JP2000510822A

JP2000510822A - 胃腸疾患の治療のためのマクロファージ刺激タンパク質

Info

Publication number: JP2000510822A
Application number: JP09534669A
Authority: JP
Inventors: チヤン，クー
Original assignee: アムジエン・インコーポレーテツド
Priority date: 1996-03-26
Filing date: 1997-03-25
Publication date: 2000-08-22
Also published as: CA2249666A1; WO1997035606A1; CA2249666C; EP0889732A1; AU2555397A; US5814308A

Abstract

(57)【要約】腸管上皮細胞の保護、再生及び修復により、胃腸管疾患を治療する方法が記載される。マクロファージ刺激タンパク質が陰窩細胞によるコロニー形成を促進し、腸管陰窩細胞の増殖の刺激に関わっているかもしれないことがわかった。ＭＳＰの医薬組成物と陰窩細胞増殖を刺激する物質の同定方法も記載される。

Description

【発明の詳細な説明】胃腸疾患の治療のためのマクロファージ刺激タンパク質発明の分野本発明は一般に、胃腸管の上皮細胞の成長および分化を調節する因子に関する。より詳細には、本発明は、陰窩細胞（ｃｒｙｐｔｃｅｌｌ）によるコロニー形成を刺激し、結腸陰窩細胞の増殖を刺激する因子、マクロファージ刺激タンパク質（ＭＳＰ）に関する。ＭＳＰは、腸管上皮を保護し、修復し、または再生し、従って、胃腸管疾患の治療に有効である。発明の背景胃、小腸および大腸を含む胃腸管は、上皮細胞の単一層（粘膜）でおおわれている。腸において、この層は、絨毛または消化管の管腔への突起、および下の結合組織を貫く陰窩細胞から成る高度に入り組んだ表面を保護する。腸管の上皮は、生涯にわたって次々に新生する高度に増殖性の組織である。腸上皮の増殖に関して現在既知である事柄について簡単に再検討した（Ｐｏｄｏｌｓｋｙ，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２４６，Ｇ１７９（１９９３））。陰窩幹細胞が、４つの異なる細胞系：エンテロサイト（ｅｎｔｅｒｏｃｙｔｅ）、ゴブレット（ｇｏｂｌｅｔ）、エンテロエンドタリン（ｅｎｔｅｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｅ）、およびパネト（ｐａｎｅｔｈ）細胞、の１つに分化することができる前駆細胞を、急速に増殖させるもとになると一般に考えられている。陰窩細胞形成と、高度に分化した上皮細胞種の老化および剥離との間にダイナミックな均衡が存在すると考えられる。構造性新生の目的論的意味は明らかではないが、細胞成長の調節を混乱させる突然変異体の蓄積を防止すると考えられる。正常な腸管上皮成長調節は、一部は、有糸分裂生起原を刺激する可溶性因子によって、および一部は、細胞外マトリックスタンパク質および隣接する間葉由来の陰窩周囲（ｐｅｒｉｃｒｙｐｔａｌ）線維芽細胞によって調節されると考えられる。多型潜在性幹細胞から最終分化細胞種に導く過程は未知であり、種々の細胞系に関わる前駆細胞母集団を同定する特定のマーカーは未だ同定されていない。トランスジェニックおよびキメラマウスを使って、幹細胞のいくつかの本質的特性が、自己新生および再生組織の範例として解明されている。（Ｇｏｒｄｏｎら、ＦＡＳＥＢ６，３０３９（１９９２））第一に、陰窩上皮が性質上モノクローナルであるので、幹細胞は、非対称的に分裂して、自己更新幹細胞、および全ての分化細胞種の形成に関わる前駆細胞を形成しなければならない。第二に、娘幹細胞が高い増殖能力を有さなければならない。第三に、幹細胞が、陰窩ニッチェ内に機能的に保持され、従って、固有層（ｌａｍｉｎａｐｒｏｐｒｉａ）及び／又は他の隣接する細胞と特定の接触を有さなければならない。腸管上皮幹細胞の性質および同定は、未だ解明されていない。腸管上皮分化の本質の解明を補助するために、腸管上皮に由来する細胞系を用いて、生体外システムが開発された。例えば、ＷｈｉｔｅｈｅａｄらのＣａｎｃｅｒＲｅｓ．４７，２６８３（１９８７）を参照。結腸粘膜の再生を支持するのに重要な、いくつかのオートクリン因子が、結腸癌細胞系において同定されている。これらの細胞系によって産生される因子の中には、ＴＧＦα（Ｍａｌｄｅｎら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ４３，３８０（１９８９））、並びに、ＥＧＦファミリーに属する種類、アンフィレグリン（Ｋｕｎｉｙａｓｈｉら、Ｊｐｎ．Ｊ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．８２，９６９（１９９１））および陰窩（Ｊｏｈｎｓｏｎら、Ｊ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．，１１８，７４１（１９９２））が包含され、後者は、正常な結腸粘膜にも見い出されている。しかし、ＥＧＦ関連タンパク質が、正常な陰窩細胞の成長を促進するかどうかは未知である。さらに、炎症性腸疾患の特徴である粘膜の過増殖に、リンフォカインが関わっていると推測される。現在のところ、腸管上皮の新生に導く陰窩細胞の増殖を誘起する因子に関して、ほとんど未知である。この分野における知識は、陰窩幹細胞に対する成長因子の影響を分析するアッセイが存在しないことによって妨げられている。多くの胃腸管疾患は、周囲の薬剤への曝露、炎症性応答、自己免疫性疾患、感染、または身体的傷害に起因する腸または結腸粘膜の損傷または喪失を特徴とする。癌の放射線治療および化学療法を受けている患者は、骨髄毒性を受け、その結果、貧血および白血球減少を生じることが多い。骨髄毒性は、放射線または化学療法剤の高い投与量を要求する攻撃的治療方法に付随することが多い。最近までは、赤血球細胞および白血球細胞レベルが回復するまで、投与量の減少または治療の停止が一般に必要とされた。しかし、エリトロポイエチン（ＥＰＯ）および顆粒性コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）のような血液生成を高める因子の治療計画への導入が、このような毒性源を大幅に軽減した。癌治療に付随する第二の最も一般的な毒性源は、腸管上皮の喪失を特徴とする消化管毒性である。現在のところ、癌治療の間に、消化管の内層を保護または修復する因子が利用できない。癌治療のこのような副作用を軽減する因子が利用可能になることが望まれる。