JP2000510243A - 固体ｎｍｒによる距離測定方法及び装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、回転エコー二重共鳴(ＲＥＤＯＲ)、伝達エコー二重共鳴(ＴＥＤＯＲ)、マジック角における双極子再結合(ＤＲＡＭＡ)、ウィンドウレスシーケンスによる双極子再結合(ＤＲＡＷＳ)、およびスピン固定とＤＲＡＭＡの融合（ＭＥＬＯＤＲＡＭＡ）をはじめとする様々な固体ＮＭＲ実験によって生成されたデータを分析する方法を含む。この方法は、新しい分析変換または最大エントロピー法とそれらの多次元拡張とを交互に基礎として使用する。これにより、化学シフトが同一の核からでも、高精度の同時複数の距離測定が可能になる。無秩序の固定材料から容易に達成される高品質の距離測定を提供することによって、本発明は、薬品の主要化合物、薬物の分子、またはそれらの標的の構造を高速決定することを通して、薬剤の発見および設計をも改善する。

Description

【発明の詳細な説明】 固体ＮＭＲによる距離測定方法及び装置 本発明の明細書の開示部分は、著作権保護に係わる問題を含んでいる。本著作 権所有者は、本発明の開示のいかなるものについても、特許商標庁に対して特許 出願や登録する際のファクシミリによる複製をすることについては異議を述べる つもりはないが、それ以外の場合にはいかなる場合においても複写許諾権を有す るものである。 本発明は、国家標準技術局（National Institute of Standards and Technolo gy）によって認可された認可番号70NANB5H1066の下に、米国政府の支援の下にお いてなされたものである。米国政府は、本発明に対して所定の権利を有するもの である。 １．発明の分野 本発明の分野は、分子の各磁気共鳴（“ＮＭＲ”）分光測定によって得られた データを解析することによって、分子内における核間分離に関連したデータを測 定することに関する。本発明は、具体的には新規なＮＭＲ及びシグナル処理技術 を用いてドラッグデザイン分野において分子構造を迅速かつ正確に決定するため の用途を有する。 ２.発明の背景 新規、かつより良い薬剤の探索は、分子構造決定をより迅速かつより正確に行 う必要を喚起している。製薬会社は、迅速かつ効率的に新薬を発見するとともに 商業化させる必要がある。新薬の必要性は、近年において増加しているにもかか わらず、薬剤発見及び開発の生産性は、大きく改善されているとはいえない。19 76年から1994年までの間に医薬工業及びバイオテクノロジー工業により費やされ た探索及び開発は、10倍以上に増大しているものの、医薬用途においてＦＤＡに よって認可される新規分子の数は、上述の期間内において12〜13／年の範囲で比 較的一定である。新規な医薬学的分子の発見、開発、商業化のために費やされる 時間は、1薬剤について10年から12年と一定にとどまっている。薬剤発見のため の時間を短縮し、コストを低減することが必要である。 薬剤発見における問題点をよりよく理解するために、当該技術の現状について 考察を加える。分子生物学からの証拠によれば、基本的な生物学的メカニズムに おいては、通常の状態及び多くの疾病状態においてタンパクがそのターゲットと 相互作用することが示されている。例えば、アルテリオスクレロシス(artherios clerosis)(心臓麻痺や不整脈の本質的原因である)及び癌は、米国における死亡 率が50％よりも高いとともに、特定タンパク−タンパク認識の異常によって引き 起こされる。初期における薬剤開発のアプローチにおいては、どの様な生物学的 効果についても既知化合物や、通常天然資源から得られる多数の外来化合物のス クリーニングにより生物学的効果を発見する頻度に依存していた。現実のタンパ クターゲットの性質は、通常未知である。特定分子認識により疾病を特徴づける ことは、より理論に沿った薬剤発見及び薬剤開発を行うための機会を与えること になる。 しかしながら今日では、理論に沿ったドラッグデザインは限定された成功を納 めているにすぎない。理論的なドラッグデザインアプローチの一つとしては、含 まれているタンパクの全構造を迅速に決定し、可能性のあるターゲット構造を検 討し、その後に上述の可能性のあるターゲットに結合しそうな薬剤分子構造を予 測するものである。タンパクやその他のリガンドの上述のターゲットドメインに 結合する薬剤分子の物理的構造は、ファーマコフォア(pharmacophore)と呼ばれ ている。したがって、タンパク中の原子の何千もの位置を、ドラッグデザインプ ロセスを開始する前に正確に決定しておく必要がある。坑癌薬として可能性のあ るチミジレートシンセターゼ(thymidylate synthetase)(ＴＳ)インヒビター1843 U89についての最近の構造研究によれば、TSの活性サイトの構造が、薬剤の結合 によって著しく変更を受けることが示されている(ウエイシェル(Weichsel)等、1 995年、ネーチャーストラクチュアルバイオロジー、第2巻、第1095〜1101頁；ス タウト(Stout)等、ストラクチャー、第4巻、67〜77頁、1996年)。この例が示す ようにタンパクターゲットＴＳが正確に特徴づけられているとしても、ターゲッ トの特徴に基づいた理論的なドラッグデザインは、重要な可能性のある薬剤を見 つけられない可能性がある。 ドラッグデザインについてより確実な理論的アプローチは、多くのライブラリ に基づくものであり、タンパク−ターゲット相互作用を探索するために用いられ る関連する分子の膨大なライブラリを用いる(クラックソン(Clackson)等、Tibte ch、第12巻、173頁〜184頁、1994年)。このようなライブラリから、関心のある ターゲットに結合するメンバーのみを選択 する。2つの異なった確実なライブラリは、6〜12アミノ酸の小さなサイクリック ペプチドからなるライブラリと、小さな有機分子からなるライブラリとを挙げる ことができる。このようなライブラリを構成するため及び特定のタンパクターゲ ットを認識するライブリメンバーを選択するための方法が、現在使用できる(ゴ ールドマン(Goldmenn)等、バイオテクノロジー、第10巻、1557〜1561頁)。一度 多様なライブラリが構成されると、関心のあるターゲットに結合する特定メンバ ーを選択するためのソースとすることができる。分子生物学的な方法は、これら の膨大なライブラリから高い親和性と特異性とを持ってターゲットに結合する単 一分子又は小さなアンサンブルを日常的に同定するために用いることができる。 例えば、アリス・ファーマシューティカル(Arris Pharmaceutical)(ジーベル(Gi ebel)等バイオケミストリー、第34巻、15430〜15435頁、1995年;カッツ(Katz)B. A.、バイオケミストリー、第34巻15421〜15429頁、1995年)及びスミスクライン ビーチャムファーマシューティカルズ(Smithklein Beecham Pharmaceuticals)( ザオー(Zhao)等、ネーチャー・ストラクチャー・バイオロジー、第2巻、1131〜1 137頁、1995年)、は、ストレプトアビジン(streptavidin)に対するバインダーを 選択するために多様なライブラリをスクリーニングしている(ジーベル等、バイ オケミストリー、第34巻、15430〜15435頁、1995年)。彼らは、いくつかの高い 親和性を有するサイクリックペプチドを見出している。さらに、結晶学的にペプ チド構造が決定されれば、高い親和性を有するペプチドリガンドから、小さな有 機リガンドが与えられることが前提とされている(カッツ(Katz),B.A.、バイオテ クノロジー、第34巻、15421〜15429頁、1995年)。 多くのライブラリスクリーニングによって選択された医薬学的に保証される小 さな有機物を見出す際には、データベースを検索してデータベースを通じて小さ な有機物を既知の構造と比較して決定することを含んでいる。データベース検索 におけるＸ線結晶学的な構造により小さな有機物を見出すステップは、フィブリ ノーゲンインヒビターＲＥＩ-ＲＧＤ34について行われている(ザオー等、ネーチ ャー・ストラクチャー・バイオロジー、第2巻、1131〜1137頁、1995年)。これら のデータベース検索により見出された分子のうちの11％は、ターゲットペプチド に対して知られたバインダーである。この検索では、上述のインヒビターの結晶 学的構造が１Åとして決定されたことに基づいている。これらの例が示している ように、多くの方法は、スクリーニングから選択分子を選択することが可能であ り、これらの分子は、これらの分子構造が充分な精度で決定されていれば、好適 な医薬学 的なリードと比較することができる。 スクリーニングから選択された分子構造を小さな有機リード化合物へと翻訳す るのは、選択された分子の分子構造の正確な特徴づけに依存している。実験的な 構造決定は、現時点では主にＸ−線結晶法及び固体ＮＭＲによっている(マッカ ーサー(MacArther)等、トレンズ・インバイオテクノロジー、第12巻、149〜153 頁、1994年)。Ｘ−線結晶法は、Ｘ−線と電子雲の相互作用に依存するものであ り、関心のある結晶におけるすべての重原子の位置についての情報が得られる。 Ｘ−線結晶方の精度は、0.5〜2.0Å(1Å=10^-8cm)である。この方法の原理的な1 つの欠点は、高い規則性を有する結晶が、高分解能回折パターンを得るためには 必要とされることである。結晶成長技術は改善されているものの、未だ不充分で ある。生物学的に関連するタンパクの多くのクラス、例えばトランスメンブラン レセプターは、結晶化が極めて困難である。この困難性は、大きな親水性構造領 域と疎水性領域とが存在していることに一部関係している。進歩にも拘わらず、 対となった相互作用種の共結晶化は、依然として困難である。これに加えて、困 難性は、高品質の結晶を得ることの費用と時間と(マッカーサー等、トレンヅ・ イン・バイオテクノロジー、第12巻、149〜153頁、1994年)及び結晶形態の構造 がin vivo状態を表すものかどうか、が不明確であること(クロアー(Clore)等、 プロテインサイエンス、第3巻、372頁〜390頁、1994年)。同様の問題は、ターゲ ット分子がＤＮＡ又はＲＮＡの場合にも生じる。 溶液状態ＮＭＲは、主要な第2の方法であり、電子雲によって間接的に影響を 受ける双極子双極子相互作用による核スピンの間のコリレーションに依存してい る。高分解能・多次元の溶液状態ＮＭＲ技術は、in situ(すなわち、水溶液環境 )において適用でき、小さなタンパクドメインを研究することができるので結晶 法に代わる魅力的な技術である(ユー(Yu)等、セル、第76巻、933〜945頁、1994 年)。溶液状態ＮＭＲは、Ｘ−線法と同様に2Åの分解能で中程度のサイズのタン パク及びタンパク／リガンド複合体の構造を決定するためには有効である(マッ カーサー等、トレンズ・イン・バイオテクノロジー、第12巻、149〜153頁、1994 年;クロレ(Clore)等、プロテイン・サイエンス、第3巻、372〜390頁、1994年)。 タンパクに結合する医薬学的リード化合物と言ったリガンドの構造は、タンパク が均一に¹³Ｃ及び¹⁵Ｎ(コストがかかるが)によりラベルされ、結合が低い交換限 界において生じる場合に最も効率よく決定される(クロレ等、プロテイン・サイ エンス、第3 巻、372〜390頁、1994年)。この制約としては、結合した複合体が解析されるべ きリガンドが自由な状態及び結合した状態において、ともに充分に長く共鳴する だけ存在することにある。この低い交換限界は、この技術が緊密結合したリガン ドのみに適用することが可能であるとの制限を生じさせる。また、複雑なスペク トルは、相互のコリレーションの解析を極めて時間のかかるものとしてしまう。 複雑さの増加したスペクトル及び互いに重なり合うラインによる分解能おける問 題のために、溶液状態ＮＭＲは、研究することのできる分子のサイズが著しく制 限されることになる。研究するに適切なタンパクの最大サイズは、約25kD(Dalto ns)(クロレ等、プロテイン・サイエンス、第3巻、372〜390頁、1994年)である。 これらの問題は、ターゲット分子がＤＮＡ、ＲＮＡであるときにも適用される。 実際、分解能の欠如は、互いのコリレーションを不明確にさせ、ＤＮＡ及びＲＡ ＮＡ分子のサイズを前塩基数が40未満へと制限してしまう。 結晶法及び溶液状態ＮＭＲにより得られる分解能は、効果的な理論的ドラッグ デザインには不適切であり、特に有機化合物データベースからリード化合物を選 択するためには不適切である。薬剤アフィニティー及び薬剤特異性の双方を得る ために必要な分解能は、正確には知られていないものの、１Å又は0.1Å程度と 推定される（マッカーサー等、トレンズ・イン・バイオテクノロジー、第12巻、 149〜153頁、1994年)。この精度は、Ｘ−線法及び溶液状態ＮＭＲの能力を超え ている。 特に薬剤発見のために適用可能な分子構造決定の改善された方法は、大きな利 用性を有する。Ｘ−線結晶法及び溶液状態ＮＭＲに伴ういくつかの制約を避ける ための方法の1つとしては、ローテーショナルエコーダブルレゾナンス(ＲＥＤＯ Ｒ)といった双極子ディフェージング固体ＮＭＲを挙げることができる(グリオン 等、ジャーナル・オブ・マグネチック・レゾナンス、第81巻、196〜200頁、1989 年;グリオン等、アドバンスズ・イン・マグネチック・レゾナンス、第13巻、57 〜83頁、1989年)。結晶法と比較すると、固体ＮＭＲは、多結晶の不規則な材料 から高分解能の構造的情報を得ることができるという効果を有する。これは、高 分解能の回折を得るために高度に規則性のある結晶を製造する必要を排除し、結 晶充填力による構造的摂動を排除する。1／r⁶により減衰する核の間の間接的相 互コリレーション(核オーバーハウザー効果、ＮＯＥ)に依存する溶液状態ＮＭＲ とは対照的に、固体ＮＭＲは、核間距離を測定するために1／r³に依存する直接 的な双極子カップリングに基づいている。ここで、rは、核間距離である。この 結果、より長い距離がより 高精度及びより正確に固体ＮＭＲで測定できることとなる。さらに、固体ＮＭＲ は、薬剤にターゲット分子を結合させた複合体のサイズによっては厳密には制限 を受けない。固体ＮＭＲ実験においては、サイズの制限は、利用できるサンプル の量とＮＭＲ分光計の感度とによって主として規制される。 溶液状態ＮＭＲ測定に勝るＲＥＤＯＲ変換技術の一つの効果は、核間距離の測 定される周波数からの直接かつ正確な決定にある。溶液状態ＮＭＲ実験は、距離 測定のための間接的な双極子カップリングに依存する。溶液状態ＮＭＲにおいて は、実験的に測定されるパラメータと距離との間の直接関係はない。そのかわり 、カップリングの強度は、核オーバーハウザー効果(ＮＯＥ)により影響を受け、 これは、数オングストロームの距離をスキャンすることができる距離に関連する 。 明確にさせるために、本発明においての実験例について言えば、本発明ではＲ ＥＤＯＲについてのみ議論するが、ＴＥＤＯＲ(ヒンジ(Hinge)等、ジャーナル・ オブ・マグネチック・レゾナンス、シリーズＡ、第103巻、151〜162頁;1993年; ヒンジ等、ジャーナル・オブ・マグネチック・レゾナンス、第96巻、205〜209頁 、1992年）といった別の双極子ディフェージング(双極子リカップリング)法、Ｄ ＲＡＭＡ(チコ(Tycko)等、ケミカル・フィジックス・レターズ、第173巻、461〜 465頁、1990年;チコ等、ジャーナル・オブ・ケミカル・フィジックス、第98巻、 932〜943頁、1990年)、ＤＲＡＷＳ(グレゴリー(Gregory)等、第36回実験的核磁 気共鳴コンファレンス、ボストン、ＭＡ、第289頁、1995年)、ＭＥＬＯＤＲＡＭ Ａ(サン(Sun)等、ジャーナル・オブ・ケミカル・フィジックス、第102巻、702〜 707頁、1995年)を挙げることができる。種々の固体状態材料におけるＲＥＤＯＲ は、ヘテロ核の間の距離を測定するための高分解能固体ＮＭＲ技術である。生物 材料に適用するに当たっては、これは、主として¹³Ｃ原子と一つの¹⁵Ｎ原子の間 の距離を意味する(マーシャル(Maeshall)等、ジャーナル・オブ・アメリカンケ ミカル・ソサエティー、第112巻、963〜966頁、1990年;ガーボウ(Garbow)等、ジ ャーナル・オブ・ケミカル・ソサエティー、第115巻、238〜244頁、1993年)。固 体状態における核磁気共鳴相互作用なので、ＲＥＤＯＲは、高精度かつ正確に核 間距離を測定する本質的能力を有している。ＲＥＤＯＲ測定は、¹³Ｃ−¹⁵Ｎ距離 が0〜4Åの場合には、0.05Åよりも精度良く、かつ¹³Ｃ−¹⁵Ｎ距離が4〜6Åの場 合には、0.1Åよりも精度良い。 ＲＥＤＯＲデータは、その適用性と利用性により制限を受けてしまうと言う重 要な欠点が ある。すなわち従来の分析及び処理では、一度に縮重した化学シフトによる核ス ピンから一つの距離の測定を可能とする。この欠点の理由としては、通常のＲＥ ＤＯＲデータ分析は、粉体といった乱雑な材料を平均し、単に数値的に計算させ ることに依存しているためである。この分析は、ユニバーサル曲線(図2に示す実 施例)を与え、この曲線は、核間距離に関連した形状を有している。通常の分析 方法は、互いに重なり合ったユニバーサル曲線を分離することが不可能である。 したがって、分析における通常の方法では、縮重した化学シフトのスピンの一つ 以上の距離を一度に測定を行うのは現実的ではない。 双極子ディフェージング実験における改善の第2の領域は、データ処理の複雑 さを生じさせるカップリングされていない核の自然存在率によるシグナルの排除 にある。この自然存在率による寄与を排除するための実験としては、ＴＥＤＯＲ を挙げることができる。しかしながら、ＴＥＤＯＲデータの分析は、労力を要し 、その適用性に限界を生じさせることになる。ＲＥＤＯＲの分析方法の容易さと 及びＴＥＤＯＲの低いバックグラウンド寄与とを組み合わせることは、より明ら かな有効性を有する。 現在行われているＲＥＤＯＲの制限は、情報収集が遅いということにある。通 常では、一度にたった一つの距離が特定にラベル化されたスピンの間において測 定されるにすぎない。薬剤分子又はファーマコフォアにおける活性結合サイトの ため、多数の距離を測定するのは、時間を要し、かつ高価なものとなる。この方 法によって得られる距離測定は、精度良くかつ正確ではあるが、一度に複数の距 離をゆっくりと長々と測定することになる。ガーボウ(Garbow)とグリソン(Gulli son)(ガーボウ等、ジャーナル・オブ・マグネチック・レゾナンス、第95巻、442 〜445頁、1991年)は、これらのことは、化学シフトさせた核によるＲＥＤＯＲ測 定することによって低減されることを示している。しかしながら、分子サイズが 大きくなると、この方針は縮重した化学シフトにより制限されてしまうことにな る。 通常の2次元ＮＭＲ実験では、時間ドメインデータセットにおける双方の次元 は、サインとコサインの関数になる。2次元周波数ドメインスペクトルは、双方 の次元のフーリエ変換によって行われる。固体ＮＭＲの双極子ディフェージング 実験では、第2の次元のみがサインとコサインの曲線とされ、第１の次元は、フ ラクショナル次数の円筒ベッセル関数となる。したがって、2次元周波数ドメイ ンスペクトルを得るための双方の時間ドメイン次元の標準的なフーリエ変換方法 は、双極子ディフェージング法には適切ではない。これまでの2次元固体ＮＭＲ 実験では、双方の次元に対してフーリエ変換を用いて化学シフトに 対する双極子カップリングを測定するが、これは、強い双極子カップリングのも のについてのみ行われる。これらの技術は、強い双極子カップリングのためにの み好適であり、双極子ディフェージング実験における弱い双極子カップリング測 定には適切ではない。 バンエック(van Eck)及びベーマン(Veeman)による実験(バンエック等、ジャー ナル・オブ・マグネチック・レゾナンス、シリーズＡ、第109巻、250〜252頁、1 994年)は3次元実験であるが、彼らは、ＴＥＤＯＲ次元におけるフーリエ変換に よりデータを解析している。したがって、彼らの結果は、高分解能ではなく、本 発明により奏される3次元法の固有の直接的な解析を行うものではない。 分子構造に関連する明確な値があり、またこのような情報を与えることができ る方法及び装置があり、固体状態ＮＭＲは、選択された対となった核についての 正確な距離の形態として上述の情報を与えることができ固体ＮＭＲ実験により得 られたシグナルを分析する最新の方法があるがこれらには所定の問題があり実験 による、時間ドメインデータから周波数ドメインスペクトルの形態として高精度 の距離情報を得ることができ、時間ドメイン実験データにおけるノイズを抑制す ることによる高精度かつ正確な距離情報を与えることができ、縮重したスペクト ルの内部一致性を提供でき、単一の時間ドメインシグナルにおけるいくつかの双 極子カップリングによる寄与を分離でき、最終時点までゼロには減衰しないシグ ナルを有する時間ドメインデータを許容し、この時間ドメインデータを連続的に 所定の時間以上に連続させるのではなく、時間における離散的なポイントにおい て収集されたデータを代表して自然的に生じるそれに引き続いたラインブロード ニングを有するようにスムージングさせる必要を要せず、自然存在率によるシグ ナルのノイズを自然的に取り扱うことができ、これらを総合して最良な周波数ド メイン及び距離ドメインスペクトルを正確で、理論的な定義を用いて時間ドメイ ンシグナルから得ることができ、周波数ドメインスペクトルの形態としての実験 的時間ドメインデータから高精度な情報を得ることができる新たな分析方法が必 要とされていた。 本発明において挙げた上述の参考文献は、本発明の従来技術を示した文献とな るものではない。 ３．発明の開示 本発明は広く、固体ＮＭＲにより、より迅速に、より高精度かつ正確に、従来 の固体Ｎ ＭＲ技術よりもより多様な核間距離を与えることを目的とする。¹³Ｃ−¹⁵Ｎとい った特定の場合には、本発明により行われる距離測定は、距離が4Å未満では0.0 5Åよりも正確に、距離が4〜6Åの場合には、0.1Åよりも正確である。この目的 は、結晶法又は溶液状態のＮＭＲよりもより正確かつより時間的に効率の良い方 法を提供することによって、ドラッグデザイン分野における分子構造決定にあっ た従来の問題点に対応することができるという顕著な利用性を有している。ファ ーマコフォア構造の決定をより迅速、かつ正確に行うことによって、好適な医薬 組成物がより迅速かつ効率的に得られることになる。 本発明の目的は、双極子カップリングにより生じた測定シグナルである固体状 態ＮＭＲによって得られた実験的な時間ドメインデータからの高精度情報を得る ことを目的とする。 このドメインデータを解析して、周波数ドメイン又は時間ドメインデータに寄 与する双極子カップリングに対応したこれと等価な距離ドメインスペクトルを得 る。 本発明によれば、上述の目的は多数の距離を同時に測定することができ、単一 の距離についてより正確な測定を行うことを可能とする、実験手法及びデータ解 析双方における改善を行うことによって達成される。本発明は、ＲＥＤＯＲ変換 及びマキシマムエントロピー法に基づく方法を用いるものである。本発明は、時 間ドメインデータからこのデータに寄与するカップリング周波数の周波数ドメイ ン情報に対応したスペクトルを導くことができる固体ＮＭＲ実験のクラスから時 間ドメインデータを分析する方法を提供する。言い換えれば、本方法は、時間ド メインデータによって表されたシグナルに寄与する核間距離のスペクトルを与え るものである。本発明はまた、ＲＥＤＯＲ以外で、ＲＥＤＯＲシグナルの時間依 存性の関数形態を有する固体ＮＭＲヘテロ核及び同核距離測定実験にも適用でき る。より一般的には、シグナル関数の時間依存性が数値的に知られている固体状 態ＮＭＲヘテロ核及び同核における距離測定に適用することができる。 本発明の1つの態様においては、ＲＥＤＯＲ測定においてＲＥＤＯＲＮＭＲ測 定及びデータ解析を行う方法を提供するものであり、同一の化学シフトを有する 核スピンから測定される多重の同時な距離測定を可能とする方法を提供すること にある。 好ましい実施態様においては、1次元ＲＥＤＯＲ変換により、一つの特定の化 学シフトを有するすべての核から2つ以上の核間距離を測定することを可能とさ せる。別の好適な態様においては、観測された核の化学シフトを異核カップリン グに関連づけるための２次 元スペクトルにより、すべての化学シフトされた核からの2つ以上の核間距離の 測定が可能となる。別の好適な態様においては、2次元スペクトルは、ヘテロ核 対における双方の核について得られる。これらの２つのスペクトルのそれに続い たコリレーションは、複雑なサンプルにおけるサイト同定性を改善させる。さら に好ましい態様では、双方の核の化学シフトを互いにコリレートさせる３次元ス ペクトルは、複雑なサンプルにおけるサイト同定性を改善することを可能とする 。 