JP2000510326A - 移植および炎症状態に対する抗アポトーシス性遺伝子療法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 哺乳類、特に内皮細胞に遺伝子修飾を加えることにより、炎症または他の免疫学的活性化刺激因子に対するそれらの感受性を低下させる方法であって、その細胞またはその先祖細胞においてＮＦ−κＢを阻害し得る抗アポトーシス性ポリペプチドをコード化するＤＮＡを挿入し、タンパク質を発現させることにより、細胞におけるＮＦ−κＢが細胞活性化刺激因子の存在下で実質的に阻害されることを含む方法が記載されている。適当なポリペプチドは、天然タンパク質の相同体および先端切除形態を含む、哺乳類Ａ２０、ＢＣＬ−２、ＢＣＬ−Ｘ_L（ＭＣＬ−１）またはＡ１タンパク質の活性を有するものから選択される。ＢＣＬ−２、ＢＣＬ−Ｘ_LまたはＡ１活性ポリペプチドはまた、ホモ二量体またはＢＣＬ群の別の抗アポトーシス性ポリペプチドとのヘテロ二量体として使用され得る。この方法は、インビボまたはエクスビボまたはインビトロで行われ得、同種異系または特に異種間移植に関して、および全身的または局所的炎症状態の処置に特に有用である。内皮細胞により調節可能な方法で上記ポリペプチドを発現するヒト以外のトランスジェニックまたは体細胞組換え哺乳類が製造され得ることにより、上記細胞および上記細胞を含む組織または器官が哺乳類レシピエントへの移植用に得られる。

Description

【発明の詳細な説明】 移植および炎症状態に対する抗アポトーシス性遺伝子療法 発明の分野 この発明は、移植および炎症状態に対する抗アポトーシス性遺伝子療法分野に関 するものである。この発明は、遺伝子療法並びに組織および器官移植分野に改善 をもたらす。この発明は、その広い態様において、細胞活性化プロセスの処置方 法に関するものである。特にこの発明は、炎症性、免疫学的または他の活性化刺 激因子に対する内皮細胞の感受性を低下させるための前記細胞の遺伝子修飾に関 するものである。 この発明は、具体的には細胞アポトーシスを阻害し得るポリペプチドを発現し 得るものにするための細胞、特に内皮細胞の遺伝子修飾、およびそのための組換 えベクター関するものである。哺乳類細胞においてアポトーシスを阻害し得るポ リペプチドの例には、哺乳類Ａ２０タンパク質の活性を有するポリペプチド、お よびさらに一般的には抗アポトーシス活性を有するポリペプチド、特にＢＣＬ群 に属するある種のタンパク質がある。 この発明はまた、生成した遺伝子修飾細胞、またはこれらの細胞を含む組織ま たは器官、およびそうして修飾されたヒト以外のトランスジェニックまたは体細 胞組換え動物に関するものである。 この発明は、さらに特定すれば、哺乳類レシピエントへの遺伝子修飾細胞また は前記細胞を含む移植可能組織または器官の移植に関するものである。哺乳類レ シピエントは、細胞に関して同種異系または異種であり得る。 発明の背景 移植器官に対する受容者抗体および補体系の即時免疫学的応答を含め、不調和 な種間における器官移植に伴う「過度急性拒絶」という十分に特性確認された問 題については、免疫抑制剤、および受容者の補体系を阻害する因子を発現するド ナー器官の使用を含め、様々な手段で取り組まれてきた（ダルマッソ、Ａ.Ｐ.、 「イムノファーマコロジー」２４（２）［１９９２］１４９−１６０）。 しかしながら、移植された組織または器官、および炎症プロセスを被った細胞 に一般に伴うさらに別の状態は、「活性化」として知られる病的状態である。特 に、内皮細胞「活性化」は、刺激因子、例えば細胞傷害性サイトカイン［例、腫 瘍壊死因子（ＴＮＦ）］、炎症または感染状態、再潅流損傷、アテローム性動脈 硬化、脈管炎または移植拒絶に曝された内皮細胞の特性を表す変化の連続を包含 する。内皮（「脈管内皮」とも称する）は、心臓および血管およびリンパ管の内 面を覆う細胞の層により構成される。活性化刺激因子に対する上記細胞の初期細 胞応答（「Ｉ型」活性化と称されることが多い）は、典型的には細胞表現型の変 化、例えば互いの細胞の退縮、出血および浮腫、および内皮を通る白血球の移行 を含む。細胞活性化のさらに別の局面（「II型」活性化）は、インターロイキン 、接着性分子、および凝固系の前凝固性、前血栓性成分をコードする様々な遺伝 子の転写アップレギュレーションを含む。例えば、Ｅ−セレクチンは、活性化時 内皮細胞（ＥＣ）により独占的に発現される組織特異分子であるため、一般に認 められているII型ＥＣ活性化の指標である（ポーバー、Ｊ.Ｓ.およびコトラン、 Ｒ.Ｓ.、「トランスプランテーション」５０［１９９０］５３７−５４４）。 正常な細胞機能を犠牲にして、上記活性化タンパク質の連続過剰発現に伴うこ とが認められている現象は、細胞において「アポトーシス」として知られる能動 細胞枯死プロセスが起こりやすい傾向である（Ｇ.Ｔ.ウィリアムズおよびＣ.Ａ. スミス、「セル」７４［１９９３］７７７−７７９、Ｄ.Ｌ.ヴォーら、「セル」 ７６［１９９４］７７７−７７９）。アポトーシスは、組織の発生、分化または 代謝回転過程で見られる予めプログラムされた細胞死としてみなされ得る（ウィ リー、Ａ.Ｈ.ら、「インターナショナル・レビュー・オブ・サイトロジー」６８ ［１９８０］２５１−３０６）。細胞が外因性または内因性シグナルの結果とし て内部コード化自死プログラムを活性化すると、アポトーシスによる細胞死が起 こる。形態学的には、アポトーシスは、近隣細胞との接触の喪失、細胞質の濃化 、エンドヌクレアーゼ活性付随染色質凝縮および核凝縮、および特に核の分割を 特徴とする。細胞表面からの微絨毛の消失および細胞表面における小胞形成（膜 小気胞形成）もまた観察される。アポトーシス体細胞の残りの断片は、最終的に は近隣細胞により捕食される（デュバル、Ｅ.およびウィリー、Ａ.Ｈ.、「イム ノロジー・テュデー」７（４）［１９８６］１１５−１１９、トラウス、Ｂ.Ｃ. ら、「サイエンス」２４５［１９８９］３０１−３０５）。アポトーシス細胞死 は、 炎症、胚形成およびリンパ球選択において基本的に重要である。一般に炎症に伴 い、特に器官移植に伴う細胞活性化およびアポトーシス細胞死の回避は、当業界 従事者にとっての主要目標となっている。移植片保存技術に伴い、そして移植片 拒絶に付随して生じる移植片損傷および喪失は、内皮細胞が上記プロセスに弱い ことを示している。 活性化刺激因子、例えばＴＮＦαに応じた転写アップレギュレーションに感受 性がある遺伝子の多くについて同定された転写因子は、「核因子κＢ」、すなわ ちＮＦ−κＢである（Ｍ.グリリら、「インターナショナル・レビュー・オブ・ サイトロジー」１４３［１９９３］１−６１）。ＮＦ−κＢは細胞の細胞質に予 め形成された転写因子として存在し、ＩκＢ群のタンパク質阻害剤との会合によ り不活化される。細胞活性化刺激因子、例えばリポ多糖（ＬＰＳ）、ＴＮＦまた は酸素基に暴露されると、ＩκＢタンパク質は急速にリン酸化され、次いで分解 されることにより、前形成ＮＦ−κＢを遊離させ、それを核へ移行させる。核に おいて、核ＤＮＡのプロモーター領域におけるある種のＮＦ−κＢ結合部位（「 κＢ成分」とも称する）へＮＦ−κＢが結合することにより、前記プロモーター の制御下で直接的または間接的に遺伝子の転写が開始される。ＴＮＦによる細胞 の刺激時ＮＦ−κＢによりアップレギュレーションが行われる遺伝子は、特にＥ −セレクチン、ＩＬ−８および組織因子を含む（Ｆ.Ｈ.バッハら、「イムノロジ カル・レビューズ」１４１［１９９４］１−３０、Ｔ.コリンズ、「ラボラトリ ー・インヴェスティゲーション」６８［１９９３］４９９−５０８、Ｍ.Ａ.リー ドら、「ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディシン」１７９［１９９ ４］５０３−５１２）。 例えば、Ａ２０遺伝子は、ＴＮＦまたは他の細胞活性化因子により誘導され得 ることが見いだされた（Ａ.Ｗ.オピパリら、「ジャーナル・オブ・バイオロジカ ル・ケミストリー」２６５［１９９０］１４７０５−１４７０８、Ｃ.Ｄ.ラハー ティーら、「ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー」２６８［１９ ９３］５０３２−５０３９）。Ａ２０は、最終的にＴＮＦ−誘導アポトーシスに 対する抵抗力を付与するのを助けるＴＮＦ−誘導性遺伝子のサブセットに属する という証拠がある（Ｍ.テワリら、「ジャーナル・オブ・イムノロジー」１５４ ［１９９５］１６９９−１７０６、Ａ.Ｗ.オピパリら、「ジャーナル・オブ・バ イオロジカル・ケミストリー」２６７［１９９２］１２４２４−１２４２７、Ａ .Ｗ.オピパリら、「ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー」２６５ ［１９９０］１４７０５−１４７０８、ディキシットら［１９８９］、前掲）。 Ａ．クリコスおよび共同研究者ら（「ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミ ストリー」２６７［１９９２］１７９７１−１７９７６）は、ＴＮＦαによるＡ ２０遺伝子の誘導がＡ２０プロモーターのＮＦ−κＢ結合性部位によっても伝達 されることを立証した（Ｃ.Ｄ.ラハーティーら、「ジャーナル・オブ・バイオロ ジカル・ケミストリー」２６８［１９９３］５０３２−５０３９も参照）。 Ａ２０タンパク質以外に、タンパク質のＢＣＬ（ＢＣＬ−２とも称する）群の ある種のタンパク質も、抗アポトーシス効果を発揮する。上記タンパク質には、 ＢＣＬ−２、ＢＣＬ−Ｘ_L、ＭＣＬ−１およびＡ１がある。しかしながら、Ａ２ ０タンパク質またはＢＣＬタンパク質が抗アポトーシス効果を発揮する正確な機 構について完全には解明されていない。 発明の要約 細胞のＮＦ−κＢ−介在活性化を抑制する重要な手段は現時点では見いだされ ていない。意外なことに、遺伝子転写のＮＦ−κＢ調節はアポトーシス阻害性（ すなわち「抗アポトーシス性」）タンパク質の発現に関連があることが見いださ れた。さらに特定すれば、こういったタンパク質はＮＦ−κＢ伝達遺伝子転写に 対して負のフィードバック制御力を発揮し得、すなわち抗アポトーシス性タンパ ク質はＮＦ−κＢ転写因子の阻害剤として機能することが見いだされた。この観 察された負のフィードバック効果は、場合によっては、見かけ上ＩＫＢ分解の上 流に作用することより、解離から直接的または間接的にＮＦ−κＢ−ＩκＢ複合 体を保護する抗酸化機構を介して発揮され得ると考えられる。上記の阻害機能は 、通常アポトーシス細胞死の阻止を補助し得る。