CN112461881B - 一种检测rna中弱稳定性碱基对的固体核磁共振方法 - Google Patents

一种检测rna中弱稳定性碱基对的固体核磁共振方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测RNA中弱稳定性碱基对的固体核磁共振方法，涉及固体核磁共振波谱学领域。通过设计一种新型二维氢检测固体核磁共振脉冲序列2D WaterREXSY，检测RNA中稳定性较弱的碱基对。在脉冲序列中，利用了氢核上的Lee‑Goldburg自旋锁场，观测水与RNA中可交换质子的化学交换，并通过压制1H自旋扩散和偶极耦合相互作用，实现化学交换过程的专一性检测。弱稳定性碱基对中的可交换质子与水的交换速率较快，信号较强，从而实现对弱稳定性碱基对的特异性检测。

Description

一种检测RNA中弱稳定性碱基对的固体核磁共振方法
技术领域
本发明涉及固体核磁共振波谱学领域，尤其涉及基于固体核磁共振技术检测RNA中弱稳定性碱基对，以及RNA中可交换质子与水化学交换的研究方法。
背景技术
RNA是一种重要的生物大分子，在传递遗传信息、调控基因表达、抵御和治疗疾病等方面发挥着重要的作用(Bandyra,K.；Luisi,B.,RNA，2015.)。RNA的生物学功能与RNA多样的结构，以及复杂的动力学特征密切相关(J.Chen and W.Zhang,J Chem Phys,2012.)。RNA结构的基础之一是由氢键稳定的碱基对。碱基对的稳定性由形成碱基对的氢键稳定性决定，与形成碱基对的碱基类型以及RNA中碱基对所处的位置密切相关(H.A.Heus andC.W.Hilbers,Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids,2003.)。了解碱基对稳定性的强弱是理解RNA结构和动力学的重要基础，特别是RNA中弱稳定性碱基对与配体识别、构象变化等机理息息相关，有重要的研究价值。虽然传统的结构生物学技术，如液体核磁、X-ray晶体衍射技术、低温冷冻电镜等技术手段可以解析RNA结构，并获取氢键的结构信息，然而检测RNA中氢键强度的强弱，以及RNA中碱基对稳定性的强弱，依然是各技术手段的难点，尤其是缺少特异性检测弱稳定性碱基对的实验方法(J.Sheng,et al.,Nucleic Acids Res,2013.)。
近年来，固态核磁共振技术(SSNMR)作为研究RNA结构和动力学的重要工具发展迅速(Y.Yang and S.Wang,Chemistry,2018.)。它不受RNA分子量的限制(J.Leppert,et.al,Nucleic Acids Res,2004.)，并且在研究聚集态RNA方面具有巨大研究潜力(A.Jain andR.D.Vale,Nature,2017.)。此外，SSNMR可以提供时间尺度在秒-毫秒范围内的RNA动力学信息(P.S.Emani,et al.,J Phys Chem B,2010.)。由于RNA动力学与氢键的稳定性相关，因此可通过RNA动力学相关实验判断RNA中氢键稳定性的强弱。
RNA中弱稳定性碱基对的检测，可以利用RNA分子中参与形成氢键的亚氨基质子与环境中水分子的化学交换过程。亚氨基质子与环境中的水交换过程通常可以根据碱基对的“开-关模型”进行描述(P.Varnai,M.Canalia and J.L.Leroy,J Am Chem Soc,2004)(图1)，即RNA中的氢键存在形成(关)和解离(开)的动态平衡。在解离状态下，氢键中的亚氨基质子可以与周围水分子发生化学交换，而在氢键形成状态下，此化学交换过程不发生。因此，参与形成氢键的亚氨基质子可以作为氢键开合动力学的“探针”，通过检测亚氨基质子与水分子的交换速率，可分析亚氨基质子参与形成的氢键的强度、稳定性等。对于稳定性强的碱基对而言，处于解离(开)状态的碱基较少，亚氨基质子与水分子之间的化学交换速率较慢，通常交换速率常数(kex)小于10s-1；而对于弱稳定性的碱基对而言，处于解离(开)状态的碱基相对较多，亚氨基质子与水分子发生化学交换速率较快，通常kex大于100s-1。因此，通过设计水与亚氨基质子交换速率编辑的固体核磁共振实验，可实现对RNA中不同碱基对稳定性强弱的比较。