この方法の別の態様では、マキシマムエントロピー法によって発生される。こ の方法は、操作モードに依存した特定のカップリング周波数又は特定の核間分離 に対応する時間ドメインデータを発生させるためのカーネルの入力を必要とする 。データに対応する最も可能性のあるスペクトルは、マキシマムエントロピー法 である。これに加えて、このマキシマムエントロピー法は、スペクトルをデフォ ルト値として使用し、与えられたデータ内でのノイズを見積もるようにされてい て、スペクトル中の誤差に関連した情報を発生させるようになっているとともに 、データに与えられた見積もり誤差の信頼性を与えるようになっている。 本発明は、またＮＭＲスペクトルにおける測定されたピーク強度への自然存在 率を排除するためのシンメトリックＴＥＤＯＲ実験を行う方法を含んでいる。こ のような排除は、測定されたＮＭＲシグナルにおけるオフセットコリレーション を行うために必要とされる。このシンメトリックＴＥＤＯＲ実験の機能的形態は 、ＲＥＤＯＲ実験と同一である。ＴＥＤＯＲ実験における改善は、自然存在率の 寄与を排除して、本発明における改善されたデータ処理技術を適用するためであ る。 本発明の特徴は、ＲＥＤＯＲ技術により同時に複数の距離について測定するこ とにより、実験時間を低減させることにある。同時に多数の距離を測定するのは 、連続して多くの距離を測定するよりも時間を要しない。さらに、同時に距離を 測定することにより、ターゲットタンパク及び薬剤分子のサンプル合成のコスト が下げられることになる。タンパクターゲットが低コストになることは、実験に 必要なタンパクの量を低減させることができることによる。薬剤分子が低コスト になることは、単一の化合物で多数の距離を測定することにより、合成が安価と なることによる。測定される距離の数の増加は、データ解析において費やされる 時間を増加させることにはならない。データ分析に用いられる時間は、（典型的 には数時間)は、Ｘ−線結晶法及び溶液状態ＮＭＲデータ分析に費やされる時間 （典型 的には数カ月)よりもずっと少ない。 本発明の方法の医薬的リード化合物への応用は、同一の化学シフトを有する核 の対から1つ以上の距離を測定することを可能とさせる。 本発明の特徴は、多数の距離を含むより複雑なサンプルについて距離測定を行 うことができることにある。本発明の特定の態様においては、複雑なサンプルは 、ペプチド1つにつき測定可能な距離を有するペプチドを物理的に混合すること によって製造される。本発明の別の態様では、複雑なサンプルは、1つのペプチ ド内に多くの測定可能な距離を含んでいる。本発明の別の態様においては、複雑 なサンプルはペプチドそれぞれが多数の測定可能な距離を含んでいるペプチドを 混合することによって製造される。 本発明の特徴は、回折を行うために高度に規則的な結晶を用いる必要がある結 晶法とは対照的に、実験が不規則な(微結晶又はアモルファス)材料を用いて実施 することができることにある。さらに、本発明は分解能の点において溶液状態Ｎ ＭＲのように関心のある分子又は複数の分子の分子量には厳格には左右されない ことにある。 本発明の特徴は、本方法が、数多くの環境下でファーマコフォアを研究するの に用いることができることにある。本発明の好適な態様においては、ペプチドは 合成樹脂に結合されている。本発明の別の好適な態様においては、ペプチドは、 未ラベルのペプチド又はミルクタンパクといったマトリックス内に緊密に混合さ れる。本発明の別の好適な態様においては、ペプチドは、ターゲットタンパクに 結合される。 本発明の特徴は、この技術が適用される材料が、本発明において報告するペプ チドを超えて適用することができることにあり、ペプトイド、ペプチドミメティ ックス、核酸、炭化水素、これら以外の小さな有機薬剤分子といった非ペプチド 分子に適用されることにあるが、特にこれらの物に限定されるわけではない。距 離測定は、ターゲットタンパク内における距離測定の他、ターゲットタンパクと リガンドの間においても行うことができる。いかなる適用可能な材料にも関連す る特徴は、その材料が本来有しているものでも、又は対となったＮＭＲ活性核で 選択的にラベルできるものを挙げることができる。この対は、ヘテロ核対であっ ても良く、同核対であっても良い。 この方法の双方のグループは、多次元ＮＭＲ分析に適用することができる。デ ータの2次元処理のために導入する方法は、多重の化学シフトを有するスピンの 多数の距離を同時に測定することを可能とする。2つの付加的な方法は、2次元デ ータセットのコリレー ション及び3次元実験であり、さらに解像力が向上することになる。核の間のヘ テロ核双極子カップリングを双方の種の化学シフトにコリレーションすることに よって、これらの技術は、より複雑なサンプルへと利用性が広げられる。複雑な サンプルとは、多重となった核間距離と多重の化学シフトされた核を有するサン プルをいう。利点としては、より複雑なサンプルでも、単位時間当たりに測定さ れるヘテロ核距離への翻訳がなされることにある。1次元、2次元、3次元技術に より測定された距離は、従来のＲＥＤＯＲ測定の高い精度及び正確さを有してい るとともに、速度を向上させ、かつコストを低下させることになる。 本発明の態様においては、1つ以上の分子を含む対となったサイトのそれぞれ について1つ以上の距離を決定する方法を提供することにある。これらの1つ以上 の分子は、1つ以上の対となったサイトを有し、各サイトの対は、第1のサイトと第2 のサイトとを含んでおり、対となった各サイトの距離は、第1のサイトと第2のサイ トの間とされ、さらにこの方法は、ＮＭＲ活性核からのＮＭＲ時間ドメインデー タを発生させ、対となった1つ以上のサイトの各対は、第1のＮＭＲ活性核によっ て占有される第1のサイトを有するとともに、第2のＮＭＲ活性核によって占有さ れる上述の第2のサイトを有している。この第1のＮＭＲ活性核は、上述の発生ス テップにおいて観測され、上述の第1のＮＭＲ活性核及び上述の第2のＮＭＲ活性 核は、上述の第1のサイトと第2のサイトの間の距離に対応した双極子カップリン グ周波数によって特徴づけられる双極子カップリングを有している。上述の時間 ドメインデータは、少なくとも1つの時間次元に沿った上述の1つ以上の対のそれ ぞれの双極子カップリングに対応し、さらに上述の時間ドメインデータを解析し て、上述の一つ以上の対となった1つ以上のサイトの第1の核と第2の核の間の双 極子カップリングを特徴づける双極子カップリング周波数を同定するスペクトル ドメインデータ得る。この解析は、上述の第1の時間次元に沿って時間ドメイン データをマキシマムエントロピー変換することを含んでいる。 本発明の態様においては、1つ以上の分子を含むサンプルにおいて1つ以上の距 離を決定する方法を提供することにあり、上述の1つ以上の分子は、1つ以上の対 となったサイトを有しており、対となった各サイトは、第1のサイトと第2のサイ トを有し、各距離は、上述の第1のサイトと第2のサイトの間とされ、この方法は 、1つ以上の上述した1つ以上の分子に1つ以上のターゲット化合物を結合させ、 ＮＭＲ活性核からＮＭＲ時間ドメインデータを発生させるものであって、上述の サイトの1つ以上の各対は、第1のＮＭＲ活性核 によって占有される第1のサイトを有しているとともに、第2のＮＭＲ活性核によ って占有される第2のサイトを有し、上述の第1のＮＭＲ活性核は、上述の発生ス テップにおいて観測され、上述の第1のＮＭＲ活性核及び上述の第2のＮＭＲ活性 核は、上述の第1のサイトと第2のサイトの間の距離に対応した双極子カップリン グ周波数によって特徴づけられる双極子カップリングを有している。上述の時間 ドメインデータは、少なくとも1つの時間次元に沿って上述の1つ以上の対のそれ ぞれの双極子カップリングに対応し、さらに上述の時間ドメインデータを解析し て、上述の一つ以上の対となった1つ以上のサイトの第1の核と第2の核の間の双 極子カップリングを特徴づける双極子カップリング周波数を同定するスペクトル ドメインデータ得る。この解析は、上述の第1の時間次元に沿って時間ドメイン データをＲＥＤＯＲ変換することを含んでいる。 本発明の態様においては、1つ以上のペプチドを含んだサンプルにおける1つ以 上の距離を決定する方法が提供され、この1つ以上のペプチドは、1つ以上の対と なったサイトを有しており、対となった各サイトは、第1のサイトと第2のサイト とを有していて、各距離は、上述の第1のサイトと第2のサイトの間とされ、この 方法は、ＮＭＲ活性核からＮＭＲ時間ドメインデータを発生させるものであって 、上述のサイトの1つ以上の対は、第1のＮＭＲ活性核によって占有される第1の サイトを有しているとともに、第2のＮＭＲ活性核によって占有される第2のサイ トを有し、上述の第1のＮＭＲ活性核は、上述の発生ステップにおいて観測され 、上述の第１ＮＭＲ活性核及び第2のＮＭＲ活性核は、上述の第1のサイトと第２ のサイトの間の距離に対応した双極子カップリング周波数によって特徴づけられ る双極子カップリングを有している。上述の時間ドメインデータは、少なくとも 第1の時間次元に沿って1つ以上の対のそれぞれの双極子カップリングに対応し、 さらに上述の時間ドメインデータを解析して、上述の一つ以上の対となった1つ 以上のサイトの第1の核と第2の核の間の双極子カップリングを特徴づける双極子 カップリング周波数を同定するスペクトルドメインデータを得る。この解析は、 上述の第1の時間次元に沿って時間ドメインデータをＲＥＤＯＲ変換することを 含んでいる。 本発明の態様においては、1つ以上の分子を含んだサンプルにおける複数の距 離を決定する方法を提供するものであり、上述の1つ以上の分子は、複数の対と なったサイトを含み、対となった各サイトは、第1のサイトと第2のサイトとを有 していて、各距離は、上述の第1のサイトと第2のサイトの間とされ、この方法は 、ＮＭＲ活性核からＮＭＲ時間ドメ インデータを発生させるものであって、上述のサイトの1つ以上の対は、第1のＮ ＭＲ活性核によって占有される第1のサイトを有しているとともに、第2のＮＭＲ 活性核によって占有される第2のサイトを有し、上述の第1のＮＭＲ活性核は、上 述の発生ステップにおいて観測され、上述の第１ＮＭＲ活性核及び第2のＮＭＲ 活性核は、上述の第1のサイトと第2のサイトの間の距離に対応した双極子カップ リング周波数によって特徴づけられる双極子カップリングを有している。上述の 時間ドメインデータは、少なくとも第1の時間次元に沿って上述の1つ以上の対の それぞれの双極子カップリングに対応し、さらに上述の時間ドメインデータを分 析して、上述の一つ以上の対となった1つ以上のサイトの第1の核と第2の核の間 の双極子カップリングを特徴づける双極子カップリング周波数を同定するスペク トルドメインデータを得、さらにＮＭＲ時間ドメインデータを解析して上述の対 となった1つ以上のサイトの第1の核と第2の核の間の双極子カップリングを特徴 づける1つ以上の双極子カップリング周波数を同定して、スペクトルドメインデ ータを得る。この解析は、上述の第1の時間次元に沿って時間ドメインデータを ＲＥＤＯＲ変換することを含んでいる。 本発明の態様においては、1つ以上の分子を含んだサンプルにおける1つ以上の 距離を決定する方法を提供するものであり、上述の1つ以上の分子は、1つ以上の 対となったサイトを含み、対となった各サイトは、第1のサイトと第2のサイトと を有していて、各距離は、上述の第1のサイトと第2のサイトの間とされ、この方 法は、ＮＭＲ活性核からＮＭＲ時間ドメインデータを発生させるものであって、 上述のサイトの1つ以上の各対は、第1のＮＭＲ活性核によって占有される第1の サイトを有しているとともに、第2のＮＭＲ活性核によって占有される第2のサイ トを有し、上述の第1のＮＭＲ活性核は、上述の発生ステップにおいて観測され るとともに、化学シフトを有しており、上述の第1のＮＭＲ活性核と上述の第2の ＮＭＲ活性核は、対となったＮＭＲ活性核を形成し、前記第1のサイトと前記第2 のサイトの間の距離に応じた双極子カップリング周波数によって特徴づけられる 双極子カップリングを有しており、上述の時間ドメインデータは、上述の第1の サイトと第2のサイトの間の距離に対応した双極子カップリング周波数によって 特徴づけられる双極子カップリングを有しているとともに、上述の時間ドメイン データは、第1の時間次元に沿って1つ以上の各対の双極子カップリングに対応し 、少なくとも1つの第2の時間次元に沿った上述の1つ以上の対それぞれの第1のサ イトにおける前記第1の核の化学シフトに対応してお り、さらに上述のＮＭＲ時間ドメインデータを解析して、上述した対となった1 つ以上のサイト内の第1の核と第2の核の間の双極子カップリングを特徴づける1 つ以上の双極子カップリング周波数を同定するとともに、さらに双極子カップリ ング周波数における上述の第1のそれぞれの核の化学シフトの上述した双極子カ ップリング周波数を同定する。解析においてはさらに上述の少なくとも1つの双 極子カップリングに対応した双極子ディフェージングスペクトル変換を上述の時 間ドメインデータに対して上述の第1の時間次元に沿って、かつそれ以外の時間 次元に沿って施すことを含んでいる。 これまでの態様に加え、本発明においては、上述の1つ以上の対となったサイ トのそれぞれの第2のサイトの上述の第2のＮＭＲ活性核が化学シフトを有する方 法が提供される。この方法は、少なくとも1つの第３の時間次元に沿って上述し た1つ以上の対となったサイトの内のそれぞれの第2のサイトにおける第2のＮＭ Ｒ活性核の化学シフトに対応するようにＮＭＲ時間ドメインデータを発生させる 発生ステップと、所定の双極子カップリング周波数を有する上述の第2の核の1つ 以上の化学シフトについて上述の双極子カップリング周波数を同定する解析ステ ップと、を有している。 本発明の態様においては、マキシマムエントロピー変換の施されたサンプルに より、実験的なＮＭＲ時間ドメインデータ値から予測されるスペクトルドメイン データ値を決定するステップを有する。上述の時間ドメインデータ値は、少なく とも1つの時間次元を有し、この時間次元は、上述のサンプルにおけるＮＭＲ活 性核の1つ以上の対の間の1つ以上の双極子カップッリングに対応して変動する。 このための方法は、求積法のためのベーシス関数のＭ係数として、デフォルトの スペクトルドメインデータ値を選択し、規格化パラメータαの値を決定し、上述 の求積法のためのベーシス関数のＭ係数としてαＥ−χ²／2式に従って最大とな る上述の予測されたスペクトルドメインデータ値を決定する。上述のＥは、上述 のデフォルトスペクトルドメインデータ値に対する予測されたスペクトルドメイ ンデータ値のエントロピーであり、χ2は、時間ドメインデータ値と予測された スペクトルドメインデータから決定される時間ドメインデータの間の実験的な誤 差を予測することによって規格化された差の尺度である。 本発明の態様においては、ＲＥＤＯＲ変換にしたがってＮＭＲ時間ドメインデ ータを解析する方法が提供される。この時間ドメインデータ値は、サンプルから 得られるとともに、2つ以上の時間変動の次元を有していて、この次元のうちの 少なくとも1つは、サンプル中の 1つ以上の対となったＮＭＲ活性核の間の双極子カップリングのうちの1つに対応 し、この時間ドメインデータ値は、下式を評価する技術によってこの双極子カッ プリングスペクトルドメインデータから決定される。 上式中、Ｍ（Ｄ）は、スペクトルドメインデータ値であり、Ｓ（t）は、上述し た時間ドメインデータ値であり、Ｋ(t,Ｄ)は、式 により与えられる。 上述の方法には、上述の時間ドメインデータ値から予測されたスペルトルドメイ ンデータ値決定するため式 を評価することが含まれ、これは、上述の時間ドメインデータ値における求積法 技術にしたがってなされる。上式中、k(t,Ｄ)は、式 で与えられる。 本発明の態様においては、サンプルからの実験的ＮＭＲ時間ドメインデータ値 から、マキシマムエントロピー変換を用いて予測されるスペクトルドメインデー タ値Ｍ( )を見出す装置が提供される。この時間ドメインデータ値は、上述のサ ンプル中のＮＭＲ活性核の1つ以上の対の間の1つ以上の双極子カップリングに対 応した少なくとも1つの時間変動 の次元を有している。上述の装置は、デフォルトのスペクトルドメインデータ値 Ｍ( )を選択する手段を有しており、このＭは、上述したスペクトルドメインに おける求積法のベーシス関数の係数であり、さらに規格化パラメータαの値を決 定するための手段と、上述の求積法のためのベーシス関数のＭを係数として予測 されるスペクトルドメインデータを決定するための手段とを有し、これらの係数 の値は、ダビッドソン−フレッチャー−パウエル法に従った式αＥ−χ²／2にし たがい、最大化される。(i)上式中、Ｅは、上述のデフォルトスペクトルドメイ ンデータ値に対する上述の予測されたスペクトルドメインデータ値のエントロピ ーであり、式 にしたがって、上述したグリッドのポイントでの求積法により見積もられ、(ii) χ²は、上述した時間ドメインデータ値S_iと時間ドメインデータ値S'iの間の実験 誤差の見積もりσ_iによって規格化した差の尺度である。この値S_i'は、上述した 予測スペクトルドメインデータ値Ｍ( )により下記式で特定される技術によって 得られる。 上式中、Ｎ＋1は、上述した時間ドメインデータ値の数である。 本発明の態様においては、予測されるスペクトルドメイン値を決定するために ＲＥＤＯＲ変換にしたがってＮＭＲ時間ドメインデータ値を解析する装置が提供 される。この装置は、サンプルから上述の時間ドメインデータ値を発生させるた めの手段を有しており、この時間ドメインデータ値は、時間変動に対する2つ以 上の次元を有し、これらの次元のうちの少なくとも1つは、上述したサンプル内 の対となったＮＭＲ活性核の間の1つ以上の双極子カップリングに対応しており 、上述の時間ドメインデータ値は、スペクトルドメインデータから決定すること ができ、下記式を評価する技術によって上述の双極子カップリングが特徴づけら れる。 上式中、Ｍ(Ｄ)は、上述したスペクトルドメインデータ値であり、Ｓ(t)は、上 述した時間ドメインデータ値であり、Ｋ(t,Ｄ)は、式 で与えられ、さらに上述の時間ドメインデータ値における求積技術にしたがって 式 を評価するための手段を有している。ここで、k(t,Ｄ)は、式 によって与えられる。 本発明の態様においては、サンプルの1つ以上の距離を決定する方法が提供さ れ、この方法は、1つ以上の対となったサイトを含む1つ以上のペプチドを含むサ ンプルの1つ以上の距離を決定する方法を提供するものであり、上述の各対とな ったサイトは、第1のサイトと第2のサイトを有し、上述の距離は、上述の第1の サイトと第2のサイトの間にあり、この方法は、ＮＭＲ活性核で上述の1つ以上の 対となったサイトそれぞれをラベリングし、上述の対となった各サイトは、上述 の第1のＮＭＲ活性核と第2のＮＭＲ活性核によって占有されており、さらに、Ｎ ＭＲ活性核からのＮＭＲ時間ドメインデータを発生させ、1つ以上の対となった サイトの各対は、第1のＮＭＲ活性核によって占有される第1のサイトと、第2の ＮＭＲ活性核によって占有される第2のサイトを有しており、上述の第1のＮＭＲ 活性核は、上述の発生ステップにおいて観測されるとともに、化学シフトを有し ていて、上述の第1及び第2のＮＭＲ活性核は、上述の第1と第2のサイトの間の距 離に応じた双極 子カップリング周波数によって特徴づけられる双極子カップリングを有しており 、上述の時間ドメインデータは、少なくとも第1の時間次元に沿って1つ以上の各 サイトの双極子カップリングに対応しているとともに、少なくとも第2の時間次 元に沿った上述の1つ以上のサイトの上述の各サイトにおける上述の第1のサイト の上述の第1の核の化学シフトに対応し、上述のＮＭＲ時間ドメインデータを解 析して上述の1つ以上の双極子カップリング周波数を同定するスペクトルドメイ ンデータを得、この1つ以上の双極子カップリング周波数は、上述の第1の核及び 第2の核の間の双極子カップリングを特徴づけているとともに、上述の双極子カ ップリング周波数を有する上述の第1の核の1つ以上の化学シフトの上述の双極子 カップリング周波数それぞれを同定しており、上述の解析は、上述の1つ以上の 双極子カップリングに応じた双極子ディフェージングスペクトル変換を上述の第 1の時間次元及び別の時間次元に沿って上述の時間ドメインデータに対して行う 様になっている。 本発明は、さらに請求項45の方法を行うための指令を含んだコンピュータ読み 取り可能な媒体及び請求項62に記載の方法を実施するための指令を含んだコンピ ュータ読み取り可能な媒体を提供するものである。 ４．図面の簡単な説明 本発明のこれらの目的、特徴および利点は、添付図面、詳細な説明および添付 クレームを考慮して、当業者には明白となることだろう。なお図面中、 図1は、ＲＥＤＯＲパルスシーケンスの一例を示す； 図2は、ローターサイクル数の関数としてプロットしたＲＥＤＯＲΔS／S₀曲線 の一例を示す。 図3は、ローターサイクル数の関数としてのＲＥＤＯＲ S/S₀曲線の一例を示す 。 図4は、ＲＥＤＯＲ変換実施態様によりペプチド混合物から得られた双極子周 波数スペクトルを例示している。 図5は、3Åより大きい¹³Ｃ−¹⁵Ｎ距離を測定するための好ましい代替的ＲＥＤ ＯＲパルスシーケンスを例示する。 図6は、核間距離および双極子−カップリング周波数の関係を示す曲線を例示 する。 図7は、ＴＥＤＯＲ実験についてのパルスシーケンスを例示する。 図8は、化学シフトおよび双極子カップリングの相関関係を示す図4のデータの 二次元 スペクトルを例示する。 図9A、9Bおよび9Cは、化学シフトおよび異核双極子カップリングの相関関係を 示す二次元スペクトルの一例を示す。 図10は、準三次元処理を例示する。 図11は、¹³Ｃ化学シフト、¹⁵Ｎ化学シフトおよび双極子カップリングの相関関 係を示す三次元実験についてのパルスシーケンス例を示す。 図12は、¹³Ｃおよび¹⁵Ｎの三次元相関関係の一例を示す。 図13は、¹³Ｃ化学シフトおよび同核双極子カップリングの相関関係を示す三次 元実験についてのパルスシーケンスを例示する。 図14は、測定されたＲＥＤＯＲデータの例を示す。 図15は、最大エントロピー方法の流れ図を例示する。 図16Aおよび16Bは、最大エントロピー方法の応用例を例示する。 ５．詳細な説明 5.1節は、観測された核の双極子カップリングおよび化学シフトに対して応答 するシグナルを生成する基本的な固体ＮＭＲ実験について記述している。5.2節 は、本発明の双極子脱位相スペクトル変換の最大エントロピー実施態様について 記述している。5.3節は、本発明の双極子脱位相スペクトル変換のＲＥＤＯＲ変 換実施態様について記述する。5.4節は、本発明に適合可能な好ましいＴＥＤＯ Ｒパルスシーケンスについて記述する。5.4節は、二次元および三次元ＮＭＲシ グナルの測定および解析について記述する。5.6節は、本発明の方法に従った測 定および解析のためのサンプルを作成するためのサンプルの標識化、合成および 調製方法について記述する。 本発明に基づく方法は、¹³Ｃおよび¹⁵Ｎで選択的に標識したペプチドサンプル を用いて例示されている。しかしながら、この方法は、このようなサンプルにも 、このような標識にも制限されるわけではない。本発明のデータ収集および処理 方法は、一般的なものであり、天然にＮＭＲ活性核を有するか、またはＮＭＲ活 性核で選択的に標識することのできるあらゆるサンプルに適用できるものである 。 さらに、本発明の方法は、2つのＮＭＲ活性核で標識したサンプルを用いて例 示されている。しかしながら、本発明の方法はこのような標識化に制限されるわ けではない。特に、サンプルペプチドの中には多数の観測されていないＮＭＲ活 性核が存在する可能性が あり、このような観測されていない核の磁気特性は、三次元より高次元に拡張さ れた多次元解析技術によってサンプリングされ得る。たとえば、時間−ドメイン ＮＭＲシグナルは、観測された核の双極子カップリング、その化学シフトおよび それが双極子カップリングされている観測されていない核すべての化学シフトに 対し応答性をもつ可能性がある。このようなシグナルは、このシグナルが感応性 をもつすべての核の周波数チャンネル内でRFパルスサブシーケンスを適用するこ とによって生成できる。しかしながら従来のＮＭＲ計装は、RFパルスの3つのチ ャンネルしか生成しない。 5．1 双極子スペクトルおよび双極子脱位相実験 本発明において記述されている薬物発見の分野における構造決定方法は、双極 子脱位相実験として知られるＮＭＲ実験およびこれらの実験からの時間−ドメイ ンシグナルの、周波数ドメインまたは距離ドメインスペクトルへの改良型解析方 法に基づいている。これらの実験を行なうための好ましい方法は、ＮＭＲ活性核 の間の距離、特に縮退化学シフトを伴うスピンから生じた場合であっても一度に 複数の距離の精確かつ急速な測定を可能にする。これらの解析方法は、目的の分 子のより積極的な標識化スキームを可能にする。