JP2000506489A - Ahpnを用いる癌の治療方法 - Google Patents

Ahpnを用いる癌の治療方法

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Abstract

(57)【要約】 G0/G1の停止およびアポトーシスを誘発するレチノイド、すなわち6−[3−1(1−アダマンチル)−4−ヒドロキシフェニル]−2−ナフタレン・カルボン酸(AHPN)を投与することにより、乳ガンまたは白血病を治療または予防する方法。

Description

【発明の詳細な説明】 6−[3−(1−アダマンチル)−4−ヒドロキシフェニル] を用いる癌の治療方法 発明の分野 本発明は乳癌又は白血病の治療又は予防に対し独特の性質を有するレチノイド の使用に関する。更に具体的には、乳癌又は白血病を治療又は予防するための6 −[3−(1−アダマンチル)−4−ヒドロキシフェニル]−2−ナフタレンカルボ ン酸(AHPN)の使用に関する。 発明の背景 レチノイドは、1個又は1組の特異的レセプターと結合し、活性化することに よって特異的な生物学的応答を誘発し得る物質として定義されている。レチノイ ドは正常な細胞増殖及び分化で基本的な役割を果たすことが知られている。(Rob erts,A.B.ら、「The Retinoids」中、M.B.Sporn、A.B.Roberts及びD.S.Goodm an編、2巻、209〜256頁、Academic Press、Orlando Fla、(1984);Sporn,M.B.ら 、J.Amer.Acad.Dermatol.、15:756〜764(1986))。複数のレチノイン酸核レ セプター(RARα、β及びγ)及びレチノイドXレセプター(RXRα、β及 びγ)が同定されている(Evans,R.M.、Science、240:889〜895(1988);O'Malley ,B.W.、Mol.Endocrin.、4:363〜364(1990年);Gudas,L.J.Cell Growth Diffe r、3:655〜662(1992年);Lohnesら、Cell Sci.、16(増刊):69〜76(1992))。そ の上、両者択一のスプライシングの結果、種々の核レセプターの異性体が多数存 在する(Gudas L.J.、J.Biol.Chem.、269:15399〜15402(1994))。 レチノイン酸レセプターは多様なメカニズムで遺伝子の転写を媒介する。これ らの核レセプターは、レチノイド標的遺伝子の調節領域に存在しているレチノイ ドレセプタ一応答エレメント(RARE又はRXRE)と呼ばれる特異的なDN A共通配列と結合することができる(Gudas L.J.、Cell Growth Differ.、3: 655〜662(1992年);Lohnesら、Cell Sci.、16(増刊):69〜76(1992年))。これら の応答エレメントに対する核レセプターの結合は、ホモ二量体結合とそれに続く 遺伝子活性化も見られたが、好ましくはRARとRXR間のヘテロ二量体形成に よって行われる(Hermannら、Mol.Endocrinol.、6:1153〜1162(1992年);Leidら 、Cell、68:377〜395(1992年));Zhang X、Nature、355:441〜446(1992年)) 。RXRは、RAR、ビタミンD、甲状腺ホルモン(Yuら、Cell、67:1251〜126 6(1991年);Hermammら、Mol.Endocrinol.、6:1153〜1162(1992年);Kliewerら、N ature、355:446〜449(1992年);Leidら、Cell、68:377〜39(1992年);Zhangら、Na ture、355:441〜446(1992年))及び多数のオーファンレセプター(Apfelら、Mol .Cell Biol.、14:7025〜7035(1994年);Songら、Proc.Natl.Acad.Sci.,US A 91:10809〜10813(1994年))とのヘテロ二量体の形成によって遺伝子の転写を 媒介することができる。