JP2000512853A - 非天然ヌクレオチドを有するキメラ突然変異性ベクター - Google Patents
非天然ヌクレオチドを有するキメラ突然変異性ベクターInfo
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Abstract
Description
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1.真核細胞の遺伝子に変異を導入するためのオリゴヌクレオ塩基化合物であっ て、 a)1)合計で少なくとも15個のヌクレオ塩基; 2)2'AX-ヌクレオシド、2'AX-ヌクレオトイドおよび2'AR-ヌク レオチド(ここでA=O、F、ClまたはBrであり、A=Oであるとき X=HまたはC1-6アルカンおよびR=C1-6アルカンであり、A≠ Oであるとき、XおよびRは存在しない)よりなる群から選択される 少なくとも3個のヌクレアーゼ耐性のリボ型ヌクレオ塩基;および 3)ヌクレアーゼ耐性のリボ型ヌクレオ塩基と同じであっても、それらに 加わったものでもよい、少なくとも3個の連続リボ型ヌクレオ塩基; を含んでなる、3'端と5'端を有する第1ストランド、および b)3'端と5'端を有するヌクレオ塩基の第2ストランドであって、第2スト ランドのヌクレオ塩基が第1ストランドのヌクレオ塩基にワトソン・ク リック型塩基対合しているもの、 を含んでなり、 第1ストランドの連続リボ型ヌクレオ塩基が2'-デオキシリボ型ヌクレオ塩基 にワトソン・クリック型塩基対合しており、少なくとも1個のリボ型ヌクレオ 塩基が2'O-メチル置換ヌクレオチド以外のものである、上記のオリゴヌクレ オ塩基化合物。 2.第1ストランドが3'末端と5'末端を有するオリゴヌクレオ塩基鎖の一領域で ある、請求項1に記載の化合物。 3.第1ストランドが少なくとも3個の連続リボ型ヌクレオ塩基のセグメントを 少なくとも2つ含み、前記リボ型ヌクレオ塩基が2'-デオキシリボ型ヌクレオ 塩基にワトソン・クリック型塩基対合している、請求項2に記載の化合物。 4.第1ストランドの各リボ型ヌクレオ塩基が第2ストランドのデオキシリボ型 ヌクレオ塩基にワトソン・クリック型塩基対合している、請求項3に記載の化 合物。 5.第1ストランドの各リボ型ヌクレオ塩基が2'AX-ヌクレオシド、2'AX- ヌクレオトイドおよび2'AR-ヌクレオチド(ここでA=O、F、ClまたはBr であり、A=OであるときX=HまたはC1-6アルカンおよびR=C1-6アル カンであり、A≠Oであるとき、XおよびRは存在しない)よりなる群から選 択される、請求項4に記載の化合物。 6.第1ストランドを含有する第1の3'末端と第1の5'末端をもつ第1鎖、およ び第2ストランドを含有する第2の3'末端と第2の5'末端をもつ第2鎖を含む 、請求項5に記載の化合物。 7.少なくとも1個のリボ型ヌクレオ塩基についてはA=Fである、請求項5に 記載の化合物。 8.第1鎖と第2鎖がワトソン・クリック型塩基対合したヌクレオ塩基によって のみ結合されている、請求項6または7に記載の化合物。 9.少なくとも14個の連続ヌクレオ塩基の配列を有する一領域または少なくとも 7個の連続ヌクレオ塩基の配列を有する一対の領域をさらに含み、前記配列の それぞれが哺乳動物遺伝子の断片またはその相補体の配列である、請求項5に 記載の化合物。 10.少なくとも14個の連続ヌクレオ塩基の配列を有する一領域または少なくとも 7個の連続ヌクレオ塩基の配列を有する一対の領域をさらに含み、前記配列の それぞれが植物遺伝子の断片またはその相補体の配列である、請求項5に記載 の化合物。 11.第1ストランドが少なくとも9個のリボ型ヌクレオ塩基を含む、請求項5に 記載の化合物。 12.第2ストランドがリボ型ヌクレオ塩基を含まない、請求項5に記載の化合物 。 13.ペプチドヌクレオ塩基を含まない、請求項5に記載の化合物。 