腸下部（末端回腸および結腸）疾患も、腸管粘膜に有害な影響を及ぼし、炎症性腸疾患と称される種類の疾患を包含する。２つの主要な疾患は、潰瘍性大腸炎および局所周炎（クローン病）である。潰瘍性大腸炎は、結腸および直腸における粘膜および粘膜下内層の炎症であり、一方、クローン病は、消化管の全ての層に関わる炎症を特徴とする。炎症性腸疾患の他の形態には、局所回腸炎および直腸炎がある。炎症性腸疾患の現在の治療は、抗炎症剤、および、必要であれば患部組織を除去する手術を含む。下記引例は、胃腸疾患の種々の治療方法の例を開示している。ＷＯ第９４／０６４２０号は、胃腸潰瘍の治療のための、ＯＰ−１、ＯＰ−２、およびＣＢＭＰ２タンパク質のような骨原性タンパク質、並びにＤＰＰ、Ｖｇ１、Ｖｇｒ−１、６０Ａ、およびＧＤＦ−１のような関連タンパク質の使用を開示している。ＷＯ第９４／０５３１８号は、小腸および大腸の損傷されたまたは喪失された上皮細胞の処置のために、インターロイキン−１１、インターロイキン−６、白血病阻害因子、オンコスタチンＭ、および繊毛神経栄養因子（ｃｉｌｉａｒｙｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃｆａｃｔｏｒ）の使用を開示している。この処置は、肝臓上皮細胞、皮膚細胞、毛髪細胞、および精子細胞にも使用することができる。ＷＯ第９２／０３１５５号は、腸管粘膜の処置に使用することができるグルタミン、あるいはその誘導体または類似体、短鎖または中鎖脂肪酸、および成長因子またはその類似体の組成物を開示している。成長因子は、成長ホルモン、インシュリン様成長因子１および２（ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２）、成長ホルモン放出因子、またはそれらの類似体である。ＷＯ第９３／２５２２７号は、胃腸疾患の治療のためのＩＧＦ−２の使用を開示している。米国特許第５，２３５，９０８号は、胃腸潰瘍の治療のための血小板に由来する成長因子（ＰＤＧＦ）の使用を開示している。ＷＯ第９３／０７８９１号は、炎症性腸疾患および大腸炎のような胃腸疾患の治療ための、表皮性成長因子（ＥＧＦ）組成物を開示している。ＷＯ第９２／０２２４６号およびＷＯ第９３／１４７８３号は、胃腸病変を含む異常成長症状を治療するための、ヒトＥＦＧ１−４８またはＥＦＧ１−４７またはＥＦＧ１−４９種の切断（ｎｉｃｋｅｄ）または非切断（ｎｏｎ−ｎｉｃｋｅｄ）種の使用を開示している。前記の引例は、消化管の上皮細胞を含む種々の上皮細胞の増殖を刺激する因子を記述している。しかし、全ての腸管上皮細胞種がそこから発生している結腸陰窩細胞の、増殖を刺激する因子に関しての報告はない。そのような因子は、消化管外の上皮細胞成長の刺激が望ましくない疾患を含む種々の胃腸疾患を治療するのに有用である。従って、本発明の目的は、腸管上皮細胞の成長及び／又は分化を調節する因子を同定することである。前に同定された、マクロファージ刺激タンパク質、即ちＭＳＰと称されるタンパク質が、培養において、結腸陰窩細胞によるコロニー形成を刺激する能力を有することが見い出された。これは、正常な陰窩細胞に作用する因子に関する最初の報告である。これらの発見は、ＭＳＰが、損傷されたまたは喪失された腸管上皮の再生のための治療薬であることを意味する。発明の要旨本発明は治療的有効量のマクロファージ刺激タンパク質、即ちＭＳＰを投与することによって、胃腸管疾患を治療する方法に関する。ＭＳＰは、陰窩細胞によってコロニー形成を刺激し、および、陰窩幹細胞の増殖をも刺激する。これに関して、ＭＳＰは、全ての腸管上皮細胞種の形成を増加させるのに特に有用である。従って、本発明は、損傷された、または癌療法、身体的傷害または疾患の結果として損傷される可能性のある、腸管上皮の保護、修復または再生に利用することができる。本発明は、医薬的に許容される希釈剤、アジュバント、防腐剤、担体、または安定剤中の、ＭＳＰの組成物をも提供する。ＭＳＰは、使用される輸送経路に好適な形態でも提供される。図面の説明図１は、マウス陰窩上皮の視覚化を示す。Ａ）成長マウス結腸から単離後の懸濁液中の陰窩。Ｂ）クリスタルバイオレットで染色されたコラーゲン塗布プレート上の陰窩細胞コロニー。Ｃ）およびＤ）マウスの結腸部分、およびＭｃＭａｎｕｓＰｅｒｉｏｄｉｃＡｃｉｄ法で染色された陰窩コロニー。Ｅ）およびＦ）マウス結腸部分、およびα／β−Ｄ−ガラクトシルレクチンのためにトリコサンテスキリロウイ（Ｔｒｉｃｈｏｓａｎｔｅｓｋｉｒｉｌｏｗｉｉ）で染色された陰窩コロニー。図２は、陰窩コロニー形成アッセイにおける既知因子の試験を示す。陰窩を、５０ｎｇ／ｍｌにおける因子の存在下に３７℃で２４時間培養した。処理陰窩のプレート上のコロニーの数を、非処理陰窩のそれと比較した。活性を刺激の倍数として（ａｓｆｏｌｄｏｆＳｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ）示す。この数値で示される結果は、１つの実験に基づく。スクリーニングを２回繰り返して、同様の結果を得た。図３は、陰窩コロニー形成活性に関する、細胞系条件付け培地のスクリーニングを示す。元の濃度の０．２５倍において、条件付け培地を図２に記載のように試験した。活性を刺激の倍数として示す。１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を陽性対照として使用した。図４は、ＫＧ−１条件付け培地からの陰窩コロニー形成活性の精製を示す。条件付け培地を細胞から採取し、清浄化し、次に、種々のカラム：Ａ）ヘパリン− セファロース；Ｂ）フェニル−セファロース；Ｃ）Ｑ−セファロース、でのクロマトグラフィーによって分別した。溶離緩衝液の濃度は平行線で印を付けられ、合計タンパク質は実線で印を付けられている。陰窩コロニー形成活性を、実線バーによって示す。図５は、精製陰窩コロニー形成活性を含有するＱ−セファロースカラム画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。Ｑ−セファロースカラム画分６〜１３を、８％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルで電気泳動にかけた。５マイクロリットルの各サンプルを、β−メルカプトエタノール（２％ｖ／ｖ）を用いて（Ａ）、またはβ −メルカプトエタノールを用いずに（Ｂ）、１００℃で５分間処理した。得られるゲルをクーマシーブルーで染色した。図６は、陰窩コロニー形成因子のアミノ酸配列を示す。ｐ７５タンパク質からのｐ５５およびｐ２２ペプチドを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、トリプシンで消化した。