これらのオーファンレセプターは反対に、RAR及び甲 状腺核レセプター(TR)の活性を阻害することができる(Kliewerら、Proc.N atl.Acad.Sci.,USA,89:1448〜1452(1992年);Tranら、Mol.Cell Biol.、1 2:4666〜4676(1992年);Apfelら、Mol.Cell Bio1.、14:7025〜7035(1994年);Cas anovaら、Mol.Cell Biol.、14:5756〜5765(1991年);Songら、Proc.Natl.Acad .Sci.,USA、91:10809〜10813(1994年))。 レチノイドレセプター応答エレメントは通常、直列反復配列(DRs)を含み 、その半分(half-sites)は多数の塩基対スペーサーによって分離されている。結 合の分離能力はスペーサーとして使用される塩基対の数並びに応答エレメント自 体の配列によって決定されるように思われる(Kimら、Mol.Endocrinol.、6:148 9〜1501(1992年)、Maderら、J.Biol.Chem.、268:591〜600(1993年))。 AP−1媒介のRAR及びRXRの遺伝子の転写の阻害は、RAR又はRXR とDNAとの結合を必要としないことも観察されている(Pfahl、Endocrin.Revi ews、14:651〜658(1993年)、及びそこで引用された参照文献);RARとRXRが それらのリガンドと複合体を形成したとき、これらはc−Jun/c−Fosと AP−1共通配列との結合、続いて遺伝子活性化を阻害することが示されている (Pfahl、Endocrine Reviews、14:651〜658(1993年)、及びそこで引用され た参照文献)。RAによる転写の負の調節は、明らかに、RARがプロモーター 領域への結合が必要としないが、エンハンサー活性を阻害することによって行う ことができる(Gudas、J.Biol.Chem.、269:15399〜15402(1994年))。更に、 RAR媒介、TR媒介の遺伝子転写の負の調節は、オーファンレセプター、coup 及びv-ErbAとRARE及びTREとの競合結合によって発生する(Tranら、Mol .Cell Biol.、12:4666〜4676(1992年)、Hermammら、Oncogene 8:55〜65(1993 年)。 ほとんどの細胞タイプは1個以上のRAR及びRXRレセプターを発現する。 RAR相同組換え試験によって、RARの機能的冗長性が種々のRAR中に存在 していることが示唆されている(Liら、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA、90:15 90〜1594(1993年)、Lohnesら、Cell、73:643〜658(1993年)、Lufkinら、Proc.N atl.Acad.Sci.,USA、90:7225〜7229(1993年))。しかしながら、他の試 験によって、種々のレセプターサブタイプは別個の機能を有しておりそして実際 、別の遺伝子の活性を調節し得ることが示唆されている(Nagpalら、Cell、70:1 007〜1019(1992年);Boylanら、Mol.Cell Biol.、15:843〜851(1995年))。証 拠によっても、各レセプターサブタイプが特有の役割を示唆している:(1)特 異的な転写活性化応答エレメントに対するレセプター選択性が証明され(Nagpal ら、Cell、70:1007〜1019(1992年));そして(2)特異的な細胞タイプはRAの 抗増殖及び分化効果に抵抗性となり、1個のレセプターサブタイプは失われるが 、他のRARサブタイプは存在している(Sheikhら、J.Cell Biochem、53:393 〜403(1993年);Moasserら、Oncogene、9:833〜840(1994年))。 RARはRA及びその異性体9−シス−RAの両方と結合するが、一方RXR は9−シス−RAとしか結合しない(Allenbyら、J.Biol.Chem.、269:16689〜1 6695(1995年)、及びそこで引用された参照文献)。