しかしながら、例えば移植およ び特に異種間移植に伴って起こる場合のような、過酷な細胞攻撃条件下では、細 胞における抗アポトーシス性タンパク質の発現は不十分なレベルであるか、また は細胞におけるＮＦ−κＢの急速な活性化に対して遅延し得るため、ＮＦ−κＢ の阻害は細胞活性化およびアポトーシスの阻止に効果的ではなくなる。 この発見を用いることにより、炎症性または他の活性化刺激因子に感受性があ る内皮または他の細胞を処置し、および特に移植拒絶に曝されている細胞、組織 または器官を処置する方法が考え出された。この発明の方法および他の態様を用 いることにより、炎症または炎症に伴う病状、例えば敗血症ショック、慢性拒絶 、異種間移植拒絶、アテローム性動脈硬化（再狭窄）、脈管炎、心不全または自 己免疫疾患が処置され得る。 この発明は、遺伝子療法技術により、抗アポトーシス性遺伝子およびその発現 産物を用いて、活性化刺激因子に感受性がある哺乳類細胞においてＮＦ−κＢ活 性化を阻止するものである。 従って、この発明は第１の態様において、遺伝子修飾が加えられたことにより 、細胞活性化刺激因子の存在下ＮＦ−κＢ活性化を実質的に阻害し得る抗アポト ーシス性タンパク質を発現する哺乳類細胞（特に、内皮細胞）を提供する。「細 胞活性化刺激因子」の一例は、腫瘍壊死因子、ＴＮＦ（すなわちＴＮＦα）であ る。 「ＮＦ−κＢ活性化」は、直接的または間接的にＮＦ−κＢ結合部位の制御下 にある遺伝子、例えば内皮細胞におけるＥ−セレクチンのＮＦ−κＢ−伝達アッ プレギュレーションを意味する。機能的な意味では、ＮＦ−κＢ活性化は、κＢ 調節配列と機能し得るように会合した遺伝子の転写開始に十分な状態で（単独ま たは他の因子と組み合わせて）細胞のＤＮＡにおけるＮＦ−κＢと上記配列の結 合を構成する。 「ＮＦ−κＢ阻害」は、核ＤＮＡにおけるＮＦ−κＢ結合部位へのＮＦ−κＢ の結合が阻害されることを意味する。例えば本発明に従い遺伝子修飾され、ＴＮ Ｆαで刺激された内皮細胞によるＥ−セレクチン遺伝子の転写が、同様にＴＮＦ αによる刺激を受けた非修飾細胞（すなわち本発明による遺伝子操作を受けてい ない細胞）と比べて６０％またはそれより大きく、好ましくは８０％またはそれ より大きく、さらには９０％またはそれより大きく、例えば９５％、さらには９ ９％またはそれより大きく低減化されたとき、ＮＦ−κＢは「実質的に阻害され た」とみなされる。 この発明はまた、そのさらに広い態様において、哺乳類（例、内皮）細胞に遺 伝子修飾を加え、これらの細胞またはその先祖において、ＮＦ−κＢを阻害し得 る抗アポトーシス性タンパク質をコード化するＤＮＡを挿入し、上記タンパク質 を発現させることにより、細胞におけるＮＦ−κＢが細胞活性化刺激因子の存在 下でも実質的に阻害される結果、炎症性または他の免疫学的活性化刺激因子に対 する上記細胞の感受性が低減化される方法に関するものである。 遺伝子修飾細胞における抗アポトーシス性タンパク質、例えばＡ２０タンパク 質によるＮＦ−κＢ開始転写の阻害は、対応するＡ２０遺伝子によるインビトロ での中程度のトランスフェクションレベル（例、約５×１０⁵細胞当たり０.５μ ｇプラスミドＤＮA）でさえ予想外にも強力であり、サイトカイン誘導性遺伝子 、例えば組織因子、Ｅ−セレクチンおよびＩκＢα（これらは全て炎症に伴う） の誘導を効果的に抑制することが見いだされた。 この治療法が、ＮＦ−κＢ活性化の阻害が有益であり得る状態、例えば炎症に 苦しむ患者の処置に一般に有用であることは明白である。また、この治療法は、 特に移植片レシピエントがヒトである場合、さらに特定すれば移植片がレシピエ ントにとって異種関係である場合、器官移植に付随して起こる合併症を和らげる のに有用である。 すなわち本発明は、さらに別の態様において、供与内皮または他の補乳類細胞 （例、単核球、ＮＫ細胞またはリンパ球の前駆体としての骨髄幹細胞、または島 細胞）または上記細胞を含む移植可能な組織または器官を、全血または血漿にお いてこれらの細胞、組織または器官が活性化を被っている哺乳類受容者に移植す る方法であって、（ａ）供与細胞またはその先祖細胞に対し、ＮＦ−κＢを阻害 し得る抗アポトーシス性タンパク質をコードするＤＮＡをそこに挿入することに より遺伝子修飾を加え、（ｂ）生成した修飾供与細胞またはこれらの細胞を含む 組織または器官を受容者に移植し、細胞において抗アポトーシス性タンパク質を 発現させることにより、細胞におけるＮＦ−κＢ活性化が細胞活性化刺激因子の 存在下で実質的に阻害されることを含む方法を包含する。 段階（ｂ）の「修飾供与細胞」は、段階（ａ）で細胞自体に遺伝子修飾が加え られた細胞およびその子孫を包含するものと理解すべきである。 本発明のさらに別の態様によると、供与内皮細胞、および上記細胞を含む組織 および器官が提供され、この場合、上記細胞は、レシピエント種への移植を目的 として、遺伝子修飾が加えられた結果、移植片レシピエントにおいて抗アポトー シス性タンパク質を調節可能にまたは構成的に発現することにより、ＮＦ−κＢ は実質的に阻害される。移植片レシピエントは、供与細胞、組織または器官に関 して同種異系または異種であり得る。その追加的態様において、この発明は、異 なる種類の抗アポトーシス性タンパク質をコードするＤＮＡを含むヒト以外のト ランスジェニックまたは体細胞組換え哺乳類、およびヒト以外のトランスジェニ ックまたは体細胞組換え哺乳類の製造方法を提供する。また、抗アポトーシス性 タンパク質コード化ポリヌクレオチドの挿入により細胞を遺伝子修飾するための ベクター、例えばレトロウイルス性ベクターおよび特にアデノウイルスベクター もこの発明の範囲内に含まれる。 図面の説明 図１：ＴＮＦαによる刺激後にＡ２０ベクター（「Ａ２０」）によりトランス フェクションされたＢＡＥＣ、エンプティーｐＡＣベクター（「ＰＡＣ」）によ りトランスフェクションされたＢＡＥＣ)または非トランスフェクションＢＡＥ Ｃ（「ＮＴ」）から抽出された抗体アフィニティー精製タンパク質の分析。また 、非刺激（「ＮＳ」）またはＴＮＦαにより刺激された（「ＴＮＦ」）ＨＵＶＥ Ｃについても比較分析している。 図２：ルシフェラーゼ発現ベクターへクローン化されたブタＥ−セレクチンプ ロモーター領域（「ブタＥ−セレクチンリポーター」）と共にＡ２０および／ま たはｐＡＣベクター（「ｐＡＣ」）により同時トランスフェクションされたＢＡ ＥＣにおける相対光単位（ＲＬＵ）でのルシフェラーゼレベル。ＢＡＥＣは、非 刺激（「ＮＳ」または「対照」）またはＴＮＦα（「ＴＮＦ」）またはリポ多糖 （「ＬＰＳ」）により刺激されている。 図３Ａ−３Ｃ：Ａ２０またはｐＡＣベクター（「ｐＡＣ」）およびルシフェラ ーゼベクターへクローン化された次のプロモーター:（ａ）ヒトＩＬ−８プロモ ーター（「ＩＬ−８リポーター」）（図３Ａ）、（ｂ）ブタＩκＢαプロモータ ー（「ＩＫＢαリポーター」）（図３Ｂ）および（ｃ）ブタ組織因子（ＴＦ）プ ロモーター（「組織因子リポーター」）（図３Ｃ）のうちの１つにより同時トラ ンスフェクションされ、次いでＴＮＦαまたはＬＰＳにより刺激されるかまたは 対照として維持されたＢＡＥＣにおけるルシフェラーゼレベル。 図４：Ａ２０またはｐＡＣおよびルシフェラーゼベクターにクローン化された ブタＥ−セレクチンプロモーターから誘導されたκＢ成分(「NFκBリポーター」 )により同時トランスフェクションされ、次いでＴＮＦαまたはＬＰＳにより刺 激されたかまたは対照として維持されたＢＡＥＣにおけるルシフェラーゼレベル 。 図５Ａ：Ａ２０またはｐＡＣおよびＲＳＶ−ＬＴＲ推進ルシフェラーゼベクタ ー（「ＲＳＶ−ＬＵＣリポーター」）により同時トランスフェクションされたＢ ＡＥＣにおけるルシフェラーゼレベル。 図５Ｂ：Ａ２０および／またはｐＡＣおよびＨＩＶＬＴＲ推進ＣＡＴベクター （「ＨＩＶ−ＣＡＴリポーター」）により同時トランスフェクションされたＢＡ ＥＣにおける、１分当たりの数（ＣＰＭ）での¹⁴Ｃ-標識クロラムフェニコール レベル。細胞をウイルスｃ−Ｔａｔタンパク質（「Ｃ−Ｔａｔ」）により刺激す るかまたは対照として維持する。 図６Ａ、６Ｂ、６Ｃ：ルシフェラーゼベクターへクローン化されたＥ−セレク チンリポーター（図６ａ）、ＩＫＢαリポーター（図６Ｂ）またはＮＦκＢリポ ーター（図６Ｃ）と共に、ｐＡＣおよびＢｃｌ−２またはＢｃｌ−ＸＬにより同 時トランスフェクションされ、次いでＴＮＦまたはＬＰＳにより刺激されるかま たは非刺激対照として維持されたＢＡＥＣにおけるルシフェラーゼレベル。 図７：ルシフェラーゼベクターへクローン化されたＥ-セレクチンリポーター と共に、ｐＡＣ、完全長Ａ２０または先端切除Ａ２０クローン＃３［「ｔＡ２０ （３）」］または＃７［「ｔＡ２０（７）」］により同時トランスフェクション され、次いでＴＮＦまたはＬＰＳにより刺激されるかまたは非刺激（「ＮＴ」） 対照として維持されたＢＡＥＣにおけるルシフェラーゼレベル。 図８：ヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）κプロモーターから誘導されたκＢ結合オ リゴヌクレオチドおよび、比較用に、低温野生型ＮＦκＢ−特異的プローブ（sp -comp.）および非特異的競合物質（「nsp.comp.」）（ＡＰ−１）を用いて、ア デノウイルスＢｃｌ−２（「ｒＡｄ.Ｂｃ１−２」）または対照としてβ-ｇａｌ （「ｒＡｄ.β−ＧａＵ）により感染したＴＮＦ−刺激（＋）または非刺激（− ）ＰＡＥＣからの核抽出物のＥＭＳＡ。 図９：示されているとおりＴＮＦ、Ｉκβαによる刺激の前（「０」）、また は１０分（「１０」）または１２０分（「１２０」）後に採取したｒＡｄ.Ｂｃ ｌ−２−（または対照として、ｒＡｄ.β−ｇａｌ−）感染ＰＡＥＣのウエスタ ンブロット。 図１０：プローブとして転写因子ｃＡＭＰ応答成分（「ＣＲＥ」）および、比 較用に、低温野生型ＣＲＥ−特異的プローブ（sp-comp.）および非特異的競合物 質（「nsp.comp.」）を用いた、ＴＮＦ刺激の前（「−」）または２時間後（＋ ）のｒＡｄ.Ｂｃｌ−２−（または対照として、ｒＡｄ.β−ｇａｌ−）感染ＰＡ ＥＣからの核抽出物のＥＭＳＡ。 図１１：Ａ１またはｐＡＣおよび０.７μｇの（Ａ）Ｅ−セレクチンまたは（ Ｂ）ＮＦκＢリポーターを含むルシフェラーゼベクターにより同時トランスフェ クションされたＢＡＥＣにおけるルシフェラーゼレベル。細胞はＴＮＦまたはＬ ＰＳにより刺激されているかまたは刺激されていない（対照）。 図１２：アデノウイルスＩκＢα（「ｒＡｄ.ＩＫＢ」α）またはＡ２０（「 ｒＡｄ.Ａ２０」）または対照としてｒＡｄ.β−ｇａｌにより感染したＴＮＦ刺 激（＋）または非刺激（−）ＨＵＶＥＣのノーザンブロット。 定義 「移植(片)」と訳される「graft」、「transplant」または「implant」は、レ シピエントへの移植用に提供者から摘出された生物材料、および上記生物材料を レシピエントに定着させる行為を包含するものとして互換的に使用される。 