得られるペプチドをＨＰＬＣ装置を用いてＣ４カラムで分離した。ｐ２２タンパク質バンドのＮ−末端、および選択されたトリプシンペプチドの配列を求め、図に示す。得られた配列は、ヒトＭＳＰの配列と相同である。これらの配列と相同であるヒトＭＳＰの配列の位置を示す。太字の残基は、ヒトＭＳＰの対応する残基と異なる。図７は、精製陰窩コロニー形成活性をコードするｍＲＮＡのＰＣＲ分析を示す。ｃＤＮＡは、ＫＧ−１ポリＡ＋ＲＮＡ、ウシ肝臓ポリＡ＋ＲＮＡ、ＨｅｐＧ２全ＲＮＡ、およびハツカネズミ肝臓全ＲＮＡから作られた。次に、ｃＤＮＡを、精製タンパク質のアミノ末端配列、およびトリプシンペプチドＴ３５．８Ｂの配列に基づく、２つの縮重オリゴヌクレオチドを使用して増幅した。図８は、ウシおよびヒトＭＳＰのアミノ酸配列配置を示す。ヌクレオチド配列を、ウシ肝臓ＲＮＡからＰＣＲ増幅されたウシＭＳＰｃＤＮＡから得た。推定アミノ酸配列を示す。底線は、ヒトＭＳＰのアミノ酸配列である。上部の線は、この領域に適合するペプチド配列である。図９は、単離陰窩のＭＳＰ処置後の、ｒｏｎ受容体の自己ホスホリル化を示す。マウス結腸陰窩細胞を、１００ｎｇ／ｍｌのウシＭＳＰを使用して、または使用せずに、３７℃で２０分間処理し、溶解させた。ｒｏｎ受容体タンパク質を免疫沈降させ、６％アクリルアミドゲルで電気泳動にかけた。タンパク質を、ニトロセルロース膜上に移し、抗ホスホチロシン（抗ＰＴｙｒ）抗体（左パネル）でブロッティングを行った。次に、膜を細長く切り、抗−ＲＯＮ抗体（右パネル）で再度ブロッティングを行った。図１０は、陰窩コロニー形成アッセイにおける組換えマウスＭＳＰの試験を示す。組換えマウスＭＳＰを、ＣＨＯ細胞の条件付け培地中で形成し、図１に記載のように、陰窩細胞によるコロニー形成の刺激に関して試験した。精製ウシＭＳＰ（１μｇ／ｍｌ）を陽性対照として使用し、ベクターを導入したＣＨＯ細胞からの条件付け培地を陰性対照として使用した。ベクターおよび組換えマウスＭＳＰはどちらも、元の条件付け培地の０．１倍に相当した。本発明の詳細な説明ここに使用される場合、用語「胃腸管」は、胃、小腸および大腸に該当する。「胃腸管の内層」は、胃および腸の内腔に露出した上皮細胞の層に該当する。用語「腸」は、腸の幽門開口部から肛門に伸びる消化器管の部分に該当し、そして腸（ｂｏｗｅｌ）または腸（原腸管、ｇｕｔ）にも該当する。用語「結腸」は、盲腸から直腸まで伸びる大腸のセクションに該当する。腸の陰窩にある幹細胞は、制限なしに分割する能力があり、そして生じた娘細胞は、幹細胞として残ることかできるか、または成熟腸上皮細胞型に分化できる。陰窩細胞標品は、培養中で生存能力がなく、そして増殖を刺激する因子の不在下ではコロニーを形成しない。１０％ウシ血清（ＦＢＳ）の存在が、マウスの陰窩細胞標品（実施例１参照）によってコロニー形成を刺激することが観察された。これは、陰窩細胞に対して活性を有する可能性のある因子を同定するアッセイの基礎を形成する。多くの精製成長因子が、コロニー形成アッセイで試験され、そして、ｎｅｕ分化因子−β１（ＮＤＦ−β１）を除いてそれらの試験されたもの全てが、なんら活性を示さなかった（図２参照）。ＮＤＦ−β１によるコロニー形成刺激の範囲は、１０％ＦＢＳについて見られたものに類似した。ＮＤＦ− β１は、ＰＣＴ出願番号ＷＯ９４／２８１３３号に記載されており、それは参考として組込まれる。０．５％ＦＢＳを含有する様々な細胞系から得た条件付け培地を、結腸陰窩細胞を用いてコロニー形成を刺激する活性についてスクリーニングした。ＫＧ−１細胞から得た培地がコロニー形成を刺激することが観察された。ＫＧ−１細胞による刺激の範囲は、１０％ＦＢＳを含有する増殖培地に観察されるものと比較でき、そして試験されたあらゆる他の条件付け培地によるコロニー刺激より際立って大きかった（試験された培地のいくつかと比較するために図３参照）。陰窩コロニー形成活性を、ヘパリンセファロース、フェニルセファロースおよびＱ−セファロースクロマトグラフィーによって精製した（実施例２および図４）。精製因子が、非還元ＳＤＳポリアクリルアミドで約７５ｋｄａｌの分子量を示し、還元ＳＤＳポリアクリルアミドゲルで５５ｋｄａｌと２２ｋｄａｌの２つのバンドとして移動することを観察した（図５参照）。アミノ酸配列決定は、ヒトマクロファージ刺激因子（ＭＳＰ）に高度な相同性を有し、そしてそれはさらに、ヒトＭＳＰ（実施例３）のウシ相同体であることを確認した。したがって、陰窩細胞に観察されたコロニー形成活性は、ウシ血清中のＭＳＰの存在によると思われた。０．５％ＦＢＳを含有する増殖培地は、ごくわずかなコロニー形成活性を示すので、ＫＧ−１細胞から分泌された因子は、条件付け培地に存在するＭＳＰ前駆体を修飾する可能性がある。代わりに、正常な増殖培地に存在するＭＳＰは、ＫＧ−１細胞の表面マトリックスに結合でき、そして後に条件付け培地に放出されうる。これは、正常な陰窩細胞に作用するポリペプチド因子の最初の記録である。この知見の重要性は２倍である。第一に、腸管陰窩から単離された細胞は、全ての成熟腸上皮細胞型になる幹細胞を含む。したがって、陰窩コロニー形成の刺激は、すぐに、全ての成熟腸上皮細胞型の集団で増加させられる陰窩幹細胞増殖の刺激に相関する。この生物学的活性は、損傷を受けたかまたは消耗させられた上皮内層（ライニング）を再集合させるのに重要であると思われる。第二に、その陰窩細胞は、上皮細胞成長因子、塩基性繊維芽細胞成長因子^-1、肝細胞成長因子、インシュリン様成長因子−１、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ケラチノサイト成長因子およびＥＣＫのレセプターを含めた多数の細胞表層レセプターを発現することが観察された。（Ｂｕｒｇｅｓｓら、Ｊ．ｏｆＧａｓｔｒｏｅｎｔｅｎｏｌ−Ｈｅｐａｔｏｌ．５、１０−２１（１９９０年）；Ｈｏｕｓｅｌｙら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９４，１７６４−１７７７（１９９４年）。さらに、陰窩細胞は、これらのレセプターに相互作用するかまたは活性化することが知られているリガンドには応答しないようにみえる（図２）。したがって、陰窩細胞の表面にあるそのレセプターとのＭＳＰの相互作用は、陰窩に生物学的な反応を生じるそれの活性に独特ものもである。ＭＳＰは、マウス腹膜マクロファージを、補体Ｃ５ａのような化学誘引物質に反応性を示させる哺乳類血液血漿に存在する活性と先に同定された（Ｌｅｏｎａｒｄら、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ．Ｒｅｓ．１０２、４３４（１９７６年）；Ｌｅｏｎａｒｄら、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ．Ｒｅｓ．１１４、１１７（１９７８年））。精製ＭＳＰは、米国特許第５２１９９９１号に記載されるとおりヒト血清から得、そしてＤＮＡコード・ヒトＭＳＰは、米国特許第５３１５０００号で報告された。ＭＳＰは、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）に対するそれの相同性、および肝細胞の増殖を促進する上でのそれの活性に基づいた肝細胞成長因子（ＨＧＦ）−様タンパク質に該当した。最近、ＭＳＰは、ｒｏｎに対するリガンドであり、タンパク質チロシンキナーゼのｃ−ｍｅｔファミリーの構成員である細胞膜タンパク質チロシンキナーゼであることが報告された（Ｗａｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２６６、１１７ −１１９（１９９４年）；Ｇａｕｄｉｎｏら、ＥＭＢＯＪ．１３、３５２４− ３５３２（１９９４年）；Ｒｏｎｓｉｎら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ８、１１９５− １２０２（１９９３年））。ヒト組織および細胞系でのＲＯＮの発現を試験し（Ｇａｕｄｉｎｏら、同書）、そしてＲＯＮは、結腸、皮膚、肺および骨髄で、そして顆粒細胞および接着単核細胞で発現することが分かった。胃、膵臓および乳腺癌腫から誘導された上皮細胞系、および造血細胞系もＲＯＮ発現を示した。ＭＳＰは、ＲＯＮのチロシン・リン酸化を誘発し、そして乳腺癌腫細胞系でＤＮＡ合成を刺激した。これらの観察から、ＭＳＰが、マクロファージ活性化以外に生物学上の活性を示すことができることが示唆されるが、しかしマクロファージを活性化する以外のＭＳＰ活性の特性は、わかりにくさを残した。特に、ＭＳＰが、腸の上皮細胞の増殖に関連した活性を示すことは以前は知られていなかった。本発明は、治療上有効な量のＭＳＰを投与することによって胃腸管の内層の障害の処置を提供する。ここに提供された処置は、腸上皮を含めた障害に特に有用である。本発明の因子は、腸上皮の増殖または分化を調節でき、それによって、損傷から健全な上皮を保護するか、または上皮の損傷または消耗の修復及び／又は再生を誘導する。ＭＳＰの投与は、１回および胃（ｇｕｔ）内層を保護し、修復し、及び／又は再生するのに充分な濃度で、胃腸管内層の障害の発症の前後に、又は同時に行われうる。ここに使用される場合、「治療的に有効な量」は、示された条件および投与計画に治療効果を供するＭＳＰの量に該当する。上記量は、０．１μｇ／ｋｇ体重から１０００ｍｇ／ｋｇ体重で変えることができ、そして当業者によってさらに正確に決定することができる。癌を攻撃的に処置する努力は、高用量の化学治療剤の投与、または全身照射に向けられた。しかしこのような養生計画は、最初に骨髄毒性（赤血球細胞および白血球細胞の消耗）を、続いて胃（ｇｕｔ）毒性（腸上皮の消耗）を起こす可能性がある。毒性が克服されるまで、治療の用量削減または中止を行うことが通常である。処置の好ましい方法は、そのような治療の前かまたは同時に化学療法または放射線治療に補助剤としてＭＳＰを使用することである。ＭＳＰは、胃腸管の上皮細胞内層を維持または修復する助けとなり、それによって治療の削減又は中止の発生を防止または減らす。ある種の疾患状態も、腸上皮の損傷または消耗に至る可能性があり、そしてＭＳＰを投与することによって処置できる。例としては、炎症性腸（ｂｏｗｅｌ）疾患、潰瘍性大腸炎およびクローン病、十二指腸潰瘍または感染症が挙げられる。ＭＳＰの投与は、損傷が起こった正常な腸の粘膜を修復するのを助ける。ＭＳＰは、腸上皮障害を処置するのに単独でまたは他の因子と組合せて使用できることが分かる。１つの具体例で、ＭＳＰは、上皮細胞の成長を促進する治療的に有効な量の因子と共に使用される。このような因子としては、インシュリン成長因子−１（ＩＧＦ−１）、インシュリン成長因子−２（ＩＧＦ−２）、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング成長因子−α（ＴＧＦ−α）、酸性および塩基性線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）またはインターロイキン−１１（ＩＬ−１１）が挙げられる。別の具体例で、胃（ｇｕｔ）毒性を緩和する化学療法または放射性治療に対する補助剤として使用する場合、ＭＳＰは、造血因子と共に投与でき、それにより骨髄毒性は、同様に緩和される。ＭＳＰと共に使用されるべき造血因子は、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、顆粒細胞コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、巨核球成長・分化因子（ＭＧＤＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、幹細胞成長因子（ＳＣＦ）、インターロイキン−３（ＩＬ−３）またはインターロイキン−６（ＩＬ−６）が挙げられる。ＭＳＰは、非経口、経口、鼻腔、または腸内投与を含めた様々な経路によって投与することができる。非経口投与は、静脈、皮下、腹腔内、筋肉内、関節内およびくも膜下注入によって行うことができる。胃腸管を通しての吸収を含めた経口投与は、圧縮錠剤、カプセル剤、丸剤、トローチ、カッシェ剤（ｃａｈｃｅｔｓ）およびペレットを使用する。鼻腔または経口吸引経路による投与は、エアロゾルとして送出される粉末または液体ポリペプチドを使用できる。鼻腔送出としては、ドロップまたはスプレイによる投与が挙げられる。直腸投与は、坐剤を使用できる。選択されるべき投与の経路は、ＭＳＰの薬物動態特性および治療されるべき症状の特性および重篤度を含めた様々な変数に左右される。本発明は、治療上有効な量のＭＳＰおよび医薬上許容しうる希釈剤、担体、防腐剤、乳化剤、及び／又は可溶化剤を包含する医薬組成物を提供する。希釈剤としては、トリス、酢酸またはリン酸緩衝液が挙げられる。可溶化剤としては、ツイーン、ポリソルベートが挙げられる。担体としては、ヒト血清アルブミンが挙げられる。防腐剤としては、チメロサールおよびベンジルアルコールが挙げられる。そして抗酸化剤としては、アスコルビン酸が挙げられる。溶解性、血清半減期、安定性および生物学的利用能を改善するために、ＭＳＰも、当業者に利用可能な材料および方法を用いて、水溶性重合体（例えば、ポリエチレングリコール）と結合させてもよい。ＭＳＰは、特定のデリバリーシステムで使用するための配合で存在できる。例としては、ＭＳＰは、時間をかけた制御送達のために配合されうる。