各レセプターサブタイプの特 有の機能を更に証明するために、RAR及びRXRサブタイプと選択的に結合し 、選択的サブタイプによって転写活性を高めるコンホメーション的に制限された レチノイドが合成されている(Graupnerら、Biochem.Biophys.Res.Commun.、 179:1554〜1561(1991年);Lehmannら、Cancer Res.、61:4804〜4809 (1991年)、Lehmannら、Science、258:1944〜1946(1992年);Dawsonら、「Retinoi ds:New Treatments in Research and Clinical Applications」中、Livrea MA 及びPacker L.、(編)Marcel Dekker:NY、205〜221頁(1992年);Daviesら、Amer .Ass'n of Cancer Res.Conf.、Banff、Alberta、Canada、3月号15〜20(1993 年)抄録B-28;Jongら、J.Med.Chem.、36:2605〜2613(1993年);Reichertら、「M ol.Biol.to Therapeutics:Pharmacology of the Skin」、5巻から、Bernard B A及びShroot B(編)、Karger:B.2d 117〜127頁(1993年);Beardら、Bioorg.Me d.Chemical、4:1447〜1452(1994年);及びBoehmら、J.Med.Chem.、37:2936〜 2941(1994年))。 これらの合成レセプター選択性レチノイドによって、更に、種々の細胞タイプ でのRA応答の調節における特異的RARサブタイプの特有性が確認されている (Ruddら、Cancer Letter、73:41〜49(1993年);Sheikhら、J.Biol.Chem.、269: 21440〜21447(1994年))。最近、RARγを選択的に転写活性化する一連の合成 レチノイドが記載されている(Bernardら、Biochem.Biophys.Res.Comm.、186 (2):977〜983(1992年))。 レチノイドは細胞増殖及び分化に影響を与え得るため、これらの化合物は異常 な細胞増殖及び分化にかかわる疾病及び状態の治療又は予防に有用であることが 発表されている。例えば、種々の皮膚疾患及び腫瘍の治療に有効な治療法として のレチノイドの用途が報告されている(Roberts,A.B.及びSporn,M.B.、「The R etinoids」中、Spornら、209〜286頁、Academic Press、Orlando Fla;Bollagら 、Ann.Oncol.、3:513〜526(1992年);Smithら、J.Clin.Oncol.、10:839〜864 (1992年))。 今日まで、レチノイド治療の最良の結果は、典型的にはレチノイドの投与を他 の分化又は細胞阻害剤の投与と組み合わせる療法によって達成されている。レチ ノール及びレチノイン酸に加えて、9−シスレチノイン酸及びN−(9−ヒドロ キシフェニル)レチノイドだけでなく、イソトレトイン(13−シス−レチノイン 酸)及びエトレチネートも使用されている。 最も納得のゆく結果は、皮膚科の分野での応用によって証明されている。すな わち、レチノイドの全身投与中に時折観察される毒性効果を局部適用によって回 避できることである。例えば、レチノイドは、乾癬、嚢胞性ざ瘡、皮膚角化異常 を含む多様な皮膚疾患の治療に有用であることが報告されている。 皮膚疾患に並んで、レチノイドは、抗癌剤として重要な可能性を有している。 例えば、レチノイド化合物は皮膚癌の予防、例えば、急性骨髄球性白血病(AM L)、急性前骨髄球性白血病(APL)の治療;脊髄形成異常症候群、若年性慢 性骨髄性白血病、セザリー症候群、上部空気消化管の篇平上皮細胞癌、非小型肺 癌並びにヒト頭部及び類部癌のような他の悪性の造血性疾患の治療に可能性を有 することが発表されている(Pfahlら、Vitamins and Hormones、49:327〜382(1 993年)363〜366参照、治療におけるレチノイドの用途の総説)。 