「宿主」または「レシピエント」は、供与生物材料が移植される患者の体を指 す。 「同種異系の」は、提供者および受容者が同種に属する場合（「同種移植」と もいう）を指す。そのサブセットとして、「同系の」は、提供者および受容者が 遺伝学的に同一である状況を意味する。「オートロガス」は、提供者および受容 者が同一個体であることを意味する。「異種間の」（および「異種移植」）は、 移植片提供者と受容者が異なる種に属する場合の状況を指す。 「Ａ２０」は、天然哺乳類Ａ２０遺伝子（そのｃＤＮＡを含む）またはタンパ ク質を意味し、例えば天然タンパク質がＮＦ−κＢ活性化を遮断する能力を損な うことのないＤＮＡ（またはアミノ酸）配列の改変（例えば５個以下のアミノ酸 のサイレント突然変異または欠失）を有するその誘導体が含まれる。Ａ２０遺伝 子（タンパク質）は、修飾される細胞の性質および移植が計画されているレシピ エントの種によっては、例えばブタ、ウシまたはヒトであり得るか、またはヒト 以外の霊長類に属するものであり得る。 「Ａ２０タンパク質の活性を有するポリペプチド」または「Ａ２０活性タンパ ク質」は、ＮＦ−κＢ活性化を遮断または抑制し得、天然哺乳類（例、ヒト）Ａ ２０タンパク質のタンパク質配列（例、後記配列番号１）に対して少なくとも７ ０％、好ましくは少なくとも８０％、およびさらに好ましくは少なくとも９０％ （最も好ましくは少なくとも９５％）の相同性を示すタンパク質を包含する。好 ましい態様において、本発明のＡ２０タンパク質はヒトであり、後記配列番号１ に対応するアミノ酸配列を有する（Ａ.Ｊ.オピパリら［１９９０］により開示さ れている、前掲）。さらに別の態様では、この発明のＡ２０遺伝子は、後記配列 番号２に対して少なくとも７０％、およびさらに好ましくは少なくとも８０％、 または少なくとも９０％（例、少なくとも９５％）の相同性を示すか、またはこ れに対応する。 「Ｂｃｌ−２」は、天然哺乳類Ｂｃｌ−２遺伝子（そのｃＤＮＡを含む）また はタンパク質（大文字で示されている）を包含し、例えば天然タンパク質がＮＦ −κＢ活性化を遮断する能力を損なうことのないＤＮＡ（またはアミノ酸）配列 の改変（例えば５個以下のアミノ酸のサイレント突然変異または欠失）を有する その誘導体が含まれる。Ｂｃｌ−２遺伝子（タンパク質）は、修飾される細胞の 性質および移植が計画されているレシピエントの種によっては、例えばブタ、ウ シまたはヒトであり得るか、またはヒト以外の霊長類に属するものであり得る。 「ＢＣＬ−２タンパク質の活性を有するポリペプチド」または「ＢＣＬ−２活 性タンパク質」は、ＮＦ−κＢ活性化を遮断または抑制し得、天然哺乳類（例、 ヒト）ＢＣＬ−２のタンパク質配列（例、後記配列番号３）に対して少なくとも ７０％、好ましくは少なくとも８０％、およびさらに好ましくは少なくとも９０ ％（最も好ましくは少なくとも９５％）の相同性を示すタンパク質を包含する。 本発明の好ましい態様において、本発明のＢＣＬ−２ポリペプチドはヒトであり 、 後記配列番号３に対応するアミノ酸配列を有する（ツジモト、Ｙ.およびクロー チェ、Ｃ.Ｍ.、ＰＮＡＳ ８３［１９８６］５２１４−５２１８、およびＷＯ９ ５／００６４２に開示されている）。 同様に、「Ｂｃｌ−ｘ_L」は、天然哺乳類Ｂｃｌ−ｘ_L遺伝子（そのｃＤＮＡを 含む）またはタンパク質（大文字で示されている）を包含し、例えば天然タンパ ク質がＮＦ−κＢ活性化を遮断する能力を損なうことのないＤＮＡ（またはアミ ノ酸）配列の改変（例えば５個以下のアミノ酸のサイレント突然変異または欠失 ）を有するその誘導体が含まれる。Ｂｃｌ−ｘ_L遺伝子（タンパク質）は、修飾 される細胞の性質および移植が計画されているレシピエントの種によっては、例 えばブタ、ウシまたはヒトであり得るか、またはヒト以外の霊長類に属するもの であり得る。 「ＢＣＬ−Ｘ_Lタンパク質の活性を有するポリペプチド」または「ＢＣＬ−Ｘ_L 活性タンパク質」は、ＮＦ−κＢ活性化を遮断または抑制し得、天然哺乳類（例 、ヒト）ＢＣＬ−Ｘ_Lタンパク質のタンパク質配列（例、後記配列番号４）に対 して少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、およびさらに好ましくは 少なくとも９０％（最も好ましくは少なくとも９５％）の相同性を示すタンパク 質を包含する。本発明の好ましい態様において、本発明のＢＣＬ−Ｘ_Lポリペプ チドはヒトであり、後記配列番号４に対応するアミノ酸配列を有する（ＷＯ９５ ／００６４２にも開示されている）。 「Ａ１」は、天然哺乳類Ａ１遺伝子（そのｃＤＮＡを含む）またはタンパク質 を包含し、例えば天然タンパク質がＮＦ−κＢ活性化を遮断する能力を損なうこ とのないＤＮＡ（またはアミノ酸）配列の改変（例えば５個以下のアミノ酸のサ イレント突然変異または欠失）を有するその誘導体が含まれる。この発明で使用 されるＡ１遺伝子（タンパク質）は、修飾される細胞の性質および移植が計画さ れているレシピエントの種によっては、例えばブタ、ウシまたはヒトであり得る か、またはヒト以外の霊長類に属するものであり得る。 「Ａ１タンパク質の活性を有するポリペプチド」または「Ａ１活性タンパク質 」は、ＮＦ−κＢ活性化を遮断または抑制し得、天然哺乳類（例、ヒト）Ａ１の タンパク質配列（例、後記配列番号５）に対して少なくとも７０％、好ましく は少なくとも８０％、およびさらに好ましくは少なくとも９０％（最も好ましく は少なくとも９５％）の相同性を示すタンパク質を包含する。本発明の好ましい 態様において、本発明のＡ１ポリペプチドはヒトであり、後記配列番号５に対応 するアミノ酸配列を有する（Ａ．カーサンら、「ブラッド」８７、ナンバー８［ １９９６年４月１５日］３０８９−３０９６に開示されている）。 詳細な記載 ヒトＡ２０遺伝子は、初めはヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）のＴＮＦ処理 後急速ではあるが一時的に発現される即時型応答遺伝子としてクローン化された （オピパリら、［１９９０］、前掲）。現在、Ａ２０活性を有するタンパク質は また、他の刺激因子、例えばＨＵＶＥＣ中ＩＬ−１（ディキシットら［１９８９ ］、前掲）、Ｂ細胞中ＣＤ４O架橋（テワリら、［１９９５］、前掲）、または ジャーカットＴ細胞中ホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ ）またはＨＴＬＶ−Ｉ Ｔａｘタンパク質（ラハーティーら、［１９９３］、前 掲）によっても誘導され得ることが知られている。Ａ２０タンパク質はまた、成 熟休止Ｔ細胞にも構成的に存在する。 ＨＵＶＥＣから得られるヒトＡ２０遺伝子のｃＤＮＡ配列、および推定される アミノ酸配列は、上記で示されている通り、オピパリら［１９９０］（前掲）に より発表されている。Ａ２０のＴＮＦ−誘導は、遺伝子の−４５から−５４（５ '-ＧＧＡＡＡＴＣＣＣＣ-３'）および−５７から−６６（５'-ＧＧＡＡＡＧＴＣ ＣＣ-３'）へ伸長する、Ａ２０プロモーターにおけるＮＦ−κＢ結合部位を介し て伝達されることが示された。このタンパク質レベルでは、推定された７９０ア ミノ酸の配列（配列番号１）は、そのカルボキシル末端ハーフ内に７Ｃｙｓ₂／ Ｃｙｓ₂亜鉛フィンガ一繰り返し体；立体配置Ｃｙｓ-Ｘ₄-Ｃｙｓ-Ｘ₁₁-Ｃｙｓ- Ｘ₂-Ｃｙｓをもつ６体および立体配置Ｃｙｓ-Ｘ₂-Ｃｙｓ-Ｘ₁₁-Ｃｙｓ-Ｘ₂-Ｃｙ ｓ（式中、Ｘはいずれかのアミノ酸であり、下付き文字は示された各システイン 間のアミノ酸の数を表す）をもつ１体を含む。１１アミノ酸残基により構成され る新規フィンガーループドメインもまた同定されている（クリコスら、［１９９ ２］、前掲）。 この発明の一態様では、「Ａ２０活性を有するタンパク質」は、配列番号１の アミノ酸残基３８６−７９０を含み、天然タンパク質配列の亜鉛フィンガー領域 （すなわち７亜鉛結合ドメインを有する）、または上記残基との相同性が少なく とも８０％である領域が含まれる。天然ヒトタンパク質の別の適当な先端切除形 態は、本質的に後記配列番号１の残基３７３−７９０により構成される。ＮＦκ Ｂを阻害し得ることが見いだされた他の欠失突然変異体は、ポリペプチドのＮ− 末端および２亜鉛結合性ドメイン、例えば配列番号１のアミノ酸１−５３８を含 む。 Ａ２０タンパク質は、ＮＦκＢを阻害すべく特異的に作用することが見いださ れた。例えば、ＪｕｎＢ、別のＴＮＦまたはＬＰＳ−誘導性タンパク質の発現は 、ＮＦκＢが上記要領で阻害される条件下でもＡ２０発現により阻害されること は見いだされていない。 ｂｃｌ−２遺伝子は、初めは多くのヒトＢ細胞リンパ種に存在するｔ（１４； １８）転位の切断点からクローン化された。インビトロで、ＢＣＬ−２タンパク 質は、選択的にある種のセルラインでアポトーシス細胞死を阻害することが示さ れたことから、アポトーシスの多重独立細胞内機構が存在すると思われ、それら の中には、ＢＣＬ−２により阻害され得るものもあれば、見たところ遺伝子によ り影響されないものもある（ＷＯ９５／００６４２）。ＢＣＬ（すなわちＢＣＬ −２）群の未変性タンパク質は、ＢＣＬ−２相同領域１、２および３（略してＢ Ｈ−１、ＢＨ−２およびＢＨ−３）と称される、３つの保存領域を特徴とし、ア ポトーシスの調節およびタンパク質−タンパク質相互作用に要求される。ＢＣＬ 群のタンパク質は、抗アポトーシス性ポリペプチド、例えばＢＣＬ−２、ＢＣＬ −Ｘ_L（ＢＣＬ−Ｘのスプライス変異型の長鎖形態）、ＭＣＬ−１およびＢＡＧ −１を含む。 ＢＣＬ群の別の構成員はＡ１タンパク質を含む。ヒトＡ１は、ＢＣＬ群特有の ＢＨ１およびＢＨ２領域を含むことが見いだされた（Ａ．カーサンら、「ブラッ ド」８７、ナンバー８［１９９６年４月１５日］３０８９−３０９６、Ａ．カー サンら、「ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー」２７１（４４） ［１９９６年１１月１日］２７２０ １−２７２０４）。この発明で使用される適当な抗アポトーシス性ポリペプチド は、本質的に天然（例、ヒト）Ａ１タンパク質の領域ＢＨ１およびＢＨ２、また は凝集体で、天然Ａ１タンパク質のＢＨ１およびＢＨ２領域の凝集体に対する相 同性が少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、およびさらに好ましく は少なくとも９５％であるアミノ酸配列を含むかまたはそれらにより構成され得 る。 一般に、ＢＣＬ群の適当な欠失突然変異体は、例えば未変性タンパク質のＢＨ １、ＢＨ２、ＢＨ３およびＢＨ４領域の少なくとも１つ、例えば各タンパク質に ついて、下記ペプチド配列の１つまたはそれ以上を含み得る（a.a.