そのような配合例としては、限定されるものではないが、硬質ゼラチンの水溶性重合体、メチルおよびエチルセルロース、ポリヒドロキシメタクリレート、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルアセテートおよび様々なワックスの単独で、または組合せでのカプセル封入；不溶性樹脂、親水性重合体、または脂肪酸化合物の不活性重合体マトリックス中での分散；およびセラック、ワックス、デンプン、酢酸フタレートセルロースまたはポリビニルピロリドンのような水溶性重合体を有するコーティング剤か挙げられる。ＭＳＰは、リン脂質小胞内への封入により標的デリバリーシステムのために配合することもできる。好ましい具体例で、ＭＳＰは、直腸送達用の坐剤に封入されるココアバターまたはポリエチレングリコール基剤に組込まれうる。別の好ましい具体例では、ＭＳＰは、ＰＣＴ出願第ＷＯ９５／２８９６３号に記載されるもののような結腸特異的薬剤徐放性配合に組込むことができる。医薬組成物および配合物中に一般に見られる成分のさらに重点的な調査は、レミントンの医薬科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ）、１８版、Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編、ペンシルベニア州、イーストンのＭａｃｋ（１９９０年）に表されており、その関連部分は、参考としてここに組込まれる。本発明は、胃腸管内層の障害を処置する能力のある物質を同定する方法を提供する。その方法は、コロニー形成をさせる可能性のある条件下で単離陰窩細胞で物質をインキュベートすること、そしてコロニー形成の刺激をえることを含む段階を包含する。実施例１で記載されたアッセイは、ｉｎｖｉｔｒｏでの陰窩細胞のコロニー形成を促進し、そして陰窩細胞の増殖に重要で腸上皮の再生または再集団化の助けとなる物質を迅速に同定させる物質をスクリーニングする迅速な方法を提供する。スクリーニングに適切な材料は、限定されないが、粗混合物（例えば、条件付け培地、細胞抽出物および同等物）、精製ポリペプチド、糖および低分子量有機化合物（ここで、後者は、単独にまたはコンビナトリアルライブラリーのような混合物でアッセイできる）が挙げられる。コロニー形成を促進する物質が結腸陰窩細胞の増殖に関与しているようであることが予測される。以下の実施例は、本発明をさらに充分に例示することが提供されるが、その範囲を限定するものとは見なされない。実施例１マウス結腸陰窩コロニー形成アッセイマウス結腸陰窩をＷｈｉｔｅｈｅａｄら（ＩｎＶｉｔｒｏＣｅｌｌｕｌａｒ＆ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌＢｉｏｌｏｇｙ，２３，４３６−４４２（１９８７年）で記載されるとおりに調製された。マウスを致死量のＣＯ₂で犠牲にし、そして大腸を単離した。大腸を縦に切断し、０．３ｍｇ／ｍｌのＬ−グルタミン、１００単位／ｍｌペニシリン、１００単位／ｍｌのストレプトマイシン（緩衝液Ａ）を含有するＰＢＳで洗浄し、そして０．５ｃｍ片にスライスした。スライスした結腸片を、５０ｍｌの円錐型試験管内で緩衝液Ａで数回洗浄した。抽出緩衝液（緩衝液Ａ中の０．５ｍＭＤＴＴ、２ｍＭＥＤＴＡ）で新鮮な組織を洗浄し、そしてその後１０ｍｌの新鮮な抽出緩衝液で、１時間インキュベートした。その後、抽出緩衝液を除去し、そして組織を溶液Ａで洗浄した。５ｍｌの溶液Ａ中で組織を振盪させることによって、陰窩を回収した。回収された陰窩を、４ｍｌ培地（ＲＰＭＩ１６４０、０．３ｍｇ／ｍｌのＬ −グルタミン、１００単位／ｍｌペニシリン、１００単位／ｍｌストレプトマイシン、および１０％ウシ血清（ＦＢＳ；メリーランド州、カイザースバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）のＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）中１ウエル当たり５００陰窩の密度でコラーゲン型ＩＶ被覆６穴プレート（マサチュセッツ州、ベッドフォード（Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）のＣｏｌ１ａｂｏｒａｔｉｖｅＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＰｒｏｄｕｃｔｓ）に載せた。３７℃で２４時間インキュベートした後、付属細胞のコロニーをクリスタルバイオレットで染色し、そして顕微鏡下で計数した。コロニー内の細胞が陰窩上皮から由来することを確認するために、（Ｃａｒｓｏｎ、Ｈｉｓｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：自習用テキスト、米国臨床病理学学会出版、１５８−１６０頁（１９９０年）；（Ｆａｌｋら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２６６、Ｇ９８７−１００３（１９９４年）に記載されるとおり、コロニーをＭｃＭａｎｕｓ’の過ヨウ素酸シッフ法およびＴｒｉｃｈｏｓａｎｔｅｓｋｉｒｉｌｏｗｉｉで染色した。コロニーを、同じ方法で染色したマウス結腸パラフィン切片と比較した。陰窩細胞を染色した結果は、図１に示され、そして両方の方法は、結腸切片中の上皮細胞に特異性があり、そしてコロニーに陽性に染色した。コロニーの形成はＦＢＳ依存性であり、ＦＢＳなしのものより１０％ＦＢＳを含有する培地中で３−５倍多いコロニーが形成された。同じ効果は、１０％ＢＳＡがＦＢＳの代わりに使用される場合観察されないので、コロニー形成が増加するのは、培地中のタンパク質の総合的な増加によるのではない。アッセイでの公知タンパク質の因子の効果を試験するために、１０％ＦＢＳを、０．１％ＢＳＡを含有する培地中で試験された５０ｎｇ／ｍｌの各因子に代えた。試験因子は、図２で示され、そして結果は、唯一ｎｅｕ分化因子−β１（ＮＤＦ−β１）が、アッセイでＦＢＳと同様の刺激をもたらしたことを示す。大腸陰窩によってコロニー形成を刺激する可能性のある新規因子を同定するために、多くの様々な細胞系から作られた条件付け培地をスクリーニングした。試験された細胞系としては、２．２２．