特異的な乳癌の場合、幾つかの乳癌細胞株の増殖がレチノイドによって阻害さ れることが報告されている(La Croixら、J.Clin.Invest.、65:586〜591(1980 年))。また、エトレチナートは、無胸腺症マウスの異種移植乳癌細胞の増殖を防 ぐことが報告されている(Halterら、Cancer Res.、48:3733〜3736(1988年))。 更に、N−(4−ヒドロキシフェニル)レチナミド(4−HPR)は、エストロゲ ンレセプター(ER)の状態やRAR発現とは関係ないと断言され、乳癌細胞株 のアポトーシス及び分化を誘発することが報告されている(Pellegriniら、Cell Growth Differ.、6(7):863〜869(1995年))。 また、最近の特許、即ちCurleyらに付与され、オハイオ州研究財団(Ohio Sta te Research Foundation)に譲渡された米国特許第5516792号は、乳癌を含む癌 を治療し、予防および研究するためにレチノイルβ−グルクロナイドN−グリコ シド類似体の使用を開示している。更に、N−(4−ヒドロキシフェニル)レチナ ミド(4−HPR)、即ちトランス−レチノイン酸誘導体は、乳癌の化学的予防剤 として現在臨床試験中である。 更に、RAR−βレセプターと組み合わせたレチノイン酸は、エストロゲンレ セプター陽性(ER+)ヒト乳癌細胞株のアポトーシスを促進することが報告さ れている(Liuら、Mol.Cell Biol.16(3):1138〜1149(1996年))。 更に、レチノイン酸をインターフェロン、詳細にはαインターフェロン又はγ インターフェロンと組み合わせて使用すると、ある乳癌細胞株の増殖が阻害され ることが報告されている(Widschwendterら、Anticancer Res.、16(1):369〜3 74(1996年);Widschwendterら、Cancer Res.、55(10):2135〜2139(1995年))。 また、9−シスレチノイン酸も乳癌細胞の増殖を阻害し、エストロゲンレセプ ターRNA及びタンパク質の下方制御(downregulate)をすることが報告されてい る(Rubinら、Cancer Res.、54(24):6549〜6556(1994年))。 更に尚、(4−HPR)を乳癌の化学的予防に可能性がある相乗性組合せとし て、抗エストロゲンタモキシフェンを組み合わせて使用することが報告されてい る(Costa,A.、Eur.J.Cancer、29A(4):589〜592(1993年))。 しかしながら、幾つかのレチノイドは抗癌剤として、そして具体的には乳癌及 び白血病の治療又は予防に可能性を有していることが報告されているが、このよ うな癌の治療又は予防に適する改善された治療的特性を有するレチノイドの同定 は非常に有益であろう。特に、エストロゲンレセプター陽性か又はエストロゲン レセプター陰性の乳癌に対して細胞毒性であるレチノイドの同定は非常に有益で あろう。 発明の目的及び簡単な説明 本発明の1つの目的は、G0/G1停止及びアポトーシスを誘導するレチノイド の投与を含む乳癌又は白血病を治療又は予防する新規方法を提供することである 。 本発明の更なる目的は、乳癌又は白血病の治療又は予防を必要としている対象 に、治療的又は予防的に有効量の6−[3−アダマンチル−4−ヒドロキシプロ ピル]−2−ナフタレンカルボン酸を投与することに関連する乳癌又は白血病を 治療又は予防的する新規方法を提供することである。 本発明の更に特定の目的は、乳癌の治療又は予防を必要としている対象に治療 的又は予防的に有効量の6−[3−アダマンチル−4−ヒドロキシプロピル]−2 −ナフタレンカルボン酸を投与することに関連する乳癌を治療又は予防する新規 方法を提供することである。 本発明のもう1つの目的は、乳癌又は白血病を治療又は予防するために採用さ れる治療的又は予防的に有効量の6−[3−アダマンチル−4−ヒドロキシフェ ニル]−2−ナフタレンカルボン酸を含有する新規組成物を提供することである 。 