その上、この方法は、生化学お よび材料構造の決定のための信頼性の高い方法の開発に向けて重要な1つの段階 を表わしている。 ＮＭＲ活性核は、非ゼロ核磁気双極子モーメントを有する核である。非ゼロ双 極子モーメントを伴う2つのこのような核は、以下の式1にしたがって核間距離r に直接左右される双極子カップリング周波数Ｄと磁気的に直接相互作用する。 この式中、hは、プランク定数を２πで除したものであり、γ1およびγ2は、 相互作用する核の磁気回転比である。磁気回転比は、核の固有物理特性である。 本発明により考慮されているＮＭＲ実験は、一般に、非結晶または微結晶の不 規則化された固体材料に対する実験をも含んでいる。材料は、好ましくは、ＮＭ Ｒ活性核が特定的に標識化によって導入された生物学的に注目されている有機化 合物である。実験用サンプルは、約54.7°のマジック角(「マジック角スピニング」 または「MAS」)で、かつ標準的には3kHzより高い周波数で、磁界内でスピンさせ られる。(Munowitz，M. Coherence and NMR;John Wiley & Sons；New York，1988,p289)。マジック角ス ピニングは、異方性化学シフトならびに核双極子カップリングを平均する。考慮 対象の実験は、一般に、結果として得られる自由誘導崩壊(「FID」)シグナルが選 択された双極子カップリングに対し少なくとも応答性をもつようにさまざまな予 備パルスシーケンスによる摂動を受けるスピン・エコー実験である。予備パルス シーケンスは、選択された双極子カップリングがスピンエコーをさらに脱位相さ せ、このようにしてＦＩＤシグナルを変えるように作用するような形で配置され ている。 双極子カップリングの測定は、核間距離の単純な決定を可能にする。式1から 、本発明の方法によって測定される双極子カップリング周波数を、対応する核間 距離に単純に変換することができる。図6は、式1にしたがって生成された、生物 学的利用分野における最も一般的なＮＭＲ活性核である核対¹³Ｃ−¹⁵Ｎについて の、核間距離と双極子周波数の関係を表わす曲線を例示している。水平軸601は 、Hz単位の双極子カップリング周波数を記録し、垂直軸602は、Å単位の核間距 離を記録している。破線603および604は、測定された双極子周波数(たとえば200 Hz)をオングストローム単位の対応する核間距離(たとえば、2.5Å)へとグラフ上 で変換する上での容易さを実証している。同様に式1から、精確に測定可能な最 小カップリング周波数Ｄがわかっていると、精確に測定可能な最長距離Ｒを決定 できるということも明白である。現在精確に測定可能なＤの最小値は、約15Hzで ある。したがって、γ1およびγ2がわかっているため、精確に測定可能な最長距 離は、式2からそのおおよその値が得られる。 一例としては、¹³Ｃおよび¹⁵Ｎについて、測定可能な最大距離は約6Åである(Hi ng et al.,1994,Biochemistry 33:8651-8661)。 15Hzの双極子カップリングに基づくその他の異核対についての磁気回転比γ、 および測定可能最大距離Ｒの値を表1に示す。磁気回転比の単位はHz/ガウスであ る。 表1:測定可能な最大核間距離 より詳細に言うと、ここで双極子−脱位相実験と呼ばれているＮＭＲ技術は、 同核または異核双極子相互作用を測定するための固体ＮＭＲ ＭＡＳ技術のクラ スを含んでいる。これらについては、文献中ですでに記述されてきた。(Gullion et al.,1989，Journal of Magnetic Resonance 81:196-200;Gullion et al.，1 989，Advances in Magnetic Resonance 13:57-83;Tycko et al.，1990，Chemica l Physics Letters 173:461-465;Tycko et al.，1993，Journal of Chemical Ph ysics 98:932-943;Sun et al.，1995，Journal of Chemical Physics 102:702-7 07;およびPan et al.，1990，Journal of Magnetic Resonance 90:330-340)。こ れらの実験は、離散的サンプル時間Ｓ(t_i)における時間−ドメインシグナルを生 成する。これらのデータに結びつけられているのは、最も好ましくはいくつかの 実験を行ない実験データの標準偏差としてσ(t_i)を計算することによって得られ る実験的誤差σ(t_i)、の推定値である。さほど好ましいことではないものの、誤 差を推定することは可能である。これらの実験は、標準的には、ｎを標準的に16 未満の小さい整数としτ_rを1回のローターサイクルの時間とし、Ｎを測定が行な われる最大ローターサイクルとして、離散的時間ｎτ、2ｎτ、3ｎτ、・・・、Ｎ ｎτにおいてデータを生成する。これらの離散的時間は、摂動パルスシーケンス と結びつけられ、双極子カップリングの効果の時間−ドメイン表現を有する。こ れらの実験においては、時間０におけるシグナルは、理論的にわかっている。 ＲＥＤＯＲならびにその他の双極子−脱位相実験は、当然のことながら、少な くとも二次元の実験である。1つの次元は、ローターサイクル数の増分により表 わされる。この次元は双極子カップリングの情報を支持している。もう1つの次 元は、ＮＭＲ自由誘導減衰シグナルの収集により表わされる。この次元は、化学 シフト情報を支持している。これらの次元は両方ともに、時間の関数であり、し たがって、我々は、二次元データ集合を時間−ドメインデータ集合と呼ぶ、さら に、ある種のケースにおいては、摂動パルスシーケンスは、 その構造を制御する付加的な内部時間パラメータを有していてよい。これらの付 加的な時間パラメータは、付加的な情報を支持する付加的な1つの次元であり得 る。 本発明は、重要な態様において、これらの一次元、二次元およびさらに高次元 の時間−ドメインデータ集合の解析に向けられている。この解析の1つの重要な 態様は、ここで「双極子−脱位相変換」と呼ばれている、スペクトル−ドメインデ ータから時間−ドメインデータへの変換である。本発明の一実施態様において、 双極子−脱位相変換は、最大エントロピー技術に基づいている。この実施態様を 応用するためには、スペクトル−ドメインデータから対応する時間−ドメインデ ータを計算する方法以外は、ＮＭＲ実験について何ら知る必要がない。このよう な方法があれば、観測された時間−ドメインデータに基づき、最大エントロピー の実施態様により、最も確率の高いスペクトル−ドメインデータの計算が可能と なる。 もう1つの実施態様においては、双極子−脱位相変換は、ＲＥＤＯＲ変換とし て知られている直接解析変換技術に基づいている。この実施態様は、双極子−脱 位相角度が式3の関数形態を有するすべてのＮＭＲ実験に適用可能である。 ここで、Ｄは双極子カップリングであり、ｎはローターサイクル数であり、α およびβは、ＭＡＳローター内の核間ベクトルの向きを説明する方位角および極 角度であり、τ_rはローター周期(ＭＡＳ周波数の逆数)である。回転−エコー2重 共鳴(ＲＥＤＯＲ)実験は、この形の双極子脱位相を有する。同じ形の脱位相を有 するその他の実験としては、マジック角における双極子再カップリング(ＤＲＡ ＭＡ)(Tycko et al.，1990，Chemical Physics Letters 173:461-465;Tycko et al.，1993，Journal of Chemical Physics 98:932.943)、ウィンドウレスシーケ ンスでの双極子再カップリング(ＤＲＡＷＳ)(Gregory et al.，第36回実験的核 磁気共鳴会議:Boston，MA，1995:P289)、スピンロッキングとＤＲＡＭＡの融合( ＭＥＬＯＤＲＡＭＡ)(Sun et al.，1995，Journal of Chemical Physics 102:70 2〜707)、といった同核技術および伝達エコー2重共鳴(ＴＥＤＯＲ)の対称的バー ジョン(Hing et al.，1993，Journal of Magnetic Resonance，Series A103：15 1-162;Hing et al.，1992，Journal of Magnetic Resonance 96:205-209) という異核技術が含まれるが、これらに限られるわけではない。 これらのＮＭＲ技術のより詳細な例示として、回転−エコー2重共鳴(ＲＥＤＯ Ｒ)および一次元ＲＥＤＯＲシグナルの生成を考える。ＲＥＤＯＲ実験において は、曲線ΔＳ/Ｓ₀（ここでΔＳはＳ₀−Ｓである)にたどりつくため、2つのデー タ集合Ｓ₀およびＳ、が収集される。両方のデータ集合共、ローター速度と呼ば れる特定的なマジック角スピニング速度で収集される。図1には、ＲＥＤＯＲに ついてのパルスシーケンス例を示す。Ｓ₀の実験においては、観測されたチャン ネル(たとえば¹⁵Ｎ)に対し、角集束ＲＦ(無線周波数)パルスが適用され、観測さ れていないチャンネル(たとえば¹³Ｃ)にはいかなるパルスも適用されない。観測 されていないチャンネル上にパルスが存在しない場合、異核双極子カップリング は、マジック角スピニングによりゼロに平均される。観測されたまたは観測され ていないチャンネルに対しＲＦパルスが適用された時点で、Ｓと呼ばれる第2の データ集合が収集される。観測されていないチャンネル上に適用されたＲＦパル スの最終的な効果は、マジック角スピニングに起因する異核双極子カップリング の平均化を取消すことにある。Ｓ０およびＳの両方の実験において、パルスは、 ローター周期と同期で適用される。このようにして、ローターサイクルの数の一 関数としてプロットされたΔＳ／Ｓ₀曲線は、ＲＥＤＯＲ曲線を生み出し、異核 双極子カップリングに対する応答性をもつ。実験の実施においては、個々のΔＳ /Ｓ₀点が、算術的に増分されたローターサイクル数で収集される。図2は、400Ｈ ｚの双極子カップリング、5000Ｈｚでのマジック角スピニングについて生成され 、4回のローターサイクル毎に1つのΔＳ/Ｓ₀点を収集する理論上のＲＥＤＯＲ実 験の結果を表わすデータ点203を例示する。垂直軸202は、ΔＳ/Ｓ₀の値を記録し 、水平軸201はローターサイクルの数を記録する。図3は、図2中のΔＳ/Ｓ₀デー タ点の逆数であるＳ/Ｓ₀データ点303を例示する。この図では、垂直軸302は、Ｓ /Ｓ₀の値を記録し、水平軸301はローターサイクルの数を記録する。 図1は、ＲＥＤＯＲ実験についての1つのパルスシーケンス例を示す。この図で は、曲線110は、¹Ｈ周波数チャンネ内に適用されたＲＦ放射線を表わし、曲線11 1は¹⁵Ｎ周波数チャンネル内のＲＦ放射線を表わし、曲線112は、¹³Ｃチャンネル 内のものを表わす。さらに詳細には、図1を参照すると、Ｓ₀およびＳの両方の実 験についてのパルスシーケンス内の最初の段階は、₁Ｈチャンネルに対するπ/2 パルス101の適用である。このパルスの直後に、連続ＲＦ放射線102が１Ｈチャン ネルおよび観測されたチャンネル、つまりここで は¹⁵Ｎに適用され、干渉偏波を介して¹Ｈ核から観測された¹⁵Ｎ核まで偏極を伝 達する。干渉偏波rfの場が適用される時間的長さは、干渉偏波最大値を探索する ことによって経験的に決定される。標準的には、干渉偏波rf場がオン状態に残さ れている時間的長さは、約１ｍｓｅｃである。実験の残りの部分については、デ カップリング放射線107が¹Ｈチャンネル内で適用される。 次に、Ｓ₀実験のためのデータ収集は、算術的に増大するローターサイクル数 ｎで一連のスピン−エコー実験を行なうことからなる。スピン−エコーは、ｎ回 のローターサイクルの後、πパルス103を適用することによって生成される。ス ピン−エコーに対応するＦＩＤ１０4の収集は、2ｎ回のローターサイクルにおい て起こる。ＲＥＤＯＲ実験はマジック角スピニングの間に実施されることから、 πパルスは、ローター周期と同期で適用される。本発明において記述されている 特定の例においては、ｎは2だけ増分され、データ集合が、4回、8回、12回・・・、 108回、112回のローターサイクルで収集されたスピン−エコーＦＩＤで構成され るようになっている。 Ｓ実験のためのデータの収集は、観測された¹⁵Ｎチャンネル上での一連のスピ ン−エコー実験であるＳ₀実験と類似の要領で進められるが、観測されていない チャンネルに対し適用される付加的なローター同期πパルスの摂動を伴う。Ｓ実 験における観測されていないチャンネル上のパルスは、観測されたチャンネル上 にパルスが適用されるローターサイクルおよびデータ収集が始まる最終ローター サイクルの終りを除いて、ｎ/2回のローター周期105毎に、かつローター周期106 の倍数において適用される。実験は、Ｓ₀実験の場合と同様に、同一のローター サイクルにおけるスピン−エコーの収集を伴って進められる。 一次元処理のためには、さまざまなローター周期数の後に収集されたＦＩＤは 、フーリエ変換され、選択された観測されたチャンネルの化学シフト共鳴のピー ク高さがＳ₀中のＳの値として用いられる。このようにして、これらは各々のロ ーター周期について2つずつの、2つの値系列を形成する。二次元処理のためには 、すべてのデータが保持される。このようにして、Ｓアレイ1つとＳ₀アレイ1つ の2つの方形データアレイが存在する。各々のアレイは、さまざまな数のロータ ー周期後に収集されたすべてのＦＩＤを有し、一方各々のＦＩＤは、離散的時間 でサンプリングされた自由誘導崩壊シグナルからなる。 本発明に従ったデータ解析は、主としてスペクトルＭ(ν)とデータＳ(t)を結 びつけるこ とからなる。νという語は、双極子カップリングを意味することができ、その場 合スペクトルＭ(ν)は周波数ドメイン内にある。あるいは、この語は特別の距離 を表わすこともあり、その場合スペクトルＭ(ν)は距離ドメイン内にある。いず れのドメイン内のスペクトルも、式1により直接関係づけされる。いずれの場合 でも、スペクトル値は、分布中の密度を表わし、したがって負でない実数でなく てはならない。 好ましいコンピュータ実施においては、スペクトルＭ(ν)は、位置または周波 数のいずれかの点の疎系列ν₀、ν₁・・・・・・、ν_Mにおける1組の値として表わされ る。この離散的なＭ(ν)の表現においては、それを超えるとＭ(ν)がゼロである ような仮定上の最大値ν_Mが存在する。この最大値は好ましくは、実験的シグナ ルに寄与すると予想される値のうちのいずれよりもはるかに大きいものとして選 択される。最終的な計算上のスペクトルが、ν_Mに達する前にゼロまで崩壊する か否かを観測することによって、最大値についての選択を検査することが可能で ある。崩壊しない場合、解析を、最大についてより大きい値を用いて反復するこ とができる。 これらの離散的点での値全体にわたる和として連続的Ｍ(ν)にわたる積分を表 現するには、標準的な求積技術を用いることができる。すなわち、式4の積分は 、式5の和として評価できる。 ここではＭ_jは、ν_jにおけるスペクトルの値Ｍ(ν_j)であり、係数Δ_jは、(ν_{j +1} −ν_j-1)/2としてとることのできる距離尺度である。最初の位置については( Δ₀＝(ν₁−ν₀)/2を使用し、最後の位置についてはΔ_M＝(ν_M−ν_M-1)/2を使用 することが好ましい。この選択は、台形公式に対応する。その係数Δ_jについて のその他の選択もシンプソンの公式およびボーデンの公式にしたがって行なうこ とができる。好ましくは、離散的点の間の間隔は、それが連続分布に対する信頼 性の高い代用物として性能を示すように、充分小さいものである。この条件は、 実際には、点間距離を減少させながらスペクトル内の点の数を倍増させ、この方 法により生成される最終スペクトルに有意な変化があるか否かを観測 することによって検査できる。好ましくは、離散的点の数は、少なくとも150、 より好ましくは200以上である。Ｓ(t)またはその他の数量全体にわたる積分は、 類似の要領で処理できる。 より一般的に言うと、本発明の積分は、その他の求積技術によって評価可能で ある。たとえば、このような技術において、Ｍ(ν)は といった基底関数の和として表わされ、式4のような積分は、 といった積の和として評価される。 なお式中、は求積加重値である。このような表現は、当業者にとって周知のものである(Pre ss et al.，1994;Numerical Recipes in Ｃ:The Art of Scientific Computing ，Cambridge Univ．Press，New York，Chap．4)。本発明における積分の評価は 、このような積分を密に近似するようなあらゆる求積技術に適合できるものであ る。前述の好ましい表現は、点ν_jを中心とするデルタ関数として関数φ_jをとる ことに対応する。 最後に、当該技術分野において周知であるように、式4および6のもののような 積分、および式5および7のもののような和は、Ｍ()の値において線形である。す なわち、すべてのＭ()値に1つの定数を乗じることにより、積分または和が同じ 定数で乗じられることになり、Ｍ( )およびＭ'( )の和の積分または和は、別々 にＭ( )およびＭ'( )の各々の積分または和の和である。本明細書では便宜上、 束縛変数または独立変数の名前が重要でない場合には、「Ｆ」という名の関数を単 純にＦ( )により表わすことができる。 次に、スペクトルＭ(ν)をその対応するシグナルＳ(t)に関係づけする変換が なくてはならない。最大のエントロピーについては、この変換が1つのカーネル として表わされるこ とが好ましい。Ｋ(t，ν)と表現されるこのカーネルは、式6または7により定義 づけされる。 積分は、それを超えるとスペクトルが好ましくはゼロになるものとして取られ る最大値ν_Mで打切られる。あるいは、かつより一般的には、式6の積分は、求積 基底関数およびカーネルＫ(t，ν)に左右される求積加重が関与する積の和とし て表わすことができる。 νが周波数に対応するとき、ＲＥＤＯＲ実験のためのカーネルは、式8により 求められる。 νが距離に対応するとき、このカーネルは式9により求められる。 (Mueller，K.T.，1995,Journal of Magnetic Resonance，Series Ａ 113:81-9 3)。本発明のＲＥＤＯＲ変換実施態様については、ＮＭＲ実験は、式8または9の 形のカーネルにより支配されなくてはならない。 式9の場合、カーネルは、距離νがゼロに接近する限界内で無限に発散する。 しかしながら、分子内の核はつねに少なくとも1Å以上の結合距離だけ分離され ることになるため、この発散は、いかなる影響ももたらさない。このようにして 、距離−ドメインスペクトルを使用するときには、スペクトルの離散的表現中の 最初の点のための好ましい下限としてν₀＝0.5Åを使用し、より小さい距離につ いては、スペクトルをゼロにして考えることが好ましい。距離ドメイン内のＭ(r )と周波数ドメイン内のＭ(ω)の間の関係は、次の通りである。 なお式中、Ｍ(ω)は周波数Γ/r³で評価される。 5.2．最大エントロピー実施態様 特に薬物発見の分野に向けられた、分子構造の決定のための本発明の実施態様 は、情報理論の原則に基づいている。情報理論は、予め規定されたデフォルト(d efault)または予想されるスペクトルｍ(ν)との関係において可能なかぎり最大 のエントロピーをも有しながら実験データを最も良く再現するようなスペクトル を選択することを提案している。この選択は、可能なスペクトルに関しておよび 規則化パラメータαに関して、数量αＥ−Ｘ²/2を最大化することによって行な われる。ここで、Ｅは、デフォルトスペクトルに関して可能なスペクトルのエン トロピーであり、Ｘ²は、可能なスペクトルから予測されたデータに対する実験 データの近さを測定する1関数である。 この実施態様が必要とするＮＭＲ実験についての唯一の情報は、スペクトルド メインシグナルから観測された時間−ドメインデータをどのように予測するかで ある。これを式6および7といった式にしたがって行なうことができる場合、必要 であることは、カーネルＫ(t，ν)の表現のみである。この表現は、関数形態と してでもよいし、その数値を計算するための方法としてであってもよい。 エントロピーＥは、式11によって与えられる。 スペクトルが離散値ν₁でのみ規定される好ましい離散的表現においては、ｍ( ν₁)はｍ₁と表わされ、Ｍ(ν_j)はＭ_jと表わされる。このときエントロピーは式1 2によって与えられる。 ここで加重値Δ_jは、好ましくは台形公式求積技術(trapezoidal rule quadrat ure technique)にしたがって既に与えられたものである。より一般的には、記述 されている通り、好ましいデルタ関数基底以外の基底関数の組の和としてＭ( ) およびｍ( )を表現する ことによって導き出される、その他の求積技術にしたがって式11の積分を表現す ることが可能である。Ｍ(ν)＝ｍ(ν)の場合、エントロピーは0という最大値を とる。関数Ｘ²は式13により定義づけされる。 ここでＳ₁は、時間t₁における実験測定値でありσ₁は時間t_iにおける実験的誤 差または標準偏差である。Ｓ₁は、式14による連続的表現および式15による離散 的表現の中で与えられるスペクトルから予測されるデータである。 ＮＭＲ実験について必要とされる唯一の情報は、これらの式を評価するのに必 要なカーネルの値またはこれらの値を計算するための方法である。規則化パラメ ータαの特定の正の値について、αＥ−Ｘ²/2を最大化することによってスペク トルが得られる。好ましい離散的表現においては、この最大化は、各々のＭ_jの 負でない値全体にわたるものである。 情報理論は同様に、αがその最も確率の高い値に達した時点で満たされる一対 の首尾一貫した式をも提案する。第1のものは、式16により得られる古典的最大 エントロピー条件である。 第2のものは、式17により定義づけられる「優良」データ点の数Ｎ_goodである。 値λ_Jは、(Ｍ＋1)×(Ｍ＋1)行列Ｃの固有値である。好ましい離散的表現の中 のこの行列は、式18および19から得られる。 行列Ｃは、エントロピー計量内の関数Ｘ²の曲率である。 最大エントロピー実施態様に従った処理は、最大エントロピー方法の好ましい 実施の流れ図を示す図15を参照すれば最も良く理解できる。現行の実施ではステ ップ1512が実施されないことに留意されたい。この実施では、αの各々の値につ いてのエントロピー最大化スペクトルが直接的最大化技術により決定されるのに 対し、規則化パラメータαについての首尾一貫した式の対は、反復によって満た される。 主要な計算の前にいくつかの予備的ステップが行なわれる。ステップ1501は、 カーネルＫ(t，ν)によって特徴づけされるＮＭＲ実験である。これは、ステッ プ1502で実施され、誤差推定値σ_i＝σ(t_j)により特徴づけされる測定データSi ＝Ｓ(t_i)を結果としてもたらす。この実施態様は好ましくは、いかなる平滑化も 基底線またはオフセット補正もない未処理の実験データに適用される。ノイズデ ータの場合、当該技術分野において知られているような、結果として得られるス ペクトルの中の人為構造(artifact)を減少させるため、経験的に決定された量の 平滑化を行なうことができる。ステップ1503は、可能なスペクトルの充分に密な 離散的表現を選択する。ステップ1504は、デフォルトスペクトルを選択する。好 ましい実施態様においては、デフォルトスペクトルは、一定であると考えられる 。この実験クラスは同様に、時間ゼロで標準化されたシグナル1を発生し、好ま しいＮＭＲ実験について、1ｉｍ_t-0Ｋ(t，ν)＝1であることから、デフォルトス ペクトル、ｍ(ν)は好ましくは1/ν_M(ここでν_Mはスペクトル内の最大周波数で ある)である。 最後に、予備的ステップ1505は、正規化パラメータのための初期値を選択する 。好ましくは、Ｎをデータ点の合計数として、Ｎ^-3からＮ³までの範囲の値の幾 何級数について、後述するようにαＥ−Ｘ²/2を最大化にすることによって、α についての初期値が選択される。αについての初期値は、Ｎ_goodが、−2αＥに 最も近い値である。好ましくは、20未満、さらには10未満のわずかな評価しか必 要でない。好ましい他の実施態様においては、αについてたとえば1といった初 期値が任意に選択され、首尾一貫性について反復探索を開始させる。この実施で は、α'−αの差が大きい場合またはいずれかのステップにおいてα＜０である 場合、後述するように、収束係数を利用することが好ましい。 この反復は、αＥ−Ｘ²/2を最大化するスペクトルを発見するステップ1505を 開始させる。最大化技術としては、数多くのものが考えられる。最大化技術の唯 一の必要条件は、それがスペクトルについて正の値を維持するということである 。好ましい技術では、Ｍ_jに関するαＥ−Ｘ²/2の導関数を必要とするダヴィドン −フレッチャー−パウエル法(Davidon-Fletcher-Powell method)が利用される。 