＝アミノ酸位 置番号）： ＢＣＬ−２：配列番号３の約a.a.１０〜約a.a.３０、約a.a.９３〜約a.a.１０ ７、約a.a.１３５〜約１５５、約a.a.１８７〜約a.a.２０２、 ＢＣＬ−Ｘ_L：配列番号４の約a.a.５〜約a.a.２４、約a.a.８６〜約a.a.１０ ０、約a.a.１２９〜約１４８、約a.a.１８０〜約a.a．１９５、 Ａ１：配列番号５の約a.a.２７〜約a.a.４５、約a.a.６６〜約a.a.９９、約a. a.１３３〜約１４５。 この発明において有用であるさらに他のＢＣＬ群アポトーシス−調節性ポリペ プチドは、ＣＤＮ−１およびＣＤＮ−２（ＷＯ９５／１５０８４）、ＭＣＬ−１ （ヤングら、「ジャーナル・オブ・セルラー・フィジオロジー」１６６［１９９ ６］５２３−５３６）、特にそのアミノ酸残基６−２５、２０９−２２３、２５ ２−２７２および３０４−３１９の１個またはそれ以上を含むポリペプチド、お よびＢＡＧ−１（またはＢＣＬ−２または他のＢＣＬ群構成員とのそのホモ−ま たはヘテロニ量体）（タカヤマら、「セル」８０［１９９５］２７９−２８４） を含み得る。 これらの抗アポトーシス性ポリペプチドは、ＢＣＬ群の別の抗アポトーシス性 ポリペプチドとのホモ二量体またはヘテロ二量体形態でインビボで存在し得る。 上記抗アポトーシス性ポリペプチドはまた、ＢＣＬ群 の拮抗体ポリペプチド、例えばＢＣＬ−Ｘ_s（ＢＣＬ−Ｘの別の方法でスプライ スした短鎖形態）、ＢＡＸおよびＢＡＤとのヘテロ二量体の組み合わせから見い だされ得る。 この発明はまた、炎症性または他の活性化刺激因子に対する細胞の機能不全ま たは活性化応答の処置方法であって、上記細胞に対し、適当なプロモーターを機 能し得るように組み合わせて抗アポトーシス性タンパク質をコードするＤＮＡを そこに挿入することにより修飾を加え、上記細胞におけるＮＦ−κＢ活性化が実 質的に阻害される有効レベルで上記抗アポトーシス性タンパク質を発現させるこ とを含む方法を包含する。 特定の態様において、この発明は、炎症性または他の活性化刺激因子に対する 細胞の機能不全または活性化応答の処置方法であって、上記細胞に対し、適当な プロモーターを機能し得るように組み合わせてＡ２０タンパク質の抗アポトーシ ス活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡをそこに挿入することにより修 飾を加え、上記細胞における活性化が実質的に阻害される有効レベルでポリペプ チドを発現させることを含む方法を包含する。 さらにこの発明は、炎症または免疫学的刺激因子に対する感受性がある哺乳類 対象における細胞活性化を阻害する方法であって、ＮＦ−κＢを阻害し得る抗ア ポトーシス性タンパク質をコードするＤＮＡの挿入により対象の内皮細胞に遺伝 子修飾を加え、そのタンパク質を発現させることにより、ＮＦ−κＢが細胞活性 化刺激因子の存在下でも細胞において実質的に阻害されることを含む方法を包含 する。 別の態様において、この発明は、炎症性または他の刺激因子に対する細胞の活 性化応答の処置方法であって、その細胞に対し、ＢＣＬタンパク質（例えばＢＣ Ｌ−２およびＢＣＬ−Ｘ_Lタンパク質）の抗アポトーシス活性を有するボリペプ チド、上記ポリペプチドのホモ二量体、またはＢＣＬ群の別の抗アポトーシス性 タンパク質との上記ポリペプチドのヘテロ二量体をコードするＤＮＡをそこに挿 入することにより修飾を加え、上記細胞における活性化が実質的に阻害される有 効レベルでポリペプチドまたは二量体を発現させることを含む方法を包含する。 この発明はまた、上記要領で修飾された細胞、および上記細胞を含む対応する 組織または器官を包含する。 挿入されたＤＮＡのタンパク質コード化領域および／またはプロモーター領域 は、細胞にとって異種、すなわち非天然のものであり得る。別法として、プロモ ーターが細胞において抗アポトーシス性（例、Ａ２０）発現を通常制御するプロ モーター以外の場合、タンパク質コード化領域およびプロモーター領域の一方ま たは両方は細胞にとって天然であり得る。タンパク質暗号化配列は、適当なシグ ナル配列、例えば核特異シグナル配列の制御下にあり得る。 好ましくはタンパク質コード化領域は、構成的または調節可能なプロモーター の制御下にある。「構成的」とは、細胞の生存期間中における実質的に連続した 遺伝子の転写およびタンパク質の発現を意味する。「調節可能な」とは、遺伝子 の転写およびタンパク質の発現が所定の物質の存在または非存在と関係があるこ とを意味する。「調節可能な」発現の一具体例は、「誘導可能な」発現、すなわ ちそれにより転写（すなわちタンパク質発現）が刺激因子に反応し要求に応じて 行われる場合を含む。刺激因子は、内皮細胞活性化刺激因子または予め定められ た外部刺激因子を含み得る。内皮細胞活性化刺激因子は、凝固を刺激する供与組 織または器官の内皮において変化を生じさせる刺激因子であればそのいずれでも あり得る。予め定められた外部刺激因子は、薬物、サイトカインまたは他の薬剤 であり得る。 移植目的用の誘導可能なプロモーターを用いる利点は、（例、Ａ２０）活性タ ンパク質の所望の高レベル発現が、予め定められた刺激因子、例えば細胞環境に おけるテトラサイクリンの存在に応答し要求に応じて得られることである。この 発明での使用に適したテトラサイクリン誘導性プロモーターの一例は、Ｐ.Ａ.フ ァースら、ＰＮＡＳ９１［１９９４］９３０２−９３０６に開示されている。別 法として、転写がテトラサイクリンの投与中止により開始される調節可能なプロ モーター系の一例は、Ｍ.ゴッセンおよびＨ.ブジャード、ＰＮＡＳ８９［１９９ ２］５５４７−５５５１に記載されている。 好ましくは、（例、Ａ２０）活性タンパク質の発現は、予め定められた外部刺 激因子に応じて誘導され、刺激因子の適用は細胞を活性化刺激因子に曝す直前か ら始められるため、発現は既にＮＦ−κＢ活性化の遮断に有効なレベルとなって いる。例えば、供与哺乳類（例、ブタ）の細胞は、薬剤、例えばテトラサイクリ ンにより誘導され得るプロモーターの制御下抗アポトーシス性遺伝子（例、ブタ またはヒト）の挿入により本発明に従い遺伝子修飾され得る。動物は、体細胞組 換え動物であろうと形質転換動物であろうと、テトラサイクリン不含有条件下で 所望の成熟レベルまで高められ得、その時点で上記細胞または上記細胞を含む組 織または器官は移植目的用として外科的に除去される。その場合、器官の外科的 摘出前に、ドナー動物にテトラサイクリンを投与することにより、高レベルの抗 アポトーシス性（例、Ａ２０）タンパク質発現が誘導され始め得る。次いで、器 官はレシピエント（例、ヒト）に移植され得、テトラサイクリンは、ＮＦ−κＢ 活性化を阻害するため移植細胞において所望レベルにタンパク質を維持するのに 十分な時間レシピエントに投与続行され得る。別法として、ドナーから外科的に 摘出された後、レシピエントへの移植が適当となる時点まで器官はテトラサイク リン含有培地中エクスビボで維持され得る。 別の態様では、発現は、細胞環境からテトラサイクリンを控えた結果、行われ 得る。すなわち、ドナー動物の細胞は、テトラサイクリンにより遮断され、テト ラサイクリンの非存在下で誘導されるプロモーターの制御下抗アポトーシス性（ 例、Ａ２０）タンパク質をコードする遺伝子の挿入により本発明に従い遺伝子修 飾され得る。その場合、動物は、テトラサイクリンを投与されながらも所望の成 熟レベルまで高められ得、その時点で動物の細胞、組織または器官は採取される 。外科的摘出前、ドナー動物からテトラサイクリンを除くことにより、タンパク 質の発現が誘導され始め得、その後細胞、組織または器官が移植される患者はま た、適当な発現レベルを維持するのに十分な時間テトラサイクリン不含有状態に 維持され得る。 好ましくは、挿入されたＤＮＡ配列は、細胞のゲノムへ組み込まれる。 別法として、挿入された配列は、染色体外的に安定してまたは限られた期間細胞 中で維持され得る。 この発明による内皮または他の哺乳類細胞の修飾は、インビボまたはエクスビ ボで行われ得る。 すなわちこの発明はまた、治療を必要とする患者におけるインビボでの炎症性 または他の活性化刺激因子に対する内皮細胞の機能不全または活性化応答の阻害 方法であって、患者の上記細胞に対し、構成的または誘導可能なプロモーターを 機能し得るように組み合わせて抗アポトーシス性タンパク質をコードするＤＮＡ を細胞に挿入することにより修飾を加え、ＮＦ−κＢ活性化が実質的に阻害され る有効レベルでタンパク質を発現させることを含む方法を包含する。例えば、器 官（例、腎臓）の血管を患者の血液循環系から一時的にクランプで止め、抗アポ トーシス性（例、Ａ２０）遺伝子を含む伝達性ベクター構築物を含む溶液を用い て、器官の少なくともある程度の細胞がベクター構築物の挿入により遺伝子修飾 されるのに十分な時間血管を潅流することができ、クランプを除去すると、器官 への血流は回復され、その正常な機能が再開され得る。 別の態様において、細胞集団は、患者またはドナー動物から摘出され、ベクタ ーＤＮＡの挿入によりエクスビボで遺伝子修飾され、次いで患者へ再移植または 別のレシピエントへ移植され得る。例えば、器官は患者またはドナーから摘出さ れ、エクスビボで上記再潅流処置にかけられ、その器官は患者に再移植または同 一もしくは異なる種に属する異なるレシピエントへ移植され得る。 遺伝子送達について、レトロウイルスベクター、および特にレトロウイルス複 製に要求されるｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ配列の１つまたはそれ以上を欠く複 製欠失レトロウイルスベクターは、当業界ではよく知られており、内皮または他 の哺乳類細胞の形質転換に使用され得る。ヘルパー不含有ウイルスベクターを生 産するＰＡ３１７または他の生産セルラインについては、文献に詳記されている （Ａ.Ｄ.ミラーおよびＣ.ブッティモア、Mol..Cell.Biology６［１９８６］２８ ９５−２９０２）。代表的なレトロウイルス構築物は、治療物質のヌクレオチド 配列の上流 に少なくとも１個のウイルス性長末端繰り返し体およびプロモーター配列および ヌクレオチド配列の下流に少なくとも１個のウイルス性長末端繰り返し体および ポリアデニル化シグナルを含む。 アデノウイルス、すなわち霊長類において上部呼吸器系疾患を誘発し、潜伏期 感染にも存在するウイルスに由来するベクターについても当業界では公知である 。アデノウイルスが低周囲温度で細胞に付着する能力は、組織または器官の低温 保存中における遺伝子移動を容易にし得るという移植環境では有利な点である。 上記要領の形質導入潅流手段による脈管または器官中へのアデノウイルス伝達性 遺伝子移動は、インビボまたはエクスビボで細胞を遺伝子修飾する手段でもある 。 