かくして、主題発明は本質的に、乳癌又は白血病を治療又は予防するためにG0 /G1停止及びアポトーシスを誘導する特定のレチノイド、即ち6−[3−アダ マンチル−4−ヒドロキシフェニル]−2−ナフタレンカルボン酸並びに、乳癌 又は白血病を治療又は予防するために採用される有効量の6−[3−アダマンチ ル−4−ヒドロキシフェニル]−2−ナフタレンカルボン酸を含有する製薬組成 物の使用に関するものである。 図面の詳細な説明 図1はAHPNによる乳癌細胞増殖の阻害を示す。試験した乳癌腫細胞株は、 1ウエル当たり3×104又は1×104個の細胞濃度で、5%FBSを補充した DMEM:F−12培地に播いた。次いで、細胞を一夜インキュベートし、この 時点でAHPNが1μMの最終濃度になるように添加した。この図面のデータは 、3つの異なる実験の平均値±SEMを表わす。 図2は、MCF−7及びMDA−MB−231の増殖に与えられたAHPN濃 度の変化による効果を示す。MCF−7細胞及びMDA−MB−231細胞は、 24ウエルプレートにおいて、1ウエル当たりそれぞれ3×104及び1×104 個の細胞濃度で、5%FBSを補充したDMEM:F−12に播いた。細胞を2 4時間インキュベートし、この時点で種々の濃度でAHPNを添加した。コント ロール細胞は賦形剤のみにて処理した。培地及びAHPNは2日毎に交換し、3 つのウエル中の細胞を6日間インキュベートした後にカウントした。データは3 つの独立した実験の平均値±SEMを表わす。 図3A及び3Bはそれぞれ、AHPNによるMCF−7及びMDA−MB−2 31細胞のG1停止を示す。5%FBSを補充したDMEM:F−12において 対数増殖中のMCF−7及びMDA−MB−231細胞にAHPNを1μMの最 終濃度になるように添加した。種々の時間に細胞を採集し、DNAをヨウ化プロ ピジウムで染色し、次に細胞周期の各時期の分布を測定した。 図4A及び4Bは、AHPN媒介及びRA媒介RARE及びRXREの転写活 性並びにMCF−7及びMDA−MB−231細胞における抗AP−1活性を比 較した。通常の培地に、10cmプレートの中で対数増殖中のMDA−MB−2 31及びMCF−7細胞(プレート当たり約3×106個の細胞)を、指示され たプラスミドで一時的に移入し、1μMRAか又は1μMAHPNで48時問処 理した。次いでCATアッセイを実施し遺伝子発現を測定した。更に、 14C活 性をレーザーデンシトメトリーで定量した。活性は、ジアセテート及びモノアセ テートの形態に転換した14C活性対総14C活性の比で表す。図4Aは代表的なC ATアッセイの結果を示し、図4Bは2つの異なる実験を定量したものである。 値は、1の任意値が与えられたそれぞれのコントロールに対して表す。エラーバ ーは標準誤差を表わす。 図5は、HL−60R増殖のAHPN媒介阻害を示す。HL−60細胞を5% FBSを補充したDMEM:F−12に、1ウエル当たり3×104個細胞の細 胞濃度で播いた。AHPN又はRAを1μMの最終濃度になるように添加し、培 地及び補充物は2日毎に交換した。細胞のカウントは血球計数器を使用した。こ れらの結果は3つの独立した実験の平均値±SEMを表わす。 図6は、MCF−7及びMDA−MB−231細胞でAHPNによって誘導さ れたDNAのフラグメントを示す。MCF−7及びMDA−MB−231細胞を 、5%FBSを補充したDMEM:F−12培地に播き、一夜インキュベートし た。AHPN又はRAを1μMの最終濃度になるように添加し、細胞を種々の時 間にてインキュベートした。DNAを抽出し、ゲル電気泳動で分画した。 図7A〜7Eは、MDA−MB−231細胞におけるAHPN媒介アポトーシ スに対する、与えた種々の濃度のAHPNの効果を示す。MDA−MB−231 細胞を、5%FBSを補充したDMEM:F−12培地に播き、一夜インキュベ ートし、賦形剤のみ(図7A)又は30nM(図7B)、100nM(図7C)若 しくは500nM(図7D)のAHPNに72時間暴露した(倍率は×100)。 培地と補充物は18時間毎に交換した。細胞の免疫ペルオキシダーゼ染色を行い 、アポトーシス指数を種々のAHPN投与量について定量した。これらの結果は 図7Eに含まれている。 図8A〜8EはMDA−MB−231細胞におけるAHPN媒介アポトーシス を示す。