これらの導関数は、式20により得られる。 それほど好ましくはない最大化技術は、ブロイデン−フレッチャー−ゴールド ファーブ−シャンノ法(Broyden-Fletcher-Goldfarb-Shanno method)である。本 発明は、第2の導関数を必要とするものを含むその他の最大化スキームにも適合 可能である(Presset al．1994、Numerical Recipes in C:The Art of Scientifi c Computing. Cambridge Univ．Press，New York，Chap．10)。最大化の後、各々 のＭ_j＞０であることを検査することも好ましい。好ましい技術の実際的使用に おいては、負の値に遭遇したことは一度もない。計算の不安定性を避けるため、 約10^-60といったカットオフ値よりも小さいすべてのＭ_jを10^-60に設定すること が好ましい。この方法は、どんなに小さなカットオフ値にでも適合可能である。 ステップ1507は、行列Ｃの固有値を発見する。Ｃのような実際に対称な行列の 固有値を得るための計算技術は、当該技術分野において周知であり、だれでも使 用可能である。好ましい技術は、ヤコビ法(Jacobi method)である。それほど好 ましくはないもう1つの方法は、ギヴンス−ハウスホルダー法(Givens-Household er method)である。(Press et al.，Chap．11)。 ステップ1508は次に、αの現行値に基づいて式21にしたがってαの新しい値を 計算する。 この実施においては、ステップ1512は実施されない。 ステップ1509は、αについての収束基準をテストする。好ましい基準では｜α −α'｜ がαに比べて小さいか否かを検査する。好ましくは、これらの値の比率は約10^-6 未満である。それほど好ましくはないもう1つの収束基準は10^-4である。この基 準が満たされたならば、反復はステップ1511で終結し、スペクトルの現行値は、 予測された最も良く適合したスペクトルとなる。この基準が満たされない場合、 αは新しい値αに設定され、ステップ1506においてプロセスが再開する。次の反 復ステップについては、新しい計算による最大化のための出発点としてスペクト ルの古い値を使用することが好ましい。同様に、スペクトルが準安定最大値の中 にトラップされた場合、新しい反復を開始する前に、最大のM_j値との関係におい て好ましくは1％の少量のランダムノイズを付加することも好ましい。 あるいは、必要な場合に収束を助けるために収束係数を使用することが可能で ある。収束係数を実現するための好ましい形態は、αをα＋f(α'−α)で置換す ることであり、ここで分数fは0と1の間にある。 あるいはまた、反復が終了した時点で、実験誤差 σ₀、σ₁、・・・・、σ_Nの確 率について検査を行なうことができる。この検査は、データ点の合計数Ｎが、式 17により定義される優良データ点の数であるＮ_goodとＸ²として定義される不良 データの数であるN_badの和に等しいものであるべきという点に関する。 和Ｎ_good＋Ｎ_badは好ましくはＮの10％以内にあるべきである。 誤差推定値を最適化する他の実施態様 最大エントロピー態様の最も好ましい代替的実施においては、実験データ点に おける実験誤差σ:および規則化パラメータαは、ともに最適化される。この実 施では、各点における誤差は、γ_σσ_iという形態をもつものと仮定される。な お、ここでσ_iは、実験誤差の初期推定値であり、γ_σは、各々のσ_iに適用され る全体的誤差スケーリング係数である。全体的スケーリング係数γ_σと規則化パ ラメータαは同時に最適化される。 この最適化は、同様に、好ましくは図15に例示されている流れ図にしたがって 反復的に行なわれる。予備的ステップ1501、1502、1503および1504は、前出の実 施の場合と実質的に同様に実施される。ステップ1505は最初に、前述の方法によ り、αを適切 な値に設定する。あるいは、1/Ｎ〜Ｎの範囲内の任意の値(例えば1)を使用する ことができる、γ_σの初期値も同様に適切な値に設定される。γ。のための好ま しい初期値は１であり、これは、誤差推定値が当初から正しいと仮定されること を表わしている。 各々の反復サイクルはまず第1に、前出の実施と実質的に同じ計算を実施する 。ステップ1506は、αＥ−Ｘ²/2を最大化するスペクトルを発見し、ステップ150 7は、行列Ｃの固定値をλ_jを計算する。ステップ1508は、式23にしたがって、前 出の実施と類似の形でαの新しい値を設定する。 なお、ここで、エントロピーＥは、前出の通りに計算される。ただし、Ｎ_good は式17ではなく、式24にしたがって異なる形で定義づけされる。 さらに、ステップ1512はこの実施では、式25にしたがってγ_σの新しい値を計 算するために実行される。 式25は、Ｎ＝Ｎ_good+Ｎ_badという関係式と、式26に従った不良データ点の数に ついての定義の組合せから得られる。 反復の出発時点では場合によって起こりうるものであるが、スペクトルが収束 に近い時には発生し得ないＮ_good＞Ｎ、という状態の場合、γ_σの古い値が、そ の後の反復のために保持される。 前出のものと同様、テスト1509は、収束基準が満たされるまで反復サイクルを 続行する。 しかしながら、この実施においては、αおよびγ_σの両方の値の相対的変化は、 好ましくは小さいものである。好ましい収束基準は、10^-6分の1のαおよびγ_σ の両方の反復サイクルの変化である。10^-4分の1の変化は、これほど好ましくは ない。 γ_σの最終的収束値は、初期誤差推定値が理にかなったものである確率を表わ している。0.3と3の間のγ_σの値は、信頼できる初期誤差推定値の典型的なもの である。この場合、最大エントロピー法は、ＮＭＲ実験誤差推定値測定または実 験自体を再検査し再実施する必要があるという指示を全く提供しない。0.09未満 または9を上回る値は、初期誤差推定値が信頼できるものでない確率が高いこと を表わしている。この後者のケースでは、最大エントロピー法は、少なくともＮ ＭＲ実験誤差推定値の測定を再検査し再実施する必要があることを提案する。こ のような検査には、実験自体の再検査または再実施が関与し得る。 第7節には、Ｃ言語でのコンピュータプログラムコードにおける最大エントロ ピー態様の両方の実施態様の実施が含まれている。固定値を獲得し(ルーチンeig rs)、最大化を行ない(ルーチンdfpmin)、ＲＥＤＯＲタイプのカーネルの一部を 計算する(ルーチンbessjy)のため、さまざまな標準的ライブラリルーチンが利用 される。ルーチン例は、容易に入手可能である(Press et al.，1992．Numerical Recipes in Ｃ:The Art of Scientific Computing，Cambrige University Pres s，New York，Chap．6，10，11)。あるいは、実質的に同じ機能を果たすその他 のルーチンも使用可能である。 5.3 ＲＥＤＯＲ変換の実施態様 特に薬物発見の分野に向けられた分子構造決定のための本発明のもう1つの実 施態様は、式8および9のカーネルで式6および8を逆転させることに基づく。これ らの式を逆転させる変換は、時間−ドメインＮＭＲデータを、式1により与えら れる双極子結合周波数を表わすスペクトル−ドメインデータに変換する。ここで はＲＥＤＯＲ変換と呼ぶこの変換は、式27および28によって得られる。 ここで、積分の中で、Ｄは双極子結合でありｋ(t，Ｄ)はＲＥＤＯＲ変換のカ ーネルである。この変換は、1−ΔＳ/Ｓ₀と同じである、Ｓ/Ｓ₀の形をしたデー タに適用される。離散近似に おいては、ｎはローターサイクル数であり、Ｎはデータが存在する最大ローター サイクル数であり、τ_r、ＭＡＳ回転速度の逆数である。ＲＥＤＯＲ変換カーネ ルは、式29により求められる。 ここで、Jは、第1の種類の指示された分数の円柱形ベッセル関数(cylindrical Bessel function)である。(Mueller et al.，1995，Chemical Physics Letters 242，535-54)。この変換は、式8および9のカーネルの関数形態のみに左右され ることから、これは、双極子結合を測定し、同じ関数形態をもつすべてのＮＭＲ 実験に適用可能である。 この実施態様は、好ましい実施において以下の段階を包含する。第1の段階は 、補正されたＳ/Ｓ₀データを補正する。これらのデータは、標識された部位と同 じ化学シフトを伴う、天然に豊富に存在する、典型的には¹⁵Ｎまたは¹³Ｃといっ た観測された核の効果を排除するように補正される。これらの天然に豊富な核は 、Ｓ₀およびＳデータに対する望ましくないシグナルを与える。補正の最終目的 は、ΔＳ/Ｓ₀曲線が、最大ローターサイクル数で1まで進み、このようにしてＳ/ Ｓ₀曲線がゼロへと進むようにすることにある。このことは、まず第1に、測定さ れたＳ₀およびＳをΔＳ/Ｓ₀データへと変換し、次に適当な係数をΔＳ/Ｓ₀デー タに乗じてそれらを大きなローターサイクル数で1にすることによって行なわれ る。補正後、式30の関係からＳ/Ｓ₀が見い出される。 図2は、0〜130のローターサイクル範囲にわたる、補正済みのΔＳ/Ｓ₀データ の例を示す。図3は、対応するＳ/Ｓ₀データ点を例示する。 次の段階は、必要に応じてＳ/Ｓ₀データを平滑化する。当該技術分野において 既知であるように、平滑化は、シグナル内のノイズに起因する望ましくない人為 構造を回避するが、過度の平滑化はスペクトルを広くする。任意の特別な実験に おける平滑化の正確な量は、試行および誤差により、このような人為構造を避け るための最小限の平滑化であるものとして決定できる。好ましい平滑化関数は、 式31により与えられる3点ブラックマン −ハリス関数(3-point Blackman-Harris function)である。 ここでＮはローターサイクルの合計数であり、ｎは個々のデータ点のローター サイクル数である。その他の適切な平滑化関数としては、指数的な線の広がり、 式32から得られるハミングウインドー(Hamming window)、 および式33から得られるカイザーウインドー(Kaiser window)が含まれる。 ここでＩ₀は、ゼロ次の修正ベッセル関数(modified Bessel function)である 。 最後の工程では、式28の近似積分を実施することによって、スペクトルが計算 される。カーネルテーブルは、特定のＭＡＳ回転速度、サンプリング増分(1点あ たりのローターサイクル数)、およびゼロＨｚからスペクトルの周波数帯域幅ま でである双極子結合の適切な範囲についての式28のカーネルの値を含んでいる。 変換の後、異核双極子結合と強度との関係の結果として得られたスペクトルがプ ロットされる。図4は、実験的データから得られた双極子結合のスペクトルを例 示している。この図は、添付の実施例の節で詳述されている。 本発明のこの実施態様の好ましい実施においては、次に、マッキントッシュ上 で実行されるMathematicaソフトウェアプログラム(Wolfram Research，Inc.)(Wo lfram，S.，Mathematica;コンピュータにより数学を行なうためのシステム;第二 版Addison．Wesley;New York，1991)内に、Ｓ₀およびＳの値が入力され、この上 で処理される。上述のステップをすべて含むＯＮＥ−Ｄ−ＴＲＡＮＳＦＯＲＭお よびカーネルテーブルを計算するためのコードを含むＫＥＲＮＥＬという2つのM athematicaファイルが、第7節に記載されている。データを処理するその他の適 切な方法としては、Ｃ言語といったよう な言語でのプログラミングが含まれる。 ＲＥＤＯＲ以外の異核および同核双極子−脱位相方法に対するこの方法の応用 が、当業者には明白であろう。 5.4 対称ＴＥＤＯＲ 先に論じたように、天然に豊富に存在する核からのシグナルは、特に本発明の ＲＥＤＯＲ変換態様の場合、ＮＭＲデータから除くことが好ましい。本発明には 、天然に豊富に存在する核からのシグナルを減らす、または除く実験設計を使用 することが好ましい。対称ＴＥＤＯＲは、天然に豊富に存在するバックグラウン ドシグナルを除き、かつＲＥＤＯＲ変換態様に適用しやすい一つのそのような好 ましい実験設計である。ＴＥＤＯＲは、一般的に実施される形では、双極子脱位 相角の関数形態が式3に準じず、よって誤りであるため、ＲＥＤＯＲ変換態様に は適していない。しかし、ＴＥＤＯＲ実験の対称バージョンは、双極子脱位相角 にとって正しい関数形態を有している。したがって、本発明の実施態様はいずれ も対称ＴＥＤＯＲデータに適用することができる。 図7は、対称ＴＥＤＯＲ実験の好ましい実施態様で使用されるパルスシーケン ス(pulse sequence)を示す。他にも適当なＴＥＤＯＲパルスシーケンスが当該技 術で公知である。この図では、曲線701、702および703が、それぞれ¹Ｈ、¹⁵Ｎお よび¹³Ｃ周波数チャンネルにおけるＲＦ放射のパルスの印加を表す。このＴＥＤ ＯＲパルスシーケンスの例では、¹³Ｃが観測される核であり、¹⁵Ｎが観測されな い核である。当業者にとって、¹³Ｃが観測されない核であり、¹⁵Ｎが観測される 核である同様なパルスシーケンスを構成する方法は明白である。 ＴＥＤＯＲ実験は、二つの完全なデータセットの収集を要するＲＥＤＯＲ実験 とは違い、1セットのデータ点Ｓ_kしか収集しない。Ｓ_kデータセットは、サイク ル数を変えるためにさらなるローター同期パルスが両チャンネルに印加されたの ちに取得される。図7のローターサイクルカウントｍおよびｎは、それぞれ、追 加πパルスが観測されるチャンネルおよび観測されないチャンネルに印加される 期間を表す。対称ＴＥＤＯＲ実験では、ローターサイクルカウントｍおよびｎは 、別々の観測データ点Ｓ_kを発生するために、同じ整数デルタ、たとえばｋだけ 増加される。一般的なＴＥＤＯＲ実験では、ｍおよびｎは、互いに独立して変化 させることができる。 詳細には、ＴＥＤＯＲパルスシーケンスは、π／2パルスを¹Ｈチャンネルに印 加すると同 時に始まる。このパルスの直後に、連続的なＲＦ放射を¹Ｈチャンネルおよび観 測されないチャンネルに印加して、¹Ｈ核からの偏波を干渉偏波を介して観測さ れない核に移す。干渉偏波rfフィールドが印加される期間の長さは、干渉偏波最 大値を求めることによって経験的に決定される。通常、干渉偏波rfフィールドが オンのままである期間の長さは1ｍｓｅｃのオーダである。実験の残りの部分で は、デカップリング放射線707を¹Ｈチャンネルに印加する。 実験は、ＭＡＳ速度と同期であり、ＭＡＳ速度の期間を有するπパルス708お よび709を両チャンネルに印加することで進行する。さらなるローター同期πパ ルス、好ましくは2個のさらなるパルス710および711が、ローター期間あたり、 ローター期間の1／4および3／4において観測されるチャンネルに印加される。観 測されるチャンネルに印加されるさらなるπパルスの効果は、異核に双極子カッ プリングしているときだけ、ある形態のスピンコヒーレンスを観測されない核に 生成することである。ｍローターサイクルの間、さらなるパルスが印加される。 そして、このスピンコヒーレンスを双極子カップリング異核に移すため、同時π ／2パルス712および713が両チャンネルに印加される。事実上、偏波転送である これらのパルスの後、ほぼ714にあるさらなるπパルスが、観測されるチャンネ ルに印加されたのと同じようにして、観測されないチャンネルにも、ｎサイクル だけ印加される。これらのさらなるπパルスは、スピンコヒーレンスを観測され る核における観測可能な磁化に変換する。ｍ＋ｎローターサイクルの後、ＦＩＤ 715が収集されると、実験は終了する。対称ＴＥＤＯＲ実験のデータの収集は、 ローターサイクルカウントｍ＋ｋおよびｎ＋ｋで一連の実験を実行することから なる(ｍおよびｎは定数であり、ｋは増分する)。 この対称ＴＥＤＯＲパルスシーケンスの効果は、ＦＩＤ715が収集されるとき の観測される核における磁化が、観測されない核に双極子カップリングしている 観測される核からのみ生じることである。 従って、ＮＭＲデータ点に対する自然存在率の影響はない。このデータは、自 然存在シグナルによるオフ集合を除くためにデータを修正する最初の段階を必要 とすることなく、ＲＥＤＯＲ変換態様に従って解析することができる。データは 、必要な平滑化の後、直接変換することができる。あるいはまた、未加工のデー タを、本発明の最大エントロピー態様に従って解析することもできる。 5.5 多次元解析法 観測される双極子カップリング共鳴に寄与する核を完全に決定するためには、 ＮＭＲデータを測定し、この節で説明する多次元法に従って処理することが有利 である。双極子脱位相データは本質的に二次元であり、そのように処理するのが 好都合である。さらに、本発明のＮＭＲパルスシーケンスは、三次元法によって 処理することが好都合である三次元時間−ドメインデータを生じさせる。 以下、「双極子脱位相スペクトル変換」とは、核双極子カップリングに応答す る時間−ドメインデータから、このカップリングを周波数−ドメインまたは距離 −ドメインで表すスペクトルデータへの変換をいう。この変換は、本発明の最大 エントロピー態様によって実施することもできるし、適切なパルスシーケンスの 場合には、本発明のＲＥＤＯＲ変換態様によって実施することもできる。 この節では、一次元、二次元および三次元のデータ生成・解析法を説明する。 これらは、観測磁化が、観測される核の双極子カップリング、その化学シフトお よび場合によっては観測されない核の化学シフトに応答する技術に基づく。この ような応答性は、時間−ドメインデータにおける時間可変性の独立次元によって 表される。これらは、双極子カップリングに応答する磁化を形成し、スピンエコ ーＦＩＤシグナルを生成し、磁化を観測されない核から観測される核に移すため のパルスサブシーケンスに基づく。当業者にとっては、より高次元の時間可変性 、例えば四次元、五次元またはそれ以上の次元の時間可変性を有する時間−ドメ インＮＭＲシグナルを生成するために、これらのパルスサブシーケンスをさらな るやり方で組み合わせる方法が明白であろう。さらに、記載したサブシーケンス を、当該技術で公知の他のサブシーケンスと組み合わせて、核磁気環境の他の局 面に応答する時間−ドメインＮＭＲシグナルを創造することもできる。そのよう なより高次元のシグナルは、当業者には明白になるであろう、本明細書に記載す る方法の延長によって解析することができる。特に、脱位相パルスサブシーケン スによって生成される双極子カップリングに感応性をもつ数の次元は、その数の 次元で双極子脱位相スペクトル変換を適用することによって解析することが好ま しい。種々の核の化学シフトに感応性をもつ数の次元は、その数の次元でフーリ エ変換を適用することによって解析することが好ましい。 5.5.1 二次元解析法 ＮＭＲデータは、二次元で処理し、提示することが有利である。このような提 示は、多数 の双極子カップリング周波数、ひいては多数の距離を、化学シフトした各スピン に相関させる(Ernstら、1990，Principles of Nuclear Magnetic Resonance in One and Two Dimensions，Clarendon Press，Oxford，Vol．14:610)。時間−ド メイン双極子脱位相データの好ましい二次元解析法は、化学シフト情報を運ぶＦ ＩＤ次元をフーリエ変換し、双極子カップリング情報を運ぶローターサイクル次 元を双極子脱位相スペクトル変換することにより、データの両方の数の次元を合 わせて変換する方法である。得られるスペクトルは通常、一方の軸が、ＲＥＤＯ Ｒ実験中に収集した各ＦＩＤシグナル中の周波数成分(通常はｐｐｍ単位)を表し 、もう一方の軸が、各化学シフトにおける双極子カップリング周波数成分(通常 はＨｚ単位)を表す二次元プロットして提示される。本明細書の説明は、ＲＥＤ ＯＲ実験を対象とするが、双極子脱位相スペクトル変換を伴う二次元解析法を、 ＲＥＤＯＲ以外の、異核および同核双極子脱位相実験に応用することは、当業者 にとって容易であろう。 二次元解析は、三つの主要段階、第一に二次元時間−ドメインデータ収集、第 二に時間−ドメインデータのフーリエ変換、そして第三にフーリエ変換したデー タの双極子脱位相スペクトル変換を含む。第一の二次元時間−ドメインデータ収 集段階は、5.1の節に従って実施される。得られる時間−ドメインデータは、2ｍ ×p値の二次元行列である(mは、Ｓ₀(およびＳ)点の数であり、ｐは、各ＦＩＤ中 のサンプルの数である)。第二の段階は、当該技術で公知であるフーリエ変換技 術によって実施することができる、各ＦＩＤのフーリエ変換である(Pressら、19 92，Numerical Recipes in c:The Art of Scientific Computing，Cambridge Un iv．Press，New York，Chap．13)。フーリエ変換したデータは、2ｍ×p点の二次 元行列である(ｍは、Ｓ₀(およびＳ)点の数であり、ｐは、化学シフトスペクトル 中の点の数である)。 最後に、第三の段階は、ｐ集合の2ｍＳ₀およびＳデータ点に双極子脱位相スペ クトル変換を適用する段階である。まず、2ｍＳ₀およびＳ値の各集合をＳ/Ｓ₀曲 線に変換する。双極子脱位相変換の最大エントロピー態様を選択する場合には、 このデータを、さらに手を加えることなく、その態様に入力する。ＲＥＤＯＲ変 換態様を選択する場合、ｐ個のＳ／Ｓ₀データ集合を、5.3の節に記したように、 △Ｓ／Ｓ₀の形態でオフ集合修正する。各Ｓ／Ｓ₀集合ごとに、特に、化学シフト スペクトルのピークに対応するものについて、別個のオフ集合修正を実施して、 各特定の部位の自然存在率の違いを考慮に入れることが好まし い。次に、同じく5.3の節に記したように、Ｓ／Ｓ₀データ集合を十分に均一に平 滑化する。最後に、ＲＥＤＯＲ変換を、ｐ個の修正し、平滑化したデータ集合に 適用する。双極子脱位相スペクトル変換のいずれかの態様の後、得られるデータ は、観測される核のｍ個の化学シフト値に相関したｐ個の異核双極子カップリン グ値を有する二次元スペクトルであるｍ×ｐ行列となる。 要するに、上述した一次元処理と二次元処理との違いは、一次元処理では、す べての時間−ドメインデータがたった1集合のＳ／Ｓ₀データに変換され、各デー タ値が、異なるローターサイクル数で選択された化学シフト共鳴のピーク高に対 応し、それが後で変換されることである。しかし、二次元処理では、ｐ個のＳ／ Ｓ₀データ集合が保持され、各集合がスペクトル中の各点に対応し、それらがす べて変換される。従って、フーリエ変換の後に生成される化学シフトスペクトル 中のｐ個の点ごとに別個の双極子カップリングスペクトルが生成される。 図9Ａ、9Ｂおよび9Ｃは、二つの異なる化学シフトを受けた観測される核¹⁵Ｎ_A および¹⁵Ｎ_Bが、1個の分子中に存在し得る2個および3個の¹³Ｃ異核に双極子カッ プリングしている例を示す。図9Ａは、式1に従って、約140ｐｐｍの化学シフト を有する¹⁵Ｎ_Aと、それぞれ3.0Åおよび4.0Åの距離にあり、約120Ｈｚおよび50 Ｈｚのカップリング周波数を有する2個の¹³Ｃ核との双極子カップリングを示す 。図9Ｂは、式1に従って、約430ｐｐｍの化学シフトを有する¹⁵Ｎ_Bと、それぞれ 2.7Å、3.5Åおよび4.2Åの距離にあり、それぞれ約150Ｈｚ、70Hzおよび40Ｈｚ のカップリング周波数を有する3個の¹³Ｃ核との双極子カップリングを示す。図9 Ｃは、得られる二次元スペクトルを示す。この図では、水平軸901が双極子カッ プリング周波数を表し、軸902が化学シフトを表す。ピーク905および906は、¹⁵ Ｎ_A観測される核の双極子カップリングから発生する。ピーク907、908および909 は、¹⁵Ｎ_B観測される核の双極子カップリングから発生する。スペクトル903は一 次元化学シフトスペクトルである。スペクトル904は、例えばすべてのＦＩＤデ ータを合計してＳ／Ｓ₀データを生成することにより、ＦＩＤ中の情報を無視し たならば得られるであろう一次元双極子カップリングスペクトルである。この一 次元スペクトルでは、50Ｈｚでの¹⁵Ｎ_Aの双極子カップリング906と、40Ｈｚでの¹⁵ Ｎ_Bの双極子カップリング909との重複により、ピーク910が未分解ピークであ ることが見てとれる。一次元スペクトルでは未分解であるが、これらは、それぞ れ140ｐｐｍおよび430ｐｐｍの非縮退化学シフトを明らかに有するため、二 次元スペクトルでは明確に分解される。従って、二次元スペクトルが一次元スペ クトルの曖昧さをいかに解くことができるのかを理解することができる。 5.5.2 準三次元相関解析法 一次元および二次元の解析法には一定の限界があり、そのような限界は、本発 明のさらなる方法、すなわち準および全三次元解析法によって解消される。一次 元解析法および二次元解析法の一つの限界は、観測されない核の部位に関する情 報を欠くことである。