘍細胞馴らし培地に向かって走化性を有する微生物の集団を単離することにより生産されるものである請求項５記載の方法。 14．重感染した腫瘍細胞特異的微生物の単離された集団が、 (a) 固形腫瘍細胞癌を有する哺乳動物を、微生物に、該微生物が腫瘍細胞に感染することができるように十分な時間曝し、そして、 (b) 感染した腫瘍細胞から、重感染した腫瘍細胞特異的微生物の集団を単離することにより生産されるものである請求項６記載の方法。 15．ステップ(a)の前に微生物を突然変異誘発にかけることをさらに含む、請求項12、13又は14記載の方法。 16．(c) ステップ(a)及び(b)を所望の回数繰り返すことをさらに含む、請求項12、13又は14記載の方法。 17．固形腫瘍細胞癌がメラノーマの癌である請求項５、12、13又は14記載の方法。 18．固形腫瘍癌が結腸腺癌である請求項５、12、13又は14記載の方法。 19．固形腫瘍癌が、肺癌、肝臓癌、腎臓癌、前立腺癌及び乳癌からなる群から選ばれるものである請求項５、12、13又は14記載の方法。 20．腫瘍細胞特異的微生物の単離された集団の単一コロニークローンの有効量を、固形腫瘍癌を有する患者に投与することを含む、固形腫瘍癌の治療方法。 21．腫瘍細胞特異的微生物の単離された集団の単一コロニークローンが、重感染した腫瘍細胞特異的微生物の単離された集団の単一コロニークローンである請求項20記載の方法。 22．重感染した腫瘍細胞特異的単一コロニークローンが弱毒化されたものである請求項20記載の方法。 23．弱毒化クローンが、改変したリピドA分子を発現するものである請求項22 記載の方法。 24．弱毒化クローンが、非弱毒化集団と比較して少ない程度にTNF-α発現を誘導するものである請求項20記載の方法。 25．腫瘍細胞特異的微生物の単離された集団の単一コロニークローンが、Borr elia burgdorferi，Brucella melitensis，Escherichia coli，腸内侵襲性 Escherichia coli，Legionella pneumophila，Salmonella typhi，Salmonella t yphimurium，Shigella spp.，Treponema pallidum，Yersinia enterocohtica，C hlamydia trachomatis，Listeria monocytogenies，Mycobacterium avium，Myco bacterium bovis，Mycobacterium tuberculosis，Mycoplasma hominis，Rickett siae quintana，Streptococcus spp.，Cryptococcus neoformans，Histoplasma capsulatum，Pneumocystis carnii，Eimeria acervulina，Neospora caninum，P lasmodium falciparum，Sarcocystis suihominis，Toxoplasma gondii，Leishma nia amazonensis，Leishmania major，Leishmania mexacana，Leptomonas karyo philus，Phytomonas spp.，Trypanasoma cruzi，Encephahtozoon cuniculi，Nos ema helminthorum及びUnikaryon legeriからなる群から選ばれるものである請求項20記載の方法。 26．重感染した腫瘍細胞特異的微生物の単離された集団の単一コロニークローンが、Salmonella typhimurium株 #70、Salmonella typhimurium株 #71、Salmon ella typhimurium株 #72、Salmonella typhimurium株 #72^5-3-2、Salmonella ty phlmurium株 YS721、Salmonella typhimurium株 YS7211、Salmonella typhimu rium株 YS7212及びSalmonella typhimurium株 YS7213からなる群から選ばれるものである請求項20又は21記載の方法。 27．重感染した腫瘍細胞特異的微生物の単離された集団の単一コロニークローンが、 (a) 固形腫瘍癌の細胞培養物を、微生物に、該微生物が腫瘍細胞に感染することができるように十分な時間曝し、 (b) 感染した細胞培養物から、重感染した腫瘍細胞特異的微生物の集団を単離し、そして、 (c) ステップ(b)で単離された集団を、単一コロニークローンが得られるように培養することにより生産されるものである請求項21記載の方法。 28．腫瘍細胞特異的微生物の単離された集団の単一コロニークローンが、 (a) 微生物を、腫瘍細胞馴らし培地に、該微生物が腫瘍細胞馴らし培地に向かって走化性をもたらすのに十分な時間曝し、 (b) 腫瘍細胞馴らし培地に向かって走化性を有する微生物の集団を単離し、そして、 (c) ステップ(b)で単離された集団を、単一コロニークローンが得られるように培養することにより生産されるものである請求項20記載の方法。 29．