１マウス間質細胞系、Ａ４３１（メリーランド州、ロックビル（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）のｔｈｅＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎから、受託番号ＣＲＬ−１５５５で入手可能）、ＡｔＴ２０（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−８９）、ＢＨＫ−２１（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−２０）、ＢＴ−４７４（ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ−２０）、ＣａＣｏ２（ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ−３７）、ＤＵ−１４５（ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ −８１）、Ｈ−９（ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ−１７６）、ＨＬ−６０（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−２４０）、ＨＴ−１０８０（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−１４）、ＪｕｒｋａｔＥ６（ＡＴＣＣ番号ＴＩＢ−１５２）、ＫＧ−１（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−２４６）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ−２６）、およびＭＤＡ−ＭＢ−４５（ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ− １３１）が挙げられる。一般に、細胞は、７０％集密または２×１０⁶／ｍｌの密度まで、それらの正常な培地で成長させ、そして０．５％ＦＢＳを含有する培地に代えた。３−７日インキュベートした後、条件付け培地を回収した。０．２５×の初期濃度で、陰窩コロニー形成アッセイで、条件付け培地を試験した。結果を図３に示す。バイオアッセイで、ＫＧ−１細胞から得た唯一条件付け培地は、１０％ＦＢＳより強力な刺激を示した。実施例２ＫＧ−１条件付け培地から得た陰窩細胞コロニー形成因子の精製３７℃で、３−５日間、３リットルスピナーを用いて、ＫＧ−１細胞を、０．３ｍｇ／ｍｌのＬ−グルタミン、１００単位／ｍｌペニシリン、１００単位／ｍｌストレプトマイシン、および１０％ＦＢＳで補足したＲＰＭＩ１６４０培地で増殖させた。３×１０⁶細胞／ｍｌの密度に達した後、１０分間、１０００×ｇで遠心分離することによって、細胞を回収した。その後、１．５×１０⁶細胞／ｍｌの密度で、０．５％ＦＢＳを含有する同じ培地に細胞を再懸濁し、そして３７℃で、３日間増殖させた。遠心分離により細胞を除くことによって、条件付け培地を回収した。５０個のスピナーから得た総量１５０リットルの条件付け培地を取り０．４５μ濾材を通しての濾過により清澄化し、そして螺旋回転（ｓｐｉｒａｌ−ｗｏｕｎｄ）メンブランカートリッジ（Ｓ１Ｙ１０、マサチューセッツ州、ビバリー（Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）のＡｍｉｃｏｎ）を用いて、７．５リットル（２０×）に濃縮した。全てのタンパク質精製段階は高速タンパク質液体クロマトグラフィー系（ニュージャージー州、ピスキャットアウエイ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）のＰｈａｒｍａｃｉａ）によって行った。濃縮材料を、直接、緩衝液Ａ（２０ｍＭＮａＨ₂ＰＯ₄（ｐＨ７．２））で予備平衡された７０ｍｌヘパリン−セファロース・カラムにかけた。緩衝液Ａでカラムを洗浄し、そして結合タンパク質を、ＮａＣｌ（５７０ｍｌ、０．０５Ｍから０．７Ｍ）の勾配で溶出し、そして１０ｍｌの画分を収集した。１０μｌのサンプルを使用して、バイオアッセイで記載されたとおり活性を試験した。結果は、活性が、０．２Ｍの塩濃度で現れることを示す。９カラム実行して得た活性画分をプールし、そして硫酸アンモニウムを１Ｍ濃度に達するまで添加した。材料をフェニルセファロースカラム（ＨＲ１０／１０）にかけた。カラムを、２５０ｍｌの（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄（１Ｍから塩不含まで）の勾配で溶出させた。５ｍｌの画分を収集し、そして２μｌの各画分をバイオアッセイに使用した。活性物を０．４Ｍに減少させた塩濃度で溶出させた。２つのカラムランから活性画分をプール（３０ｍｌ）し、緩衝液を交換し、そしてＣｅｎｔｒｉｐｌｕｓ１０限外濾過（Ａｍｉｃｏｎ）で、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）および０．００５％ツイーン２０中の５ｍｌに濃縮した。材料を、緩衝液（２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、０．００５％ツイーン２０）で予め平衡にしたＱ −セファロースカラム（ＨＲ５／２、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にかけた。結合タンパク質を、ＮａＣｌ（３０ｍｌ、０から１Ｍ）の勾配で溶出し、そして１ｍｌ画分を収集した。０．１μｌの各画分を用いて、陰窩コロニー形成アッセイを行った。活性は、画分８−１１に現れ画分９および１０でピークを示した。画分６−１３から得た５μｌのサンプルを、５μｌのサンプル緩衝液（０．１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、４０％グリセロール、０．００４％ブロモフェノールブルー、２％のＳＤＳを、および２％のβ−メルカプトエタノールと一緒に／またはなしに）で混合し、そして５分間煮沸した。２８％ポリアクリルアミドゲルでサンプルを電気泳動した。ゲルをクマシーブルーで染色した。この分析は、タンパク質が活性に相関することを示す。このタンパク質は、非還元条件下で７５ｋｄの単一バンドとなり、そして還元条件下で５５ｋｄと２２ｋｄの２つのバンドになった。他の可視タンパク質バンドもあるが、活性に関連したこれらのものはまったく観察されなかった。実施例３ウシＭＳＰとしての陰窩コロニー形成因子の特徴づけＡ．タンパク質配列解析１．タンパク質バンドのＮ−末端配列解析１０％Ｌａｅｍｍｌｉゲルを用いて、実施例２で記載されたとおり調製された精製陰窩コロニー形成因子を還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、そしてその後、ＦａｕｓｓｅｔおよびＬｕ（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ１２、２２−２７（１９９１年））にしたがって、電気泳動的にＰＶＤＦメンブラン（プロブロット、カリフォルニア州、フォースター・シティ（ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，ＣＡ）のＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＩｎｃ．）