一次元または二次元スペクトルだけからでは、双極子スペ クトル中の特定のピークを生じさせる観測されない核の実体はわからない。先に 説明したＮＭＲシグナルは、観測されない核の特性には応答しない。以前の解析 法のさらなる限界は、縮退化学シフトを有する観測される核の双極子カップリン グどうしを区別できないことである。当該技術で周知であるように、化学シフト が異なる観測される核どうしは明瞭に識別することができる。しかし、縮退化学 シフトを有する観測される核の双極子カップリングどうしは区別することができ ない。 ときには、縮退観測される核および縮退観測されない核は、計測距離の観点か ら分子の幾何学形状を考慮することによって識別することができる。ある程度の 複雑さの特定の分子では、既知のタイプの核と核との間の特定の距離が、分子中 の核の部位を一意的に識別することができる。しかし、これら特定の核の識別が 曖昧であるとき、本発明の好ましい実施態様は、さらなる準または全三次元解析 の方法による解析を含む。 準三次元解析とは、すべての双極子カップリングが分解され、縮退していない 状況で適切な三次元解析の簡略化形態である。この状況では、この方法は、両方 のカップリングした異核の化学シフトを測定する。準三次元解析は、本発明のす でに記載した方法に従って異核対の各核の二次元スペクトルを測定することによ って進行する。目的の分子が¹⁵Ｎおよび¹³Ｃで標識されている例示的かつ一般的 な場合では、¹⁵Ｎの二次元スペクトルおよび¹³Ｃの二次元スペクトルを測定する 。各二次元スペクトルは、観測される核の化学シフトをその化学シフトと相関さ せる。さらに、同じ双極子カップリング周波数を有する二次元スペクトルの両方 におけるピークは、同じ対のカップリング核を表す。従って、特定のカップリン グ周波数でカップリングした両方の異核の化学シフトを、それらの個々の二次元 スペクトルから測定することができる。当該技術で公知であるように、カップリ ングした核の分子部位の識別は、それらの化学シフトから進行する。 図10は、¹⁵Ｎおよび¹³Ｃで標識された分子に適用された準三次元法を例示する 。¹⁵Ｎ二次元スペクトル1001が水平方向に描かれ、¹³Ｃ二次元スペクトルが垂直 方向に描かれている。軸1003は¹⁵Ｎ化学シフトであり、軸1004は相関双極子カッ プリング周波数である。同様に、軸1006は¹³Ｃ化学シフトであり、軸は相関双極 子カップリング周波数である。目的の分子の特定の標識の結果、4対の双極子カ ップリング核が生じている。¹⁵Ｎ二次元スペクトルでは、これらは、50Ｈｚでの 双極子共鳴1007、100Ｈｚでの双極子共鳴１008、200Ｈｚでの双極子共鳴1009お よび250Ｈｚでの双極子共鳴1010である。関連する¹⁵Ｎ核の化学シフトを軸1003 から読むことができ、分子の部位をこれらの化学シフトから識別することができ る。¹³Ｃ二次元スペクトルでは、50Ｈｚでの双極子共鳴1011が共鳴1007と同じカ ップリング異核対を表す。同様に、共鳴1012、1013および1014は、それぞれ共鳴 1008、1009および1010と同じカップリング対を表す。この関係は、関連する共鳴 どうしをつなぐ線によって示されている。カップリング対に含まれる¹³Ｃの化学 シフトを軸1006から読むことができ、分子の部位を識別することができる。例え ば、250Ｈｚの双極子カップリング周波数共鳴は、約98ｐｐｍの化学シフトを有 する¹⁵Ｎと、約80ｐｐｍの¹³Ｃとを含む。式1または図6によると、これらの異核 どうしは約2.2Å離間している。このようにして、準三次元解析は、非縮退双極 子カップリングに含まれる異核を一意的に測定することができる。 5.5.3 3 次元分析法 全３次元実験および分析法は、両方の異核の明白な部位同定のために、縮重化 学シフトまたは縮重双極子カップリング周波数でさえ、本発明のより好適な実施 例である。3次元法は、両方の双極子カップリング核の化学シフトと双極子カッ プリングの強さとに応答する3時間次元でＮＭＲシグナルを生成する異核および 同核パルスシーケンスを含む。これらの方法は、いずれか適切な実施例において 双極子脱位相スペクトル変換を適用して、カップリング核の化学シフトへ双極子 カップリングを相関させる３次元スペクトルを生成する分析方法をさらに含む。 化学シフトから、カップリング核の分子同定は、当業界で公知の方法によって決 定することができる。異核3次元法 異核3次元パルスシーケンスは、3時間次元に応答するＮＭＲデータを生成する が、3 時間次元のうち2つは双極子カップリング核の化学シフトを表し、第3の次元は双 極子カップリングの強さを表す。図11は実施例の3次元パルスシーケンスである 。この図において、曲線1101は¹Ｈ周波数チャンネルに印加されるＲＦ放射を示 す。曲線1102は¹⁵Ｎ周波数チャンネルに印加されるＲＦ放射を示し、曲線1103は¹³ Ｃ周波数チャンネルに印加されるＲＦ放射を示す。図11において、¹⁵Ｎは観測 核であり、¹³Ｃは非観測核である。¹³Ｃが観測核、¹⁵Ｎが非観測核となるように 、実施例のパルスシーケンスを変更する方法は、当業者には明らかであろう。 図11は概して、実施例のパルスシーケンスを、ほぼ1105、1106、1107に示され る３つの時間t₁、t₂、t₃に分割され、これらがすべて独立に変化して、3次元時 間ドメインＮＭＲシグナルを発生することができることを示す。時間t₃では、Ｆ ＩＤシグナル1104の時間展開は、当業者には知られているが、¹⁵Ｎ核の化学シフ トに応答する。時間ｔ₃では、パルスシーケンスは、シグナルが¹³Ｃの化学シフ トに応答するように設計される。最後に、時間t₂では、パルスシーケンスは、シ グナルが¹⁵Ｎ核と¹³Ｃ核との間の双極子カップリングの強さに応答するように設 計される。これらの要件を満たす時間t₁およびｔ₂のどんなパルスシーケンスも 使用することができる。特に、本発明の最大エントロピー実施例に従って双極子 脱位相スペクトル変換を行う場合、双極子カップリングを補足し、かつ周波数ド メインシグナルから時間ドメインシグナルを演算する方法を持つどんなパルスシ ーケンスも時間ｔ₂において使用することができる。本発明のＲＥＤＯＲ変換の 実施例に従って双極子脱位相スペクトル変換を実現する場合、脱位相角は、式３ に従って、式8および9の形の核を生成しなければならない。そのようなパルスシ ーケンスは、5.4節に記載のＴＥＤＯＲシーケンスの対称版を含む。図11および 以下で、時間t₂が図1のＲＥＤＯＲパルスシーケンスを使用する場合の3次元パル スシーケンスについて説明する。本発明は前述の双極子脱位相パルスシーケンス のどれにも適応できるので、これは限定されない。 さらに詳しく、図11に関して説明すると、実施例の３次元実験法では、時間t₁ のたびに、時間t₂およびt₃の完全な2次元ＲＥＤＯＲスペクトルが測定される。 これは、t₁のたびに、ＳおよびＳ₀データ点の完全な集合を収集すること、およ びそうしたデータ点のたびごとに標本化ＦＩＤシグナル1104を収集することを含 む。完全な２次元スペクトルは、0から最大時間まで連続的に増分しながら拡張 する時間t₁の間について測定される。増分および最大時間は、当技術分野におい て周知のように、ナイキスト標本抽出帯域幅が¹³Ｃの化学 シフトスペクトルの目的の区域を完全に包含するように選択される。そのように 選択されたt₁ごとに、π／２パルス1108を¹Ｈチャンネルに印加することにより 、実施例の3次元実験が開始される。このパルスの直後に、連続ＲＦ放射1109が¹ Ｈチャンネルおよび非観測チャンネル、本明細書では¹³Ｃに加えられ、偏極が直 交偏極を介して極を¹Ｈ核から非観測¹³Ｃ核へ転移する。これは、磁化が、¹Ｈか ら観測核へ直接転移する1次元および2次元実験とは異なる。これらの直交偏極Ｒ Ｆ放射電界が印加される時間の長さ、およびその後の¹³Ｃから¹⁵Ｎへの直交偏極 の転移が行われる時間の長さは、最大直交偏極を探すことによって経験的に決定 される。一般的に、直交偏極ＲＦ電界がオン状態に維持される時間の長さは、1ミリ 秒台である。 ¹Ｈからの偏極の転移後、¹³Ｃ核上の磁化が、¹³Ｃ化学シフトの影響下で、¹³ Ｃ核を時間t₁の間展開させる。この時間の間、3次元ＮＭＲシグナル非観測核の 化学シフトに応答する。時間t₁の期間の後、磁化は、直交偏極ＲＦ電界1110によ って非観測¹³Ｃから観測¹⁵Ｎへ転移される。次に、時間t₂およびt₃の期間に、2 次元ＲＥＤＯＲ実験が、節5.1におよび図1に関連して説明されるように実施され る。簡単に言うと、前述の通り、Ｓ₀実験は、一連のスピンエコー実験がロータ ーサイクルの算術的に増加する数であるときに行われる。ローター同期πパルス 1111は観測チャンネルにnローターサイクルで印加され、ＦＩＤは2nローターサ イクル後に観察される。Ｓ実験は概して1112で示され、非観測チャンネルに印加 されるローター同期脱位相パルスの追加の点を除いて一連のスピンエコー実験に 類似する。 適切な直核分検出により非観測核のスペクトルを得るために、ｔ₁の増分は、 時間比例位相増分(ＴＰＰＩ)(Ernestら、1990、Principles of Nuclear Magneti c Resonance in One and Two Dimensions;Clarendon Press:Oxford,Vol．14,pp. 610)法のt₁期間の前に直交偏極パルスの位相のサイクリングと共に行われる。Ｔ ＰＰＩ法において、直交偏極パルスの位相は、連続的なt₁の増分ごとに90°増分 する。ＴＰＰＩ法において¹³Ｃスペクトルの適切な帯域を達成するために、t₁は 毎25μ秒台でどこかで増分しなければならない。ＴＰＰＩ法は真の標本化増分の 半分の効果的標本化率を示し(従って25μ秒は50μ秒になる)、従ってスペクトル 帯域幅は20ｋＨｚである。非観測核のスペクトルの帯域幅の選択は経験的に行わ れる。本発明の重要な別の実施例では、適切な直角分検出によって、非観測核の スペクトルを得るために、ＴＰＰＩ法ではなくThe method of States (Ernstら、Vol．14,pp.610)が使用される。 次いで3次元ＮＭＲシグナルを、望ましい3次元分析法に従って処理する。実施 例の実験によって発生した完全な3次元ＮＭＲシグナルは、ｋ×2ｍ×p点の3次元 行列である。ここで、ｋはt₁点の数、ｍはＳ₀およびＳ点の数、pはＦＩＤ標本数 である。簡単に言うと、３次元分析法は、第1に、t₁時間値毎に一つの、一連の 完全な2次元スペクトルを形成し、第2に、t₁次元に沿ってこの一連の２次元スペ クトルのすべての対応点をフーリエ変換する。従って、kt₁値ごとに前述の方法 に従って、2ｍ×p点の2次元行列はｍ×p行列に転換され、これは観測核の化学シ フトに相関する異核双極子カップリングの2次元スペクトルである。このステッ プの後、中間データ行列はｋ×ｍ×pの3次元行列になる。ここで、ｋはt₁点の数 、ｍは異核双極子カップリングスペクトルの点の数、pは観測核の化学シフトス ペクトルの点の数である。 3次元分析法の最終ステップは、時間次元t₁に沿ってフーリエ変換によって中 間データを3次元スペクトルに転換することである。このフーリエ変換は、非観 測核の化学シフトスペクトルを回復する。フーリエ変換の前に、結果として得ら れるスペクトルが適切な位相関係を有するために、データはＴＰＰＩ法に従って 実および虚の標識付けをされる。このようにして、奇数のt₁点に対応するすべて の2次元スペクトルは実のデータとして標識付けされ、偶数のt₁点に対応するす べての2次元スペクトルは虚のデータとして標識付けされる。結果として得られ るデータ行列は、t₁次元は実と虚との標識付けによって半分に切断されたため、 今や効果的なｋ／２×ｍ×pである。最後に、2次元スペクトル毎のすべてのｍ× p点はフーリエ変換される。最終3次元スペクトルはｋ／２×ｍ×p行列である。 ここで、ｋ／２は非観測核の化学シフトスペクトル点の数、ｍは異核双極子カッ プリングスペクトルの点の数、pは観測核の化学シフトスペクトルの点の数であ る。 図１２は、前述の３次元実験の例示の標本３次元スペクトル図を示す。この図 では、軸１２０１に沿って３次元行列の双極子カップリング次元が示され、軸１ ２０２に沿って非観測¹³Ｃ核の化学シフトが示され、軸１２０３に沿って観測¹⁵ Ｎ核の化学シフトが示される。この図は、３次元スペクトルに表わした、非観測 核の化学シフトスペクトルと、異核双極子カップリング周波数および３次元スペ クトルに存在する観測核の化学シフトスペクトルとの相関を示す。標識付けされ た分子は、概して１２０４、１２０５、１２０６、１２０７で示される４つのス ペクトル共鳴を発生した。例えば共鳴１２０７は、約１００ｐｐｍの化学シフト を持つ¹³Ｃ核が約９８ｐｐｍの化学シフトを持つ¹⁵Ｎの核とカップリングされた 状態で、２．２Åの核間距離に対応する２５０Ｈｚの双極子カップリング周波数 で発生する。この情報から、特定の¹³Ｃ核にカップリングされた特定の¹⁵Ｎ核の 分子同定を、当業者は決定することができる。 ３次元スペクトルを２次元表面に正しい相関関係で表わした図12のような斜視 図は有利である。このような斜視図により、３次元スペクトルの構造および内容 をすぐに理解することができる。 同核３次元法 同核３次元法は、異核の場合と同様の分析法を、異なるパルスシーケンスから 生成される３次元時間ドメインＮＭＲデータに適用するものである。異核の場合 と同様に、同核３次元パルスシーケンスは、３つの時間次元に応答するＮＭＲデ ータを生成し、３つの次元のうちの２つは双極子結合核の化学シフトを表わし、 ３番目の次元は双極子結合の強さを表わす。図１３は、実施例の３次元同核パル スシーケンスを示す。この図において、曲線１２０１は³Ｈ周波数チャネルに加 えられるＲＦ放射を表わし、曲線１２０２は¹³Ｃチャネルに加えられるＲＦ放射 を表わす。生物学的に関心のある化合物、特に薬物発見に関連する化合物では、 観測核は一般的に¹³Ｃであり、本節では¹³Ｃを無制限で観測核として説明する。¹⁵ Ｎまたはその他のＮＭＲ活性核が観測核となるように、実施例のパルスシーケ ンスを変更する方法は、当業者には明らかであろう。 図１３は一般的に、実施例の同核パルスシーケンスも、一般に１２０３、１２ ０４、１２０５で示される３つの時限ｔ₁、ｔ₂、ｔ₃に分割され、これらが全て 独立に変化して３次元時間ドメインＮＭＲシグナルを発生することができること を示す。時限ｔ₃では、ＦＩＤシグナル１１０４の時間展開は、当業者には知ら れているように、¹³Ｃ核の化学シフトに応答する。時限t₁では、パルスシーケン スは、シグナルが¹³Ｃ核の化学シフトにも応答するように設計される。最後に、 時限ｔ₂では、パルスシーケンスは、シグナルが¹³Ｃ核間の双極子結合の強さに 応答するように設計される。これらの要求事項を満たす時限t₁およびt₂のどんな パルスシーケンスも使用することができる。特に、本発明の最大エントロピーの 実施例に従って双極子デフェージングスペクトル変換を実現する場合、双極子結 合を捕捉し、かつ周波数ドメインシグナルから時間ドメインシグナルを計算する 方法を持つどんなパルスシーケンスでも、時限ｔ₂で使用することができる。本 発明のＲＥＤＯＲ変換の実施例に従って双極子デフェージングスペクトル変換を 実現する場合、デフェージング角は方程式３に従って展開し、方程式８および９ の形の核を生成しなければならない。図１３および以下で、時限ｔ₂がマジック 角（ＤＲＡＭＡ）パルスシーケンスにおける双極子回復を使用する場合の３次元 パルスシーケンスについて説明する（Tycko et al.，1990，Chemical Phy sics Letters 173:461-465;Tycko et al.，1993，Journal of Chemical Physics 98:932-943）。本発明は当技術分野で知られている同核双極子デフェージング パルスシーケンスのどれにでも適応できるので、これは無制限である。 さらに詳しく、図１３に関連して説明すると、実施例の３次元実験法では、時 限t₁のたびに、時限ｔ₂およびｔ₃の完全な２次元同核スペクトルが測定される。 これは、t₁のたびに、双極子デフェージング時間ドメインデータ点の完全な集合 を収集すること、およびそうしたデータ点のたびごとに、標本化ＦＩＤシグナル １２０６を収集することを含む。完全な２次元スペクトルは、0から最大時限ま で連続的に増分しながら拡張する時限ｔ₁について測定される。増分および最大 時限は、当技術分野において周知の通り、ナイキスト標本抽出帯域幅が、¹³Ｃの 化学シフトスペクトルの関心部分を完全に包含するように選択される。そのよう に選択されたt₁ごとに、π／２パルス１２０７を¹Ｈチャネルに印加することに より、実施例の３次元実験が開始される。このパルスの直後に、連続ＲＦ放射１ ２０８が¹Ｈチャネルおよび非観測チャネル、ここでは¹³Ｃに加えられ、偏極が 直交偏極を介して¹Ｈ核から観測¹³Ｃ核へ転移する。これらの直交偏極ＲＦ電界 が印加される時間の長さは、最大直交偏極を探すことによって経験的に決定され る。一般的に、直交偏極ＲＦ電界がオン状態に維持される時間の長さは１ミリ秒 台である。ｔ₁の増分は、時間比例位相増分（ＴＰＰＩ）法に従って、ｔ₁期間の 前の直交偏極ＲＦパルスの位相のサイクリングと共に行われる。代替的に、本発 明は、適切な直角分検出により非観測核のスペクトルを得るために、ＴＰＰＩ法 ではなく「状態法」に適応される。 ¹Ｈからの偏極転移の後、¹³Ｃの化学シフトの影響下で¹³Ｃ核の磁化を時間ｔ₁ の間、展開させる。この期間に、３次元ＮＭＲシグナルはその化学シフトに応答 するようになる。磁化のｔ₁展開を停止するために、印加される静的磁界に平行 な実験室フレームのｚ軸に沿って、それは切り換えられる。これは、¹³Ｃ核の横 緩和時間Ｔ₂より長くなるように選択された時間間隔γで分離される２つのπ／ ２パルスを印加することによって達成される。γの一般的な値は１ミリ秒台であ る。次に、0からローターの最大サイクル数ｍまでのローターの可変サイクル数 だけＤＲＡＭＡパルスシーケンスを印加することによって、２次元同核スペクト ルを測定する。このパルスシーケンスの後、ｐ時間位置でＦＩＤシグナル１２０ ６を標本抽出する。ＤＲＡＭＡパルスシーケンスは、毎サイクル、サイクルの０ ．２５で印加されるパルス１２１１および０．７５で印加されるパルス１２１２ の２つのローター同期π／２パルスを含む。さらに、１つおきのローターサイク πパルス１２１３は、サイクルの起点で印加される。 図１３の実施例のパルスシーケンスは、ｋｘｍｘｐ点の３次元マトリックスを 生成する。ここでｋはｔ₁点の数、ｍはＤＲＡＭＡパルスシーケンスが印加され ている間のローターの最大サイクル数、ｐはＦＩＤ標本数である。このデータは 異核の場合と同じ方法によって処理され、ｋ／２ｘｍｘｐ点の３次元スペクトル を生じる。ここでｋ／２は1つの双極子結合された観測核の化学シフトスペクト ルにおける点の数であり、ｍは異核双極子結合スペクトルにおける点数、ｐは他 の双極子結合観測核の化学シフトスペクトルにおける点の数である。 結果的に得られる３次元スペクトルは、両方の双極子結合核の化学シフトスペ クトルを同核双極子結合周波数と相関させる。これは、異核の場合と同様に、３ 次元斜視図方式で表わすことができる。この情報から、結合された核の分子識別 およびこれらの核の距離を決定することができる。核が化学シフトを縮退してし まわない限り、結合同核の各対から２つの共鳴が得られる。縮退した場合には、 単一の共鳴がある。 ここでは、同核双極子デフェージングパルスシーケンスを３次元分析に適用す る場合についてのみ説明したが、こうしたパルスシーケンスは他の次元の分析に も適用される。例えば、時限ｔ₁を省くことによって、ここで説明したパルスシ ーケンスは、前述の２次元法によって有利に分析される２次元データを生成する 。こうした２次元データを前述の通り分析して、単に１次元スペクトルを生成す ることもできる。したがって、同核双極子デフェージングパルスシーケンスは、 １次元法、２次元法、および３次元法による分析のためのデータを生成するため に適用することができる。さらに、上述の通り、本発明はＤＲＡＭＡパルスシー ケンスによって生成されたデータのみに制限されない。任意の双極子デフェージ ング同核パルスシーケンスを使用して、任意の次元の分析のためのデータを生成 することができる。 ５．６ 標本標識付け法 本発明の方法により、核間距離の測定および測定された距離の複合標本におけ る識別核への割当が可能になる。複合標本とは、他の化学シフトした核に結合さ れた複数の化学シフト観測核を含む標本である。本発明は、いかなる複合標本に も有利適用される。関心のある生物学的標本への特定の適用例では、ＮＭＲ活性 核は一般的に選択的標識付けにより導入される。多様に標識付けされた標本で実 験を実行すると、分子構造の決定に必要な時間が短縮される。したがって、ＮＭ Ｒ標本の作成は３つの主要段階、すなわち標識付け戦略の選択と、その戦略に従 って標識付けされた標本の合成と、本発明に係るＮＭＲ実験用の標本の作成とを 含むことが望ましい。 本発明は、一般に全ての単一または複合標本に使用されるが、本節で標本物は 、生物学で、そして特に薬剤の設計において関心のある特定の場合に制限される ことなく説明される。この場合は、関心のある薬理学上の特性を示す多様なライ ブラリーからスクリーニングされた分子のように有機分子の構造を決定すること である。本発明は、このような有機の多様なライブラリーの全てに適用でき、そ してペプチドに関して制限なしに説明される。そうした標本について、本節は、 一般的な標識付きプロトコール、合成の方法、および標本物について説明してい る。最も迅速に、そして標識付けされたアミノ酸の損失を最小にしながら分子構 造における最大の情報を引出すことは、好ましくは慎重な標識付けを必要とする 。標識付けは、関心のある特定の分子領域について可能な最大の情報を得るため に行われるのが好ましい。このような領域としては、制限されるものではないが 、ペプチドが関心分野の標的に結合する領域が挙げられ、そしてそのような領域 は、おそらく薬剤作用を明確にする。そのような関心分野の領域では、一般的な 標識付け戦略としては、骨格標識付け、および側鎖標識付けが挙げられる。例え ば、骨格標識付けは、１つのアミノ酸のアミン窒素原子（Ｎ）、および次の隣接 またはそれ以上の距離のアミノ酸の骨格炭素原子（Ｃ）の1つを標識付けする。 骨格標識付けは、一般に、強力な薬剤作用の関心分野の分子領域の付近にある骨 格で行われる。側鎖標識付け戦略は、関心分野の領域の化学構造で変化す る。側鎖Ｎが利用できれば、隣接側鎖または骨格Ｃが標識付けできる。そうでな ければ、側鎖Ｃおよび骨格アミノＮが標識付けできる。側鎖標識付けは、関心分 野の分子領域での側鎖で、あるいは候補の薬剤作用で行われることが好ましい。 要するに、関心ある分子領域で好ましい標識付けは、骨格Ｎおよびすぐそばの骨 格Ｃまたは側鎖Ｃのいずれかであるか、または利用できれば、側鎖Ｎおよび隣接 またはすぐ傍の側鎖Ｃである。 ＮＭＲ実験標本で核の対の複数を標識化するのがしばしば有利である。２つま たはそれ以上の標識付き核対を有する標本が、標本ごとに１つの標識付き距離を 示す分子を混合するか、または１つの分子で複数の距離を標識することのいずれ かによって製造できる。複数の標識付き距離を示す分子を、1つのＮＭＲ標本に 混合させることもできる。１つの分子中の複数の標識付き距離の場合には、複数 の標識付けを施す場所の選択は、同核結合が最小限にされるさらなる制約を伴っ て、上述の方法に従う。当業界でよく知られるとおり、同核結合は、以下の特定 の指針にしたがって最小限にできるかまたは削除できる。第１の指針 は、１つ の分子に施される場合、同核スピンが、空間でもう１つから遠くに離されること である。測定される異核距離のおよそ２、３倍、同核スピンが離されることで十 分である。それらがマジック角スピンによって０に平均化され、そしてｒ^-3で崩 壊もするので、この距離で、同核双極性結合は最小化される。第２の指針は、そ れらの化学シフトが低下したとき、またはスピン間の化学シフトの差異が、スピ ンの間の双極性結合より大きい場合、同核スピンが、互いに接近して位置決めで きることである。これらの条件下で、同核双極性結合 は、ＭＡＳによって０ま で平均化される。第３の指針は、互いに化学シフトしたスピンのためのものであ り、さらに空間で互いに接近している場合、スピン共鳴の条件は、回避されなけ ればならない。２つの同核の間の化学シフト頻度の差異の整数倍にあたる周波数 で、回転共鳴、またはマジック角のスピンは、マジック角スピンの０にまで平均 化するのを避ける。 好ましくない分子間双極性結合を避けるために、多重に標識付けされたペプチ ド標本が、混合標識付きペプチドから生じる場合、実験は、純粋な標識付きペプ チドで行われないことが好ましい。