发明内容
本发明的目的是提出一种特异性检测RNA中弱稳定性碱基对的固体核磁共振方法，通过设计氢检测固体核磁共振脉冲序列，检测RNA中与水分子发生快速化学交换的亚氨基质子，进而可鉴定出稳定性较弱的碱基对。本发明通过如下技术方案实现：
一种检测RNA中弱稳定性碱基对的固体核磁共振方法，包括以下步骤：
(1)制备待测RNA样品，所述RNA样品中鸟嘌呤核糖核苷酸(G)或尿嘧啶核糖核苷酸(U)二者至少有一种由15N标记；
(2)对所述RNA样品进行水-RNA交换光谱的二维固体核磁脉冲序列2D WaterREXSY(水-RNA交换谱法，Water-RNA exchange spectroscopy)的设定，步骤包括：
首先将1H信号激发，通过1H-15N REDOR、band selective-REDOR等中的一种组合脉冲，压制亚氨基的1H信号，但对水分子或其他不与15N相连的1H核信号影响较小；
然后将1H的磁化矢量方向偏转至魔角方向(54.7°)进行自旋锁场，其时间为tSL。在tSL时间内，水和RNA中可交换质子可发生化学交换；
再然后通过Lee-Goldburg交叉极化(Lee-Goldburg CP，LG)将由水极化传递的亚氨基的1H信号转移给化学键相连的15N原子，记录15N化学位移，同时采用TPPM、CW、XiX、SPINAL等中的一种脉冲对1H去耦；
最后在1H通道上利用MISSISIPPI脉冲序列进行溶剂信号的压制，再通过15N-1H CP(交叉极化)将15N极化量转移给直接相连的1H原子，记录1H化学位移，完成化学交换过程的二维纪录；
(3)使用固体核磁共振波谱仪对RNA样品进行检测，得到二维WaterREXSY谱图；
(4)收集不同锁场时间(tSL)下二维WaterREXSY谱图并进行分析，得到RNA中亚氨基质子与水分子的化学交换速率常数kex。
进一步地，步骤(1)中所述RNA样品的制备方法包括：通过体外转录法、固相合成方法或生物提取法得到RNA样品。
进一步地，所述RNA样品通过含尿素的聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯化。
进一步地，所述RNA样品纯度在90％以上。
进一步地，步骤(4)中得到RNA中亚氨基质子与水分子的化学交换速率常数kex的步骤包括：
对于2D WaterREXSY脉冲序列，在LG锁场时，通过调节锁场时间tSL改变水分子与RNA的接触时间，即RNA与水分子化学交换的时间；
根据经典的Solomon方程推导得到WaterREXSY谱图的信号强度与锁场时间tSL，交换速率常数kex之间的关系，该关系如以下方程3，根据该方程3计算得到RNA中亚氨基质子与水分子之间的kex。
本发明方法的原理可通过“碱基对开-关模型”(图1)进行解释：
碱基对存在着打开、关闭的动态过程，碱基对打开、关闭的速率常数分别为kopen、kclose。形成氢键的亚氨基质子仅在碱基对打开时，可以与水分子发生化学交换，且打开状态下亚氨基质子与水的交换速率常数为kex,open。因此，对于参与形成氢键的亚氨基质子与水分子之间化学交换全过程的速率常数为kex，其可以根据kopen、kclose和kex,open之间的关系表示(K.Snoussi and J.L.Leroy,Biochemistry)：
kex＝kopen*kex,open/(kclose+kex,open) (方程1)
无其他催化剂时，kclose>>kex,open，因此方程1可简化为：
kex＝kopen*kex,open/kclose＝Kop*kex,open (方程2)
其中，Kop＝kopen/kclose，其为碱基对打开、关闭过程的平衡常数，可以反映碱基对的稳定性：碱基对稳定性越弱，Kop数值越大。此外，kex,open代表氢键打开情况下亚氨基质子与水的交换速率，数值约为106s-1.
