JP2000511047A - 光学活性ヒドロキサム酸の酵素学的合成及びＬｏｓｓｅｎ転移によるそれらの光学活性一級アミンへの変換 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 一般式 （ここでR¹、R²及びR³は異なり、環状又は直線で、脂肪族又は芳香族で、置換又は非置換の炭化水素ラジカルであって、任意にヘテロ原子を含むことができる）の光学活性ヒドロキサム酸の調製方法であって、一般式 のキラルなアミド、カルボン酸エステル又はカルボン酸のラセミ体（ここでR¹、R²及びR³は上記定義と同じであり、Xは-NH₂、-OR又は-OHでありRは任意の有機ラジカルである）を、アシルトランスフェラーゼの存在下でヒドロキシルアミンNH₂OHと反応させ、続いて形成された光学活性ヒドロキサム酸(I)を、変換されない一般式(II)の鏡像体から分離することを特徴とする方法が記載される。得られる光学活性ヒドロキサム酸は、Lossen転移により、対応する光学活性一級アミンに変換することが出来る。

Description

【発明の詳細な説明】 光学活性ヒドロキサム酸の酵素学的合成及びLossen転移によるそれらの光学活性 一級アミンへの変換 本発明は、光学活性ヒドロキサム酸の酵素学的合成及びLossen転移によるそれ らの光学活性一級アミンへの変換に関する。 ヒドロキサム酸は、大きな薬剤学的関心が持たれる化合物である。ヒドロキサ ム酸誘導体は抗菌及び殺真菌特性を有するものとして存在している(Duda et al. ，1965;Hase et al.，1971)。アルキルアミノプロピオノヒドロキサム酸は、降 圧特性を示す(Coutts et al.，1971)。低コレステロール(hypocholesterolaemic )作用もまた、ヒドロキサム酸について示されている(Ludwig et al.，1967)。p- ブトキシフェニルアセトヒドロキサム酸は、抗炎症作用を有し(Dell et al.，19 71)、ヒトの医薬として用いられている。マラリアに対する効力について研究さ れているヒドロキサム酸もある(Hynes，1970;Hynes & Hack，1972)。 しかしながら、鏡像体的に純粋なヒドロキサム酸は、特に重要である。それら の薬理学的活性は、ラセミ体より高い。さらに、Lossen転移を介し、それらはキ ラル一級アミンへの新しいルートを開く。このクラスの 物質もまた薬理学的重要性が高い。したがって例えばキラルβ-アミノアルコー ルは、β-ブロッカーと略称されるβ-アドレナリン受容体アンタゴニストとして 多量に使用される。 しかしながら、慣用の有機化学的方法による鏡像体的に純粋なヒドロキサム酸 の調製は高価となる。通常は、ラセミ分割又は有機金属触媒の使用が必要となる が、後者は薬物の調製には一般的には適さない。これらの方法は、例えば、DE-P S 2 400 531，EP-A-203 379及びEP-A-268 215に記載されている。 従って本発明の目的は、上記問題と関連しない、光学活性なヒドロキサム酸を 調製する新規な方法を提供することにある。 驚くべきことに、α-炭素原子にキラル中心を有するアミド、カルボン酸エス テル及びカルボン酸が、ヒドロキシルアミン存在下アシルトランスフェラーゼに よって、鏡像体選択的に光学活性ヒドロキサム酸に変換されうることが此度見出 された。 従って、本発明は、一般式 （ここでR¹、R²及びR³は異なり、環状又は直線で、脂 肪族又は芳香族で、置換又は非置換の炭化水素ラジカルであって、任意にヘテロ 原子を含むことができる）の光学活性ヒドロキサム酸の調製方法であって、一般 式 で表わされるキラルなアミド、カルボン酸エステル又はカルボン酸のラセミ体（ ここでR¹、R²及びR³は上記定義と同じであり、Xは-NH₂、-OR又は-OHでありRは任 意の有機ラジカルである）を、アシルトランスフェラーゼの存在下でヒドロキシ ルアミンNH₂OHと反応させ、続いて形成された光学活性ヒドロキサム酸(I)を、変 換されない一般式(II)の鏡像体から分離することを特徴とする方法を提供する。 適切なアシルトランスフェラーゼ、即ちアシルラジカルをヒドロキシルアミン に移す酵素自体は知られている。それらは、例えば以下の微生物から分離するこ とができる：ミコバクテリア科(Mycobacteriaceae)、スメグマ菌(Mycobacterium smegmatis)、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)、アルトロバクター(Arthrobact er)、アスペルギルス・ニジュランス (Aspergillus nidulans)、ブラジリゾビウム・ジャポニカム(Bradyrhizobium ja ponicum)、ブレビバクテリウム(Brevibacterium)sp.R312、メチロフィラス・メ チロトロフス(Methylophilus methylotrophus)、シュードモナス・クロロラフィ ス(Pseudomonas chlororaphis)、シュードモナス・フルオレセンス(Pseudomonas fluorescens)、ロドコッカス・ロドクロス(Rhodococcus rhodochrous)J1及びロ ドコッカス・エリスロポリス(Rhodococcus erythropolis)MP50。 ロドコッカス・エリスロポリスMP50から単離されたアシルトランスフェラーゼ は、特に非常に適切であることが見出される。研究された全てのアミダーゼの中 で、これが最も高い特異的活性と最も広い基質スペクトラムを有していた。アミ ダーセ及びアシルトランスフェラーゼ活性を、同じ酵素に見出すことが出来る。 アミダーゼ活性も高いが、アシルトランスフェラーゼ活性が著明に高く、これは おそらくヒドロキシルアミンが水より良いアシルラジカル受容体だからであろう 。従って、この特殊なアシルトランスフェラーゼ即ちロドコッカス・エリスロポ リスMP50から単離されたアシルトランスフェラーゼを用いることにより、出発材 料としてアミド及びエステルが用いられた加水分解を高度に回避することができ る。 