分子間の双極性結合を最小限にするために、 標識付きペプチドを、未標識ペプチドまたはミルクタンパク質のような別の不活 性材料のいずれかのマトリックスに希釈することが好ましい。標識付き材料を、 全材料のおよそ１０重量％まで希釈するのが好ましい。この希釈レベルでは、分 子間双極性結合が最小化される。しかし、ほとんど標識付けされない核が、測定 ＮＭＲシグナルを発生する標本に存在するので、ペプチドの希釈は、ノイズに対 するシグナルの結果を減少させる。したがって、希釈は、分子間双極性結合を最 小限にするのにちょうど充分であるべきであるが、ノイズに対するシグナル比を 反対に影響を及ぼすのには十分でないべきである。 本発明の方法のこの適用において予測される短いペプチドは、市販の標識付き ペプチドから当業界で知られるタンパク質合成のどんな方法によっても合成でき る。（ペプチド化学（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）・実施の教科書、 ２版、Ｍ．Ｂｏｄａｎｓｘｋｙ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、ニューヨー ク、１９９３年。）実施例６．４節は、標準ｔＢＯＣおよびＦＭＯＣ技術の組合 せを使用して、合成樹脂に付着した短ペプチドの実験的合成を説明している。 標識付きペプチドは、数種の技術によって、ＮＭＲ標本として製造できる。分 子間双極性結合を最小限にするのに十分な希釈で合成樹脂上で合成された標本は 、合成されたものとして使用できる。代わりに、標本は、合成樹脂から分離し、 そして同様の十分な希釈で未標識材料と混合することができる。標本物のための 好ましい技術は、ＮＭＲ測定より前にそのタンパク質標的にそのペプチドを結合 する。標本がタンパク質標的に結合できる非ペプチド分子から構成される場合、 このような分子にとって好ましい標本物も、それらをそれらのタンパク質標的に 結合する。例えば、このような非ペプチド分子としては、有機物の多様なライブ ラリーから得られるものが挙げられる。さらに、本発明は、タンパク質以外の標 的に使用することができる。このような標的としては、核酸、脂質、プロテオグ リカンなどが挙げられる。標本がこの方法で製造されると、測定距離は、結合ペ プチドの活性構造のものであることが確信される。これは、結合分子の構造が、 当業界で知られるとおり、標的タンパク質に結合することによってしばしば変更 されるので、重要な考察である。その標的タンパク質に結合したペプチドの標本 を製造するために、タンパク質の溶液を、３：１モル過剰量のペプチドで滴 定する。タンパク質へのペプチドの結合に基づいて、１００倍過剰量の水で洗浄 することによって過剰なペプチドを除去する。さらに、様々な標識付けを有する 標本を、ＮＭＲ測定のために混合して、合成樹脂に付着させ、遊離の、またはそ れらのそれぞれの標的に結合できる。 ＮＭＲ標本物における最終な好ましいステップは、迅速な冷凍および凍結乾燥 であり、標本が水溶液として製造されるので適切である。冷凍および凍結乾燥の 前に水溶液に凍結保存剤糖を添加することによって活性構造を維持するのが好ま しい（Ｄａｂｕｌｉｓら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅ ｒｉｎｇ、４１：５６６−５７１、１９９３年；Ｂｕｒｋｅら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６７：２００５７−２ ００６４、１９９２年）。ＮＭＲ測定にふさわしい標本としては、混合液は、凍 結乾燥前に迅速に冷凍される。迅速な冷凍は、液体窒素中で、２００μＬ量の少 量アリコートで溶液を冷凍することによって達成される（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅ ｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３２：２８６８−２８７３、１９９３年；Ｌ ａｚｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓ ｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ、１９７：９０４−９０９、１９９ ３年）。凍結乾燥後、結果的に生じた凍結乾燥粉末は、ＮＭＲ実験に十分である 。生物学的に活性な構造の的確な代表例としては、結果的に生じる凍結乾燥物が 部分的に水和されるのが好ましいことは当業界で知られている（Ｌａｚｏら、Ｂ ｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ １９７：９０４−９０９、１９９３年；Ｄａｂ ｕｌｉｓら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ４１ ：５６６−５７１、１９９３年；Ｂｕｒｋｅら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏ ｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６７：２００５７−２００６４、１９ ９２年；Ｄｅｓａｉら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃ ｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ １１６：９４２０−９４２２、１９９４年； およびＧｒｉｅｂｅｎｏｗら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉ ｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ９２：１０９６９−１０９ ７６、１９９４年）。 凍結乾燥または部分的に水和された凍結乾燥標本は、ＮＭＲ測定に適切である 。 ペプチドが標的タンパク質に結合される標本物の好ましい技術では、標的タン パク質は、固形状態のＮＭＲ実験に十分である量で必要とされる。必要とされる タンパク質の量は、根本的にＭＡＳローターの標本量によって決定される。化学 磁気（Ｃｈｅｍａｇｎｅｔｉｃ）の標準５ｍｍペンシルローターは、０．１４立 方センチメーターの容積を有する；薄壁ローターは、０．２１立方センチメータ ーの容積を有する。２つのバージョンのローターに詰める材料の全質量は、標準 および薄壁ローターそれぞれ、およそ１００ｍｇおよび１５０ｍｇである。 標的タンパク質は、以下の実施例の方法によってそれらのｃＤＮＡから製造で きる。当業界で知られた他の発現系は、標的タンパク質を合成するのに使用する こともできる。関心の標的タンパク質のｃＤＮＡは、分子生物学で知られた標準 的な方法によって得ることができる（組換えＤＮＡ（ＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＤ ＮＡ）、２版、Ｊ．Ｄ． Ｗａｔｓｏｎら、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ ．、ニューヨーク、１９９２年）。標的タンパク質、例えばｒａｓ、ｒａｆ、ｖ ＥＧＦおよびＫＤＲは、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）のパストリス発現系（カリフォ ルニア州、サンディエゴ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇo、ＣＡ）のＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ）で、そしてイー．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）でグルタチオン−Ｓ−トランスフェラ ーゼ（ＧＳＴ）−融合タンパク質として発現できる（Ｇｕａｎら、Ａｎａｌｙｔ ｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９２：２６２−２６７、１９９１年） 。 ピキア・パストリス発現系については、標的タンパク質のｃＤＮＡは、ピキア の発現ベクターｐＨＩＬ−Ｓ１およびｐＰＩＣ９（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でク ローン化される。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、これらのタンパク質のカ ルボキシ末端で６つのヒスチジンを導入するのに使用されて、その結果このヒス チジルタグは、これらのタンパク質をアフィニティー精製するのに使用すること ができる。組換えプラスミドは、スフェロプラスティング法によってまたは電気 穿孔法によってピキア細胞を形質転換するのに使用される。標的タンパク質の発 現は、メタノールの存在下で、ピキアで誘発できる。ｐＨＩＬ−Ｓ１プラスミド でクローン化されたｃＤＮＡは、ＰＨ０１シグナルペプチドとの融合体として発 現され、従って細胞外に分泌される。同様に、ｐＰＩＣ９プラスミドでクローン 化されたｃＤＮＡｓは、α因子シグナルペプチドとの融合体として発現され、よ って細胞外に分泌される。したがって、標的タンパク質の精製は、成長培地から のアフィニティー精製を単に含む場合、より簡単である。ピキアは、非常に低い 濃度の相同タンパク質を分泌し、そしてそれによって異種タンパク質がその培地 に非常に多数のタンパク質を包含するという事実によって、精製はさらに助長さ れる。発現された標的タンパク質は、ニッケルを含有するアフィニティーマトリ ックス上でアフィニティー精製した。その後、結合標的タンパク質を、ＥＤＴＡ またはイミダゾールのいずれかで抽出し、そして遠心分離濃縮機を使用すること によって、さらに濃縮した。 ピキア発現系の代替物として、標的タンパク質は、イー．コリでグルタチオン −Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパク質として発現される。標的タ ンパク質ｃＤＮＡは、関心のタンパク質が、ＧＳＴタンパク質とのＣ末端融合体 として発現されるｐＧＥＸ−ＫＧベクター（Ｇｕａｎら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９２：２６２−２６７、１９９１年）にクロー ン化される。ｐＧＥＸ−ＫＧプラスミドは、標的タンパク質をＧＳＴタグから切 り取るのに使用される融合接合で遺伝子操作されたトロンビン切断部位を有する 。ＧＳＴ遺伝子が、ｔａｃプロモーターの影響下にあるので、発現は、ＩＰＴＧ の存在下で導入できる。導入細胞を、音波処理によって破砕し、そしてＧＳＴ融 合タンパク質を、グルタチオン結合アフィニティーマトリックス上でアフィニテ ィー精製する。その後、アフィニティーマトリックスにトロンビンを添加するこ とによって、結合タンパク質を切断し、そして洗浄によって回復する一方で、Ｇ ＳＴタグは、マトリックスに結合したままである。イー．コリ培養物の１リット ル当たりの組換えタンパク質のミリグラム量は、この方法で得ることができると 予測される。 標本の標識付けの別の方法および分子構造決定を薬剤の設計に適用する方法は 、コンセンサス配座バイアス・モンテカルロ法および薬剤作動構造決定に関する 体系について１９９５年３月３１日に提出された出願人の同時係属中の米国特 許出願番号第０８／４１８，９９２号で見られる。 ＮＭＲ標本サイズおよび実験タイミング 本発明の利点は、測定タンパク質標本が、溶液状態のＮＭＲでのように厳密な サイズ制限を示さないことである。溶液状態のＮＭＲでは、ＮＭＲスペクトルで 重なり合っているラインを分離する能力によってタンパク質の最大サイズが決定 される。溶液状態のＮＭＲでの分離可能なタンパク質の最大サイズは、およそ２ ５キロダルトンである（Ｃｌｏｒｅら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ３： ３７２−３９０、１９９４年）。本発明の方法で、タンパク質標的の最大サイズ は、ＮＭＲシグナルのシグナル対ノイズ比によって制限される。シグナル対ノイ ズは、標本中に存在する観測核の数、検出核の磁気回転比、およびＮＭＲ測定の 感受性によっておよそ決定される。ＮＭＲ測定の感受性に対する主要な誘因は、 磁界の強度である。 付随の実施例に説明される本発明の適用において、磁界は、７．０５テスラで あり、そして５ｍｍペンシルローターの標本容積は、１４０μＬである。化学磁 気は、標本容積を２１０μＬまで増大する薄壁ローターを導入する計画がある。 表２は、種々のサイズのタンパク質に結合した９００Ｄのペプチド（環状オクド マーについてのおよその質量）に対しておよそ¹⁵Ｎ検出実験時間を示した。 表２：¹⁵Ｎ検出について実験時間 表３は、¹³Ｃ検出実験について同じ情報を示す。 表３：¹³Ｃ検出について実験時間 ２つの表は、データ収集が２８Ｓ／Ｓ₀点を包含することを呈する。表中の値 は、付随の実施例に説明される測定の経験的実施の感受性に、そして固体状態の ＮＭＲでの感受性およびシグナル対ノイズの原理に基づいている。（Ｍｅｈｒｉ ｎ ｇ、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｈｉｇｈ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ＮＭ Ｒ ｉｎ Ｓｏｌｉｄｓ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ・ベルリン、４章・ １９８３年）。 これらの表は、さらに迅速にそして少ない損失で分子構造を決定するために１ つのＮＭＲ標本での複数の距離を測定する利点を示す。 溶液状態のＮＭＲの技術で知られるとおり、大形の生物学的分子を、高磁界強 度を使用して調べることができる。その理由は、研究できる分子の最大のサイズ における制限である分離は、適用される磁界強度Ｂ₀で線状になる化学シフト分 散によって原理的に決定されることである。同様に、本発明に記載された固体状 態のＮＭＲ技術による生物学的分子のサイズは、適用される磁界強度で増加する 。固体状態のＮＭＲ技術のサイズでの制限因子は、感受性があるので、感受性が Ｂ₀ ^3/2として増加するため感受性における増加は、溶液状態のＮＭＲの場合より いっそう迅速である。高分解ＮＭＲ磁石における技術の現状は、共通１４．１テ スラ磁石でおよそ１８．８テスラである（英国オックスフォード（Ｏｘｆｏｒｄ 、Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）のオックスフォード・インストルメンツ（Ｏ ｘｆｏｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ））。 ６．実施例 本節には、本発明の最大エントロピーおよびＲＥＤＯＲ変換の具体例によって 、ＲＥＤＯＲパルス配列およびそれの１次元および２次元分析を使用したＮＭＲ データ収集の実施例が記載されている。さらに、標本標識付けおよび合成方法も 記載されている。 ６．１．ＲＥＤＯＲデータ収集 これらの実施例に記載されたデータを収集したＮＭＲ実験を、ケマグネティッ クス（Chemagnetics)５ｍｍ三重分離ＭＡＳ（マジック角スピニング）ペンシル プローブを具備するケマグネティックスＣＭＸ３００スペクトロメーター（コロ ラド州フォルト・コリンズ（Fort Collins,CO）のオーツカ・エレクトロニック ス(Otsuka Electronics)）で行った。この装置は、オックスフォード・インスト ルメンツ（英国オックスフォード）から得た７．０５テスラ磁石、およびＮＭＲ 技術では一般的なＲＦパルス励起および受容ハードウエアを包含する。核のため の共鳴周波数は、¹Ｈ ２９９．９９１ＭＨｚ；¹⁵Ｎ ３０．４０１ＭＨｚ；¹³ Ｃ ７５．４４２ＭＨｚである。バリアン・インストルメンツ（Varian Instrum ents）（カリフォルニア州パロアルト(Palo Alto、CA))またはブルッカー・イン ストルメンツ（Bruker Instruments）(マサチューセッツ、ビレリカ(Billerica, .MA)）から得たもののような他のスペクトロメーターは、ケマグネティックスス ペクトロメーター（Chemagnetics spectrometer）の代替として適切である。マ ジック角スピニングプローブの他の製造源としては、ドッティ・サイエンティフ ィック社(Doty Scientific Inc.)（サウスカロライナ州、コロンビア(Columbia 、SC)）が挙げられる。 実験の前に、数種の標準装置較正がなされた。マジック角は、ＫＢｒ中の⁷⁹Ｂ ｒの時間ドメイン信号を観察することによって調整された。磁界を、１０Ｈｚの 残留ライン幅に対して自然な多量の¹³Ｃ上に水平にした。¹³Ｃπパルス幅は、８ ．８μ秒であり、¹⁵Ｎπパルス幅は、１２．２μ秒で、そして１Ｈπ／２パルス 幅は、３．０μ秒であった。パルス時間を決定する実施例の手段は、ゼロが達成 されるまで標識付けされたグリシンでの¹⁵Ｎまたは¹³Ｃのいずれかでの単独のパ ルス実験でパルス幅を変えることであ る。同様の方法で、水を使用して、ゼロを探すことによって¹Ｈパルス幅を測定 した。ゼロは、πパルスに対応する。当業界でよく知られるとおり、¹³Ｃおよび¹⁵ Ｎチャンネルにおける短いパルス幅は、正確な距離測定にとって重要である。 １０ｋＨｚ未満のマジック角スピニングでなされたＲＥＤＯＲには、１５μ秒ま たはそれ未満のパルスが適切である。¹Ｈから¹⁵Ｎまでの直交偏極にとっての最 適レベルを、様々な¹Ｈ電力レベルでの直交偏極効率の経験的評価によって設定 した。１ｍ秒の最適な直交偏極時間を、直交偏極効率の経験的評価によって設定 した。 ＲＥＤＯＲ実験のこの具体例で使用されたパルス配列は、図１に例示され、他 の適切なパルス配列は、当業界で知れられている。パルス配列は、¹Ｈ、¹⁵Ｎお よび¹³Ｃチャンネルでのパルスの適用を詳説し、そして５．１節で、図１を参照 して詳細に記述された。ＲＥＤＯＲ実験のこの特定の具体例で、¹⁵Ｎは、観測核 であり、そして¹³Ｃは非観測核である。本発明処理の別の具体例は、¹³Ｃは観測 核であり、そして¹⁵Ｎは、非観測核である。Ｓ₀およびＳデータ点ごとに、２秒 の捕捉の間の遅延時間で４０９６の平均値が記録された。各Ｓ₀およびＳデータ 点の平均の数は、信号対ノイズ比の許容しうるレベルを確定するために経験的に 選択された。各Ｓ₀およびＳデータ点ごとに収集されたＦＩＤの長さは、１０２ ４点であった。９０ｋＨｚの陽子デカップリング（２．７μ秒の¹Ｈπ／２パル ス幅に対応する）は、ＲＥＤＯＲデフェージング期間に使用され、そして７０ｋ Ｈｚデカップリング（３．５μ秒の¹Ｈπ／２パルス幅に対応する）は、補足期 間中に使用された。ＲＥＤＯＲデフェージング期間中の９０ｋＨｚまたは上記の デカップリングが、正確な距離測定のために必要とされる。 これらの実施例で報告されるデータが生じた標本は、それらの標識付け以外は 同一な２つの環状ペプチドの１：１物理的混合物であった。２つのペプチドは、 Ｇ末端を介してｍＢＨＡ合成樹脂に結合したＣｙｓ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ− Ｌｙｓ−＊Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙであった。ペプチドは、ジスルフィ ド結合を介して環状化された。この環状ペプチドは、糖タンパクＩＩｂ／ＩＩＩ ａに結合し、それによってフィブリノーゲンとの結合に対する拮抗阻害剤として 作用することがＯ’Ｎｅｉｌら（Ｏ’Ｎｅｉｌら、タンパク質：構造、機能およ び遺伝 １４：５０９−５１５、１９９３年） によって先に示された。結果として、ペプチドは、血小板凝集の強力な阻害剤で ある。１方のペプチドは、¹⁵Ｎ，１−¹³Ｃグリシンで標識付けされ、他方は¹⁵Ｎ ，２−¹³Ｃグリシンで標識付けされた。合成樹脂（アドバンスド・ケムテック(A dvanced Chem Tech)）は、０．１ｍｅｑの専有ｍＢＨＡ表面部位／ポリスチレン 樹脂のｇ数を示した。合成樹脂の存在によって自然に希釈され、それによって分 子間双極性結合を除去するので、さらにペプチドを希釈する必要はなかった。８ ９０ｇ／モルのペプチド分子量、およびｍＢＨＡ樹脂上での専有表面部位の密度 から、これは、０．０９ｇのペプチド／１ｇの樹脂を示す。およそ８５ｍｇのペ プチド−樹脂標本、そしてしたがって−７ｍｇのペプチドを、５ｍｍケマグネテ ィックスペンシルローターに詰めた。ローターに詰める前に、同じ質量（５０ｍ ｇ）の２つのペプチド−樹脂標本を計り取ることによって物理的混合物をなした 。これらの２つのペプチド−樹脂標本を、一緒に加え、そしてへらで静かに混合 した。ペプチドは、アイソテック(Isotec)（オハイオ州ミアミスバーグ(Miamisb urg、OH)）から得られる標識付けアミノ酸と一緒に、ＦＭＯＣおよびｔＢＯＣの 化学的性質の組合せを介してカリフォルニア州、サンディエゴのマルチプル・ペ プチド・システムズ（Multiple Peptide Systems）によって合成された。標本標 識付けおよび合成の詳細は、６．４節に記載される。 このＮＭＲ機中のこの標本から、４回のローターサイクルごとに１回、ＸＹ− ４位相サイクルを使用して６０００Ｈｚでスピンさせながら、データを収集した 。スピン速度は、実験のコースをとおして１０Ｈｚ内に、ケマグネティックスス ピン速度発生装置で調節された。このサンプリング率、４回のローターサイクル 毎に１回のデータサンプリングによって分割された６００Ｈｚは、およそ１５０ ０Ｈｚの周波数帯域幅を示す。２８Ｓ／Ｓ₀点が、収集され、それにより５４Ｈ ｚ／点のデジタル分解能になった。デジタル分解能は、Ｓ／Ｓ₀点の数によって 周波数帯域幅を分割することによって決定される。始点０．０１から終点０．１ の範囲のこれらのデータ点の誤差概算σは、始点と終点の間で線状に増加する。 代わりに、サンプリングは、他のローターサイクル増加で行ってもよい。例え ば、１６ローターサイクルごとのサンプリングは、図５およびＸＹ−１６（また はそれより高い桁数）相のサイクル（Gullionら、Journal of Magnetic Resonance 89:479-484、1990年）に示される好ましいパルス・プログ ラムの使用を可能にする。図５は、１Ｈチャンネル、パルス配列５０１で適用さ れたＲＦパルスと、１３Ｃチャネル、パルス配列５０３で適用されたＲＦパルス を示している。 ６．２．１次元ＲＥＤＯＲデータ分析 ６．１節によって測定されたデータは、ＲＥＤＯＲ変換および本発明の最大エ ントロピーの具体例を使用して、一次元分析法によって分析された。２つの具体 例は、他の測定技術で得られたものに相当する距離測定を示す。それによって、 本発明の方法の有効性が確認される。 ＲＥＤＯＲ変換具体例 ２８のＳ₀および２８のＳ ＦＩＤは、データがノイズのレベルにまで減退し たＦＩＤの末端で多くのデータ点（この特定の場合では、１００点）の値を平均 することによって補正された基準線であった。この平均値は、ＦＩＤがゼロに減 退するように全ＦＩＤから減じられた。基準線補正の後、ＦＩＤは、指数および フーリエ変換で５００Ｈｚに線拡大された。線拡大のＨｚをどのくらい適用する かの選択は、フーリエ変換共鳴線を平滑にする必要性を拡大する最小量を経験的 に探すことによって行われた。変換後、スペクトルは、純粋な吸収モードでの平 滑な基本線と全てのピークに達成するために位相補正された。Ｓ₀およびＳの値 は、そのスペクトルでの標識付けされた¹⁵Ｎ共鳴のピークの高さから測定した。 この実施例でのＮＭＲデータ処理は、マッキントッシュ（カリフォルニア州、カ ペルチノ（Cupertino、ＣＡ）のアップル・コンピューター(Apple Computer)） ソフトウエア・プログラムＲＭＮ（オハイオ州立大学、化学科のPhilip J.Grand inetti博士から自由に入手可能。ｅ−メール：grandinetti.1＠osu.edu）で行わ れた。他の適切なＮＭＲデータ処理プログラムとしては、それに制限されないが 、ケマグネティックス、バリア、およびブルッカー・スペクトロメーターで搭載 済みのソフトウエアが挙げられる。 図１４は、この前処理の結果を例示する。その図では、軸１４０１は、ロータ ーサイクルの数を表し、そして軸１４０２は、１．０とローターサイ クルの公知の値から出発するＳ／Ｓ₀の値を表す。続いて記載されたとおり、デ ータ点１４０４で曲線１４０３がこの入力データに適合した最大エントロピーを 示す場合、誤った線がありそうなデータ点が示される。 この前処理の後、双極性デフェージングスペクトルの変換のＲＥＤＯＲ変換具 体例を、６．３節で記載した方法にしたがってこの入力データに適用した。図４ は、結果として得られる双極性結合周波数スペクトルを例示する。この図では、 軸４０１は、双極性結合周波数であり、そして軸４０２は、スペクトルの強度で ある。