因此，从方程2可以看出，kex的数值大小主要受Kop数值大小的影响：碱基对稳定性越弱，Kop数值越大，从而导致参与形成碱基对的亚氨基质子与水分子的化学交换速率常数kex数值越大。
为了实现检测目的，固体核磁脉冲序列的设计原理如下：
图2显示了2D WaterREXSY脉冲序列。此脉冲序列是二维1H-15N氢检测固体核磁共振脉冲序列，设计上有两个重要部分；(1)加入1H-15N REDOR脉冲序列，压制直接与15N原子相连的1H原子信号；(2)加入Lee-Goldburg(LG)序列，在魔角方向进行氢核自旋锁场。其中，1H-15N REDOR脉冲序列的作用是压制RNA中自身的亚氨基信号，而水的信号受到影响较小。LG序列的作用是压制1H-1H自旋扩散，避免自旋扩散现象对观测化学交换过程的影响，同时RNA中的可交换质子与水发生化学交换，因此可以对化学交换过程实现专一性的检测。
在该脉冲序列中，魔角方向进行氢核自旋锁场时的时间(tSL)决定了RNA的亚氨基质子与水分子发生化学交换的时间。因此设置不同的tSL可收集不同的固体核磁谱图，谱图中信号峰的强弱(S)与tSL之间具有如下的关系：
S(tSL)＝S(0)+A[1-exp(-kextSL)]exp(-tSL/T1ρ) (方程3)
方程3中，S(0)为tSL＝0时的信号强度，其为定值，A为常数，T1ρ为参与交换的质子的自旋晶格弛豫时间，kex为交换速率常数，tSL为锁场时间，S(tSL)代表不同tSL下的信号强度。此外，通过方程3中不同tSL下信号强度S(tSL)与tSL之间的关系即可拟合得到kex的数值。
该方法利用了参与形成氢键的亚氨基质子与水之间的化学交换过程，以使观察到的亚氨基信号均来自激发的水信号。由于弱稳定性的碱基对中亚氨基质子与水有较快的交换速率，因此在2D WaterREXSY实验中仅需较短的tSL可以检测到信号。如：亚氨基质子与水之间的kex为500ms-1时，tSL仅需要2ms便可观测到较强的信号。而稳定性强的碱基对则难以在相同的tSL时间范围内得到检测。因此，该脉冲序列的设计可以特异性实现区分弱碱基对强弱的目的，从而对RNA中不同碱基对稳定性强弱进行判断。此外，通过氢直接检测和二维技术，可以提高分辨率和实验的灵敏度，避免不同亚氨基原子的化学位移相似导致的重叠问题。
相较于现有技术，本发明的有益效果如下：
(1)本发明与以往研究生物大分子与水分子化学交换过程的实验相比，避免了1H自旋扩散和偶极耦合相互作用的影响，首次实现了RNA碱基对中亚氨基质子与水分子化学交换过程的特异性检测和RNA中氢键稳定性强弱的比较，在固体RNA样品中特异性检测弱稳定性的碱基对，克服了弱稳定性碱基对难检测的困难；
(2)设计了检测亚氨基质子与水分子化学交换现象的固体核磁方法，通过新型二维固体核磁脉冲序列WaterREXSY，实现了1H-15N相关谱的建立，实现了对与水分子发生化学交换，且时间尺度在毫秒量级的，RNA中核苷酸位点的检测。通过WaterREXSY实验，只有与水分子发生化学交换的RNA亚氨基信号可以被检测到，同时可以避免1H-1H偶极偶合相互作用的干扰，实现对RNA与水分子相互作用过程的专一性检测。
(3)此外，通过该方法可以检测RNA的亚氨基或氨基质子与水分子发生化学交换时的速率，从而得到相关氢键“解离-形成”的速率。
附图说明
图1为RNA的碱基对的“开-关模型”示意图；
图中：kex为亚氨基质子发生化学交换的速率常数，kopen为碱基对打开的速率常数，kclose为碱基对闭合的速率常数，kex,open为碱基对打开时与水分子发生化学交换的速率常数；
图2为二维WaterREXSY脉冲序列示意图；
图中LGSL为魔角锁场过程，CP为交叉极化，LGCP为Lee-Goldburg交叉极化，lpTPPM为低功率1H去耦过程，DEC为采集1H信号时对15N去耦过程；
图中：φ1＝y,-y；φ2＝x,x,-x,-x；φ3＝y,y,y,y,-y,-y,-y,-y；φrec＝y,-y,-y,y,-y,y,y,-y；t1：演化期；t2：采集期；
图3为本发明一实施例riboA71-adenine、未加配体的riboA71(记作W-riboA71)和突变体M-riboA71-adenine的结构模型；
图4为本发明一实施例riboA71-adenine的二维hNH谱和二维WaterREXSY谱的比较；