本発明の方法は、前記微生物からのアシルトランスフェラーゼの粗抽出物又は 精製形を用いて行うことが できる。粗抽出物を用いることは、酵素精製段階を不用とすることができるとい う利点がある。しかしながら特殊な応用において、精製されたアシルトランスフ ェラーゼを使用することが推奨される。特に、精製アシルトランスフェラーゼの 触媒活性は粗抽出物のものより高いことが見出されており、従って化学的に不活 性な出発材料は、好ましくは精製されたアシルトランスフェラーゼにより反応さ れる。 ロドコッカス・エリスロポリスMP50からのアシルトランスフェラーゼの回収及 び精製は、『ロドコッカス・エリスロポリスMP50からの、鏡像体選択的に2‐ア リルプロピオンアミドを加水分解するアミダーゼの精製と性質』B．Hirrlinger ，A．Stolz & H.-J.Knackmuss，Journal of Bacteriology，1996，vol.178(12) ，pp.3501-3507に記載されている。 細胞又は精製された酵素は、直接又は固定化形態として用いることができる。 固体化は、生物学的触媒に様々な用途を付与すること、及び反応混合物の刺激の 単純化を可能とする。本発明の枠組みの中で、全細胞又は精製酵素は、それ自体 は知られた方法で固定化される。全細胞は、例えばアルギン酸塩、κ−カラギー ナン、ポリウレタン又はポリアクリルアミドで固定化される(I．Chibata，T.Tos a & T．Sato，1983，Immobilized Cells in Preparation of Fine Chemicals，A dvances In Biotechnological Processes(A.R.Liss， editor)，volume 1，pp.203-222)。 セルロース）上への吸着、イオン交換樹脂（DEAE-セルロース、セファデックス ）へのイオン結合、担体（ポーラスガラスビーズ、セルロース、デキストラン、 アガロース）への共有結合的結合、又はゲル（アルギン酸塩、寒天、ポリアクリ ルアミド）への包含のいずれかによって固定化される(0.R.Zaborsky，1973，Imm obilized Enzymes，CRC Press，Cleveland，Ohio;M.D．Trevan，1980，Immobili zed Enzymes:Introduction and Applications in Biotechnology，Wiley，New Y ork;W．Hartmeier，1986，Immobilisierte Biokatalysatoren(固定化生物触媒) ，Springer，Berlin)。 本発明の方法は酵素触媒反応であるので、反応媒体のpHは考慮されるべきもの である。一般的に、5.5から９のpH範囲、好ましくは6.5から7.0のpH範囲である 必要がある。適切な緩衝液系、例えばリン酸ナトリウム緩衝液及びトリス／HCl 緩衝液等を、この目的に用いることができる。 原則的に、カルボニル炭素に隣接する炭素原子即ちα‐炭素原子がキラルであ る限り、いずれのアミド、カルボン酸エステル及びカルボン酸をも、所望のヒド ロキサム酸の調製の出発材料として用いることが可能である。このことは、この 炭素原子上に存在する置換 基は異なっている必要があることを意味する。これらの置換基は、いずれの環状 又は直鎖状、脂肪族又は芳香族、置換又は非置換の炭化水素ラジカルであっても よく、任意に酸素、硫黄、窒素、リン等のヘテロ原子を含むことができる。 メチル、エチル、n-ペンチル、イソプロピル、シクロヘキシル、フェニル及び ナフチル等の置換基が、特に適切であることが見出される。 従って特に好ましい出発材料は、アルキルアミノプロピオン酸、p-ブトキシフ ェニル酢酸、2-フェニルプロピオン酸、2-(6-メトキシ-2-ナフチル)プロピオン 酸(ナプロキセン(naproxen))、2-(3'-ベンゾイルフェニル)プロピオン酸(ケトプ ロフェン(ketoprofen))、2-メチルブタン酸、2-(1-ナフチル)プロピオン酸並び にこれらのエステル又はアミドである。 一般的に、一般式(I)で包含される化合物のアミドを用いることが、対応する カルボン酸又はカルボン酸エステルより反応性であるので好ましい。 反応媒体中の反応物の濃度は特に決定的ではない。式(I)の化合物は概ね0.5か ら0.001mol./l、好ましくは0.1mol./lの濃度で用いられる。ヒドロキシルアミン の濃度は概ね1.0から0.1mol./l、好ましくは0.5から0.2mol./lである。ヒドロキ シルアミンに対する式(I)の化合物の比は、従って概ね1:10から1:2であり好まし くは1:5である。アシルトランスフェラーゼ の活性は概ね3.5から37単位/mg蛋白であり、好ましくは13単位/mg蛋白である(基 質として2-フェニルプロピオンアミドを用いた場合)。 本発明の方法の本質的な利点は、アシルトランスフェラーゼが、ヒドロキシル アミンとともに出発材料として用いられる光学活性アミド、カルボン酸エステル 又はカルボン酸ラセミ体の内の一つの鏡像体のみの、対応するヒドロキサム酸へ の変換を選択的に触媒する一方でその対掌体が反応において変化せずに残るとい う事実として認められるものである。従って、まず変換の直後に得られる反応混 合物は、光学的に純粋なヒドロキサム酸を、変換されない出発材料の鏡像体と共 に含む。これらの２つの成分は、反応混合物を酢酸エチル、ジエチルエーテル又 は塩化メチレンと振とうして抽出することにより、他方と容易に分離することが できる。その一般的な手順は以下の通りである： 水性反応溶液を、水酸化ナトリウム溶液でpH10に調整する。アミドを上記有機 溶媒のいずれかで抽出する。続いて水相を塩酸でpH2に調整する。続いて振とう することによりヒドロキサム酸を有機相へ抽出し、単離する。 このように回収した光学活性ヒドロキサム酸は、続いてそれ自体知られた態様 で、Lossen転移により、対応する光学活性で鏡像体的に純粋な一級アミンに変換 することができる。