MDA−MB−231細胞を、5%FBSを補充したDMEM:F−1 2培地に播き、一夜インキュベートし、賦形剤のみ(図8A)又は1μMAH PNに24時間(図8B)、48時間(図8C)若しくは72時間(図8D)暴露 した。アポトーシスの細胞は免疫ペルオキシダーゼ染色を行った(倍率は×10 0)。次に、アポトーシスの細胞の百分率をAHPNへの暴露時間の長さとの関 係によって定量した。これらの結果は図8Eに含まれている。 図9A〜9Bは、MCF−7及びMDA−MB−231細胞におけるWAF1 /CIP1mRNA発現のAHPN誘導を示す。5%FBSを補充したDMEM :F−12(1:1)中にMCF−7及びMDA−MB−231細胞をインキュ ベートし、72時間の総インキュベートの種々の時間でAHPN(1μM)を添 加した。培養物は全て72時間のインキュベート終了時に採集した。AHPNと 共に種々の時間インキュベートした細胞に対して、AHPN非存在下で、72時 間インキュベートした0時間の培養物をコントロールとした。全RNAを抽出し 、ノーザンブロットを行った。図9Aは代表的なノーザンブロットの結果を示す 。図9Bは2つの独立した実験結果を定量したものである。値は、ここでも1の 任意値が与えられたそれぞれのコントロールに対して表す。エラーバーは標準誤 差を表わす。 図10は、MDA−MB−231及びMCF−7細胞におけるAHPNで高め られたWAF1/CIP1転写を示す。10cmプレートの5%FBSを補充した DMEM:F−12(1:1)中にで対数増殖中のMCF−7及びMDA−MB −231細胞(3×106個細胞/プレート)をWAF1/CIP1ルシフェラー ゼリポーター作成物に一時的に移入し、その後ルシフェラーゼ活性を測定した。 図11A及び11Bはbcl−2及びbax mRNAレベルのAHPN調節 を示す。5%FBSを補充したDMEM:F−12に播いたMCF−7細胞を1 μMAHPNの存在下及び非存在下で種々の時間で増殖させた。全RNAを抽出 し、ノーザンブロットを行った。図11Aは代表的なノーザンブロット結果を示 す。図11bは2つの独立した実験を定量したものである。値は、ここでも1の 任意値が与えられたそれぞれのコントロールに対して表す。エラーバーは標準誤 差を表わす。 図12A及び12Bは、RNAレベルに対するサイクリンA、B1、D1及び EのAHPN調節を示す。5%FBSを補充したDMEM:F−12中に播いた MCF−7細胞を1μMAHPNの存在下及び非存在下で種々の時間で増殖させ た。全RNAを抽出し、ノーザンブロット法を実施した。図12Aは代表的なノ ーザンブロット結果を示す。図12Bは2つの独立した実験を定量したものであ る。値は、ここでも1の任意値が与えられたそれぞれのコントロールに対して表 わされている。エラーバーは標準誤差を表わす。 発明の詳細な説明 本発明は、抗癌剤として、特に乳癌又は白血病の治療又は予防に良好に適合さ せられている新規特性を有することが見い出されている合成レチノイド6−[3 −アダマンチル−4−ヒドロキシフェニル]−2−ナフタレンカルボン酸(AH PN)の同定に基づく。詳細には、このレチノイドは乳癌及び白血病細胞株のG0 /G1停止及びアポトーシスを媒介することを発見した。かくして、6−[3− アダマンチル−4−ヒドロキシフェニル]−2−ナフタレンカルボン酸(AHP N)は癌細胞のプログラミングされた死を提供する。驚くことに、抗癌活性を有 するこれまでのレチノイドが、典型的に、癌細胞の増殖を阻害し、細胞分裂抑制 的である。 更にまた驚くべきことは、AHPNはRARγを選択的にトランス活性化し( Bernardら、Biochem.Biophys.Res.Commun.、186:977〜983(1992年))、こ の化合物は明らかに、レチノイン酸レセプター(RAR)及びレチノイドXレセ プター(RXR)の発現とは関係なく機能するメカニズムによってG0/G1停止 及びアポトーシスを媒介するという事実である。これは、AHPNがレチノイン 酸感受性(RA感受性)及びレチノイン酸耐性(RA耐性)の癌細胞株の両方で G0/G1停止及びアポトーシスを誘導するという発見によって証明される。 