图5为本发明一实施例尿嘧啶核糖核苷酸被标记的W-riboA71的1H-15N HSQC谱(a)、2D hNH谱(b)和2D WaterREXSY谱(c)，以及尿嘧啶核糖核苷酸被标记的M-riboA71-adenine的1H-15N HSQC谱(d)、2D hNH谱(e)和2D WaterREXSY谱(f)；
图6为本发明一实施例riboA71在不同tSL下的WaterREXSY谱中参与形成非经典配对的尿嘧啶的亚氨基信号强度(a)以及信号相对强度与tSL之间的拟合曲线图(b)。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明做进一步说明，所举实施例并不用于限制本发明。对于本领域技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的权利要求范围之内。
实施例1
1.RNA样品的制备：
本实施例以调节add基因的核糖开关RNA(add-riboswitch)的适配体部分(riboA71)为模型进行脉冲序列的测试。该RNA由71个核糖核苷酸构成，其为add-riboswitch的适配体区域，配体为腺嘌呤(adenine)。本发明共制备了三种riboA71相关样品，分别为riboA71与配体的复合物(记作riboA71-adenine)、未加配体的riboA71(记作W-riboA71)和G30、U19突变为A30、A19的riboA71-adenine复合物(记作M-riboA71-adenine)，结构如图3所示。
(1)DNA模板的构建
本实施例通过体外转录方法得到三种riboA71，首先需要根据目标RNA设计相应的DNA模板。DNA模板由两条互补的DNA单链组成，分别为正向链(R链)和反向链(F链)，序列如下：
riboA71-adenine和W-riboA71：
R链：
5’-GGGAAGATAATCAAGAGTTTAAGGCTCTTGGTAGAAACTCCCAAACCATATCATT AGGATTATATCTTCCCTATAGTGAGTCGTATTAA-3’
F链：
5’-TTAATACGACTCACTATAGGGAAGATATAATCCTAATGATATGGTTTGGGAGTTTCT ACCAAGAGCCTTAAACTCTTGATTATCTTCCC-3’
M-riboA71-adenine：
R链：
5’-GGGAAGATAATCAAGAGTTTAAGGCTCTTGGTAGAAACTCCTAAACCATATCTTT AGGATTATATCTTCCCTATAGTGAGTCGTATTAA-3’
F链：
5’-TTAATACGACTCACTATAGGGAAGATATAATCCTAAAGATATGGTTTAGGAGTTTC TACCAAGAGCCTTAAACTCTTGATTATCTTCCC-3’
DNA单链经过离心、溶解、升温退火等过程，形成线性化的双链DNA模板(终浓度为25M)。
(2)体外转录制备RNA样品
本实施例通过5mL的体外转录体系得到RNA样品：在50mL离心管中依次加入2.5mLDEPC处理水，100mM 13C,15N同位素标记的UTP、ATP、GTP、CTP各250μL，500μL Tris缓冲液(含400mM Tris/HCl，pH 8.0，10mM Spermidine，0.1％Triton X-100)，1M二硫苏糖醇(DTT)50μL，1M MgCl2 225μL，25μM DNA模板170μL，2mg/mL T7 RNA聚合酶500μL。37℃水浴中孵育24小时以保证原料完全反应。
(3)RNA的纯化
最常用的纯化方法为聚丙烯酰胺凝胶电泳方法，是否为变性胶(即是否加入尿素)，以及PAGE胶的比例需要根据RNA性质来确定。本实施例中，转录反应完成后通过含7M尿素的12％变性聚丙烯酰胺(PAGE)凝胶电泳进行纯化，电泳结束后在紫外灯下切胶得到目标条带。将含有目标RNA的条带浸泡于提取缓冲液中(20mM Tris-HCl，300mM sodiumacetate，1mM EDTA，pH 7.4)，37℃下浸泡约12小时，收集溶液，通过超滤的方法将RNA样品溶解于含10mM KH2PO4，30mM KCl，2mM MgCl2，pH 6.8的75％氘代溶液中。95℃下加热5分钟，冰浴30分钟，使riboA71正确折叠。
对于M-riboA71-adenine和riboA71-adenine样品，需要在折叠后加入腺嘌呤(RNA与腺嘌呤的当量比为1:7)，使配体与RNA结合。