従って本発明はまた、一般式 の光学活性一級アミン（ここでR¹、R²及びR³は上記定義と同じである）の調製方 法であって、上記の通り得られた一般式(I)の光学活性ヒドロキサム酸をO-アシ ル化し、該O-アシル化ヒドロキサム酸を加熱すること又は非プロトン溶媒中で塩 基と処理することにより対応するイソシアネートに変換し、該イソシアネートを 水と反応させCO₂の脱離と共に一般式(III)のアミンを与える方法を提供する。 Lossen転移は、従って、以下の反応式に従って進行する： 適切な塩基は、NaOH、KOH、NaNH₂、及びNa₂CO₃等の化合物であり、塩基の性質 は、所望のヒドロキサム酸の構造に応じて用いられた。 便利な非プロトン溶媒の例は、トルエン、ベンゼン及びキシレンである。 O-アシル化ヒドロキサム酸を出来るだけ定量的に且つ速く分解するために、10 0℃から150℃、好ましくは100℃の温度が一般的には便利である。 出発材料として用いられる光学活性ヒドロキサム酸のα‐炭素原子の絶対配置 はLossen転移において保持される（Campbell & Kenyon，1946参照）ので、Losse n転移の生成物として得られる一級アミンもまた光学活性である。 しかしながら、光学活性一級アミンの調製のための本願発明の方法においては 、第一の酵素触媒反応の後、光学活性ヒドロキサム酸の調製に用いられるアミド 、カルボン酸エステル又はカルボン酸の変換されない鏡像体を除去する必要が無 い。即ち、純粋な光学活性ヒドロキサム酸を用いる必要が無い。反応はまた、第 一にキラルなアミド、カルボン酸エステル又はカルボン酸のラセミ体を酵素触媒 下でヒドロキシルアミンと反応させ、光学活性ヒドロキサム酸と共に出発材料の 変換されない鏡像体を含む得られた反応混合物を、カルボジイミドとプロトン触 媒下で反応させ中間体として イソシアネート及び対応する尿素誘導体を形成するような方法で行うことができ る。イソシアネートは続いて直ちに反応系に含まれる水と反応し、カルバミン酸 を与え、これがさらに二酸化炭素及び所望の光学活性一級アミンに分解される。 アミンは、出発材料の変換されていない鏡像体から容易に分離することができる 。 カルボジイミドとの反応は、水性の反応系で得られる光学活性ヒドロキサム酸 は直ちにさらなる反応に供され、従って精製工程の必要を除くことができるとい う利点を有する。慣用のヒドロキサム酸のO-アシル化の化学的方法は非プロトン 溶媒中においてのみ行うことができ、これは酵素触媒反応において不便であるの で、カルボジイミドを用いた誘導体化が必要になる。 適切なカルボジイミドの例は、1-ベンジル-3-(3'-ジメチルアミノプロピル)カ ルボジイミド、１-シクロヘキシル-3-(2'-モルホリノエチル)カルボジイミド及 び１-エチル-3-(3'-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドである。1-エチル- 3-(3'-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDC)は、特に便利であることが 見出される。このカルボジイミドは、例えばSheehan,J.C.，P.A．Cruickshank & G.L.Boshart，1961，A convenient synthesis of water-soluble carbodiimide s，J.Org.Chem．26，2525-2528に記載される。 一般的に過剰量のヒドロキシルアミンが光学活性ヒ ドロキサム酸の調製に用いられるので、反応混合物がカルボジイミドと反応され る前に過剰のヒドロキシルアミンを除くのが便利である。これは、反応混合物を pH0から２の範囲、好ましくは１の領域に酸性化することにより行われる。ヒド ロキシルアミンは続いてアンモニアと亜酸化窒素に容易に分解される(Holleman, A.F．& E.Wiberg，1985，Lehrbuch der Anorganischen Chemie（無機化学テキス ト），edition 91-100，p.591，Walter de Gruyter Verlag，Berlin，New York) 。 酸性化した後、反応混合物を40℃から100℃の範囲、好ましくは80℃の温度で 、さらなるガスの生成が観察され得なくなるまで加熱する。続いて水酸化ナトリ ウム溶液等の塩基を反応混合物に添加し、pHを4から6、好ましくはpH5.0に調整 する。 続いて、以下の一般式に従って、カルボジイミドの誘導体化が行われる。 ここで、R¹からR⁵は上で定義された通りである。 本発明の方法において出発物質として例えばラセミ体の2-フェニルプロピオン アミドが用いられた場合、以下の反応式に従って、S-(-)-フェニルエチルアミン 及びR-2-フェニルプロピオンアミドがまず得られる。 所望の光学活性一級アミンは、出発材料の変換されなかった鏡像体から容易に 分離される。用いうる手順は以下の通りである：水性反応溶液を塩酸でpH1に酸 性化し酢酸エチル、ジエチルエーテル又は塩化メチレンで抽出する。アミドは有 機相にくる。続いて水相のpHを水酸化ナトリウム溶液で10とし、前述の溶媒でア ミンを抽出する。 この手順は、本方法を用いなければ高価なラセミ分割によってのみ得られるS- (-)-フェニルエチルアミン、S-2-アミノブタン又はS-1-(1-ナフチル)エチルアミ ン等の光学活性一級アミンを与える。 本発明は、以下の実施例により、より詳細に説明される。 ヒドロキサム酸を決定する手順は以下の通りである： 二座配置(bidentate)のリガンドとして、ヒドロキサム酸は、鉄(III)イオンと 、安定で強い色のキレート複合体を形成する。これらのトリスヒドロキサマト鉄 (III)複合体[Fe(RCONHO)₃]は、500nmに最大吸収を有し、目視で深い赤い色を有 している。この特性は、ヒドロキサム酸の定性決定(Buckles,R.E．& C.J．Thele n，1950，Qualitative determination of carboxylic esters．Scope and limit ations of hydroxamic acid test．Anal．Chem．22，676-678)及び定量決定（Br ammar，W.J．& P.H.Clarke，1964，Induction and repression of Pseudomonas aeruginosa amidase．