変換データは、およそ２００±５４Ｈｚの周波数でピーク４０３、そして およそ９００±５４Ｈｚの周波数でピーク４０４の２つの強力なピークを示した 。式１によって決定されるとおり、これらの周波数は、ピーク４０３については 、２．５±０．３Åの距離に対応し、そしてピーク４０４については１．５０± ０．０３Åの距離に対応する。大きな掃引幅と制限されたデータサンプリングに よって信号に強いられた分解能の制約内で、結果は、純粋なグリシンのｘ線結晶 データとよく一致する。純粋グリシンでの¹⁵Ｎ，１−¹³Ｃ結晶距離は、１．４９ Åであり、そして純粋グリシンでの¹⁵Ｎ，２−¹³Ｃ結晶距離は、２．４７Åであ る。 第１の概算に対して、スペクトルの周波数分解能は、収集されたＳ／Ｓ₀点の 数、およびスペクトルの周波数帯域幅によって決定される。図４での周波数分解 能は、４回のローターサイクル毎に１回サンプリングし、そして６０００Ｈｚで スピンしながら、２８Ｓ／Ｓ₀点の収集から生じる。ローター周波数とサンプリ ングのこの組合せは、１５００Ｈｚ（＝６０００Ｈｚ／４）のスペクトルの地域 幅に対応する。サンプリングは、Ｓ／Ｓ₀点当たり５４Ｈｚ（＝１５００Ｈｚ／ ２８）の分解能に対応する。 代わりに、距離分解能は、スペクトルの帯域幅の実験的パラメータおよびＳ／ Ｓ₀データ点の数を変化させることによって改善された。Ｓ／Ｓ₀データ点と同じ であるが、３７５Ｈｚ（＝６０００Ｈｚ／１６）のより小さな掃引幅で示す２０ ０Ｈｚの周波数は、実験的距離分解能で２．４８±０．０５Åまでの著しい改善 に至る。３７５Ｈｚのこの小さな帯域幅（２．０Åの¹³Ｃ−１５Ｎ距離の下限に 対応する帯域幅）は、６０００Ｈｚでスピンさせ、そして１６ローターサイクル 毎にサンプリングしながら得られる。その帯域幅で、各Ｓ／Ｓ₀ポイントは、１ ３Ｈｚに対応する(＝３７５Ｈｚ／２８)。 さらに、Ｓ／Ｓ₀ポイントの数を増加させると、スペクトルの分解能が増加する 。 最大エントロピー具体例 誤差概算が、同時に最適化されない最大エントロピーの第一の代替的具体例は 、双極性周波数および核間距離ドメインの両方において、同じデータに使用され た。最大エントロピー法が、任意の前処理なしに生の測定データに使用されるこ とも好ましい。誤差概算σは、始点では０．０１であり、そして終点では０．１ まで直線的に増加する。 図１６Ａは、最大エントロピー双極性周波数スペクトルを例示する。この図で は、軸１６０１は、双極性結合周波数であり、そして軸１６０２は、スペクトル 強度である。曲線１６０３は、測定スペクトルである。スペクトルは、点の間に 12．５Ｈｚの空間を有する２００点のグリッドで測定された。２つのピークが現 れ、一つはおよそ１５０Ｈｚであり、もう一つは、およそ９００Ｈｚである。Ｎ_good は、１２．３９とされ、そしてＮ_badは８．４８とされた。したがって、Ｎ_{g ood} とＮ_badの合計は、２０．８７であり、データ点２９の総数より少なかった。 この差異は、測定から得られた誤差概算が再検査されるべきであることを示す。 図１４に戻って、曲線１４０３は、周波数ドメインスペクトルから推定されると おり、入力時間ドメインのデータである。推定および実測の時間ドメインのデー タは、近接し、全ての点での実験測定の誤差の線以内に入る。 図１６Ｂは、核間距離ドメインで使用される最大エントロピー法を例示する。 この図では、軸１６１０は、Åで表した核間距離であり、そして軸１６１１は、 スペクトル強度である。曲線１６１２は、測定距離のドメインスペクトルである 。スペクトルは、０．５Åで始点で２００点のグリッドで測定され、分離は、０ ．０５Åの点の間であり、そして終点で１０．４５Åであった。２つのピークは 、はっきりしており、１つはおよそ１．５Åに、そして他方は、およそ２．５Å である。αについての最も可能な値は、１．８７４４であることが分かり、それ により４．７０のＮ_goodおよび６．７３のＮ_badを生じる。Ｎ_goodとＮ_badの合計 は、総Ｎより少なく、さらに実験の誤差概算が再検査されるべきであることを示 す。曲線１６１３は、式１０ によって周波数ドメインスペクトルを変換することによって得られた距離ドメイ ンスペクトルである。直接測定された距離ドメインスペクトルに明らかに近い。 最大エントロピーの具体例も、誤差概算が、スペクトルに連帯的に最適化され る代替的具体例での同じ測定データにおいて行われた。この具体例では、周波数 ドメインと距離ドメインスペクトルの両方が、直接測定された。周波数−空間変 換は、１０Ｈｚの周波数間隔および２０００Ｈｚの最大高周波数を示すグリッド を使用した。規定パラメーターαの最終値、誤差格付けγ_c、Ｎ_goodおよびＮ_bad は、表２に示される。距離−空間変換は、０．０５Åの距離間隔を示すグリッド 、０．５Åの最小グリッドポイントおよび１０．４５Åでの最大グリッドポイン トを使用した。α、γ_c、Ｎ_goodおよびＮ_badの最終値も、表２に示される。 最大エントロピーのこの具体例によって測定された２つのスペクトルは、先に 測定されたスペクトルとはそれほど異ならない。周波数−空間および距離−空間 変換の両方については、使用されるアルゴリズムによって必要とされるとおり、 Ｎ_goodおよびＮ_badは合計してデータポイントの総計２９になる。他のパラメー ターαおよびγ_cの値と異なる様に、異なるＮ_goodおよびＮ_bad差異の正確な値は 、２つの変換の間で異なる。 表２：収束パラメーター値 パラメーター 周波数−空間 距離−空間 ６．３．２次元ＲＥＤＯＲデータ解析 ６．１節に収集されたデータは、２次元分析にもかけられた。このデータは、 ＦＩＤの長さが、少数の点に切り捨てられる以外は、５．５．１．節の方法によ って処理された。ＦＩＤ切り捨ては、計算時間を単に短くすることによって行わ れた。当業界でよく知られるとおり、より高い点を示すＦＩＤのフーリエ変換が 、スペクトル中の改善されたデジタル分解能を生じる。この増加したデジタル分 解能は、２つまたはそれ以上の化学シフトした観測核がスペクトルに存在する場 合の多くの例で有用である。この実施例のデータで、唯一１つの化学シフトが、 存在し、そして分解能の増加は、不必要である。ＦＩＤは、３２点に切捨てられ た。 切捨てに続いて、処理は、５．５．１．節によって行われた。ＦＩＤは、基準 線補正され、指数およびフーリエ変換で５００Ｈｚまで線拡大され、そしてマッ キントッシュのソフトウエア・プログラムＲＭＮで位相させた。スペクトルに唯 −１つの化学シフト共鳴があるので、均一な相殺補正が、３２ΔＳ／Ｓ₀曲線に 行われた。さらに、ＲＥＤＯＲ変換前に、フーリエ変換後に生じた化学シフトス ペクトルで３２点の各々について、ΔＳ／Ｓ₀曲線が生じた。その後、全ての３ ２ΔＳ／Ｓ₀曲線は、自然の多量なバックグランドについての相殺補正され、Δ Ｓ／Ｓ₀曲線に変換され、そして一次元の場合と同様に３点のブラックマン−ハ リス関数で滑らかにされた。２次元データマトリックスは、３２ポイントＦＩＤ スペクトルが、２８Ｓ₀および２８Ｓ点ごとに存在する３２Ｘ５６であった。そ の後、これは、マテェマチカファイル２−Ｄ−ＰＲＯＣＥＳＳにしたがってマテ ェマチカで変換されたＲＥＤＯＲであり、７節に含まれる。唯一実際のデータが 変換され、虚部データは、ゼロに設定された。３２点化学シフトスペクトルが、 ２８点双極性結合スペクトルに相関関係がある３２Ｘ２８点データマトリックス が、出力されそしてプロットされた。 図８は、結果として得られた２次元スペクトルの２次元プロットを図示する。 この図において、軸８０１は、双極子結合周波数であり、軸は観測¹⁵Ｎ核の化学 シフトである。曲線８０３は、¹⁵Ｎの化学シフトスペクトルである。曲線８０４ は¹⁵Ｎの双極子結合周波数である。スペクトルピーク８０５および８０６は、双 極子結合に対する２次元相関化学シフトを示す。 ６．４． 試料の標識 これまでに記載した実施例に使用した標識付けられたペプチドは、Ｃｙｓ−Ａ ｓｎ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（¹⁵Ｎ，２−¹³Ｃ）Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｇ ｌｙ−ｍＢＨＡ樹脂、およびＣｙｓ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｌｅu−（¹⁵Ｎ，１−¹³ Ｃ）Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−ｍＢＨＡ樹脂で、ここで、グリシン結合 剤は関心のあるペプチドをｍＢＨＡ樹脂に結合した。 これらのペプチド樹脂は、ｔＢＯＣとＦＭＯＣの化学的性質の組合わせを使用 した、ｐ−メチルベンズヒドリルアミン（ｍＢＨＡ）樹脂上での固相合成により 合成した。メチルベンズヒドリルアミン樹脂（基材、０．１ｍｅｑ ／ｇ）は、アドバンスド ケム テック(Advanced Chem Tech)（ケンタッキー州 レイスビル）社から購入した。ＦＭＯＣ（¹⁵Ｎ，２−¹³Ｃ）ＧｌｙおよびＦＭＯ Ｃ（¹⁵Ｎ，１−¹³Ｃ)Ｇｌｙは、ＨＣｌ，（¹⁵Ｎ，２−¹³Ｃ）Ｇｌｙ、（¹⁵Ｎ， １−¹³Ｃ）Ｇｌｙ（イソテック社(Isotec Inc.)、オハイオ州ミアミスバーグ） から調製し、ＦＭＯＣ−ＯＳｕ、ｔＢＯＣ−Ｇｌｙ、(Ｔｒｔ)、ＦＭＯＣ−Ａｓ ｐ(ＯｔＢｕ)、ＦＭＯＣ−Ｌｙｓ(ｔＢＯｃ)、ＦＭＯＣ−Ｌｅｕ、ＦＭＯＣ−Ｔ ｈｒ(ＯｔＢｕ)、ＦＭＯＣ−ＡｓｎおよびｔＢＯＣ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）は、バケ ム(Bachem)（カリフォルニア州トランス）から購入した。試薬用の溶媒はフィッ シャーサイエンティフィック（Fisher Scientific）社から購入し、ジイソプロ ピルカスボジイミド(ＤＩＣ)、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）およびジイソプロピ ルエチルアミン（ＤＩＥＡ）は、ケム インペックス(Chem Impex)（イリノイ州 ウッドダーレ）社から購入した。窒素、ＨＦは、エアープロダクツ(Ａｉｒ Ｐ ｒｏｄｕｃｔｓ)（カリフォルニア州サンジエゴ）から購入した。 第１のステップは、ｔＢＯＣ−Ｃｙｓ（ＡＣＭ）−Ａｓｎ−Ｔｈｒ（ＯｔＢｕ ）−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（ｔＢＯＣ）Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ ）−Ｇｌｙ−ｍＢＨＡ樹脂の合成であった。１．１１ｇ（０．１１ｍｅｑ）のｍ ＢＨＡ樹脂を塩化メチレン(ＣＨ₂Ｃｌ₂)［「ＤＣＭ」］と共に、１５０ｍｌの反応 容器（底部にガラスフィルターが配置される）に入れ、樹脂を膨潤させるために 、窒素を徐々に通気して気泡を形成させながら、１５分間撹拌した。溶媒を吸引 し、樹脂を５％ＤＩＥＡのDＣＭ溶液で中和した(３×２分)。ＤＣＭで洗浄後、 ＤＣＭ中で、樹脂をｔＢＯＣ−Ｇｌｙ（０．２８０ｇ−１．６ｍｅｑ−４倍過剰 量−０．１Ｍ）およびＤＩＣ（０．２５ｍｌ−１．６ｍｅｑ−４倍過剰量−０． １Ｍ）と結合させた。結合が終了したかどうかは、ニンヒドリン試験でチェック した。洗浄後、ｔＢＯＣ保護基を離脱するために、樹脂を５５％ＴＦＡのＤＣＭ 溶液中で３０分攪拌した。次いで、樹脂を５％ＤＩＥＡのＤＣＭ溶液で中和し、 ＤＣＭ／ＤＭＦ（５０／５０中）中で、ＦＭＯＣ−Ｃｙｓ(Ｔｒｔ)（０．９３７ ｇ−１．６ｍｅｑ−４倍過剰量−０．１Ｍ）およびＤＩＣ（０．２５ｍｌ−１． ６ｍｅｑ−４倍過剰量−０．１Ｍ）と結合させた。洗浄後、樹脂をＦＭＯＣ基を 離脱するために、２０％ピペリジンのＤＭＦ溶液とともに撹拌した。洗浄後、同 じ サイクルをＦＭＯＣ−Ａｓｐ(ＯｔＢｕ)、ＦＭＯＣ（¹⁵Ｎ，２−¹³Ｃ）Ｇｌｙま たはＦＭＯＣ（¹⁵Ｎ，１−¹³Ｃ）Ｇｌｙ(２倍過剰量)、ＦＭＯＣ−Ｌｙｓ(ｔＢ ＯＣ)、ＦＭＯＣ−Ｌｅｕ、ＦＭＯＣ−Ｔｈｒ(ＯｔＢｕ)、ＦＭＯＣ−Ａｓｎお よびｔＢＯＣ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）を用いて繰り返し実施した。最後の結合後、ｔ ＢＯＣ基はペプチド上に残った。ＤＣＭを用いて樹脂を十分に洗浄し、窒素気流 下で乾燥した。収量は１．４９ｇ(予想値：−１．７ｇ)。 次のステップは、ｔＢＯＣ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ（ＯｔＢｕ）−Ｌｅｕ− Ｌｙｓ（ｔＢＯＣ）−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−ｍＢＨＡ 樹脂の環化であった。保護基つきのペプチド樹脂の６００ｍｇをポリプロピレン メッシュパケット内に入れて封をした。樹脂を膨潤させるために、バッグを溶媒 混合物(ＤＣＭ／メタノール／水−６４０／２８０／４７)中で振とうした。次い で、同じ溶媒混合物中にヨウ素を添加した溶液（０．４ｍｇＩ₂／溶媒混合物１ ｍｌ）の１００ｍｌ中で２０分振とうした。この操作を４回実施した。３回めの 後には脱色は観察されなかった。次いで、樹脂を、ＤＣＭ、ＤＭＦ、ＤＣＭおよ びメタノールで順に十分に洗浄した。 最後のステップは、Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｓ ｐ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−ｍＢＨＡ樹脂の側鎖の保護基の離脱であった。環化後に、 ポリプロピレンバッグ中の樹脂をＴＦＡ／ｐ−クレゾール／水（９５／２．５／ ２．５）の混合液１００ｍｌと１時間反応させた。ＤＣＭおよびメタノールで洗 浄した後に、樹脂を真空下で４８時間乾燥した。収量は５６０ｍｇであった。 合成用樹脂からの切断後の純度とジスルフィド架橋の存在について、得られた ペプチドを分析した。樹脂からペプチドを切断するために、４０ｍｇの樹脂をポ リプロピレンメッシュパケットに入れて封をし、アニソールの存在下において、 ０℃で、１時間ＨＦで処理した(ＨＦ／アニソール：９０／１０）。冷却したエ チルエーテルで、スキャベンジャーと副産物を樹脂から抽出した。ペプチドを１ ０％酢酸で抽出し、３６時間凍結乾燥した。乾燥したペプチド単離体は、ＰＤＭ Ｓ（マススペクトログラフィー）およびＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー ）で特徴づけた。この分析は、製造されたペプチドの９５％以上が適切なアミノ 酸配列であり、ジスルフィドループを有 し、分子間ジスルフィド２量体が存在しないことを明らかにした。 ７． コンピュータプログラムコード 本節は、本発明の方法の実行を含む。７．１節は、本発明の双極子デフェージ ングスペクトル変換の最大エントロピーの態様をＣ言語のプログラムとして実行 することを含む。７．２節は、本発明の双極子デフェージングスペクトル変換態 様のＲＥＤＯＲ変換を数学的な言語のプログラムとしてで実行することを含む。 後者の節は、式２９のＲＥＤＯＲカーネル値の表を作成するため、および２次元 変換のために、１次元ＲＥＤＯＲ変換のための別のプログラムを含む。 このコードは、これらの言語を有し、適度な性能を有するいかなるコンピュー タにおいても実行することができる。このようなコンピュータには、登録商標パ ワーピーシー（ＰｏｗｅｒＰＣ^TM)によるマッキントッシュ型コンピュータおよ び登録商標ペンチアム（Ｐｅｎｔｉｕｍ^TM）によるＰＣ型コンピュータが含まれ る。 ７．１．最大エントロピー態様 ８．特定の態様、参考文献の引用 本発明は、本明細書に記載する特定の態様によって請求の範囲が制約されるべ きではない。実際、本明細書に記載するものに加えて、本明細書に種々の修正を 加えられることは、上記の説明および添付の図面により、当業者にあきらかにな るだろう。このような修正は、添付の請求の範囲の範囲内にあることが意図され る。 種々の報告が本明細書に引用されており、その記載内容は全体として参考とし て本明細書に組み入れられる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｇ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ， ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，Ｔ Ｔ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者 ウェント，グレゴリー，ティー. アメリカ合衆国 06443 コネチカット州, マディソン，スコットランド アベニュー 25

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． それぞれが第一部位および第二部位を含む部位の対を１対以上含む、１種 類またはそれ以上の分子を含むサンプルにおける、それぞれ該第一部位と該第二 部位との間である一つまたはそれ以上の距離を決定する方法であって、 （ａ）ＮＭＲ活性核から時間−ドメインデータを生成し、ここで、該一つ以上 の部位の対の各対は、第一のＮＭＲ活性核が占める該第一部位、および第二のＮ ＭＲ活性部位が占める該第二部位を有し、該第一ＮＭＲ活性核が、該生成する段 階で観測され、そして該第一および第二活性核は、該第一部位と第二部位との間 の距離に応答する双極子カップリング周波数(dipolarcoupling frequency)によ って特徴づけられる双極子カップリングを有し、かつ該時間−ドメインデータは 、少なくとも一つの第一時間次元に沿って、該１対またはそれ以上の対のそれぞ れの該双極子カップリングに応答する段階と； （ｂ）スペクトルドメインデータを得るように該ＮＭＲ時間−ドメインデータ を解析して、該一つ以上の部位の対での該第一核と第二核との間の該双極子カッ プリングを特徴づける該一つもしくはそれ以上の双極子カップリング周波数を特 定する、該第一時間次元沿いの該時間−ドメインデータに最大エントロピー変換 を適用することを含む段階と を含む方法。 ２．該１種類またはそれ以上の分子のうち１種類もしくはそれ以上が、ペプチド である請求項１記載の方法。 ３．該１種類またはそれ以上の分子のうち一つもしくはそれ以上を、１種類また はそれ以上の標的化合物に結合する請求項１記載の方法。 ４．該一つ以上の部位の対が、複数部位の対であり、該一つまたはそれ以上の双 極子カップリング周波数が、複数の双極子カップリング周波数である請求項１記 載の方法。 ５．該生成する段階の前に、該一つ以上の部位の対のそれぞれを該ＮＭＲ活性核 で標識し、それによって該部位の各対が、該第一および第二ＮＭＲ活性核に占め られるようになる段階をさらに含む請求項１記載の方法。 ６．該第二ＮＭＲ活性核が、化学シフトを有し、該生成する段階が、該一つ 以上の部位の対の該第二部位で、少なくとも一つの第二時間次元に沿って該第二 ＮＭＲ活性核の該化学シフトにさらに応答するＮＭＲ時間−ドメインデータを生 成し、そして該解析する段階が、該双極子カップリング周波数のそれぞれに対し て、この双極子カップリング周波数を有する該第二ＮＭＲ活性核のそれぞれの該 一つまたはそれ以上の化学シフトをさらに特定する請求項１記載の方法。 ７．該部位の対のうち１対またはそれ以上が、同じ同位元素種の該第一および第 二ＮＭＲ活性核を有する請求項１記載の方法。 ８．それぞれが第一部位および第二部位を含む部位の対を１対以上含む、１種類 またはそれ以上の分子を含むサンプルにおける、それぞれ該第一部位と該第二部 位との間である、一つまたはそれ以上の距離を決定する方法であって、 （ａ）該１種類またはそれ以上の分子のうち１種類もしくはそれ以上を、１種 類またはそれ以上の標的化合物に結合する段階と； （ｂ）ＮＭＲ活性核から時間−ドメインデータを生成し、ここで、該一つ以上 の部位の対の各対は、第一のＮＭＲ活性核が占める該第一部位、および第二のＮ ＭＲ活性部位が占める該第二部位を有し、該第一ＮＭＲ活性核が、該生成する段 階で観測され、そして該第一および第二活性核は、該第一部位と第二部位との間 の距離に応答する双極子カップリング周波数によって特徴づけられる双極子カッ プリングを有し、かつ該時間−ドメインデータは、少なくとも一つの第一時間次 元に沿って、該１対またはそれ以上の対のそれぞれの双極子カップリングに応答 する段階と； （ｃ）スペクトルドメインデータを得るように該ＮＭＲ時間−ドメインデータ を解析して、該一つ以上の部位の対での該第一の核と第二の核との間の該双極子 カップリングを特徴づける該一つもしくはそれ以上の双極子カップリング周波数 を特定する、該第一時間次元沿いの該時間−ドメインデータにＲＥＤＯＲ変換を 適用することを含む段階と を含む方法。 ９．それぞれが第一部位および第二部位を含む部位の対を１対以上含む、１種類 またはそれ以上のペプチドを含むサンプルにおける、それぞれ該第一部位と第二 部位との間である一つまたはそれ以上の距離を決定する方法であ って、 （ａ）ＮＭＲ活性核から時間−ドメインデータを生成し、ここで、該一つ以上 の部位の対の各対は、第一のＮＭＲ活性核が占める該第一部位、および第二のＮ ＭＲ活性部位が占める該第二部位を有し、該第一ＮＭＲ活性核が、該生成する段 階で観測され、そして該第一および第二ＮＭＲ活性核は、該第一部位と第二部位 との間の距離に応答する双極子カップリング周波数によって特徴づけられる双極 子カップリングを有し、かつ該時間−ドメインデータは、少なくとも一つの第一 時間次元に沿って、該１対またはそれ以上の対のそれぞれの双極子カップリング に応答する段階と； （ｂ）スペクトルドメインデータを得るように該ＮＭＲ時間−ドメインデータ を解析して、該一つ以上の部位の対での該第一核と第二核との間の該双極子カッ プリングを特徴づける該一つもしくはそれ以上の双極子カップリング周波数を特 定する、該第一時間次元沿いの該時間−ドメインデータにＲＥＤＯＲ変換を適用 することを含む段階と を含む方法。 １０．該一つ以上の部位の対が、複数対の部位であり、該一つまたはそれ以上の 双極子カップリング周波数が、複数の双極子カップリング周波数である請求項９ 記載の方法。 １１．それぞれ第一部位および第二部位を含む複数対の部位を含む、１種類また はそれ以上の分子を含むサンプルにおける、それぞれ該第一部位と第二部位との 間である、複数の距離を決定する方法であって、 （ａ）ＮＭＲ活性核からＮＭＲ時間−ドメインデータを生成するが、ここで、 該一つ以上の部位の対の各対は、第一のＮＭＲ活性核が占める該第一部位、およ び第二のＮＭＲ活性部位が占める該第二部位を有し、該第一ＮＭＲ活性核が、該 生成する段階で観測され、そして該第一および第二活性核は、該第一部位と第二 部位との間の距離に応答する双極子カップリング周波数によって特徴づけられる 双極子カップリングを有し、かつ該時間−ドメインデータは、少なくとも一つの 第一時間次元に沿って、該１対またはそれ以上の対のそれぞれの双極子カップリ ングに応答する段階と； （ｂ）スペクトルドメインデータを得るように該ＮＭＲ時間−ドメインデータ を解析して、該一つ以上の部位の対での該第一の核と第二の核との間の 該双極子カップリングを特徴づける該一つもしくはそれ以上の双極子カップリン グ周波数を特定する、該第一時間次元沿いの該時間−ドメインデータにＲＥＤＯ Ｒ変換を適用することを含む段階と を含む方法。 １２．該１種類またはそれ以上の分子のうち１種類もしくはそれ以上が、ペプチ ドである請求項１１記載の方法。 １３．該生成する段階の前に、該複数対の部位のそれぞれを該ＮＭＲ活性核で標 識し、それによって該部位の各対が、該第一および第二ＮＭＲ活性核に占められ るようになる段階をさらに含む請求項１１記載の方法。 １４．それぞれが第一部位および第二部位を含む部位の対を１対以上含む、１種 類またはそれ以上の分子を含むサンプルにおける、それぞれ該第一部位と該第二 部位との間である、一つまたはそれ以上の距離を決定する方法であって、 （ａ）ＮＭＲ活性核から時間−ドメインデータを生成し、ここで、該一つ以上 の部位の対の各対は、第一のＮＭＲ活性核が占める該第一部位、および第二のＮ ＭＲ活性部位が占める該第二部位を有し、該第一ＮＭＲ活性核が、該生成する段 階で観測され、化学シフトを有し、そして該第一および第二ＮＭＲ活性核は、１ 対のＮＭＲ活性核を形成し、該第一部位と第二部位との間の距離に応答する双極 子カップリング周波数によって特徴づけられる双極子カップリングを有し、かつ 該時間−ドメインデータは、少なくとも一つの第一時間次元に沿って、該１対ま たはそれ以上の対のそれぞれの双極子カップリングに応答し、少なくとも一つの 第二時間次元に沿って、該１対またはそれ以上のそれぞれの該第一部位で該第一 核の該化学シフトに応答する段階と； （ｂ）スペクトルドメインデータを得るように該ＮＭＲ時間−ドメインデータ を解析して、該一つ以上の部位の対での該第一核と第二核の間の該双極子カップ リングを特徴づける該一つもしくはそれ以上の双極子カップリング周波数を特定 し、かつ該双極子カップリング周波数のそれぞれに対して、この双極子カップリ ング周波数を有する該第一核のそれぞれの化学シフトを特定する、該一つまたは それ以上の双極子カップリングに応答する限りでの該第一時間次元、および他の 時間次元沿いの該時間−ドメインデータに双 極子脱位相スペクトル変換を適用することを含む段階と を含む方法。 １５．該解析する段階が、該一つまたはそれ以上の化学シフトに応答する限りで の該第二時間次元および他の時間次元沿いの該時間−ドメインデータにフーリエ 変換を適用することをさらに含む請求項１４記載の方法。 １６．該ＮＭＲ時間−ドメインデータが、該一つまたはそれ以上の双極子カップ リングに応答する一つの時間次元、および該一つまたはそれ以上の化学シフトに 応答する一つの時間−ドメインを有する請求項１４記載の方法。 １７．該ＮＭＲ時間−ドメインデータが、該一つまたはそれ以上の双極子カップ リングに応答する複数の時間次元を有する請求項１４記載の方法。 １８．該双極子脱位相スペクトル変換が、最大エントロピー変換またはＲＥＤＯ Ｒ変換である請求項１４記載の方法。 １９．該１種類またはそれ以上の分子のうち１種類もしくはそれ以上がペプチド である請求項１４記載の方法。 ２０．該１種類またはそれ以上のペプチドのうち１種類もしくはそれ以上を、１ 種類またはそれ以上の標的化合物に結合する請求項１９記載の方法。 ２１．該１種類またはそれ以上の分子のうち１種類もしくはそれ以上を、１種類 またはそれ以上の標的化合物に結合する請求項１９記載の方法。 ２２．該１種類またはそれ以上の分子が、第一分子および第二分子を含み、該一 つまたは対の部位のうち一つまたはそれ以上が、該第一分子に該第一部位、およ び該第二分子に該第二部位を有する請求項１４記載の方法。 ２３．該一つ以上の部位の対が、複数対の部位であり、該一つまたはそれ以上の 双極子カップリングが、複数の双極子カップリングである請求項１４記載の方法 。 ２４．該ＮＭＲ活性核が、¹³Ｃ、¹⁵Ｎ、³¹Ｐおよび¹⁹Ｆよりなる群から選ばれる 請求項１４記載の方法。 ２５．該部位の対のうち１対またはそれ以上が、同じ同位元素種の該第一および 第二ＮＭＲ活性核を有する請求項１４記載の方法。 ２６．該生成する段階の前に、該一つ以上の部位の対のそれぞれを該ＮＭＲ活性 核で標識し、それによって該部位の各対が、該第一および第二ＮＭＲ活性核に占 められるようになる段階をさらに含む請求項１４記載の方法。 ２７．該標識する段階の後に、該サンプルを形成するために複数の標識分子を混 合する段階をさらに含む請求項２６記載の方法。 ２８．該スペクトルドメインデータを、第一次元沿いの該双極子カップリングの 数値、および第二次元沿いの該化学シフトの数値を有する少なくとも２つの次元 の配置として表示する最終段階をさらに含む請求項１４記載の方法。 ２９．第二組のＮＭＲ時間−ドメインデータを生成し、ここで、該第二ＮＭＲ核 が、該生成する段階で観測され、かつ化学シフトを有する段階と、該第二ＮＭＲ 活性核からの第二組のスペクトルドメインデータを得るように該第二組のＮＭＲ 時間−ドメインデータを解析して、該第二組のスペクトルドメインデータが、該 一つ以上の部位の対の該第一核と第二核との間の該双極子カップリングを特徴づ ける該一つもしくはそれ以上の双極子カップリング周波数を特定し、かつ該双極 子カップリング周波数のそれぞれについて、その双極子カップリング周波数を有 する該第二ＮＭＲ活性核の一つまたはそれ以上の化学シフトを特定する段階とを さらに含む請求項１４記載の方法。 ３０．該第二組のＮＭＲ時間−ドメインデータを解析する該段階の後に、該第一 ＮＭＲ活性核からの該スペクトルドメインデータ、および該第二ＮＭＲ活性核か らの該第二組のスペクトルドメインデータを相関させ、ここで、該相関させるこ とが、該第一核の該化学シフトを、該第一核に双極子カップリングさせた該第二 核の該化学シフトと相関させるように、スペクトルドメインデータを同じ双極子 カップリング周波数と相関させることを含む段階をさらに含む請求項２９記載の 方法。 ３１．該第二ＮＭＲ活性核が、該一つ以上の部位の対のそれぞれの該第二部位で 化学シフトを有し、ここで、該生成する段階は、少なくとも第３の時間次元沿い に、該一つ以上の部位の対のそれぞれの第二部位での該第二ＮＭＲ活性核の該化 学シフトにさらに応答するＮＭＲ時間−ドメインデータを生成し、そして該解析 する段階は、該双極子カップリング周波数のそれぞれについて、その双極子カッ プリング周波数を有する該第二核の一つまたはそれ以上の化学シフトをさらに特 定する請求項１４記載の方法。 ３２．該ＮＭＲ時間−ドメインデータが、該ＮＭＲ活性核の該一つまたはそ れ以上の化学シフトに応答する三つもしくはそれ以上の時間次元を有する請求項 ３１記載の方法。 ３３．該解析する段階の後に、該スペクトルドメインデータを、該双極子カップ リングの数値を第一次元沿いに、該観測された核のそれぞれの該化学シフトの数 値を第二次元沿いに、かつその他の核のそれぞれの該化学シフトの数値を第三次 元沿いに有する三次元透視配置として表示する段階をさらに含む請求項３１記載 の方法。 ３４．該生成する段階が、サンプルをマジック角で回転させる段階、および該第 一部位で該第一ＮＭＲ活性核に対する磁化を生成する１シーケンスのゼロまたは それ以上の高周波（ＲＦ）パルスを該ＮＭＲ活性核の周波数チャンネルで適用し 、自由誘導減衰（ＦＩＤ）シグナルとして該磁化を観測して、該ＮＭＲ時間−ド メインデータを生成する段階をさらに含む請求項１４記載の方法。 ３５．該１シーケンスのＲＦパルスを適用する段階が、第一のＲＦパルスのサブ シーケンスを第一時間隔にわたって適用し、第二のＲＦパルスのサブシーケンス を適用する段階をさらに含み、ここで、該ＮＭＲ活性核の該各対に対する該第一 ＲＦパルスサブシーケンスは、ある量の双極子カップリングを該第一時間隔に応 答する磁化に導入し、該第二ＲＦパルスサブシーケンスは、測定できる該ＦＩＤ シグナルを第二時間隔内に生成し、ここで、該ＦＩＤシグナルは、該第一ＲＦパ ルスサブシーケンスが導入する双極子カップリング相互作用の量と、該第一ＮＭ Ｒ活性核のそれぞれの該化学シフトとの双方に応答し、かつ該第一および該第二 時間隔は、独立に変動できる請求項３４記載の方法。 ３６．それに沿って該ＮＭＲ時間−ドメインデータが該複数の双極子カップリン グに応答する、該少なくとも一つの時間次元が、該第一時間隔の変動の結果とし て生じ、それに沿って該ＮＭＲ時間−ドメインデータが該観測された核の該一つ またはそれ以上の化学シフトに応答する、該少なくとも一つの時間次元が、該第 二時間隔の変動の結果として生じる請求項３５記載の方法。 ３７．該第一ＲＦパルスサブシーケンスが、ＲＥＤＯＲパルスシーケンスであり 、ここで、該ＲＥＤＯＲパルスのサブシーケンスは、第一および第二の形態で適 用され、該第一形態は、該第二部位の該第二ＮＭＲ活性核の該周波 数チャンネルでのパルスを全く保有せず、該第二形態は、該第二部位の該第二Ｎ ＭＲ活性核の該周波数チャンネルでのパルスを適用する請求項３５記載の方法。 ３８．該第一ＲＦパルスサブシーケンスが、ある量の双極子カップリングを、Ｒ ＥＤＯＲパルスシーケンスに対してと同じ形態の応答性で該第一時間隔に応答す る該磁化に導入する請求項３５記載の方法。 ３９．該第一ＲＦパルスサブシーケンスが、ＴＥＤＯＲパルスシーケンスであり 、ここで、該ＴＥＤＯＲパルスのサブシーケンスは、第一のサブ第一時間隔およ び第二のサブ第一時間隔を有し、該第一サブ第一時間隔の際に、該第一部位でパ ルスを該第一核の該周波数チャンネルに適用し、該第二サブ第一時間隔の際に、 該第二部位でパルスを該第二核の該周波数チャンネルに適用する請求項３５記載 の方法。 ４０．該ＴＥＤＯＲパルスシーケンスが、該第一サブ第一時間隔内および該第二 サブ第一時間隔内にともに形成される同時増分によって該第一時間隔が変動する 、対称ＴＥＤＯＲパルスシーケンスである請求項３９記載の方法。 ４１．該一つ以上の部位の対の該第一および第二の核が、同じ同位元素種のもの であり、該第一ＲＦパルスサブシーケンスが、等核ＤＲＡＭＡパルスシーケンス である請求項３５記載の方法。 ４２．該ＲＦパルスシーケンスを適用する段階が、第三の時間隔にわたって第三 のＲＦパルスサブシーケンスを適用する段階をさらに含み、ここで、該第三ＲＦ パルスシーケンスは、該第二部位の該第二核の、該第三時間隔に応答する量の該 化学シフト相互作用を該磁化に導入し、該ＦＩＤシグナルが、該第二部位の該第 二核の化学シフト相互作用の該量にさらに応答し、該第三時間隔は、該第一およ び該第二時間隔とは独立に変動することができる請求項３１および３５記載の方 法。 ４３．それに沿って該ＮＭＲ時間−ドメインデータが該第二部位の該第二核の該 一つまたはそれ以上の化学シフトに応答する、該少なくとも一つの第三の時間次 元が、該第三時間隔の変動の結果として生じる請求項４２記載の方法。 ４４．該第三ＲＦパルスサブシーケンスが、該第三時間隔の間に該第二ＮＭＲ活 性核のそれぞれに磁化を移転し、該一つ以上の部位の対のうちの該第二 部位で該磁化が該第二ＮＭＲ活性核の該化学シフトと作用し合うことを可能にす る請求項４２記載の方法。 ４５．最大エントロピー変換に従って、サンプルから、該サンプル中の１対また はそれ以上のＮＭＲ活性核の間の一つもしくはそれ以上の双極子カップリングに 応答する、少なくとも１次元の時間の変数を有する実験的ＮＭＲ時間−ドメイン データの値から予測されるスペクトルドメインデータの値を決定する方法であっ て、 （ａ）デフォールトスペクトルドメインデータの値を、求積手法(quadrature technique)のための基底関数の係数Ｍとして選ぶ段階と； （ｂ）規則化パラメータαに対する値を決定する段階と； （ｃ）式αＥ−χ²／２［式中、Ｅは、該デフォールトスペクトルドメインデ ータ値についての該予測スペクトルドメインデータ値のエントロピーであり、χ² は、該時間−ドメインデータ値と、該予測スペクトルドメインデータから決定 された時間−ドメインデータ値との間の、実験誤差の推計によって正規化された 差の尺度となる］を最大化するような値として、該求積手法のための基底関数の 係数Ｍとしての該予測スペクトルドメインデータ値を決定する段階と を含む方法。 ４６．時間−ドメインデータ値を、予め特定された方法に従ってスペクトルドメ インデータ値から決定する請求項４５記載の方法。 ４７．該スペクトルドメインデータ値が、双極子カップリング周波数ドメインで あるか、または核間距離ドメインである請求項４５記載の方法。 ４８．該時間−ドメインデータ値が、ＮＭＲの実験から直接決定されたとおりで ある請求項４５記載の方法。 ４９．該Ｍが、１５０より大である請求項４５記載の方法。 ５０．該求積手法のための該基底関数が、該スペクトルドメイン内の間隔を置い た点にピークを有するデルタ関数であり、そのために該求積手法が、該間隔を置 いた点の格子における関数を表わす請求項４５記載の方法。 ５１．該エントロピーＥが、該点の格子で該求積手法によって値を求められる限 りでの式（３７）： ［式中、Ｍ（）は、該予測スペクトルドメインデータ値であり、ｍ（）は、該デ フォールトスペクトルドメインデータ値である］ によって与えられる請求項４５記載の方法。 ５２．該尺度χ²が、式： ［式中、Ｎ＋１は、該時間−ドメインデータ値の数であり、Ｓ_iは、該時間−ド メインデータ値であり、Ｓ'_iは、該予測時間−ドメインデータ値であり、σ_iは 、該時間−ドメインデータ値の実験誤差の推定値である］ によって与えられる請求項４５記載の方法。 ５３．該規則化パラメータαが、式： ［式中、値λ_jは、式： によって与えられる（Ｍ＋１）ｘ（Ｍ＋１）の行列Ｃの固有値である］ によって与えられる請求項４５記載の方法。 ５４．該スペクトルドメインデータ値を最大化によって決定する段階が、Davido n-Fletcher-Powell法またはBroydon-Fletcher-Goldfarb-Shanno法に従って最大 化する段階をさらに含む請求項４５記載の方法。 ５５．該規則化パラメータに対する値を決定する段階が、値１を決定する請求項 ４５記載の方法。 ５６．該規則化パラメータに対する値を決定する段階が、該規則化パラメータに 対する最尤値を決定する請求項４５記載の方法。 ５７．該規則化パラメータに対する最尤値を決定する段階が、 （ａ)該規則化パラメータαに対する現行値を初期値に設定する段階と； （ｂ）該点の格子での中間的なスペクトルドメインデータ値を、αが該規則化 パラメータの該現行値である式αＥ−χ²／２を最大化するような値として決定 する段階と； （ｃ）値λ_jを、該中間的スペクトルドメインデータ値を用いて求められる限 りでの式： によって与えられる（Ｍ＋１）ｘ（Ｍ＋１）の行列Ｃの固有値であるとして決定 する段階と； （ｄ）該規則化パラメータの新たな値α’を、式： を解くことによって決定する段階と； （ｅ）該規則化パラメータの該現行値を、該規則化パラメータの該新たな値で あるとして設定し、該規則化パラメータの該新たな値が、該現行値に応答する変 換基準を満足するまで、該決定する段階を反復する段階と をさらに含む請求項５６記載の方法。 ５８．該予測スペクトルドメインデータを決定する段階の前に、該実験誤差推定 値に対して、スケーリングパラメータγ_σについて最適化された値を決定する段 階をさらに含む請求項４５記載の方法。 ５９．該スケーリングパラメータγ_σについて最適化された値を決定する段階、 ならびに該規則化パラメータαに対する該最尤値を決定する段階が、二つの式： および ［式中、Ｎ＋１は、該時間−ドメインデータ値の数であり、値λ_jは、式： によって与えられる（Ｍ＋１）_×（Ｍ＋１）の行列Ｃの固有値である］ の解として該γ_σおよび該αを決定することをさらに含む請求項５８記載の方法 。 ６０．該スケーリングパラメータγ_σが、０．３＜γ_σ＜３であるように決定さ れるならば、該実験誤差推定値が信頼できる請求項５８記載の方法。 ６１．該スケーリングパラメータγ_σが、９＜γ_σまたはγ_σ＜０．１であるよ うに決定されるならば、該実験誤差推定値は信頼できない請求項５８記載の方法 。 ６２．サンプルから生成され、時間変数の二つまたはそれ以上の、その少なくと も一つが該サンプル中のＮＭＲ活性核の一つまたはそれ以上の対の間の一つもし くはそれ以上の双極子カップリングに応答する次元を有し、そして該双極子カッ プリングを特徴づけるスペクトルドメインデータから、式： ［式中、Ｍ（Ｄ）は、該スペクトルドメインデータ値であり、Ｓ（ｔ）は、該時 間−ドメインデータ値であり、Ｋ（ｔ，Ｄ）は、式： によって示される］ の数値を求める手法によって決定できる、ＮＭＲ時間−ドメインデータ値をＲＥ ＤＯＲ変換に従って解析する方法であって、 該時間−ドメインデータ値での求積手法に従って、式： ［式中、Ｋ（ｔ，Ｄ）は、予測スペクトルドメインデータ値Ｍ（Ｄ）を該時間− ドメインデータ値から求めるための式： によって与えられる］ の数値を求める段階を含む方法。 ６３．該１対またはそれ以上のＮＭＲ活性核を標識化によって該サンプルに導入 し、かつ数値を求める段階の前に、該時間−ドメインデータ値を補正し て、該サンプル中に存在する該ＮＭＲ活性核の効果を、該標識化をせずに、かつ それらの自然界での豊富さにおいて排除する段階をさらに含む請求項６２記載の 方法。 ６４．数値を求める段階の前に、該時間−ドメインデータ値を平滑化して、該時 間−ドメインデータ値中のノイズによる該予測スペクトルドメインデータ値中の 人為産物を排除する段階をさらに含む請求項６２記載の方法。 ６５．該平滑化を、三点Blackman-Harris関数、指数線拡張関数、Hammingの窓関 数、およびKaiserの窓関数の群から選ばれる平滑化関数に従って実施する請求項 64記載の方法。 ６６．Ｓ（ｔ）／Ｓ₀（ｔ）という形態のＲＥＤＯＲ時間−ドメインデータ値で ある該ＮＭＲ時間−ドメインデータ点を、サブシーケンスとしてＲＥＤＯＲパル スシーケンスを含む高周波（「ＲＦ」）パルスシーケンスを該ＮＭＲ活性核の周 波数帯に適用することによって生成する請求項６２記載の方法。 ６７．該ＮＭＲ時間−ドメインデータ点を、サブシーケンスとして対称ＴＥＤＯ Ｒパルスシーケンスを含む高周波（「ＲＦ」）パルスシーケンスを該ＮＭＲ活性 核の周波数帯に適用することによって生成する請求項６２記載の方法。 ６８．最大エントロピー変換に従ってサンプルから、該サンプル中の１対または それ以上のＮＭＲ活性核の間の一つもしくはそれ以上の双極子カップリングに応 答する、少なくとも１つの次元の時間の変数を有する実験的ＮＭＲ時間−ドメイ ンデータの値から予測されるスペクトルドメインデータ値Ｍ（）を見出す装置で あって、 （ａ）デフォールトスペクトルドメインデータの値ｍ（）を、該スペクトルド メインでの求積手法のための基底関数の係数Ｍとして選ぶ手段と； （ｂ）規則化パラメータαに対する値を決定する手段と； （ｃ）Davidon-Fletcher-Powell法に従って式αＥ−χ²／２を最大化するよう な値として、該求積手法のための基底関数の係数Ｍとしての該予測スペクトルド メインデータ値を決定し、ここで、（１）Ｅは、該デフォールトスペクトルドメ インデータ値についての該予測スペクトルドメインデータ値のエントロピーであ り、該点の格子で求積手法によって求められる限りでの式（50）： によって与えられ、（２）χ²は、該時間−ドメインデータ値Ｓ_iと、特定された 手法に従って該予測スペクトルドメインデータ値Ｍ（）から決定され、式： ［式中、Ｎ＋１は、該時間−ドメインデータ値の数である］ によって与えられる、時間−ドメインデータ値Ｓ'_iとの間の、実験誤差の推定値 σ_iによって正規化された差の尺度となる手段と を含む装置。 ６９．該規則化パラメータに対する最尤値を決定する手段が、 （ａ）該規則化パラメータαに対する現行値を初期値に設定する手段と； （ｂ）該点の格子での中間的なスペクトルドメインデータ値を、αが該規則化 パラメータの該現行値である式αＥ−χ²/２を最大化するような値として決定す る手段と； （ｃ）Jacobi法に従って、値λ_jを、該中間的スペクトルドメインデータ値を 用いて求められる限りでの式： によって与えられる（Ｍ＋１）×（Ｍ＋１）の行列Ｃの固有値であるとして決定 する手段と； （ｄ）該規則化パラメータの新たな値α’を、式： を解くことによって決定する手段と； （ｅ）該規則化パラメータの該現行値を、該規則化パラメータの該新たな値で あるとして設定し、該規則化パラメータの該新たな値が、該現行値に応答する変 換基準を満たすまで、該決定する段階を反復する手段と をさらに含む請求項６８記載の装置。 ７０．該規則化パラメータαに対する最尤値を決定する手段が、スケーリン グパラメータγ_σに対する最適化された値を決定する手段をさらに含み、ここで 、該規則化パラメータαおよびスケーリングパラメータγ_σを、二つの式： および［式中、Ｎ＋１は、該時間−ドメインデータ値の数であり、値λ_jは、式： によって与えられる（Ｍ＋１）×（Ｍ＋１）の行列Ｃの固有値である］ の解によって決定する請求項６８記載の装置。 ７１．ＮＭＲ時間−ドメインデータ値をＲＥＤＯＲ変換に従って解析して、予測 されるスペクトルドメインデータ値を決定する装置であって、 （ａ）サンプルから、時間変数の二つまたはそれ以上の、その少なくとも一つ が該サンプル中のＮＭＲ活性核の１対またはそれ以上の間の一つもしくはそれ以 上の双極子カップリングに応答する、次元を有し、そして該双極子カップリング を特徴づけるスペクトルドメインデータから、式： ［式中、Ｍ（Ｄ）は、該スペクトルドメインデータ値であり、Ｓ（ｔ）は、該時 間−ドメインデータ値であり、Ｋ（ｔ，Ｄ）は、式： によって示される］ の数値を求める手法によって決定できる、該時間−ドメインデータ値を生成する 手段と； （ｂ）該時間−ドメインデータ値での求積手法に従って、式： の数値を求める手段と を含み、そしてＫ（ｔ，Ｄ）が、式：によって与えられる装置。 ７２．該生成する手段が、サブシーケンスとしてＲＥＤＯＲパルスシーケンスを 含む高周波（「ＲＦ」）パルスシーケンスを該ＮＭＲ活性核の周波数帯に適用す る手段をさらに含み、該時間−ドメインデータ値が、Ｓ（ｔ）／Ｓ₀（ｔ）とい う形態のＲＥＤＯＲ時間−ドメインデータ値である請求項７１記載の装置。 ７３．該生成する手段が、サブシーケンスとして対称ＴＥＤＯＲパルスシーケン スを含む高周波（「ＲＦ」）パルスシーケンスを該ＮＭＲ活性核の周波数帯に適 用する手段をさらに含む請求項７１記載の装置。 ７４．それぞれが第一部位および第二部位を含む部位の対を１対以上含む、１種 類またはそれ以上のペプチドを含むサンプルにおける、それぞれ該第一部位と該 第二部位との間である、一つまたはそれ以上の距離を決定する方法であって、 （ａ）該一つ以上の部位の対のそれぞれを該ＮＭＲ活性核で標識し、それによ って該部位の対のそれぞれが、該第一および該第二のＮＭＲ活性核によって占め られるようになる段階と； （ｂ）ＮＭＲ活性核からＮＭＲ時間−ドメインデータを生成し、ここで、該一 つ以上の部位の対の各対は、第一のＮＭＲ活性核が占める該第一部位、および第 二のＮＭＲ活性部位が占める該第二部位を有し、該第一ＮＭＲ活性核が、該生成 する段階で観測され、化学シフトを有し、そして該第一および第二ＮＭＲ活性核 は、該第一部位と第二部位との間の距離に応答する双極子カップリング周波数に よって特徴づけられる双極子カップリングを有し、かつ該時間−ドメインデータ は、少なくとも一つの第一時間次元に沿って、該１対またはそれ以上の対のそれ ぞれの双極子カップリングに応答し、少なくとも一つの第二時間次元に沿って、 該１対またはそれ以上のそれぞれの該第 一部位で該第一核の該化学シフトに応答する段階と； （ｃ）スペクトルドメインデータを得るように該ＮＭＲ時間−ドメインデータ を解析して、該一つ以上の部位の対での該第一核と第二核の間の該双極子カップ リングを特徴づける該一つもしくはそれ以上の双極子カップリング周波数を特定 し、かつ該双極子カップリング周波数のそれぞれに対して、この双極子カップリ ング周波数を有する該第一核のそれぞれの一つまたはそれ以上の化学シフトを特 定する、該一つもしくはそれ以上の双極子カップリングに応答する限りでの該第 一時間次元、および他の時間次元沿いの該時間−ドメインデータに双極子脱位相 スペクトル変換を適用することを含む段階と を含む方法。 ７５．該標識する段階が、該ＮＭＲ活性核で標識したアミノ酸からの１種類また はそれ以上のペプチドを合成する段階をさらに含む請求項７４記載の方法。 ７６．該合成を合成樹脂上で実施し、該ペプチドを、該合成樹脂上の部位に付着 させて合成する請求項７５記載の方法。 ７７．該合成を、ｔＢ０ＣまたはＦＭＯＣの化学のプロトコルに従って実施する 請求項７５記載の方法。 ７８．該１種類またはそれ以上のペプチドのうち１種類もしくはそれ以上が、１ 種類またはそれ以上の標的タンパク質に結合する請求項７４記載の方法。 ７９．該標識する段階の後に、１種類またはそれ以上の標的タンパク質に結合す る該１種類またはそれ以上のペプチドのうちの該１種類もしくはそれ以上を、該 １種類またはそれ以上の標的タンパク質に結合する段階をさらに含む請求項７８ 記載の方法。 ８０．該結合する段階の前に、該標的タンパク質をコードする１種類またはそれ 以上のｃＤＮＡから該１種類もしくはそれ以上の標的タンパク質を合成する段階 をさらに含む請求項７８記載の方法。 ８１．該１種類またはそれ以上の標的タンパク質の該合成が、該１種類またはそ れ以上の標的タンパク質を、ピキア・パストリスPichia pastorisの発現系また は大腸菌Ｅ．coli中でグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ融合タンパク質と して発現させる段階を含む請求項８０記載の方法。 ８２．該標識する段階が、異なる対の部位の該第一および第二部位を占めるＮＭ Ｒ活性核の間の双極子カップリングを最小化するように、該一つ以上の部位の対 を選ぶ段階を含む請求項７４記載の方法。 ８３．該１種類またはそれ以上のペプチドのうち該１種類もしくはそれ以上が、 構造上特に問題とされる領域を有し、該一つ以上の部位の対を、該特に問題とさ れる領域の付近で選ぶ請求項７４記載の方法。 ８４．該標識する段階が、骨格標識または側鎖標識による標識化を含む請求項７ ４記載の方法。 ８５．該サンプルが、該１種類またはそれ以上の標識ペプチドを、該ＮＭＲ活性 核間の分子間双極子カップリングの強さを、該一つ以上の部位の対での該１対も しくはそれ以上のＮＭＲ活性核の間の該分子内双極子カップリングの強さの５％ 未満にまで、該ＮＭＲ活性核間の分子間双極子カップリングの強さを最小化する 濃度で含有する請求項７４記載の方法。 ８６．請求項４５の方法を実施するための指示を含むコンピュータ可読媒体。 ８７．請求項６２の方法を実施するための指示を含むコンピュータ可読媒体。