更に驚くべきことは、AHPNがエストロゲンレセプター陽性(ER+)及び エストロゲンレセプター陰性(ER−)細胞株の両方のG0/G1停止及びアポト ーシスを誘導するという事実である。対照的に、レチノイン酸やタモキシフェン のような他の化合物はER+乳癌に対してだけ活性であることが報告されている 。この事実は、AHPNをER+及びER−の両乳癌の治療又は予防に使用でき るので、治療的に重要である。 認められているように、AHPNの治療的活性はG0/G1停止及びアポトーシ スによって発生する。癌細胞のアポトーシスは多数の異なる経路で誘発すること ができる。(Isaacsら、Curr.Opin.Oncol.、6:82〜89(1994年)。更に、多数の 異なる細胞タンパク質がG1停止、プログラミングされた細胞死を促進するるか 又は阻害することが報告されている。例えば、細胞タンパク質bcl−2(Vaux ,R.L.、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA、90:786〜789(1993年))、bcl XL( Boiseら、Cell、79:597〜608(1993年)、Ich−Is(Wangら、Cell、78:739〜750( 1994年))は細胞生存を促進し、一方、WAFI/CIP1はG,停止を誘導し(Hu nterら、Cell、79:573〜582(1994年))、bcX(Oltvaiら、Cell、74:609〜619(1 993年))、Ichm(Wangら、Cell、78:731〜750(1994年))及びTGF/β(Poly akら、Genes Dev.、8:9〜22(1994年))は細胞死を高める。 以下の実施例中で更に詳細に考察されている遺伝子発現試験の結果に基づいて 、AHPNは、明らかにp53の下流エフェクターの活性化に関連するが、p5 3−独立態様で機能する特有の経路によってG0/G1停止及びアポトーシスを誘 導するように思われる。このことは、AHPNが幾つかの乳癌細胞株(MCF− 7及びMDA−MB−231)においてWAF1/CIP1 mRNAレベルを顕 著に高め、一方別の乳癌細胞株(MCF−7)ではbcl−2 mRNAレベル を顕著に低減させることが発見されているという事実によって支持される。また 、AHPNは乳癌細胞株(MCF−7)によるbax mRNAレベルも顕著に 高めることが発見された。対照的に、AHPNは明らかにTGF-B1mRNAレ ベる又はタンパク質レベルのどちらも調節しないことが発見された。 更に、培養した乳癌細胞株をAHPNに暴露すると幾つかのサイクリン、例え ば、サイクリンD1、サイクリンA及びサイクリンB1のmRNAレベルの顕著 な低減が生じることも発見された。しかしながら、同じ細胞株をAHPNに暴露 したとき、サイクリンE mRNAレベルに与える影響は観察されなかった。こ のことは、サイクリンが細胞周期進行の重要なメディエイタであることは良く知 られている(van der Hevvelら、Science、262:2050〜2054(1993年))ので、 AHPNのアポトーシス誘導活性を更に証明している。 AHPNがアポトーシスを誘導することも、培養物中でAHPNに暴露された 癌細胞株に形態学的変化の発生が発見されたことによって証明される。これらの 変化には顕著な核分裂及びクロマチンの凝集が含まれる。更に、AHPNがこれ らの形態学的変化を誘導したことは、AHPN濃度の上昇につれてこのような形 態学的変化が次第に増加することが観察されたという事実によって証明される。 癌細胞、特に乳癌細胞及び白血病細胞に与えるAHPNの影響は、この化合物 が乳癌又は白血病の治療を必要としている対象におけるこれらの治療又は予防に 使用できることを示している。 特に、AHPNは、乳癌若しくは白血病と診断されたヒトを治療するか又は進 行性乳癌若しくは白血病の危険性の高いヒトの癌を予防するために使用すること ができる。後者のグループには乳癌又は白血病の家族歴を有するヒト、又はマー カー、例えばタンパク質を発現する(これらの発現は乳癌又は白血病の発生率の 上昇と関係がある)ことが示されているヒトが含まれる。 