標的遺伝子送達の別の手段は、ＤＮＡ−タンパク質複合体、リポソームなどを 含む。 さらに別の態様において、この発明は、細胞が活性化を被りやすい哺乳類レシ ピエントへの移植時、供与細胞、または上記細胞を含む組織または器官の活性化 応答を抑制する方法であって、 （ａ）供与細胞に対し、抗アポトーシス性タンパク質をコードするＤＮＡをそこ に導入することにより修飾を加え、そして （ｂ）修飾された供与細胞、または上記細胞を含む組織または器官をレシピエン トへ移植し、タンパク質を発現させることにより、細胞のＮＦ−κＢ活性化が実 質的に阻害される ことを含む方法を包含する。 ドナーの種は、レシピエントの種と同一または異なり、レシピエント種への移 植に適当な細胞、組織または器官を提供し得るものであればいずれの哺乳類でも あり得る。 ドナーは、レシピエントの種に対して同種または異種である種に属し得る。レ シピエントは哺乳類、例えば霊長類であり、好ましくはヒトである。ヒトレシピ エントの場合、ヒト（すなわち同種異系）およびブタ（すなわち異種）ドナーは 適当であるが、他のいずれかの哺乳類種（例、ウシまたはヒト以外の霊長類）で もドナーとして適当であると考えられる。 例えば、ブタ大動脈内皮細胞（ＰＡＥＣ）またはその先祖細胞は、ヒトレシピ エントへの移植を目的として、有効レベルでブタまたはヒト抗アポトーシス性、 例えばＡ２０タンパク質を発現すべく遺伝子修飾され得る。Ａ２０または他の抗 アポトーシス性タンパク質をコード化する異種ＤＮＡは、単細胞または初期桑実 胚段階で動物または動物の祖先へ挿入され得る。この方法は２〜８細胞段階間で 行われ得るが、好ましい段階は単細胞段階である。その要領でヒト以外のトラン スジェニック動物が得られ、異種ＤＮＡは子孫へ伝えられる。別の態様において 、遺伝子は、供与動物の体細胞／ボディー細胞へ挿入され、体細胞組換え動物が もたらされるが、そこからＤＮＡ構築物は子孫へ伝えられ得ない（例えばミラー 、Ａ.Ｄ.およびロスマン、Ｇ.Ｊ.、「バイオテクニクス」７［１９８９］９８０ −９９０参照）。 外来細胞またはＤＮＡを動物組織へ挿入する適当な公知方法には、微量注入、 胚幹細胞操作、エレクトロポレーション、細胞ガン、形質導入、トランスフェク ション、レトロウイルス感染、アデノウイルスなどがある。一態様では、遺伝子 は特定の座、例えばトロンボモデュリン（thrombomodulin）座に挿入される。そ れに続いて、構築物は胚幹細胞へ導入され、導入された子孫は、すなわち血管内 皮におけるトロンボモデュリンの発現と平行して、組織特異的に構築物を発現す る。 トランスジェニックブタの製造方法は、例えばピンカートら、「キセノ」２、 ナンバー１［１９９４］１０−１５に開示されている。 遺伝子修飾内皮細胞は、限定条件下静脈内または動脈内注射により投与され得 る。それから成る組織または器官はまた、熟知された外科的方法によりドナーか ら摘出され、レシピエントへ移植され得る。移植に先立ち、処置された内皮細胞 、組織または器官は、構築物を含み発現する遺伝子修飾細胞についてスクリーニ ングされ得る。この目的の場合、ベクター構築物にはまた、選択可能なマーカー 物質に耐性を付与する発現産物をコード化する第２のヌクレオチド配列が組み込 まれ得る。スクリーニングに適した選択マーカーには、ｎｅｏ遺伝子があり、ネ オマイシンまたはネオマイシン類似体、Ｇ４１８に対する耐性を与える。 いずれの哺乳類細胞、例えば単核球、ＮＫ細胞、リンパ球または島細胞でも、 抗アポトーシス性遺伝子挿入用の標的とされ得るが、操作に好ましい細胞は内皮 細胞である。レシピエント種は第一にヒトであるが、他の哺乳類、例えばヒト以 外の霊長類も適当なレシピエントであり得る。 この発明の別の態様においては、医薬的に許容し得る担体中で抗アポトーシス 性ポリペプチドは、インビボで細胞、組織または器官へ直接適用され得る。 補体伝達事象はまた異種間移植の超急性拒絶に関与するため、上記の修飾され た供与細胞および組織および器官は、上記移植の拒絶阻止において補充的機能を 有することは明かである（Ａ.Ｐ.ダルマッソら、「トランスプランテーション」 ５２［１９９１］５３０−５３３）。従って、供与器官の細胞の遺伝物質も、レ シピエントにおける補体経路の活性化が阻止されるように、典型的に改変される 。これは、レシピエント種の補体阻害因子を発現するトランスジェニック動物を 提供することにより行われ得る。上記動物から得られた供与器官の内皮細胞は、 遺伝子治療技術により修飾され、その結果上記内皮細胞が提供され得る。別法と して、抗アポトーシス（例、Ａ２０）活性を有するタンパク質をコード化するＤ ＮＡを含むベクターは、単細胞または初期桑実胚段階でトランスジェニック動物 へ導入され得る。こうして、得られたトランスジェニック動物は、補体阻害因子 を発現し、上記内皮細胞を有する。 すなわちさらに別の態様で、この発明はまた、１種またはそれ以上のヒト補体 阻害因子を発現する上記の内皮細胞、組織、供与器官およびヒト以外のトランス ジェニックまたは体細胞組換え動物を提供する。 下記実施例は、本発明を単に説明するためであって、限定を意図したものでは ない。培養したＢＡＥＣを、ＥＣ活性化時アップレギュレーションされることが 知られている遺伝子、すなわちＥ−セレクチン、ＩκＢα、ＩＬ−８および組織 因子のプロモーターから成るリポーター構築物によりトランスフェクションする 。 実施例 材料および方法： 次のベクターを実施例では使用する。 「ｐＡＣ」：ＣＭＶプロモーター、ｐＵＣ１９ポリリンカー部位およびＳＶ４ ０スプライス／ポリＡ部位を含む８.８ｋＢプラスミドベクター（Ｊ．ハーズお よびＲ.Ｄ.ジェラード、ＰＮＡＳ９０［１９９３］２８１２−２８１６）。 Ａ２０発現プラスミド（図における「Ａ２０」）：ＸＢａＩ制限部位でｐＡＣ 発現ベクターへサブクローン化された、ヒトＡ２０ ｃＤＮＡ（オピパリら［１ ９９０］、前掲）（配列番号２）。 Ｂｃｌ−２およびＢｃｌ−ｘ_L発現プラスミド：ネズミｂｃｌ−２およびｂｃ ｌ−ｘ_L遺伝子（Ｗ．ファングら、「ジャーナル・オブ・イムノロジー」１５５ ［１９９５］６６−７５）。８３０ｂｐ完全長ｂｃｌ−２ｃＤＮＡにフラッグ標 識し、ＰＡＷｎｅｏ−３発現ベクターでＣｌａＩ／ＸｂａＩ発現ベクターへクロ ーン化した。７００ｂｐ完全長Ｂｃｌ−ｘ_LｃＤＮＡについてもフラッグ標識し 、ＰＡＷｎｅｏ−３発現ベクター（ＰＡＷ ｎｅｏ−３は、アンピシリンおよび ネオマイシン耐性部位およびポリリンカークローニング部位前にＳＦＦＶ−ＬＴ Ｒプロモーターを含む７ｋｂ発現プラスミドである）（ＳＦＦＶ＝脾臓フォーカ ス形成ウイルス）のＣｌａＩ／ＢａｍＨＩ部位へクローン化した。 ブタＥ−セレクチンリポーター：ｍｍＴＶプロモーター（クローンテク、パロ ・アルト、カリフォルニア）を置き換えることによりｐＭＡＭｎｅｏ−ｌｕｃプ ラスミドベクターへクローン化されたブタＥ−セレクチンプロモーターのｂｐ− １２８６〜＋４８４（これは、第１の完全イントロンおよびエキソン、並びにＡ ＴＧ部位までの第２エキソンの始まりを含む）。 ブタＮＦ−κＢリポーター：ｐＴ３／Ｔ７−ｌｕｃベクター（クローンテク） において完全長ルシフェラーゼ遺伝子を推進するＴＫ最小プロモーターの上流に 挿入されたブタＥ−セレクチンプロモーターから誘導されたＮＦ−κＢ結合部位 の４コピー。 ベクターのバックボーンは、Bluescript ＫＳ＋プラスミド（ストラタジーン 、ラ・ジョラ、カリフォルニア、アメリカ合衆国）である。 ヒトＩＬ−８リポーター：ｐ−ＵＢＴｌｕｃへクローン化されたヒトＩＬ−８ （ｈＩＬ−８）プロモーター。 ブタＴＦリポーター：Ｔ．モールら、「ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ ケミストリー」２７０［１９９５］３８４９−３８５７の方法に従い、ｐ−ＵＢ Ｔ ｌｕｃ、ルシフェラーゼリポーター遺伝子ベクター（Ｒ．ド・マーチンら、 「ジーン」１２４［１９９３］１３７−１３８）へクローン化されたブタＴＦプ ロモーターの−４０００〜＋３４フラグメント。 ブタＩκＢα（「ＥＣＩ−６」とも称される）リポーター：Ｒ．ド・マーチン らにより、ＥＭＢＯジャーナル、１２［１９９３］２７７３−２７７９に報告さ れた、追加的ＨｉｎｄIII部位の作製により、ｐ−ＵＢＴ−ｌｕｃへライゲーシ ョンされたブタＥＣＩ−６／ＩκＢαプロモーターの６００ｂｐフラグメント。 ＨＩＶ−ＣＡＴリポーター：Ｋ．ツィマーマンら、「ヴァイロロジー」１８２ ［１９９１］８７４−８７８の記載に従い製造された、ＣＡＴ遺伝子（ＣＡＴ３ Ｎポリリンカー）の上流にクローン化された、ＨＩＶ−ｗｔＬＴＲの−１１７ｂ ｐ〜ＴＡＴＡボックス開始点。 ＲＳＶβ−ｇａｌリポーター：Ｎｏｔ１部位でｐＲｃ／ＲＳＶベクター（イン ビトロゲン、サンディエゴ、カリフォルニア、アメリカ合衆国）へ挿入されたエ シェリヒア・コリβ−ｇａｌ遺伝子。 ＲＳＶ−ＬＵＣリポーター：ｐＲｃ／ＲＳＶベクターへクローン化された完全 長ルシフェラーゼ遺伝子。 検定法： 細胞抽出物をルシフェラーゼ（またはＣＡＴ）およびガラクトシダーゼレベル について検定した。 ａ）ルシフェラーゼレベル（Ｅ−セレクチン、ＮＦ−κＢ、ＩＬ−８、ＴＦお よびＩκＢα［ＥＣＩ−６］プロモーター）： ２４ミリモルのグリシルグリシン（ｐＨ７.８）、２ミリモルのＡＴＰ（ｐＨ ７.５）および１０ミリモルのＭｇＳＯ₄を含む溶液９０μｌに、１０μｌの細胞 抽出物を加える。２４ミリモルのグリシルグリシンおよ び０.１ミリモルのルシフェリンから成る注射用混合物（ベーリンガー、マンハ イム、ドイツ国）を用いて、ミクロルマットＬＢ ９６Ｐルミノメーター（ＥＧ ＋Ｇバートホールド）で試料を読み取る。次式：（ルシフェラーゼ活性／β−ｇ ａｌ活性）×１０００を用いてルシフェラーゼ活性をβ−ガラクトシダーゼにつ いて正規化する。またルシフェラーゼ活性をタンパク質濃度で割ることにより、 ルシフェラーゼ活性をタンパク質について補正する。正規化されたルシフェラー ゼ活性は、相対光単位（ＲＬＵ）で与えられている。 ＣＡＴレベル（ＨＩＶＬＴＲ活性）： プロメガ製キット（プロメガ、マディソン、ウィスコンシン、アメリカ合衆国 ）を用いて、¹⁴Ｃ−標識クロラムフェニコールおよびｎ−ブチリル補酵素Ａ含有 培地で細胞をインキュベーションする（ＣＡＴタンパク質は補酵素のｎ−ブチリ ル部分をクロラムフェニコールへ移動させる）。細胞をキシレンへ抽出し、これ をシンチレーション液と混合し、シンチレーション計数管（１９００ＴＲ、パッ カード、ダウネス・グローブ、イリノイ、アメリカ合衆国）で計数する。次式： （ｃｐｍ／β−ｇａｌ活性）×１０００を用いて、１分当たりの数（ＣＰＭ）を β−ガラクトシダーゼについて正規化する。有意性をスチューデントのｔ−試験 により測定する。 