14.ペントースフラノシルヌクレオ塩基のみを含む、請求項13に記載の化合物。 15.1本のオリゴヌクレオ塩基鎖を含む、請求項14に記載の化合物。 16.a)第1ストランドまたは第2ストランドに結合されたヘアピンキャップ; および b)第1端と第2端を有するリンカーであって、前記第1端が第1ストラン ドの3'端に共有結合しており、前記第2端が第2ストランドの5'端に共 有結合しているもの; をさらに含む、請求項15に記載の化合物。 17.第1ストランドの5'端が5'末端である、請求項16に記載の化合物。 18.第2ストランドの3'端が3'末端である、請求項16に記載の化合物。 19.a)第1ストランドまたは第2ストランドに結合されたヘアピンキャップ; および b)第1端と第2端を有するリンカーであって、前記第1端が第1ストラン ドの5'端に共有結合しており、前記第2端が第2ストランドの3’端に 共有結合しているもの; をさらに含む、請求項15に記載の化合物。 20.第1ストランドの3'端が3'末端である、請求項19に記載の化合物。 21.第2ストランドの5'端が5'末端である、請求項19に記載の化合物。 22.第1ストランドが、少なくとも6個のリボ型ヌクレオ塩基からなる第1のリ ボ-セグメント少なくとも3個のリボ型ヌクレオ塩基からなる第2のリボ- セグメント、および少なくとも4個の2'-デオキシリボヌクレオ塩基からなる 介在デオキシリボ-セグメントを含む、請求項5に記載の化合物。 23.第1もしくは第2ストランドの3'端または第1もしくは第2ストランドの5' 端を保護する保護基をさらに含む、請求項5に記載の化合物。 24.第1ストランドが2'OMe-リボヌクレオチド以外のヌクレアーゼ耐性リボ型 ヌクレオ塩基を含む、請求項5に記載の化合物。 25.第2ストランドが2'-デオキシリボ型ヌクレオシドまたはペプチドヌクレオ 塩基を含む、請求項5に記載の化合物。 26.真核細胞の染色体上に該細胞の選択可能な表現型変化を引き起こす標的配列 の変異を有する真核細胞を単離する方法であって、次の工程: a)オリゴヌクレオ塩基を用意すること、ただし前記オリゴヌクレオ塩基は、 1)i)合計で少なくとも15個のヌクレオ塩基; ii)2'AX-ヌクレオシド、2'AX-ヌクレオトイドおよび2'AR- ヌクレオチド(ここでA=O、F、ClまたはBrであり、A=Oで あるときX=HまたはC1-6アルカンおよびR=C1-6アルカン であり、A≠Oであるとき、XおよびRは存在しない)よりなる 群から選択される、少なくとも3個のヌクレアーゼ耐性のリボ型 ヌクレオ塩基;および iii)ヌクレアーゼ耐性のリボ型ヌクレオ塩基と同じであっても、それ らに加わったものでもよい、少なくとも3個の連続リボ型ヌクレ オ塩基; を含んでなる、3'端と5'端を有するヌクレオ塩基の第1ストランド、 および 2)3'端と5'端を有するヌクレオ塩基の第2ストランド、 を含んでなり、第2ストランドのヌクレオ塩基が第1ストランドのヌクレオ 塩基にワトソン・クリック型塩基対合しており、第1ストランドの連続リボ 型ヌクレオ塩基が2'-デオキシリボ型ヌクレオ塩基にワトソン・クリック型 塩基対合しており、前記オリゴヌクレオ塩基は標的配列の領域とそれぞれ相 同な2つの相同領域およびそれらの間に配置されたミューテーター領域をさ らに含むものである; b)前記細胞の核内に前記オリゴヌクレオ塩基を維持すること;および c)前記選択可能な表現型変化を有する細胞を選択すること; を含んでなる上記方法。 27.ミューテーター領域が6個またはそれ以下のヌクレオ塩基である、請求項26 に記載の方法。 28.前記変異が6〜1個のヌクレオ塩基の欠失である、請求項26に記載の方法。 29.相同領域が合わせて9個以上で25個より少ないリボ型ヌクレオ塩基を含む、 請求項26に記載の方法。 30.