重感染した腫瘍細胞特異的微生物の単離された集団の単一コロニークローンが、 (a) 固形腫瘍細胞癌を有する哺乳動物を、微生物に、該微生物が腫瘍細胞に感染することができるように十分な時間曝し、 (b) 感染した腫瘍細胞から、重感染した腫瘍細胞特異的微生物の集団を単離し、そして、 (c) ステップ(b)で単離された集団を、単一コロニークローンが得られるように培養することにより生産されるものである請求項21記載の方法。 30．ステップ(a)の前に微生物を突然変異誘発にかけることをさらに含む、請求項27、28又は29記載の方法。 31．(d) ステップ(c)の前に、ステップ(a)及び(b)を所望の回数繰り返すことをさらに含む、請求項27、28又は29記載の方法。 32．固形腫瘍細胞癌がメラノーマの癌である請求項20、27、28又は29記載の方法。 33．固形腫瘍癌が結腸腺癌である請求項20、27、28又は29記載の方法。 34．固形腫瘍癌が、肺癌、肝臓癌、腎臓癌、前立腺癌及び乳癌からなる群から選ばれるものである請求項20、27、28又は29記載の方法。 35．単一コロニークローンが遺伝子工学的に作り出されたものである請求項20 又は21記載の方法。 36．単一コロニークローンが自殺遺伝子を発現するものである請求項35記載の方法。 37．自殺遺伝子が、pTK-Sec3、pCD-Sec1及びpSP-SAD4-5からなる群から選ばれるプラスミドによってコードされるものである請求項36記載の方法。 38．単一コロニークローンが、p450酸化還元酵素、HSVチミジンキナーゼ、E.c oliシトシンデアミナーゼ、カルボキシペプチダーゼG2、β-グルクロニダーゼ、ペニシリン-V-アミダーゼ、ペニシリン-G-アミダーゼ、β-ラクタマーゼ、β-グルコシダーゼ、ニトロレダクターゼ及びカルボキシペプチダーゼAからなる群から選ばれる自殺遺伝子を発現するものである請求項36記載の方法。 39．自殺遺伝子が、HSVチミジンキナーゼ及びE.coliシトシンデアミナーゼからなる群から選ばれるものである請求項37又は38記載の方法。 40．自殺遺伝子の発現が、構成プロモーターにより調節されるものである請求項36記載の方法。 41．自殺遺伝子の発現が、誘導プロモーターにより調節されるものである請求項36記載の方法。 42．自殺遺伝子の発現が、特異的標的細胞中で活性化される細菌型プロモーターにより調節されるものである請求項36記載の方法。 43．自殺遺伝子の発現が、特異的腫瘍細胞中で活性化される細菌型プロモーターにより調節されるものである請求項42記載の方法。 44．固形腫瘍癌の診断方法であって、 (a) 癌細胞であると疑われる細胞の生検試料を、腫瘍特異的微生物に、該微生物が癌であると疑われる細胞に感染できるように十分な時間曝し、 (b) 癌でない対となる対照細胞の試料を、腫瘍特異的微生物に同じ時間曝し、そして、 (c) 癌であると疑われる細胞及び癌でない対となる対照細胞について微生物の感染力を比較することを含む方法。 45．微生物が、Borrelia burgdorferi，Brucella melitensis，Escherichia c oli，腸内侵襲性Escherichia coli，Legionella pneumophila，Salmonella typh i，Salmonella typhimurium，Shigella spp.，Treponema pallidum，Yersinia e nterocohtica，Chlamydia trachomatis，Listeria monocytogenies，Mycobacter ium avium，Mycobacterium bovis，Mycobacterium tuberculosis，Mycoplasma h ominis，Rickettsiae quintana，Streptococcu sspp.，Cryptococcus neoformans，Histoplasma capsulatum，Pneumocystis carnii，Eimeria acervul ina，Neospora caninum，Plasmodium falciparum，Sarcocystis suihominis，To xoplasma gondii，Leishmania amazonensis，Leishmania major，Leishmania me xacana，Leptomonas karyophilus，Phytomonasspp.，Trypanasoma cruzi，Encep hahtozoon cuniculi，Nosema helminthorum及びUnikaryon legeriからなる群から選ばれるものである請求項44記載の方法。 46．微生物が、Salmonella typhimurium株 #14028^pop-1、Salmonella typhimu rium株 #14028^pop-2、Salmonella typhimurium株 #72^pop-1、Salmonella typhim urium株 #72^pop-2、Salmonella typhimurium株 #70、Salmonella typhimurium株 #71、Salmonella typhimurium株 #72、Salmonella typhimurium株 #72^5-3-2、S almonella typhimurium株 YS721、Salmonella typhimurium株 YS7211、Salmon ella typhimurium株 YS7212及びSalmonella typhimurium株 YS7213からなる群から選ばれるものである請求項44記載の方法。 