ｃ）β−ガラクトシダーゼレベル： ＲＳＶβ−ｇａｌリポーターは、トランスフェクション効率に関する対照とし て用いられる。トロピックス、インコーポレイテッド．ガラクトーライトプロト コール（トロピックス、インコーポレイテッド、ベッドフォード、マサチューセ ッツ、アメリカ合衆国）を用いて、β−ガラクトシダーゼレベルを測定する。 実施例１ トランスフェクションされたＢＡＥＣはヒトＡ２０タンパク質を発現。 ウシ大動脈内皮細胞（ＢＡＥＣ）を摘出し、Ｌ−グルタミン（２ミリモル）、 ペニシリンＧ（１００単位／ｍｌ）、および胎児ウシ血清（ＦＣＳ）（１０％） を補ったダルベッコの修飾イーグル培地中１０ｃｍプ レートで培養する。細胞を５％ＣＯ₂雰囲気で加湿インキュベーター中３７℃で 維持する。細胞が全面生長の７０％に達したとき、１群（すなわち約１×１０⁶ 細胞）を０.５μｇのＡ２０ベクター（「Ａ２０」）でトランスフェクションし 、第２群を０．５μｇのｐＡＣベクター（「ＰＡＣ」）でトランスフェクション し、第３群を非トランスフェクション（「ＮＴ」）対照として維持する。トラン スフェクションは全て、１６μｇのリポフェクタミンにより行う。非トランスフ ェクション、非刺激ＨＵＶＥＣ（「ＮＳ」）または非トランスフェクション、Ｔ ＮＦα−刺激ＨＵＶＥＣ（「ＴＮＦ」）についても対照として用いる。 細胞をシステインおよびメチオニン不含有培地（ＩＣＮ、ライル、イリノイ、 アメリカ合衆国）で２回洗浄し、次いで１００μＣｉ／ｍｌのトラン³⁵Ｓ標識シ ステインおよびメチオニンを補った同培地（ＩＣＮ）中に置く。４時間後、細胞 を採取する。図１に示されている、ポリアクリルアミドＳＤＳゲルでのポリクロ ーナルウサギ抗ヒトＡ２０ポリクローナル血清による免疫沈降は、「ＰＡＣ」、 「ＮＴ」または「ＮＳ」抽出物ではなく、「Ａ２０」抽出物において³⁵Ｓ−標識 ８０ｋＤのＡ２０タンパク質の存在を示している。このタンパク質は、ＴＮＦ− 刺激ＨＵＶＥＣ抽出物（「ＴＮＦ」）で見られるものと同等である。 実施例２−４：一般的方法 約３×１０⁵ＢＡＥＣを、実施例１記載の条件下同様に補った２ｍｌのＤＭＥ Ｍ中６−ウェルプレートの１ウェルに対し入れる。細胞が全面生長の５０％−７ ０％に達すると、全部で１.６μｇのＤＮＡ（試験プラスミド、リポーター構築 物およびβ−ｇａｌリポーターを含む）および８μｇのリポフェクタミンを用い て、各ウェル中の細胞をトランスフェクションする。細胞を５時間インキュベー ションした後、ＦＣＳを細胞に加えて最終濃度を１０％にする。４８時間インキ ュベーション後、同様の３つのウェルに１００Ｕ／ｍｌのＴＮＦαまたは１００ ｎｇ／ｍｌのリポ多糖（ＬＰＳ）（シグマのエシェリヒア・コリ０Ｂ５５）を加 えることにより、細胞を刺激する。非刺激細胞を対照（「ＮＳ」または「対照」 ）として用いる。刺激の７時間後、細胞を採取する（下記実施例に おいて、体積または重量は全て１ウェル当たりに基づくものである；「細胞集団 」または「細胞群」という表現は、単一ウェルプレートの細胞集団を指し、すな わち約５×１０⁵細胞であると見積もられる；棒グラフにおいて、棒は３反復値 の平均を表す；標準誤差は括弧で示されている）。 実施例２ Ｅ−セレクチンリポーター（ＢＡＥＣにおけるＡ２０発現は、用量依存的にＥ −セレクチン誘導を阻害する） ＢＡＥＣ（ウシ大動脈内皮細胞）を、Ａ２０発現プラスミドまたはｐＡＣ対照 プラスミドまたはその両方と一緒に、０.７μｇのブタＥ−セレクチンリポータ ー構築物により同時トランスフェクションする。図２の頭部分はＡ２０プラスミ ドの量を示し、次の通りである： レーン１、５、９：０μｇのＡ２０； レーン２、６、１０：０.１２５μｇのＡ２０； レーン３、７、１１：０.５μｇのＡ２０； レーン４、８、１２：０.７μｇのＡ２０。 ｐＡＣをＡ２０プラスミドで滴定し、必要ならばＡ２０およびｐＡＣベクター の全濃度を１ウェル当たり０.７μｇにする。 図２は、各細胞群のルシフェラーゼ検定結果を表す棒グラフである。Ｅ−セレ クチンプロモーターの制御下におけるルシフェラーゼ遺伝子の誘導は、検定で検 出された相対光単位（ＲＬＵ）での量に補正され得る。図２は、ＴＮＦまたはＬ ＰＳによる細胞の刺激の結果、Ｅ−セレクチンリポーターの活性が未処置対照（ レーン１）またはｐＡＣ対照のみと同時トランスフェクションされた刺激細胞（ レーン５および９）ではかなり増加し、Ｅ−セレクチン活性の８および１４倍増 加が見られることを示している。Ａ２０構築物でトランスフェクションされた刺 激細胞は、Ｅ−セレクチンリポーター誘導の顕著な阻害を示す（レーン５対８、 ９対１２）。 また、Ａ２０発現が、用量依存的にＥ−セレクチン誘導を阻害することも明か である。０.１２５μｇのＡ２０を使用すると、阻害率は、ＴＮ Ｆ−刺激細胞では５３％およびＬＰＳ−刺激細胞では７８％に達する（レーン５ 対６、９対１０）。エンプティーベクターでトランスフェクションした非刺激Ｂ ＡＥＣで検出される基底レベルと比べて、使用されるＡ２０の量が０.５μｇお よびそれより高いとき、実質的に完全な阻害が達成される（レーン１対レーン７ 、８、１１および１２）。さらに、Ａ２０発現により、０.５μｇおよびそれよ り高量で使用されるとＥ−セレクチンリポーターの基底非刺激活性が２倍減少す る。 ０.５〜０.７μｇのＡ２０ベクターでトランスフェクションすることにより最 大阻害が達成されるため、実施例３、４および５で細胞群をトランスフェクショ ンするのに使用されるＡ２０プラスミドの濃度は、０．５μｇが選ばれる。 実施例３ ＩＬ−８、ＩκＢα（ＥＣＩ−６）およびＴＦリポーター構築物 ＢＡＥＣに対し、上記一般的方法に従い０.５μｇのＡ２０発現プラスミドま たはｐＡＣ対照プラスミド、および０.７μｇの上記リポーター構築物の１つに より同時トランスフェクションし、ＥＣ活性化中アップレギュレーションする。 図３Ａ−３Ｃは、各リポータートランスフェクションに関するルシフェラーゼ検 定結果を表す棒グラフである（図３Ａ−３Ｃ、並びに図４および図５Ａにおいて 、Ａ２０またはｐＡＣの存在（「＋」）または非存在（「−」）はヘッダーに示 されている）： ａ）ＩＬ−８リポーター：ＩＬ−８リポーターをエンプティーｐＡＣベクター と同時トランスフェクションすると、ルシフェラーゼ活性は、ＴＮＦαおよびＬ ＰＳで刺激後それぞれ２.５および２.７倍増加する（図３Ａ、レーン１対３およ び５）。しかしながら、ＩＬ−８リポーターをＡ２０発現プラスミドと同時トラ ンスフェクションすると、ＴＮＦαまたはＬＰＳ刺激後のルシフェラーゼレベル は、非刺激ｐＡＣ−トランスフェクション細胞の場合よりも下位まで低減化する （非刺激細胞のルシフェラーゼ活性の６０％未満、レーン１対４および６）。さ らに、Ａ２０過剰発現により、ＩＬ−８リポーターの基底ルシフェラーゼ活性は ３倍減少する（図３Ａ、レーン１対２）。 ｂ） ＩκＢαリポーター：ブタＩκＢα（ＥＣＩ−６）リポーター構築物を 用いて行われた同時トランスフェクションの結果は、ＩＬ−８の場合と類似して いる。ＴＮＦαおよびＬＰＳによる誘導は、それぞれ１.６および３.６倍に達す る。Ａ２０をＩκＢαリポーターにより同時トランスフェクションすると、阻害 は事実上完了する。ＴＮＦα−またはＬＰＳ−誘導ルシフェラーゼ活性もまた、 エンプティーベクターで示された基底レベルよりも低い（図３Ｂ、レーン１対レ ーン４および６）。Ａ２０による同時トランスフェクションにより、ＥＣＩ−６ ルシフェラーゼ活性の基底レベルは５倍減少することが見いだされた（図３Ｂ、 レーン１対２）。 ｃ）組織因子リポーター：同等の方法で、Ａ２０発現は、ＴＮＦαおよびＬＰ Ｓ刺激後にそれぞれＴＦリポーター活性の３.５および４.５倍誘導を阻害する（ 図３Ｃ、レーン３、４、５、６）。しかしながら、Ａ２０共発現による基底ＴＦ リボーター活性の減少は観察されない（図３Ｃ、レーン１対２）。 実施例４ ＮＦ−κＢリポーター ＢＡＥＣに対し、一般的方法に従い０.５μｇのＡ２０発現プラスミドまたは ｐＡＣ対照プラスミドおよび０.７μｇのＮＦ−κＢリポーター構築物により同 時トランスフェクションし、それらの結果は図４を含む棒グラフに示されている 。結果は、Ａ２０発現が、ＴＮＦαおよびＬＰＳに応答したリポーター活性のそ れぞれ１２および２８倍誘導を廃することを立証している（図４、レーン３対４ 、５対６）。Ａ２０およびｐＡＣトランスフェクション細胞間におけるルシフェ ラーゼ活性の基底レベル間に見かけ上顕著な差異は存在しない（図４、レーン１ 対２）。 上記で列挙したリポーターは全て、ＮＦ−κＢに高く依存していることが知ら れている。ＬＰＳまたはＴＮＦαによるこれらのリポーターの活性化は、Ａ２０ の発現により阻害されることが見いだされ、ＥＣ活性化に対するＡ２０の阻害効 果は少なくとも部分的にそして恐らくは全体的にＮＦ−κＢの阻害に関連してい ることを示す。 実施例５ ＲＳＶ−ＬＵＣおよびＨＩＶ−ＣＡＴリポーター 転写装置においてＡ２０の非特異性または毒性作用を試験するため、ＮＦ−κ Ｂとは非依存的である、構成的非誘導性リポータ−ＲＳＶ−ＬＵＣにより細胞を 一般的方法に従いトランスフェクションする。ＮＦ−κＢ結合ではなくＳｐ１と 通じてウイルス性ｃ−Ｔａｔタンパク質により誘導される、ＨＩＣ−ＣＡＴリポ ーターについても試験する（ツィマーマンら［１９９１］、前掲）。０.５μｇ のＡ２０またはｐＡＣ（ＲＳＶ−ＬＵＣリポーター）（図５Ａのヘッダーに示さ れている）により細胞をトランスフェクションするか、またはＡ２０をｐＡＣと 滴定して、総量０.５μｇにする（ＨＩＶ−ＣＡＴリポーター）（図５Ｂのヘッ ダーに示されている）。ＲＳＶ−ＬＵＣリポーターの場合、細胞群は、非刺激（ 「対照」）またはＴＮＦ−またはＬＰＳ−刺激されている。ＨＩＶ−ＣＡＴリポ ーターの場合、細胞は非刺激（「対照」）または０.２μｇのｃ−Ｔａｔタンパ ク質により刺激される。ＲＳＶ−ＬＵＣリポーターの基底ルシフェラーゼ活性は 、Ａ２０およびｐＡＣトランスフェクションＢＡＥＣで見られる場合と同等であ ることが見いだされた。 図５Ａ−５Ｂは、ルシフェラーゼ検定の結果を表す棒グラフである。ｐＡＣ− またはＡ２０−発現性細胞においてＴＮＦまたはＬＰＳで刺激した場合、顕著な 誘導は達成されないことは明らかであり、ルシフェラーゼ値は２群間では同等な ままである（図５Ａ）。ＨＩＶ−ＣＡＴに関して、得られた結果は、Ａ２０発現 が、ｃ−Ｔａｔによる刺激時に観察されたリポーターの基底レベルにも１０〜１ ５倍誘導にも影響しないことを示している（図５Ｂ、レーン１対レーン２、３、 ４およびレーン１対レーン６、７、８）。 上記は、Ａ２０の発現により、内皮細胞活性化に伴う遺伝子誘導が阻害される ことを立証している。