(4)RNA固体样品的制备
向一定浓度的riboA71溶液中先加入1/10体积的2M NaCl溶液，再加入2-3倍体积的-20℃预冷的75％氘代无水乙醇，将整个体系放置在-20℃的洁净环境中过夜，以9600g离心5min后，弃去上清，用少量70％的预冷乙醇清洗底部沉淀，即可得到RNA沉淀。通过上述方法制备大约5mg含13C,15N同位素标记的RNA纯品，装进1.9mm固体核磁转子中。
2.脉冲序列的设置
2D WaterREXSY SSNMR实验在40kHz的魔角转速下完成。直接维(F1:1H)，间接维(F2:15N)，在t1演化期和t2采集期分别取了574个点和100个点。1H的π/2脉冲为2.6μs，15N的π/2脉冲为4.5μs。循环等待时间为2s。LG锁场前，在15N上施加REDOR脉冲组合。LG锁场时，在距磁场中心+37.6kHz处对1H施加频率为53.2kHz的射频场，实现魔角方向(54.7°)产生65.2kHz的有效场。在1H-15N LG交叉极化传递过程中，15N的连续锁场功率为13.2kHz，1H的锁场功率为53.2kHz，接触时间为300μs。在15N-1H交叉极化传递过程中，15N的连续锁场功率为60kHz，1H的锁场功率为100kHz，接触时间为300μs。在15N化学位移演化期，采用TPPM脉冲对1H去耦，去耦功率10kHz。实验中利用MISSISIPPI脉冲序列对水的信号进行压制。
3.谱图收集与结果分析
请参照图4。为了证明WaterREXSY实验能够实现对RNA中弱稳定性碱基对的检测，本实施例收集了13C,15N标记的riboA71-adenine样品的二维hNH谱图和WaterREXSY谱图进行对比，结果如图4所示。图4中a为riboA71的二维hNH谱图，在图中可以观察到RNA内所有亚氨基的信号，包括参与形成G-C经典沃森-克里克配对的鸟嘌呤的N1-H1交叉峰、参与形成U-A经典沃森-克里克配对的尿嘧啶的N3-H3交叉峰以及参与形成非经典配对的尿嘧啶的N3-H3交叉峰。而对于tSL为2ms下riboA71的二维WaterREXSY谱图(图4中b)而言，只能观察到参与形成非经典配对的尿嘧啶的N3-H3交叉峰，说明通过WaterREXSY实验，在较短的锁场时间下riboA71中参与形成非经典配对的尿嘧啶的亚氨基质子可以与水分子发生化学交换，同时说明非经典配对的稳定性较差，因此证明二维WaterREXSY实验在特异性筛选弱稳定性碱基对时具有可行性。
由于固体核磁谱图分辨率的限制，无法对参与形成非经典配对的尿嘧啶信号峰进行指认，因此无法确定具体发生交换的核苷酸位点。因此，本发明又收集了另外两个riboA71样品(W-riboA71和M-riboA71-adenine)的二维WaterREXSY谱图。为了简化谱图信息，两个RNA均只有尿嘧啶核糖核苷酸被标记。如图3中的结构图所示，对于W-riboA71而言，尿嘧啶形成的非经典配对仅包括U16-G30和U19-U27。因此在1H-15N HSQC谱(图5中a)中，尿嘧啶的非经典配对区域只检测到了U16,U19,U27三个信号峰，而WaterREXSY谱(图5中c)中未观察到相应的信号，表明U16,U19,U27的亚氨基质子未与水分子发生毫秒时间尺度的化学交换。而对于M-riboA71-adenine而言，尿嘧啶中仅有U35和U37可以形成非经典配对，同样在1H-15N HSQC谱(图5中d)中尿嘧啶的非经典配对区域观测到了U35,U37两个信号峰，同样在二维固体核磁谱图hNH谱中也观察到了U35、U37两个信号峰(图5中e)。而M-riboA71-adenine样品的二维WaterREXSY谱(图5中f)观察到了一个单独的信号峰。通过15N化学位移数值可以确认该信号峰代表U35的亚氨基信号。因此，通过以上两个RNA的WaterREXSY实验数据证明了在riboA71-adenine复合物中，只有U35的亚氨基质子可以与水分子发生明显的化学交换现象。根据riboA71-adenine的晶体结构可知，U35位于配体结合区域，可以与U39及adenine形成氢键。WaterREXSY实验检测到的可与水分子发生化学交换的U35的亚氨基质子可以与U39的羰基形成N-H…O＝C氢键。因此，该氢键与其他亚氨基质子形成的氢键相比属于稳定性较弱的氢键。