J.Gen.Microbiol．37，307-319)に利用される。鉄複合体 は、ヒドロキサム酸を含む溶液を、塩酸で酸性化した塩化鉄(III)溶液と混合す ることにより得られる。吸光率は、ガラスセル中分光法により500nmにおいて決 定される。 塩化鉄(III)溶液(Hoare,D.G.，A.Olson & D.E.Koshland JR.，1968．The reac tion of hydroxamic acids with water-soluble carbodiimides．A Lossen rear rangement．J.Am.Chem.Soc．90，1638-1643に従い改変）: FeCl₃・6H₂O 13.51g 濃塩酸（12M） 3.33ml H₂O 添加して500ml この溶液を、濁りを除くために孔径0.45μｍのフィルターに通した。 塩酸で酸性化した塩化鉄(III)溶液600μｌを、ピペットで、ヒドロキサム酸を 含む試料[トリス/HCl緩衝液(30mM，pH7.5)に溶解したヒドロキサム酸]300μｌ中 に入れた。深い赤色の鉄複合体が直ちに形成された。吸光率を分光光度法により 決定した。検量線を、トリス/HCl緩衝液(30mM，pH7.5)に溶解したアセトヒドロ キサム酸及び2-フェニルプロピオノヒドロキサム酸によりプロットした。これら は、ヒドロキサム酸濃度0.0から1.5mMの範囲における、吸光率とヒドロキサム酸 塩濃度との直線的な依存を示した。アセトヒドロキサム酸、フェニルアセトヒド ロキサム酸及び2-フェニルプロピオノヒドロキサム酸について決定されたモ ¹cm^-1、3800lmol.^-1cm^-1、及び4500lmol.^-1cm^-1であった。 酵素的活性は、HPLC及び測光法(photometricmethod)の両方により決定するこ とができる。測光的測定法は、室温で1mlガラスセル中光路長1cmで行われた。 比活性はmg蛋白当たりの酵素単位(U/mg)で示される。１単位は、１分間におい て１μｍｏｌ．の基質の変換又は１μｍｏｌ．の生成物の形成を触媒する酵素活 性であ る。 実施例１ ロドコッカス・エリスロポリスMP50の細胞を、アンモニア不含無機質培地に、 炭素及びエネルギー源としてコハク酸塩(10mM)、窒素源としてケトプロフェンア ミド(1mM)、並びに３％の複合培地(NB)を加えたもので育成した。対数増殖相の 終期に、細胞を遠心分離により回収し、トリス/HCl緩衝液(30mM、pH7.5)で一回 洗浄し、同じ緩衝液に再懸濁し、吸光度(OD_546nm)16.0を与えた。2.75mlのトリ ス/HCl緩衝液(30mM、pH7.5)をバッフル付き25ml三角フラスコのそれぞれに入れ 、54mgのフェニルアセタミド(PAA)又は23.6mgのアセトアミドを添加した。フラ スコを振とう水浴中で、PAA又はアセトアミドが完全に溶解するまで30℃でイン キュベートした。新たに調製し、新たにNaOH(10M)で中和した塩酸ヒドロキシル アミン溶液(2M)1mlを、それぞれのフラスコに添加した。それぞれのフラスコに0 .25mlの細胞懸濁液を添加することにより反応を開始した。総体積は4mlであった 。実験中吸光度(OD_546nm)は1.0であった。バッチは、0.1Mのアミド及び0.5Mのヒ ドロキシルアミンを含んでいた。細胞懸濁液のアリコット(aliquot)0.3mlを２分 間隔で取り、ピペットで、塩酸で酸性化した600μｌの塩化鉄(III)溶液に入れた 。細胞を遠心分離により除き、上澄みを再び１に対して10の比率の塩化鉄(III) 溶液で希釈した。吸 光率を500nmで測定し、フェニルアセトヒドロキサム酸（▼）又はアセトヒドロ キサム酸（◆）の含量を適切な検量線を用いて決定した（図１参照）。化学反応 によるヒドロキサム酸の生産を除外するために、静止した(quiescent)細胞を有 しない対応するバッチを並行してインキュベートした。30分間の観察期間にわた り、対照のバッチにおいてヒドロキサム酸の形成は全く検出できなかった。 さらなるバッチ（総体積4ml、OD_546nm=1.0）において、MP50株の静止した細胞 をPAA(100mM)と、ヒドロキシルアミンなしでインキュベートした。0.3mlの細胞 懸濁液を５分おきに取り、細胞を遠心分離により除き、フェニル酢酸（■）の濃 度をHPLCの手段により決定した。 図１に示すとおり、ヒドロキシルアミン存在下でアセトアミド及びフェニル アセトアミド(PAA)を基質として有する場合、ロドコッカス・エリスロポリスMP5 0はPAAの対応するカルボン酸への加水分解における細胞の比活性よりも著明に高 い、アシルトランスフェラーゼ活性を示す。 フェニル酢酸及びフェニルアセトヒドロキサム酸の形成の比活性は、それぞれ 0.54及び7.83U/mg蛋白であった。アセトヒドロキサム酸は、2.22U/mg蛋白の比活 性で形成された。 実施例２ アシルトランスフェラーゼ活性が実施例１においてMP50株の静止細胞において 検出されたので、実験は誘導された細胞からの粗抽出物から繰り返された。再び 、ヒドロキシルアミン存在下でPAA及びアセトアミドに対するアシルトランスフ ェラーゼ活性を検出することができた(図２)。PAAのフェニル酢酸への酵素加水 分解は、0.67U/mg蛋白の比活性で行われた。フェニルアセトヒドロキサム酸及び アセトヒドロキサム酸の形成における比活性はそれぞれ7.27U/mg及び7.80U/mg蛋 白であった。即ち、PAAの加水分解に比べて10倍を超えて高かった。 実験手順は以下の通りであった： ロドコッカス・エリスロポリスMP50の細胞を、窒素源としてのケトプロフェン アミド(1mM)と共に育成し、対数相の終期で回収した。それから粗抽出物を調製 した。10μｌの粗抽出物(6.5μｇ蛋白)を、エッペンドルフ反応槽内で640μｌの トリス/HCl緩衝液(30mM、pH7.5)で希釈し、新たに中性化した250μｌの塩酸ヒド ロキシルアミン水溶液(2M)と混合した。反応を、100μｌの、フェニルアセトア ミドのメタノール溶液(PAA、50mM)又はトリス/HCl緩衝液(30mM、pH7.5)中のアセ トアミド溶液(50mM)を添加することによって開始し、室温においた。