ＴＮＦまたはＬＰＳを用いてＥＣを刺激すると、リポータ ー阻害が見られ、遺伝子誘導に対するＡ２０の広い阻害効果を示している。ＬＰ Ｓ−およびＴＮＦ−誘導シグナル発生に対する類似効果はまた、ＴＮＦ応答自体 とＡ２０の作用の特異的な組み合わ せを一切排除する。Ｅ−セレクチン、ＩＬ−８およびＩκＢαリポーターの基底 発現はまた、Ａ２０発現細胞において顕著に減少する。阻害は用量依存的である ことが見いだされた。 Ａ２０の発現は、ＲＳＶ−ＬＵＣリポーターの構成的活性またはＨＩＶ−ＣＡ Ｔリポーターのｃ−Ｔａｔ刺激に対して明白な影響は及ぼさず、同様にＳｐ１に 対するＡ２０の効果の欠如を立証しており、ＮＦ−κＢ活性化の遮断におけるＡ ２０の特異性を説明している。 従って、アポトーシスから細胞を保護する能力に加えて、Ａ２０の発現はＮＦ −κＢ活性化を阻害し、それによって遺伝子誘導を阻害する。この機能故に、Ａ ２０は、誘導に関してＮＦ−κＢに依存的であるが、それに続いてＮＦ−κＢ、 すなわち内皮細胞活性化を阻害する遺伝子の範疇に位置する。上記遺伝子は、お そらく負の調節ループで機能して、内皮細胞活性化の範囲および持続時間を調節 すると思われる。 それと結び付けるわけではないが、Ａ２０が抗酸化剤として機能する別の機構 が存在することが提案されている。完全長ヒトＡ２０ｃＤＮＡが、７Ｃｙｓ２／ Ｃｙｓ２繰り返し体をコード化することから、潜在的に高いｚｎ結合能力をもつ ｚｎフィンガータンパク質としての特性を示す（オピパリら［１９９０］、前掲 ）。Ｚｎは、酸化からのスルフヒドリル基の保護および遷移金属、主に鉄および 銅による反応性酸素の生成の阻害という２つの機構により抗酸化剤として作用し 得る。抗酸化剤、例えばＰＤＴＣは、ＮＦ−κＢの阻害により、ＥＣ活性化に伴 う遺伝子誘導を阻止し得（Ｅ.Ｂ.クニンガム、「バイオケミカル・アンド・バイ オフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ」２１５［１９９５］２１２− ２１８）、同様にＴＮＦ−伝達アポトーシスを阻害する（Ｔ.Ｍ．ブッツケおよ びＰ.Ａ.サンドストロム、「イムノロジー・トュデー」１５［１９９４］７−１ ０）という証拠が存在する。これらの発見は、ＴＮＦレセプターを介するシグナ ル発生の結果、酸化損傷によるアポトーシスを誘発する細胞内反応性酸素中間体 のレベルが急速に上昇するという事実と相関する（ブッツケおよびサンドストロ ム［１９９４］、前掲）。 実施例６ ブタ大動脈内皮細胞へのＡ２０のアデノウイルス伝達移動 組換えＡ２０アデノウイルス（ｒＡｄ.Ａ２０）は、ヒトＡ２０ ｃＤＮＡを 含む転移ベクター、ｐＡＣ.ＣＭＶ.ＮＬＳ-Ａ２０、およびｐＪＭ１７、アデノ ウイルス５ゲノムのプラスミド担持形態間の相同的組換えにより構築される。相 同的組換えは、２９３細胞で行われる。９６ウェルプレートでの限界希釈クロー ニングによりクローナルウイルスを得、Ａ２０ｍＲＮＡの存在に関するノーザン ブロッティングにより分析する。陽性組換えＡ２０アデノウイルスの同定後、２ ９３細胞で増幅が行われる。塩化セシウム精製アデノウイルスを用いて、５００ 〜２５００／細胞の感染多重度（ＭＯＩ）でブタ大動脈内皮細胞（ＰＡＥＣ）を 感染させる。感染細胞のノーザンブロット分析によりＡ２０感染をチェックする 。感染の４８時間後、１００Ｕ／ｍｌのＴＮＦまたは１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳ により細胞を刺激する。ＥＣ刺激の２−６時間後にｍＲＮＡを抽出する。ノーザ ンブロット分析は、Ａ２０アデノウイルス感染細胞が、Ｅ−セレクチン、ＩＬ− ８およびＩκＢαのＴＮＦ−およびＬＰＳ−伝達誘導を６０−９０％まで廃する ことを示している。阻害パーセンテージは、感染細胞から検出されたＡ２０のｍ ＲＮＡレベルと直接相関している。ノーザンブロット分析によると、ＰＡＥＣに おけるＡ２０発現は、ＥＬＩＳＡにより評価されたＥ−セレクチンの表面発現を ９０％以下まで阻害する。模擬感染細胞およびβ−ガラクトシダーゼｒＡＤによ り感染させたＰＡＥＣを対照として用いる。さらにこれらの結果は、Ａ２０の発 現がＥＣ活性化を阻害することを立証している。 実施例７ リポーター構築物随伴Ｂｃｌ−２およびＢｃｌ−ｘ_L発現プラスミドとＢＡＥ Ｃの同時転移 実施例１記載の１０ｃｍプレートの培養から得られた約３×１０⁵ウシ大動脈 内皮細胞を、実施例１記載の条件下同様に補った２ｍｌのＤＭＥＭ中６ウェルプ レートの各１ウェルに対し培養する。細胞が全面生長の５０％−７０％に到達す ると、全部で１.５−１.６μｇ／ウェルのＤＮ Ａ（試験プラスミドおよびリポーター構築物）を１ウェル当たり８ｍｇのリポフ ェクタミンに加え、室温で３０分間インキュベーションした後、同様にして３通 り細胞に加える。全実験において、ＢＡＥＣを、０.５μｇのＢｃｌ−２、Ｂｃ ｌ−ｘ_LまたはｐＡＣ、および０.７μｇのＥ−セレクチン、ＥＣＩ−６（ＩκＢ α）またはＮＦ−κＢ−ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）リポーター、並びに０.３μ ｇのβ−ガラクトシダーゼ（ｂ−ｇａｌ）リポーターと同時トランスフェクショ ンする。５時間インキュベーション後、ＦＣＳを培地に加えて最終濃度を１０％ にする。その４８時間後、細胞をヒト組換えＴＮＦ（１００Ｕ／ｍｌ）またはＬ ＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）により刺激し、刺激の７時間後採取する。 ＥＣ活性化に対するＢＣＬ−２およびＢＣＬ−Ｘ_L発現の効果について、まず 内皮細胞特異マーカー、Ｅ−セレクチンを用いて試験する。ＢＡＥＣ（３×１０⁵ 〜５×１０⁵細胞）に対し、ブタＥ−セレクチンリポーター構築物（０.７μｇ ）およびｂｃｌ−２、ｂｃｌ−ｘ_L発現プラスミド（０.５μｇ）またはｐＡＣ対 照（０.５μｇ）プラスミドをＲＳＶβ−ｇａｌプラスミド（０.３μｇ）と連係 的に用いて同時トランスフェクションする。 図６Ａに描かれた結果は、ＢＣＬ−２およびＢＣＬ−Ｘ_L過剰発現により、Ｔ ＮＦおよびＬＰＳの両刺激後にＥ−セレクチンリポーターのルシフェラーゼ活性 が著しく減少することを示している。ｐＡＣ対照では、ＴＮＦまたはＬＰＳ誘導 により、Ｅ−セレクチンリポーターの活性がそれぞれ３５−および５０−倍増加 する。ＢＣＬ−Ｘ_L発現は、ＴＮＦ−およびＬＰＳ−誘導ルシフェラーゼ活性を 非常に顕著に阻害し、この阻害率は、ＴＮＦおよびＬＰＳ刺激後に対照のそれぞ れ９５％および９０％に達する（レーン４および７対５、８）。ＢＣＬ−２が細 胞で発現されると、阻害は完全であると思われる。ＴＮＦおよびＬＰＳ刺激持に Ｅ−セレクチンリポーターの誘導は全く見られない（レーン４および７対レーン ６および９）。Ｅ−セレクチンリポーターのルシフェラーゼ活性の基底レベルが 、ＢＣＬ−２またはＢＣＬ−Ｘ_L発現により影響されることはない。 ブタＩκＢα（ＥＣＩ−６）リポーター構築物を用いて行われた同時トランス フェクションの結果（図６Ｂ）は、Ｅ−セレクチンの場合と類似している。ＴＮ ＦおよびＬＰＳによる誘導は２.５倍に達する（レーン１対４および６）。ＢＣ Ｌ−Ｘ_LおよびＢＣＬ−２発現は、ＴＮＦおよびＬＰＳ刺激後のＴＮＦ−および ＬＰＳ−誘導ルシフェラーゼ活性を完全に廃する（レーン４および７対５、６お よび７、８）。ＩκＢαリポーターのルシフェラーゼ活性の基底レベルが、ＢＣ Ｌ−２またはＢＣＬ−Ｘ_L発現により影響されることはない。 ＢＡＥＣに対し、単にＮＦ−κＢに依存的なＮＦ−κＢリポーター構築物、お よびｂｃｌ−ｘ_L、ｂｃｌ−２またはエンプティーベクター、ｐＡＣにより同時 トランスフェクションを行う（図６Ｃ）。ＢＣＬ−Ｘ_L発現は、ＴＮＦおよびＬ ＰＳにそれぞれ応答するリポーター活性の１０−および２６−倍誘導を著しく減 少させる（レーン４および７対５および８）。この阻害率はそれぞれ５０％およ び７０％に達する。ＢＣＬ−Ｘ_Lとは対照的に、ＢＣＬ−２発現は、ＮＦ−κＢ リポーターのＴＮＦおよびＬＰＳ誘導性を全体的に廃する（レーン４および７対 ６および９）。ＢＣＬ−Ｘ_L、ＢＣＬ−２およびｐＡＣ間のルシフェラーゼ活性 の基底レベルに顕著な差異があるとは思われない（レーン１対２および３）。 したがって、立証されたＥＣ阻害は、転写因子ＮＦ−κＢの阻害と関連がある ことが示されている。 実施例８ Ａ２０突然変異体 分子のｂｐ１１８２〜２４５０および７Ｚｎ結合ドメインにわたるＡ２０遺伝 子の先端切除は、Ｎｃｏｌによる２.４ｋＢ ｃＤＮＡの消化により得られる。 このフラグメントは、４１７アミノ酸残基（配列番号１の残基３７３〜７９０） のポリペプチドとして発現される。先端切除されたＡ２０遺伝子をｐＢａｃ４（ プロメガ）へクローン化し、次いでｐＡＣ発現ベクターへサブクローン化するこ とにより、ＢＡＥＣにおける同時トランスフェクション実験で使用する。これら の実験では、上記と同様１ウェル当たり２×１０⁵ＢＡＥＣを、２ｍｌの培地に より６−ウェ ルプレートで培養する。細胞が全面生長の５０−７０％に達すると、それらをト ランスフェクションする。１.５−１.６μｇ／ウェルのＤＮＡ（試験プラスミド およびリポーター構築物）を１ウェル当たり４単位のリポフェクタミンに加え、 室温で３０分間インキュベーションした後、同様に３通り細胞に加える。この実 験では、０.３μｇのβ−ｇａｌリポーターを、０.５μｇのＡ２０または先端切 除Ａ２０（ｔＡ２０）または対照プラスミドｐＡＣ、および０.７μｇのＥ−セ レクチン−ｌｕｃリポーターと共に使用する。トランスフェクションの４８時間 後、１００Ｕ／ｍｌのＴＮＦまたは１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳにより細胞を攻撃 する。刺激の７時間後に細胞抽出物を製造し、上記と同様、β−ガラクトシダー ゼおよびルシフェラーゼ発現について検定する。Ａ２０の先端切除形態を発現す る２種のクローン：クローン＃３および＃７を試験する。 図７は、Ａ２０、すなわち本質的には分子の７Ｚｎ結合ドメインにより構成さ れる先端切除形態の発現が、ＴＮＦまたはＬＰＳにより刺激されるとＡ２０の場 合と同じ効率でＥ−セレクチンリポーターの誘導を阻害することを示す。 実施例９ トランスジェニックマウスにおける調節可能な遺伝子発現 ａ）誘導可能なテトラサイクリン発現系： 抗アポトーシス性遺伝子発現の一時的調節用システムは、制御可能な方法でＮ Ｆ−κＢ活性化を阻害するのに非常に望ましい。 誘導可能な発現系を用いることにより、インビボで抗アポトーシス性遺伝子発 現を調節することができ、特にテトラサイクリン除去により誘導可能である、ゴ ッセンおよびブジャード、ＰＮＡＳ［１９９２］（前掲）により報告された２成 分プラスミド系、またはファースら、ＰＮＡＳ［１９９４］（前掲）に開示され たテトラサイクリン依存系がある。