此外，通过测定不同tSL条件下的二维WaterREXSY谱图，通过谱峰信号强度随tSL的变化，可以拟合亚氨基质子与水的kex。分别收集tSL＝0.5ms、0.8ms、1.2ms、2ms、3ms、4ms和5ms的WaterREXSY谱图，截取参与形成非经典配对的尿嘧啶的亚氨基信号得到图6中a图，发现随着锁场时间变大，信号强度逐渐增强，在tSL达到4ms时，2D WaterREXSY信号强度最大，tSL达到5ms时信号开始衰减。以tSL为横坐标、归一化信号相对强度(设定最高值为1，即4ms时信号相对强度为1)为纵坐标作图。根据方程3，对于riboA71-adenine复合物体系，S(0)数值为定值，拟合方程式按照常数处理，A为常数。实验测得参与交换的亚氨基质子1HT1ρ＝8.45ms。因此，根据方程3拟合曲线得到kex为379±57s-1。因此，通过该方法可以检测大分子，如RNA与水分子之间相互作用的动态过程。

Claims (8)

1.一种检测RNA中弱稳定性碱基对的固体核磁共振方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)制备待测RNA样品，RNA样品中鸟嘌呤核糖核苷酸或尿嘧啶核糖核苷酸二者至少有一种由15N标记；
(2)对RNA样品进行水-RNA交换光谱的二维固体核磁脉冲序列2D WaterREXSY的设定，步骤包括：
首先将1H信号激发，然后通过组合脉冲压制亚氨基的1H信号，该组合脉冲包括1H-15NREDOR或band selective-REDOR；
其次将1H的磁化矢量方向偏转至魔角方向进行自旋锁场，其时间为tSL，在锁场时，水和RNA中可交换质子发生化学交换；
再次通过Lee-Goldburg交叉极化将由水极化传递的亚氨基的1H信号转移给化学键相连的15N原子，记录15N化学位移，同时利用脉冲对1H去耦；
最后在1H通道上利用MISSISIPPI脉冲序列进行溶剂信号的压制，再通过15N-1H交叉极化将15N极化量转移给直接相连的1H原子，记录1H化学位移，完成化学交换过程的二维纪录；
(3)使用固体核磁共振波谱仪对RNA样品进行检测，得到二维WaterREXSY谱图；
(4)收集不同tSL下二维WaterREXSY谱图并进行分析，得到RNA中亚氨基质子与水分子的化学交换速率。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，RNA样品的制备方法包括：通过体外转录法、固相合成方法或生物提取法。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，RNA样品通过含尿素的聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯化。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，RNA样品纯度在90％以上。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，对1H去耦的脉冲包括TPPM、CW、XiX或SPINAL。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，得到RNA中亚氨基质子与水分子的化学交换速率的步骤包括：
对于2D WaterREXSY脉冲序列，在LG锁场时，通过调节tSL改变水分子与RNA中可交换质子的交换时间；
在tSL时间内，得到WaterREXSY谱图的信号强度与tSL、交换速率常数kex之间的关系；
根据上述关系得到RNA中亚氨基质子与水分子的化学交换速率。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，根据Solomon方程推导得到WaterREXSY谱图的信号强度与tSL、kex之间的关系。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述关系的方程如下：
S(tSL)＝S(0)+A[1-exp(-kextSL)]exp(-tSL/T1ρ)；
其中，S(0)为t＝0时的信号强度，A为常数，T1ρ为参与交换的质子的自旋晶格弛豫时间，kex代表交换速率常数，tSL为锁场时间，S(tSL)代表不同tSL下的信号强度。
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