総体積は1m lであった。反応中のアミド及びヒドロキシルアミンの濃度は5mM及び0.5Mであっ た。100μｌのバッチを２分おきにとり、塩酸で酸性化した 800μｌの酸化鉄(III)溶液と混合した。強酸性の溶液は蛋白質を変性させ、酵素 反応を停止させた。沈殿した蛋白を遠心分離で除き、上澄みの吸光率を分光光度 法で500nmにて決定した。フェニルアセトヒドロキサム酸（▼）及びアセトヒド ロキサム酸（◆）を、適切な検量線の手段により決定した。アミダーゼ活性を決 定するために、10μｌの粗抽出物を0.89mlのトリス/HCl緩衝液(30mM、pH7.5)で 希釈した。反応を、PAAメタノル溶液100μｌを添加することにより開始した。総 体積は1mlであり、PAA濃度は5mMであった。反応混合物の100μｌのアリコットを ピペットで定期的なインターバルで取り10μｌの1N HClに入れ、沈殿した蛋白を 遠心分離で除きフェニル酢酸濃度（■）をHPLCの手段で決定した。 実施例３ アシルトランスフェラーゼ活性を、静止した細胞及びMP50株の粗抽出物におい て検出することができた。アミダーゼ活性及びアシルトランスフェラーゼ活性が 本当に同じ酵素に由来しているかどうかはまだ示されていなかった。均質なまで に精製したアミダーゼでのヒドロキサム酸の形成は、アシルトランスフェラーゼ 及びアミダーゼは一つの同じ酵素であったことを証明した(表１)。 下の表１に示されるとおり、2-フェニルプロピオンアミドに対するアシルトラ ンスフェラーゼ活性は、ア ミダーゼ活性のおよそ３倍高かった。アセトヒドロキサム酸の形成は酢酸へのケ ン化の４倍速く進行し、フェニルアセトヒドロキサム酸ではフェニル酢酸の９倍 速く進行した。従って、例外無くMP50株からのアミダーゼは、アミドのカルボン 酸への加水分解においてより、ヒドロキサム酸の形成において高い比活性を示し た。 表１ 精製アミダーゼ手段による、カルボキサミドからのカルボン酸及びヒドロキサ ム酸の形成における比活性 アシルトランスフェラーゼ活性の測定のために、10μｌの精製したアミダーゼ （2.6μｇ蛋白）をエッペンドルフ反応槽中で0.64mlのリン酸ナトリウム緩衝液( 10mM、pH7.5)で希釈した。水酸化ナトリウムで中和した、0.25mlの新たに調製し た塩酸ヒドロキシルアミン溶液(2M)をピペットで添加した。反応を、適切なアミ ドのメタノールストック溶液0.1mlを添加することにより開始した。アセトアミ ド(50mM)をリン酸ナトリ ウム緩衝液(10mM、pH7.5)に溶解し、添加した。総体積は1mlであった。ヒドロキ シルアミン及び適切なアミドの濃度はそれぞれ0.5M及び5mMであった。20分間に わたり、反応混合物の４つの0.1mlアリコットをピペットで取り、塩酸で酸性化 した塩化鉄(III)溶液0.8mlに入れ、ヒドロキサム酸複合体の吸光率を光学測定に より500nmにおいて測定した。ヒドロキサム酸の濃度を、適切な検量線を介して 決定した。 アミダーゼ活性の測定のため、同量の蛋白を0.89mlのリン酸ナトリウム緩衝液 (10mM、pH7.5)に希釈し、適切なアミド(5mM)を添加した。形成されたカルボン酸 の濃度をHPLCの手段を用いて決定した。アセトアミドを用いた反応において、遊 離したアンモニアの量をインドフェノール法により決定した。 実施例４ アシルトランスフェラーゼ、特にロドコッカス・エリスロポリスMP50から回収 されたアシルトランスフェラーゼが鏡像体選択的触媒として活性である事実を、 以下のように示した。 研究のためのモデル基質として、ラセミ2-フェニルプロピオンアミド(2-PPA) を選択した。精製酵素を、ヒドロキシルアミン(0.5M)の存在下(R,S)-2-PPA(5mM) とインキュベートし、ヒドロキサム酸の形成を、測光法の手段及びイオン対クロ マトグラフィーの手段の両方によってモニターした。 実験は、ヒドロキサム酸の形成が、基質の50%が変換された後に大きく減速し たことを示した(図３)。酵素的に形成された2-フェニルプロピオノヒドロキサム 酸(2-PPHA)の、キラルHPLCカラムの手段による研究は、ヒドロキサム酸のただ１ つの鏡像体のみが基質の46%変換まで形成されたことを示した。2-フェニルプロ ピオン酸の形成は、ヒドロキシルアミンの存在下で観察されなかった。MP50株か らのアミダーゼは、まさしく、ラセミ体2-PPAを鏡像体選択的に2-PPHAに変換す ることができた。 ヒドロキサム酸の形成についての反応の始めにおける比活性は9.73U/mg蛋白で あり、最大達成値13.02U/mgより幾分低い値であった(表１参照)。著明な活性の 低下が、ラセミ基質の50%が変換された際に非常に明確に観察できた。 酵素的に形成されたヒドロキサム酸のキラルHPLCカラム手段による分離は、一 つだけの鏡像体が46%変換まで現れたことを示した。鏡像体過剰は従って99%より 高かった。 実験手順は以下の通りであった： 10μｌの精製アミダーゼ（2.6μｇ蛋白）を、エッペンドルフ反応槽中で0.64m lのリン酸ナトリウム緩衝液(10mM、pH7.5)で希釈し、続いて室温で0.25mlの新た に調製した塩酸ヒドロキシルアミン溶液(2M)と共に10分間インキュベートした。 反応を、(R,S)-2-PPAの メタノール溶液（50mMストック溶液）0.1mlを添加することにより開始した。総 体積は1mlであった。ヒドロキシルアミンの濃度は0.5Mであった。最初のアミド 濃度は5mMであった。反応混合物の50μｌのアリコットを一定のインターバルで 、５μｌの1N HClに入れた。変性蛋白を遠心分離で除き、アミド（▼）及びヒド ロキサム酸（●）の濃度をイオン対クロマトグラフィーの手段により決定した。 2-PPHAの鏡像体比（○）をキラルHPLCカラム(Chiral-HSA)を用いて調べた。この ために、2-PPA及び2-PPHAは、第一に、Grom-Sil 120TMS-2CPプレパックカラムを 通して分離する必要があった。 