に移した。クマシーブルー染色した後、染色タンパク質バンドを切り出し、そして直接自動タンパク質シーケンサー（モデル４７７液体パルスシーケンサー、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＩｎｃ．）にかけた。業者から供給されたプログラムを使用して、タンパク質配列解析を行い、そして放出フェニルチオヒダントイニルアミノ酸を、微細多孔質Ｃ１８逆層ＨＰＬＣ上で分析した。小さなタンパク質バンドのＮ −末端から２９アミノ酸配列を測定した（図５および６）。大きなタンパク質バンドは、なんら配列データを生じず、これはＮ末端がブロックされていることを示唆する。２．トリプシンペプチドの単離および配列解析上述のとおり、精製因子を還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。その後、ゲルを０．０５％クマシブリリアントブルーＧ／２０％メタノール／５％酢酸で染色した。続いて、３０％ＨＰＬＣ−グレードのメタノールで脱染色する。一晩、ＨＰＬＣ−グレード水で、ゲルを洗浄し、そしてその後、タンパク質バンドを切り出し、そして、先に記載された手段（Ｍｅｒｅｗｅｔｈｅｒら、タンパク質化学の技術（ＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓｉｎＰｒｏｔｅｉｎＣｈｅｍｉｓｔｒｙ）ＶＩ，ｐｐ．１５３−１６０（１９９５年））にしたがって、イン−ゲルトリプシン消化にかけた。１０９０ＭＨＰ液体クロマトグラフィーで、ＳｙｎｃｈｒｏｍＣ４カラム（２．１×５０ｍｍ）カラムを用い、０．１５ｍｌ／分のフローレートで逆層ＨＰＬＣによって、トリプシン消化を分離し、２１５および２８０ｎｍで検出した。（Ｍｅｒｅｗｅｔｈｅｒら、同書）に記載されたとおり、アセトニトリル中の０．１％トリフルオロ酢酸の直線勾配を用いて、溶出を行った。その後、得られたアリコート量のペプチド画分を、上述のとおり配列解析にかけた。総量１１ペプチド配列を決定した（図６）。配列の解析は、ヒトＭＳＰの領域と高度の相同性を示す。Ｂ．ＰＣＲ解析およびＤＮＡ配列７５ｋｄタンパク質がＫＧ−１細胞系の産物であるか、またはＦＢＳに存在するヒトＭＳＰのウシ相同体であるかを決定するために、ウシ肝臓ポリＡ⁺ＲＮＡ（ＣｌｏｎｅｔｅｃｈＬａｂ．、カリフォルニア州、パロアルト（ＰａｌｏＡｌｔｏ、ＣＡ））、ＫＧ−１ポリＡ⁺ＲＮＡ、ＨｅｐＧ２細胞（ＡＴＣＣから得たヒト肝細胞性癌腫細胞系）から得た総ＲＮＡおよびマウス肝臓を用いて、ＰＣＲ解析を行った。ポリＡ⁺ＲＮＡおよび総ＲＮＡの調製をｍＲＮＡ精製キット（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の使用によって、そして次にキットに記載された手段によって行った。ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔｐｒｅａｍｐｌｉｃａｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍ（ＧＩＢＣＯＢＲＬ）を使用して、ｃＤＮＡを合成した。ｃＤＮＡ、２μｇのポリＡ⁺ ＫＧ−１およびウシ肝臓ＲＮＡを作るために、そして５μｇの総ＨｅｐＧ２とマウス肝臓ＲＮＡを４０μｌの総量で使用した。キットに供した指示にしたがって、反応を行った。２つのオリゴヌクレオチドを合成し、そしてプライマーとして使用した。オリゴ９９７−８２：を、ｐ２２のアミノ末端をコードできる配列に相補的に設計した。オリゴ９９７ −８５：をＴ３５．８ｂの配列に基づいて設計した。ＧｅｎｅＡｍｐ９６００系（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）でＰＣＲ解析を行った。５０μｌ反応混合液は、９μｌのｃＤＮＡ、０．５μＭの各プライマー、１×緩衝液、０．２ｍＭの各ｄＮＴＰ、および３単位のＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（カリフォルニア州、フォースター・シティ（ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，ＣＡ）のＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を含有する。陽性対照として、０．１ｎｇのヒトＭＳＰｃＤＮＡ（Ｄｅｇｅｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３０、９７８１− ９７９１（１９９１年））を同じ条件でＰＣＲ増幅した。反応混合物を９５℃で、４分間加熱し、その後３０サイクルのプログラムＡ、１５サイクルのプログラムＢにかけ、そして７２℃で、１０分間インキュベートした。プログラムＡでの各サイクルは、３０秒間９４℃、３０秒間での５４℃から０．２℃減少、そして７２℃で６０秒足す１秒間を包含する。プログラムＢでの各サイクルは、３０秒間９４℃、３０秒間４８℃、そして９０秒間７２℃を包含する。０．８％アガロースゲルで、生じたＤＮＡを解析した。図７に示されるとおり、ウシ肝臓ポリＡ⁺ ＲＮＡを用いたＰＣＲ反応で、７００ｂｐの断片を観察した。予想されるとおり、ヒトＭＳＰｃＤＮＡおよびＨｅＰＧ２総ＲＮＡの両方は、同じサイズのバンドを示した。しかし、ＫＧ−１ポリＡ⁺ＲＮＡによって製造された同様のサイズを示す明瞭なＤＮＡバンドはない。ウシ肝臓ＲＮＡから得たＰＣＲ断片の配列を、プライマーとして同じ２つのオリゴを用いて測定した。６５２ｂｐの配列か得られた。推定アミノ酸配列は、図１０に示された。配列は、アミノ酸２８４−５００から得たヒトＭＳＰと高い相同性を示す。１２ペプチド配列の４つは、この領域に一致した。ペプチドが一致する領域でヒトおよびウシＭＳＰの間に３つの差異がある。ペプチド配列は、３つの残基の内の２つでウシＭＳＰ配列と一致する。最後の位置で、ペプチドは、ウシおよびヒト配列の両方と異なってる。実施例４結腸陰窩細胞のＭＳＰの効果一次結腸陰窩細胞でのＭＳＰの効果を測定するために、これらの細胞のｒｏｎレセプターの活性化を試験した。マウス結腸陰窩を、実施例１で記載されるとおりに単離した。総陰窩（２０，０００）を２つの管に分けた。