47．微生物が、 (a) 固形腫瘍癌の細胞培養物を、微生物に、該微生物が腫瘍細胞に感染することができるように十分な時間曝し、そして、 (b) 感染した細胞培養物から、重感染した腫瘍細胞特異的微生物の集団を単離することにより生産されるものである請求項44記載の方法。 48．微生物が、 (a) 微生物を、腫瘍細胞馴らし培地に、該微生物が腫瘍細胞馴らし培地に向かって走化性をもたらすのに十分な時間曝し、そして、 (b) 腫瘍細胞馴らし培地に向かって走化性を有する微生物の集団を単離することにより生産されるものである請求項44記載の方法。 49．微生物が、 (a) 固形腫瘍細胞癌を有する哺乳動物を、微生物に、該微生物が腫瘍細胞に感染することができるように十分な時間曝し、そして、 (b) 感染した腫瘍細胞から、重感染した腫瘍細胞特異的微生物の集団を単離することにより生産されるものである請求項44記載の方法。 50．(c)ステップ(b)で単離された集団を、単一コロニークローンが得られるように培養することをさらに含む、請求項47、48又は49記載の方法。 51．ステップ(a)の前に微生物を突然変異誘発にかけることをさらに含む、請求項47、48又は49記載の方法。 52．ステップ(a)及び(b)を所望の回数繰り返すことをさらに含む、請求項47、 48又は49記載の方法。 53．固形腫瘍細胞癌がメラノーマの癌である請求項44、47、48又は49記載の方法。 54．固形腫瘍細胞癌が結腸腺癌である請求項44、47、48又は49記載の方法。 55．固形腫瘍癌が、肺癌、肝臓癌、腎臓癌、前立腺癌及び乳癌からなる群から選ばれるものである請求項44、47、48又は49記載の方法。 56．微生物が遺伝子工学的に作り出されたものである請求項44記載の方法。 57．腫瘍特異的微生物の有効量を含む診断用キット。 58．腫瘍特異的微生物が、重感染した腫瘍特異的微生物である請求項57記載の診断用キット。 59．癌でない対となる対照細胞をさらに含む、請求項57記載の診断用キット。 60．微生物が、Borrelia burgdorferi，Brucella melitensis，Escherichia c oli，腸内侵襲性Escherichia coli，Legionella pneumophila，Salmonella typh i，Salmonella typhimurium，Shigella spp.，Treponema pallidum，Yersinia e nterocohtica，Chlamydia trachomatis，Listeria monocytogenies，Mycobacter ium avium，Mycobacterium bovis，Mycobacterium tuberculosis,Mycoplasmahom inis，Rickettsiaequintana，Streptococcusspp.，Cryptococcusneoformans，Hi stoplasma capsulatum，Pneumocystis carnii，Eimeria acervulina，Neospora caninum，Plasmodium falciparum，Sarcocystis suihominis，Toxoplasma gondi i，Leishmania amazonensis，Leishmania major，Leishmania mexacana，Leptom onas karyophilus，Phytomonasspp.，Trypanasomacruzi，Encephahtozoon cunic uli，Nosema helminthorum及びUnikaryon legeriからなる群から選ばれるものである請求項57記載の診断用キット。 61．微生物が、Salmonella typhimurium株 #14028^pop-1、Salmonella typhimu rium株 #14028^pop-2、Salmonella typhimurium株 #72^pop-1、Salmonella typhim urium株 #72^pop-2、Salmonella typhimurium株 #70、Salmonella typhimurium株 #71、Salmonella typhimurium株 #72、Salmonella typhimurium株 #72^5-3-2、S almonella typhimurium株 YS721、Salmonella typhimurium株 YS7211、Salmon ella typhimurium株 YS7212及びSalmonella typhimurium株 YS7213からなる群から選ばれるものである請求項58記載の診断用キット。 62．微生物が遺伝子工学的に作り出されたものである請求項58記載の診断用キット。 63．固形腫瘍癌が転移癌である請求項５、12、13又は14記載の方法。 64．固形腫瘍癌が転移癌である請求項20、27、28又は29記載の方法。 65．固形腫瘍癌が転移癌である請求項44、47、48又は49記載の方法。