実施例５ 実施例４で調製された光学的に純粋な2-フェニルプロピオノヒドロキサム酸を 、以下の手順で、対応する、光学的に純粋な1-フェニルエチルアミンに変換した ： 過剰のヒドロキシルアミンを除くために、実施例４で得られた反応生成物を、 第１に1N HClで酸性化した。溶液のpHは、およそ０から１になった。酸性化は、 ヒドロキシルアミンの、アンモニア及び亜酸化窒素への分解を起こした。分解は 、反応混合物を水浴中80℃で10分間おくことにより促進された。ガスの発生がお さまった時点で、水酸化ナトリウム溶液でpHをおよそ５に再調整した。 十倍量の1-エチル-3-(3'-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDC)(2-フ ェニルプロピオノヒドロキサム酸に基づく)を続いて添加した。 形成された1-フェニルエチルアミンの濃度は、イオン対クロマトグラフィーの 手段により決定し、その鏡像体過剰を、キラルHPLCカラム(Crownpak CR(+))を用 いて測定した。 実施例６ ヒドロキサム酸の酵素的形成が終了したと思われるたびに、異なるバッチを始 めたほかは、実施例５に示されたのと同じ反応物を用い、反応を行った。これは 、以下のように行った。エッペンドルフ反応槽中で、10μｌの精製アミダーゼ(1 .7×10^-3mg蛋白)を315μｌのリン酸ナトリウム緩衝液(54mM、pH7.5)で希釈し、 それを125μｌの新たに調製され中性化された塩酸ヒドロキシルアミン溶液(2M) と共にインキュベートした。酵素的な反応は、2-PPAのメタノール溶液50μｌを 添加することにより開始された。それぞれのバッチの総量は0.5mlであった。2-P PA及びヒドロキシルアミンの濃度はそれぞれ5mM及び0.5Mであった。10の同じバ ッチを開始させ、10分のインターバルで、50μｌの1N HClを添加することにより 停止させた。沈殿した蛋白を遠心分離により除き、50μｌをバッチから取り、HP LC測定し、2-PPA及び2-PPHAの濃度を決定した。残った500μｌを水バッチ中80℃ で10分間加熱し、ヒドロキ シルアミンを沸騰させて除いた。試料を室温まで冷却した後、pHを、29μｌの1N NaOHを添加することにより4.5に調整した。9.6mgのEDC(100mM)を添加し、混合 物を80℃で１時間再加熱した。形成された1-フェニルエチルアミンの濃度を、実 施例３と同様にイオン対クロマトグラフィーの手段により決定し、その鏡像体過 剰を、キラルHPLCカラム(Crownpak CR(+))を用いて測定した。 実施例７ より多量のヒドロキサム酸を調製するため、酵素的に活性の材料を回収するた めの最初の手順を以下の通り行った： 第１に、ロドコッカス・エリスロポリスMP50を育成するための培地を調製した ；それは以下の組成を有している： NaHPO₄・12H₂O 14.0g KH₂PO₄ 2.0g CaCl₂・2H₂O 0.005g クエン酸鉄(III)・7H₂O 0.02g MgSO₄・7H₂O 1.0g 微量元素溶液SL6 （Pfennig & Lipper，1966に従う） 但しEDTA及びFeSO₄を含まない 1.0ml コハク酸二ナトリウム 1.62g 栄養ブイヨン(nutrient broth)溶液 30ml フェニルアセトニトリル 0.18g H₂O 添加して1000ml この培地10mlに、栄養ブイヨン上のロドコッカス・エリスロポリスMP50の液体 培養物0.1mlを接種し、三角フラスコ中、バッフルを付け、振とう器で150rpmで3 0℃にて一晩インキュベートした。この培養物を、バッフル付き三角フラスコ中 の100mlの新しい培地に接種するのに用い、これを同一の条件で18から24時間イ ンキュベートした。この培養物をさらに、ノッチ付き３リットル三角フラスコ中 の700mlの培地への接種物として用いた。細胞を、対数増殖相の終期において遠 心分離により回収し、用いるか、若しくは-70℃で急速冷却し-25℃で保存した。 細胞分解、粗抽出物回収及び酵素精製を、Journal of Bacteriology:B.Hirrling er，A．Stolz & H.-J．Knackmuss(1996)，Purification and Properties of an Amidase from Rhodococcus erythropolis MP50 which Enantioselectively Hydr olyzes 2-Arylpropionamides，Journal of Bacteriology 178(12)，pp.3501-350 7に記載されるとおり行った。 続いて、S-2-フェニルプロピオノヒドロキサム酸を、このように回収された酵 素的活性材料を用いて以下のように調製した： 全細胞、粗抽出物又は精製された酵素の形の125U のアシルトランスフェラーゼを、容量10リットルの広口ショット(Schott)フラス コ中で、マグネチックスターラーを用いて、3.2リットルのリン酸ナトリウム緩 衝液（10mM、pH7.5）と混合した。新たに調製し、水酸化ナトリウム溶液でpH7に 調製した塩酸ヒドロキシルアミン水溶液(2M)1.25リットルを添加し、混合物を室 温で10分間攪拌した。酵素的な反応を、(R,S)-フェニルプロピオンアミド（500m lメタノールに溶解）3.725g(0.025mol.)を添加することにより開始した。反応の 進行を、イオン対クロマトグラフィーの手段によりモニターした。120分後、ア ミドのS鏡像体の対応するヒドロキサム酸への変換が完結し、細胞を遠心分離で 除き、又は粗抽出物若しくは精製酵素を水酸化ナトリウムでpHを10に下げること により変性させ、さらに遠心分離で除いた。 酵素的に形成されたS-2-フェニルプロピオノヒドロキサム酸を変換されていな いR-2-フェニルプロピオンアミドから分離するために、酢酸エチル又は塩化メチ レンと振とうすることによりアミドをアルカリ水性溶液から抽出した。次に水溶 液を、濃HClでpH2に調整し、酢酸エチル又は塩化メチレンで再抽出した。 真空下での有機溶媒の除去は、S-2-フェニルプロピオノヒドロキサム酸1.9g(0.0 12mol.)を与えた。キラルHPLCカラムを用いた測定手段により決定された鏡像体 過剰は、＞99%であった。