培養哺乳動物細胞の染色体上の標的配列に変異を導入する方法であって、次 の工程: a)オリゴヌクレオ塩基を用意すること、ただし前記オリゴヌクレオ塩基は、 1)i)合計で少なくとも15個のヌクレオ塩基; ii)2'AX-ヌクレオシド、2'AX-ヌクレオトイドおよび2'AR- ヌクレオチド(ここでA=O、F、ClまたはBrであり、A=Oで あるときX=HまたはC1-6アルカンおよびR=C1-6アルカン であり、A≠Oであるとき、XおよびRは存在しない)よりなる 群から選択される、少なくとも3個のヌクレアーゼ耐性のリボ型 ヌクレオ塩基;および iii)ヌクレアーゼ耐性のリボ型ヌクレオ塩基と同じであっても、それ らに加わったものでもよい、少なくとも3個の連続リボ型ヌクレ オ塩基; を含んでなる、3'端と5'端を有するヌクレオ塩基の第1ストランド、 および 2)3'端と5'端を有するヌクレオ塩基の第2ストランド、 を含んでなり、第2ストランドのヌクレオ塩基が第1ストランドのヌクレオ 塩基にワトソン・クリック型塩基対合しており、第1ストランドの連続リボ 型ヌクレオ塩基が2'-デオキシリボ型ヌクレオ塩基にワトソン・クリック型 塩基対合しており、前記オリゴヌクレオ塩基は標的配列の領域とそれぞれ相 同な2つの相同領域およびそれらの間に配置されたミューテーター領域をさ らに含むものである; b)前記細胞の核内に前記オリゴヌクレオ塩基を維持すること; を含んでなり、それにより、標的配列に変異を導入するが、前記変異は選択可 能な表現型をもたらす変異以外のものである、上記方法。 31.ミューテーター領域が6個またはそれ以下のヌクレオ塩基である、請求項30 に記載の方法。 32.前記変異が6〜1個のヌクレオ塩基の欠失である、請求項30に記載の方法。 33.相同領域が合わせて9個以上で25個より少ないリボ型ヌクレオ塩基を含む、 請求項30に記載の方法。 34.前記変異がヒト細胞における病因突然変異を修復する、請求項30に記載の方 法。 35.前記変異が標的配列を含む遺伝子の不活性化をもたらす、請求項30に記載の 方法。 36.植物細胞のゲノムの標的配列に変異を導入する方法であって、次の工程: a)オリゴヌクレオ塩基を用意すること、ただし前記オリゴヌクレオ塩基は、 1)i)合計で少なくとも15個のヌクレオ塩基; ii)2'AX-ヌクレオシド、2'AX-ヌクレオトイドおよび2'AR- ヌクレオチド(ここでA=O、F、ClまたはBrであり、A=Oで あるときX=HまたはC1-6アルカンおよびR=C1-6アルカン であり、A≠Oであるとき、XおよびRは存在しない)よりなる 群から選択される、少なくとも3個のヌクレアーゼ耐性のリボ型 ヌクレオ塩基;および iii)ヌクレアーゼ耐性のリボ型ヌクレオ塩基と同じであっても、それ らに加わったものでもよい、少なくとも3個の連続リボ型ヌクレ オ塩基; を含んでなる、3'端と5'端を有するヌクレオ塩基の第1ストランド、 および 2)3'端と5'端を有するヌクレオ塩基の第2ストランド、 を含んでなり、第2ストランドのヌクレオ塩基が第1ストランドのヌクレオ 塩基にワトソン・クリック型塩基対合しており、第1ストランドの連続リボ 型ヌクレオ塩基が2'-デオキシリボ型ヌクレオ塩基にワトソン・クリック型 塩基対合しており、前記オリゴヌクレオ塩基は標的配列の領域とそれぞれ相 同な2つの相同領域およびそれらの間に配置されたミューテーター領域をさ らに含むものである; b)前記細胞の核内に前記オリゴヌクレオ塩基を維持すること; を含んでなり、それにより標的配列に変異を導入する、上記方法。 37.ミューテーター領域が6個またはそれ以下のヌクレオ塩基である、請求項36 に記載の方法。 38.前記変異が6〜1個のヌクレオ塩基の欠失である、請求項36に記載の方法。 39.相同領域が合わせて9個以上で25個より少ないリボ型ヌクレオ塩基を含む、 請求項36に記載の方法。
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