例えば、ゴッセンおよびブジャード系は、構 成的ＣＭＶプロモーターから発現されたＨＳＶ−ＶＰ１６転写活性化ドメイン（ ｔＴＡ）に融合させた細菌系テトラサイクリン感受性ＤＮＡ結合性タンパク質を 含む第１プラスミドを使用する。第２のプラスミドは、抗アポトーシス性遺伝子 がベクターへクローン化されるその下流に７コピーのｔＴＡに関する結合性部位 を含む。両プラスミドが細胞に存在するとき、ｔＴＡタンパク質は、本発明の高 アポトーシス性遺伝子の高レベル転写を推進する。テトラサイクリンの存在下で は、抗アポトーシス性導入遺伝子の発現は存在しない。テトラサイクリンの非存 在下では、抗アポトーシス性遺伝子の高レベル発現が存在する（ファースらの系 では、テトラサイクリンが存在すると、抗アポトーシス性遺伝子の発現が促進さ れ、テトラサイクリンが存在しない場合、抗アポトーシス性導入遺伝子の発現は 見られない）。 ｂ）トランスジェニックマウス： トランスジェニックマウスを製造するため、例えばゴッセンおよびブジャード 、ＰＮＡＳ［１９９２］（前掲）による記載に従い、抗アポトーシス性遺伝子を 適当なベクターにクローン化する。２種の別々の創始系統が、ｔＴＡおよび抗ア ポトーシス性遺伝子に対して製造される。異型接合動物を交雑することにより、 各系統のトランスジェニックマウスを同型接合とする。各系統の同型接合動物を ラインとして育てる。ｔＴＡ／ｔＴＡマウスを例えばｂｃｌ−２／ｂｃｌ−２マ ウスと交雑することにより、ｔＴａおよびＢｃｌ−２の両導入遺伝子をもつ二重 のトランスジェニックマウスが得られる。これらの交雑は、胚形成中における抗 アポトーシス性導入遺伝子発現を阻害するためテトラサイクリンの保護下で行わ れる。ｔＴＡおよび抗アポトーシス性導入遺伝子をそれぞれもつマウスは、胚形 成中における抗アポトーシス性遺伝子の発現を阻害するためサザーンブロッティ ングにより同定される。 ＥＣにおいて抗アポトーシス性遺伝子を発現するマウスは、模擬実験目的のた めのラットへの異種間移植（心臓および／または腎臓）用ドナーとして使用され 得る。 実施例１０ トランスジェニックブタの製造 ヒト抗アポトーシス性遺伝子（例、Ａ２０、ｂｃｌ−２、ｂｃｌ−ｘ_L、Ａ１ ）を発現するトランスジェニックブタは、好ましくはピンカートら ［１９９４］（前掲）に開示された技術により製造される。 実施例１１ アデノウイルス伝達ＢＣＬ−２発現はＮＦ−κＢ活性化を阻害する。 ＴＮＦ（１００Ｕ／ｍｌ）による処置の前および２時間後にｒＡｄ.Ｂｃｌ− ２またはｒＡｄ.β−ｇａｌ−感染ＰＡＥＣから核抽出物を製造する。ＮＦ−κ Ｂ活性化およびヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）κプロモーターに由来するκＢ結合 性オリゴヌクレオチドへの結合性を、電気泳動移動度シフト検定（ＥＭＳＡ）に より評価する（図８）。 ＢＣＬ−２を発現するＰＡＥＣからの核抽出物は、ほとんど構成的ではなく、 誘導性ではないＮＦ−κＢの結合を示し、ｒＡｄ.β−ｇａｌ−感染細胞はＴＮ Ｆ刺激後にＮＦ−κＢ結合活性の強力な誘導を示す。ＤＮＡ結合の特異性は、過 剰の低温野生型（特異的競合相手）または対照として非特異的競合相手（ＡＰ− １）プローブの使用により確認される（レーン３および４）。 実施例１２ ＰＡＥＣでのＢＣＬ−２発現による、ＴＮＦ処理後のＩκＢα分解の阻害 ｒＡｄ.Ｂｃｌ−２またはｒＡｄ.β−ｇａｌ−感染ＰＡＥＣのＴＮＦ処理の前 および１０分または２時間後に、細胞質抽出物を製造する。細胞質抽出物のタン パク質濃度をブラッドフォード法により定量する。ＩκＢα発現をウェスタン・ ブロットにより評価する。抗−ＭＡＤ−３ウサギポリクローナルＩｇＧ抗血清（ サンタ-クルス・バイオテクノロジー、サンタ・クルス、カリフォルニア、アメ リカ合衆国）およびペルオキシダーゼー複合ヤギ抗ウサギ２次抗体を用い、次い で強化化学発光（ＥＣＬ）検出法（アマーシャム・コーポレイテッド）により、 ＩκＢαを検出する。 結果は、ＰＡＥＣにおけるＢＣＬ−２発現が、ＴＮＦ刺激１０分後に行われる 通常のＩκＢα分解を阻害することを示している。示された結果は、独立した３ 実験の代表である（図９）。 実施例１３ ＥＣでのＢＣＬ−２発現は、転写因子、ｃＡＭＰ応答成分（ＣＲＥ）の結合に 影響せず。 ＢＣＬ−２発現がＣＲＥプローブへの核結合に影響するか否かを測定するため 、ＴＮＦ（１００Ｕ／ｍｌ）による処理の前および２時間後にｒＡｄ.Ｂｃｌ− ２−またはｒＡｄ.β−ｇａｌ−感染ＰＡＥＣから核抽出物を製造し、ＥＭＳＡ （電気泳動移動度シフト検定）により放射性標識ＣＲＥオリゴヌクレオチドのそ れらの結合性について検定する。Ｂｃｌ−２およびβ−ｇａｌ−感染細胞間に差 異は全く観察されない（図１０）。 実施例１４ 内皮細胞におけるＢｃｌ遺伝子Ａ１の機能 ａ）ＥＣでのＡ１発現は、ＮＦ−κＢの阻害を通してＴＮＦ−およびＬＰＳ− 誘導活性化を阻害する： ＨＵＶＥＣをＴＮＦで刺激すると、Ａ１を発現する。ｍＲＮＡレベルでの最大 誘導は、ＴＮＦ刺激の約３時間後に行われる。ＥＣにおけるＡ１の発現により、 ＴＮＦおよびＬＰＳ処理後活性化が阻害される。この阻害効果は、ＮＦ−κＢ活 性化の阻害に関連する。Ａ１についてコード化する発現プラスミドおよびルシフ ェラーゼ遺伝子に結合したＥ−セレクチンのプロモーター領域を含むリポーター 構築物および誘導に関してＮＦ−κＢに単に依存的なリポーターにより、ＢＡＥ Ｃを同時トランスフェクションする（図１１）。 ｂ）Ａ１の発現はＮＦ−κＢに依存的である： 機能的ＮＦ−κＢ活性がＡ１の誘導に必要とされるか否かを評価するため、Ａ １が過剰発現されたＮＦ−κＢの阻害剤（すなわちＩκＢαまたはＡ２０）の存 在下でもＨＵＶＥＣでのＴＮＦ刺激後に誘導可能であり続けるか否かを調べる。 ＨＵＶＥＣを１００のＭＯＩでｒＡｄ.ＩκＢα、ｒＡｄ.Ａ２０または対照ｒＡ ｄ.β−ｇａｌにより感染させる。ノーザンブロットは、細胞における高レベル のＩκＢαおよびＡ２０ｍＲＮＡを示す。感染の４８時間後、ＥＣを１００Ｕの ＴＮＦで３時間刺激する。ＲＮＡを抽出する。ノーザンブロット分析によりＡ１ の発現を分 析する。 結果は、対照ｒＡｄ.β−ｇａｌ感染細胞で見られるように、ＩκＢαまたは Ａ２０の発現がＡ１メッセンジャーＲＮＡの誘導を阻害することを立証している 。同様に、ＩκＢα（別のＮＦ−Ｂ依存的遺伝子）の誘導は、対照と比べてＡ２ ０発現性細胞で阻害されることから、さらにＮＦ−κＢ依存性遺伝子のアップレ ギュレーションを遮断するＡ２０の能力が確認される（図１２）。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ， ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，Ｇ Ｅ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ， ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，Ｐ Ｌ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ (72)発明者 フェラン，クリスチャン アメリカ合衆国02146マサチューセッツ州 ブルックリン、ウィンチェスター・スト リート 165番

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）遺伝子修飾されたことにより、細胞活性化刺激因子の存在下でＮＦ−κＢ 活性化を阻害し得る抗アポトーシス性タンパク質を発現する哺乳類内皮細胞。 （２）レシピエント種への移植を目的として、細胞が遺伝子修飾されたことによ り、移植レシピエントにおいて調節可能または構成的に抗アポトーシス性タンパ ク質を発現し、それによってＮＦ−κＢが実質的に阻害される、供与内皮細胞ま たは上記細胞を含む組織または器官。 （３）哺乳類内皮細胞を遺伝子修飾することにより、炎症または他の免疫学的活 性化刺激因子に対するその感受性を低下させる方法であって、その細胞またはそ の先祖細胞において、ＮＦ−κＢを阻害し得る抗アポトーシス性タンパク質をコ ード化するＤＮＡを挿入し、タンパク質を発現させることにより、細胞活性化刺 激因子の存在下で細胞におけるＮＦ−κＢ活性化が実質的に阻害されることを含 む方法。 （４）炎症性または免疫学的刺激因子に感受性がある哺乳類対象における細胞活 性化を阻害する方法であって、ＮＦ−κＢを阻害し得る抗アポトーシス性タンパ ク質をコード化するＤＮＡの挿入により、対象の内皮細胞に遺伝子修飾を加え、 タンパク質を発現させることにより、細胞活性化刺激因子の存在下、細胞におい てＮＦ−κＢが実質的に阻害されることを含む方法。 （５）供与内皮または他の哺乳類細胞、または上記細胞を含む移植可能な組織ま たは器官を、血液または血漿においてこれらの細胞、組織または器官が活性化を 被っている哺乳類レシピエントに移植する方法であって、 （ａ）供与細胞、またはその先祖細胞に対し、ＮＦ−κＢを阻害し得る抗アポ トーシス性タンパク質をコード化するＤＮＡをそこに挿入することにより修飾を 加え、そして （ｂ）製造された修飾供与細胞またはこれらの細胞を含む組織または器官をレ シピエントに移植し、細胞において抗アポトーシス性タンパク 質を発現させることにより、細胞でのＮＦ−κＢ活性化が細胞活性化刺激因子の 存在下で実質的に阻害される ことを含む方法。 （６）抗アポトーシス性タンパク質が、 −Ａ２０タンパク質の活性を有するポリペプチド、または −ＢＣＬ−２タンパク質の活性を有するポリペプチド、そのポリペプチドのホモ 二量体、またはそのポリペプチドのヘテロ二量体およびＢＣＬ群の別の抗アポ トーシス性ポリペプチド、または −ＢＣＬ−Ｘ_Lタンパク質の活性を有するポリペプチド、そのポリペプチドのホ モ 二量体、またはそのポリペプチドのヘテロ二量体およびＢＣＬ群の別の抗ア ポ トーシス性ポリペプチド、または −Ａ１タンパク質の活性を有するポリペプチド、そのポリペプチドのホモ二量体 、またはそのポリペプチドのヘテロ二量体およびＢＣＬ群の別の抗アポトーシス 性ポリペプチド である、請求項１または２記載の細胞または請求項３〜５のいずれか１項記載の 方法。 （７）ブタである、請求項１または２記載の細胞。 （８）ヒトである、請求項１または２記載の細胞。 （９）異なる種の抗アポトーシス性タンパク質をコード化するＤＮＡを含むヒト 以外のトランスジェニックまたは体細胞組換え哺乳類。 （１０）ブタである、請求項９記載の哺乳類。 （１１）抗アポトーシス性タンパク質がヒトである、請求項１０記載の哺乳類。