実施例８ S-2-フェニルプロピオノヒドロキサム酸を、実施例７に記載される酵素的に活 性な材料を用いて以下の通り調製した： 固定化した全細胞又は固定化した精製酵素の形のアシルトランスフェラーゼ12 5Uを、容量10リットルの広口ショットフラスコ中で、マグネチックスターラーを 用いて、3.2リットルのリン酸ナトリウム緩衝液（10mM、pH7.5）と混合した。新 たに調製し、水酸化ナトリウム溶液でpH7に調整した塩酸ヒドロキシルアミン水 溶液(2M)1.25リットルを添加し、混合物を室温で10分間攪拌した。酵素的な反応 を、(R,S)-2-フェニルプロピオンアミド（500mlメタノールに溶解）3.725g(0.02 5mol.)を添加することにより開始した。反応の進行を、イオン対クロマトグラフ ィーの手段によりモニターした。120分後、アミドのＳ鏡像体の対応するヒドロ キサム酸への変換が完結し、固定化した細胞又は固定化した酵素を濾取し、さら なる使用のために、＋４℃にてリン酸ナトリウム緩衝液(10mM、pH7.5)を用いて 保存した。 酵素的に形成されたS-2-フェニルプロピオノヒドロキサム酸を変換されていな いR-2-フェニルプロピオンアミドから分離するために、水溶液のpHを水酸化ナト リウム溶液で10に調整し、酢酸エチル又は塩化メチレンと振とうすることにより アミドをアルカリ水性 溶液から抽出した。次に水溶液を、濃HClでpH2に調整し、酢酸エチル又は塩化メ チレンで再抽出した。真空下での有機溶媒の除去は、S-2-フェニルプロピオノヒ ドロキサム酸1.9g(0.012mol.)を与えた。キラルHPLCカラムを用いた測定手段に より決定された鏡像体過剰は、＞99%であった。 実施例９ O-アシル化の後、実施例７から９に記載される方法により回収された、鏡像体 的に純粋なヒドロキサム酸を、加熱又は非プロトン溶媒中塩基処理でイソシアネ ートに変換することができる。水の添加後、イソシアネートは不安定なカルバミ ン酸を形成し、これはさらに反応して、CO₂の脱離を伴い、一級アミンを与える 。Lossen転移は、移動炭素原子の配置を保持しながら進行し、得られる生成物は 光学活性一級アミンである。 実施例１０ ヒドロキサム酸の前分離を伴わないキラル一級アミンの製造のために、以下の 手順を採用した： 全細胞、粗抽出物又は精製された酵素の形の125Uのアシルトランスフェラーゼ を、容量10リットルの広口ショットフラスコ中で、マグネチックスターラーを用 いて、3.2リットルのリン酸ナトリウム緩衝液(10mM、pH7.5)と混合した。新たに 調製し、水酸化ナトリウム溶液でpH7に調整した塩酸ヒドロキシルアミン水溶液( 2M)1.25リットルを添加し、混合物を室温で10分間 攪拌した。酵素的な反応を、（R,S)-2-フェニルプロピオンアミド（500mlメタノ ールに溶解）3.725g(0.025mol.)を添加することにより開始した。反応の進行を 、イオン対クロマトグラフィーの手段によりモニターした。120分後、アミドの Ｓ鏡像体の対応するヒドロキサム酸への変換が完結し、細胞を遠心分離で除き、 又は粗抽出物若しくは精製酵素を濃HClでpHを１に酸性化することにより変性さ せ、さらに遠心分離で除いた。 過剰のヒドロキシルアミンを除くために、水溶液を80℃で30分間攪拌しながら 加熱した。ヒドロキシルアミンの分解によるさらなるガスの生成は見られなくな った。溶液を室温まで冷却した後、そのpHを水酸化ナトリウム溶液で4.5に調整 した。ヒドロキサム酸の誘導体化のために、96g(0.62mol.)の１‐エチル-3-(3'- ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDC)を水溶液に攪拌しながら添加し、 溶液を攪拌しながら80℃で２時間加熱した。 酵素反応から残るR-2-フェニルプロピオンアミドを、Lossen転移により形成さ れたS-1-フェニルエチルアミンから分離するために、水溶液を濃HClでpH1に酸性 化し、アミドを酢酸エチル又は塩化メチレンで振とうして抽出した。続いて水溶 液を水酸化ナトリウム溶液でpH１０に調整し、アミンを酢酸エチル又は塩化メチ レンで振とうすることにより分離した。真空下で 溶媒を除去することにより1.2g(0.096mol.)のS-1-フェニルエチルアミンを、鏡 像体過剰＞99%で得た。 実施例１１ 実施例10記載の手順と同様に、S-1-フェニルエチルアミンを、ヒドロキサム酸 の前分離を伴わずに、Lossen転移により、以下の通り調製した。 固定化全細胞又は固定化精製酵素の形の125Uのアシルトランスフェラーゼを、 容量10リットルの広口ショットフラスコ中で、マグネチックスターラーを用いて 、3.2リットルのリン酸ナトリウム緩衝液（10mM、pH7.5）と混合した。新たに調 製し、水酸化ナトリウム溶液でpH7に調整した塩酸ヒドロキシルアミン水溶液(2M )1.25リットルを添加し、混合物を室温で10分間攪拌した。酵素的な反応を、（R ,S)-2-フェニルプロピオンアミド（500mlメタノールに溶解）3.725g(0.025mol.) を添加することにより開始した。反応の進行を、イオン対クロマトグラフィーの 手段によりモニターした。120分後、アミドのＳ鏡像体の対応するヒドロキサム 酸への変換が完結し、固定化細胞又は固定化酵素を濾取し、さらなる使用のため に、＋４℃にてリン酸ナトリウム緩衝液(10mM、pH7.5)中で保存した。 過剰のヒドロキシルアミンを除くために、水溶液を濃HClでpH1に調整し、80℃ で30分間加熱した。ヒドロキシルアミンの分解によるさらなるガスの生成は 見られなくなった。溶液を室温に冷却した後、そのpHを水酸化ナトリウムで4.5 に調整した。ヒドロキサム酸の誘導体化のために、96g(0.62mol.)の1-エチル-3- (3'-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDC)を水溶液に攪拌しながら添加 し、溶液を攪拌しながら80℃で２時間加熱した。 酵素反応から残るR-2-フェニルプロピオンアミドを、Lossen転移により形成さ れたS-1-フェニルエチルアミンから分離するために、水溶液を濃HClでpH1に酸性 化し、アミドを酢酸エチル又は塩化メチレンで振とうして抽出した。続いて水溶 液を水酸化ナトリウム溶液でpH10に調整し、アミンを酢酸エチル又は塩化メチレ ンで振とうすることにより分離した。真空下で溶媒を除去することにより1.2g(0 .096mol.)のS-1-フェニルエチルアミンを、鏡像体過剰＞99%で得た。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＣＡ，ＪＰ，ＵＳ (72)発明者 ナックムス，ハンス・ジョーキム ドイツ連邦共和国デー―71229・レオンベ ルグ，ハイメルディンゲルシュトラーセ・ 60