陰窩を、１００ｎｇ／ｍｌ精製ウシＭＳＰと一緒／またはなしの１ｍｌの増殖培地で、３７℃で、２０分間インキュベートした。遠心分離によって、陰窩を収集し、そして１ｍｌの溶解緩衝液（５０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％ノニデットＰ−４０、０．５％ナトリウムデオキシコレート（ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ）、０．１％ＳＤＳ、０．１ｍＭジチオスレイトール、０．１トリプシン阻害剤単位／ｍｌアプロチニン、１０μＭフェニルメチルスルホニルフルオライド、および０．４ｍＭバナデート）に溶解させた。基本的に、（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、抗体：実験室マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ）、ニューヨーク州、コールド・スプリング・ハーバーのＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ）（１９８８年））に記載のとおりに、免疫沈降法およびウエスタンブロット分析を行った。ＲＯＮタンパク質を、抗マウスＲＯＮ抗体で免疫沈降法にかけた。溶解物および抗体を穏やかに４℃で、１時間混合した。免疫複合体をプロテインＡセファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で回収し、そしてその後３回溶解緩衝液で洗浄した。同量の２×タンパク質サンプル緩衝液（０．１Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ６．８、４０％グリセロール、０．００４％ブロモフェノールブルー、２％ＳＤＳ、および４％β−メルカプトエタノール）で３分間沸騰させることにより、結合タンパク質を放出した。６％ポリアクリルアミドゲルでタンパク質を電気泳動し、そしてニトロセルロース膜に移した。濾材を、５％ＦＢＳおよび３％ツイーンで、一晩ブロックし、そして遮断溶液中の抗−Ｐｔｙｒ抗体（４Ｇ１０、ニューヨーク州、レイクプラシッド、ＵｐｓｔａｔｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）でプローブ探索した。シグナルを、ペルオキシダーゼ接合二次抗体およびＥＣＬ系（マサチュセッツ州、ビバリー（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）のＡｍｅｒｓｈａｍ）で可視化した。膜を細長く切り、そして再度抗ＲＯＮ抗体でブロットした。結果は、図９に示される。自動リン酸化を刺激することによって、ウシＭＳＰは、陰窩細胞中のＲＯＮタンパク質を活性化した。バイオアッセイでのコロニー形成の刺激は、ウシＭＳＰにより、そして汚染タンパク質でないことを確認するために、組換えネズミＭＳＰをそのアッセイで試験した。マウスＭＳＰｃＤＮＡをクローニングするために、以下のオリゴヌクレオチドプライマー：を使用することによって、マウス肝臓ポリ（Ａ）＋ＲＮＡから作られたｃＤＮＡから２２６６ｂｐ断片を増幅した。プライマーは、公表されたマウスＭＳＰ配列に基づいていた（Ｄｅｇｅｎら、同書）。ＰＣＲ産物のコーディング領域のいくつかの突然変異体が存在するため、クローン化断片をプローブとして使用して、マウス肝臓ｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）をスクリーニングした。２．２ｋｂ挿入物を伴う陽性クローンを単離し、配列決定した。得られたＤＮＡ配列は、このクローンが、最初の２アミノ酸以外は、マウスＭＳＰのコーディング領域を含むことを示した。全長ｃＤＮＡを得るために、公開された配列に基づいて、翻訳の開始についての最適コンテクストを含むアダプターおよび欠失ヌクレオチドを合成し、そして２．２ｋｂ挿入物と結合させた。ｃＤＮＡを、ｐｃＤＮＡ３ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローニングした。リポフェクタミン感染系（ＧＩＢＣＯＢＲＬ）で、マウスＭＳＰプラスミドＤＮＡをＣＯＳ−７細胞に感染させた。感染２日後に、血清不含条件付け培地を回収した。ベクターＤＮＡに感染されたＣＯＳ−７細胞から製造された条件付け培地を対照として使用した。実施例１に記載されるとおり、バイオアッセイで、条件付け培地を試験した。図１０に示された結果は、唯一マウスＭＳＰで感染した細胞から得た条件付け培地が、コロニー形成を刺激することを示す。本発明が好ましい具体例の点で記載されたとき、多様性および修飾は、当業者に気付かれると了解される。したがって、溺付の請求項は、請求されるとおり発明の範囲内にある全てのそのような同等の多様性を網羅する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ

Claims

【特許請求の範囲】１．治療的有効量のマクロファージ刺激タンパク質を投与することを含んで成る、哺乳動物の胃腸管内層の疾患の治療方法。２．疾患が、化学療法または放射線治療に起因する請求項１に記載の方法。３．疾患が、炎症性腸疾患、潰瘍、または感染に起因する請求項１に記載の方法。４．治療的有効量のＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２、ＥＧＦ、ＴＧＦ−α、酸性ＦＧＦ、塩基性ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＫＧＦ、ＩＬ−６、またはＩＬ−１１を投与することをさらに含んで成る請求項１に記載の方法。５．胃腸管内層の疾患の開始の前に、それと同時に、またはその後に、該因子が投与される請求項１に記載の方法。６．化学療法または放射線治療の前に、またはそれと同時に、因子が投与される請求項５に記載の方法。７．血液生成を刺激する治療的有効量の因子を投与することをさらに含んで成る請求項１に記載の方法。８．因子が、ＥＰＯ、Ｇ−ＣＳＦ、ＭＧＤＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＳＣＦ、ＩＬ−３、またはＩＬ−６である請求項７に記載の方法。９．治療的有効量のマクロファージ刺激因子を投与することを含んで成る腸管上皮の成長または分化を調節する方法。１０．腸管陰窩細胞の成長および分化が調節される請求項９に記載の方法。１１．胃腸管内層の疾患を治療することができる物質を同定する方法であって、コロニー形成を可能にする条件下において、該物資を単離された陰窩細胞で培養し；およびコロニー形成の刺激を得る：ことを含んで成る方法。