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．一般式 （ここでR¹、R²及びR³は異なり、環状又は直線で、脂肪族又は芳香族で、置換又 は非置換の炭化水素ラジカルであって、任意にヘテロ原子を含むことができる） の光学活性ヒドロキサム酸の調製方法であって、一般式 のキラルなアミド、カルボン酸エステル又はカルボン酸のラセミ体（ここでR¹、 R²及びR³は上記定義と同じであり、Xは-NH₂、-OR又は-OHでありRは任意の有機ラ ジカルである）を、アシルトランスフェラーゼの存在下でヒドロキシルアミンNH₂ OHと反応させ、続いて形成された光学活性ヒドロキサム酸(I)を、一般式(II)の 変換されない鏡像体から分離することを特徴とする方法。 ２．用いられる前記アシルトランスフェラーゼが、ミコバクテリア科(Mycobacte riaceae)、スメグマ菌(Mycobacterium smegmatis)、緑膿菌(Pseudomonas aerugi nosa)、アルトロバクター(Arthrobacter)、アスペルギルス・ニジュランス(Aspe rgillus nidulans)、ブラジリゾビウム・ジャポニカム(Bradyrhizobium japonic um)、ブレビバクテリウム(Brevibacterium)sp.R312、メチロフィラス・メチロト ロフス(Methylophilus methylotrophus)、シュードモナス・クロロラフイス(Pse udomonas chlororaphis)、シュードモナス・フルオレセンス(Pseudomonas fluor escens)、ロドコッカス・ロドクロス(Rhodococcus rhodochrous)J1及びロドコッ カス・エリスロポリス(Rhodococcus erythropolis)MP50を含む群の微生物からの アシルトランスフェラーゼであることを特徴とする請求項１記載の方法。 ３．用いられる前記アシルトランスフェラーゼが、ロドコッカス・エリスロポリ スMP50からのアシルトランスフェラーゼであることを特徴とする請求項２記載の 方法。 ４．前記アシルトランスフェラーゼが、微生物からの粗抽出物の形で用いられる ことを特徴とする請求項２又は３記載の方法。 ５．前記アシルトランスフェラーゼが、精製された形で用いられることを特徴と する請求項２又は３記載の 方法。 ６．反応が、緩衝液の存在下pH6.5から7.5で行われることを特徴とする請求項１ から５記載の方法。 ７．前記ラジカルR¹、R²及びR³が、メチル、エチル、ｎ−プロピル、i-プロピル 、n-ブチル、i-ブチル、t-ブチル、n-ペンチル、シクロヘキシル、フェニル、t- ブトキシフェニル、ナフチル、3-ベンゾフェニル、アミノ及びヒドロキシル基を 含む群から選択されることを特徴とする請求項１から６記載の方法。 ８．用いられる式(I)の化合物が、アルキルアミノプロピオン酸、p-ブトキシフ ェニル酢酸、2-フェニルプロピオン酸、2-メチルブタン酸、2-(1-ナフチル)プロ ピオン酸、2-(6-メトキシ-2-ナフチル)プロピオン酸(ナプロキセン(naproxen)) 、2-(3'-ベンゾイルフェニル)プロピオン酸(ケトプロフェン(ketoprofen))、並 びにこれらのエステル又はアミドであることを特徴とする請求項７記載の方法。 ９．用いられる一般式(I)の化合物がアミドであることを特徴とする請求項１か ら８記載の方法。 １０．一般式(I)の化合物が、基質モル当たり3000から5000単位、好ましくは基 質モル当たり5000単位のアシルトランスフェラーゼ活性で、2から10倍量、好ま しくは５倍量のヒドロキシルアミンと共に反応されることを特徴とする請求項１ から９記載の方法。 １１．一般式（ここでR¹、R²及びR³は請求項１に定義される通りである）の光学活性一級アミ ンの調製方法であって、請求項１から10記載の方法により得られた一般式(I)の 光学活性ヒドロキサム酸をO-アシル化し、O-アシル化ヒドロキサム酸を加熱する ことにより又は非プロトン溶媒中塩基で処理することにより対応するイソシアネ ートに変換し、イソシアネートを水と反応させ一般式(III)のアミンをCO₂の脱離 と共に与えることを特徴とする方法。 １２．一般式 （ここでR¹、R²及びR³は請求項１に定義される通りである）の光学活性一級アミ ンの調製方法であって、変換されない一般式(II)の鏡像体から分離される前に、 請求項１から１０記載の方法により得られた一般式 (I)の光学活性ヒドロキサム酸を、一般式 （ここでR₄はベンジル、シクロヘキシル又はエチルでありR₅はジメチルアミノプ ロピル又はモルホリノエチルである）のカルボジイミドと反応させ、続いて形成 された一般式(III)の光学活性一級アミンを変換されない一般式(II)の鏡像体か ら分離することを特徴とする方法。 １３．カルボジイミドと反応させる前に、光学活性ヒドロキサム酸(I)及び変換 されない鏡像体(II)を含む反応混合物をpH０から２、好ましくはpH1に酸性化し 、続いて反応混合物を40℃から100℃、好ましくは80℃の温度まで加熱し、続い てカルボジイミドとの反応をpH４から６、好ましくはpH5.0にて行うことを特徴 とする請求項１２記載の方法。 １４．用いられるカルボジイミドが1-エチル-3-(3'-ジメチルアミノプロピル)カ ルボジイミドであることを特徴とする請求項１２又は１３記載の方法。