本発明による乳癌又は白血病の治療又は予防は、このような治療又は予防を必 要としている対象に治療的又は予防的に有効量のAHPNを投与することによっ て行われる。AHPNの治療的又は予防的に有効な投与量は約0.001mg/kgから1 0mg/kg(体重)まで、更に好ましくは0.01から5mg/kg(体重)までの範囲で あり、最も好ましくは投与量が、レチノイン酸の投与に典型的な投与量、即ち典 型的には約2μg/kg/日から2mg/kg/日までの範囲の投与量である。 このような投与は1回又は複数回投与量で行うことができ、典型的には毎日投 与される。しかしながら、投与量管理は治療される対象の状態及び他のファクタ ー、例えばAHPNが他の任意の抗癌剤又は放射線治療法のような治療と共同し て投与されるのかどうかに依存して変動させることができる。治療は典型的には 長期間に亘って実施される。 乳癌又は白血病を治療又は予防するためにはAHPNは、任意の薬剤的に許容 される経路、例えば経口、眼内、非経口、局所又は吸入によって投与することが できる。 本発明による非経口投与には静脈内、筋肉内、皮下、直腸、外科的及び腹腔内 経路の投与並びに徐放性又は持続性組成物の投与が含まれる。これらのうちで、 静脈内、筋肉内及び皮下経路の投与が一般的に好ましい。 AHPNは1つ以上の許容される担体又は賦形剤及び添加剤を添加し、任意の 他の活性剤、例えば他の抗癌剤を添加して薬剤的に許容される製剤の形態で提供 される。担体(単数又は複数)又は賦形剤(単数又は複数)は製剤中の他の成分 と共存可能であり、薬剤的使用に安全であるという意味において許容されるであ る。(例えば、製薬的に許容される典型的な担体及び賦形剤並びに薬剤的に許容 される製剤の慣用の製造方法の一覧表については、E.W.Martin(Mack Publ.Co. 、Eastern PA)のRemington's Pharmaceutical Sciences参照。) 意図された投与様式に依存して、製薬組成物は固形、半固形又は液体の投与形 態、例えば、錠剤、坐剤、ピル、カプセル、粉末、液体、懸濁液、ローション、 クリーム、ゲル等の形態で、好ましくは正確な投与量の1回投与に適する単位の 投与量形態である。 本質的には、これらの組成物は、上記のように、製薬的に許容される担体と組 み合わせた治療的又は予防的に有効な量のAHPNを含有することができ、加え て、他の活性剤、例えば他の抗癌剤、薬剤、担体、アジュバント、希釈剤等も含 有することができる。 固形組成物に関しては、慣用の無毒性固形担体には、例えば、製薬用のマンニ トール、ラクトース、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム 、タルク、セルロース、グルコース、蔗糖、炭酸マグネシウム等が含まれる。薬 剤的に投与可能な液体組成物は、例えば、AHPN及び任意の製薬用アジュバン ト、例えば水、生理食塩水、水溶性のブドウ糖、グリセリン、エタノール等のよ うな賦形剤を溶液又は懸濁液の形態にすることができる。所望の場合、製薬組成 物は無毒の補助物質、例えば湿潤化又は乳化剤、pH緩衝化剤等、例えば酢酸ナ トリウム、モノラウリン酸ソルビタン、酢酸トリエタノールアミンナトリウム、 オレイン酸トリエタノールアミン等を補助的に含むことができる。投与形態のよ うな好適な調製方法は当該技術分野で周知である。(例えば、上記で引用したRe mington's Pharmaceutical Sciences参照。) 経口投与は、微細粉末又は顆粒は希釈剤、分散化剤及び/又は界面活性剤を含 むことができ、水若しくはシロップ、乾燥状態のカプセル若しくはサッシェ、又 は非水溶性若しくは懸濁化剤を含める懸濁液、結合剤及び潤滑剤を含める錠剤、 或いは水若しくはシロップの懸濁液を提供することができる。望ましいか又は必 要な場合、香料、保存料、懸濁化剤、増粘剤又は乳化剤を含むことができる。錠 剤及び顆粒は経口投与の形態が好ましく、これらをコーティングすることができ る。 非経口投与は、注射が好ましい。注射可能物質は慣用の形態で、即ち液体溶液 若しくは懸濁液、注射前に液体化できる溶液またはは懸濁液に適する固形物の形 態又はエマルジョンのいずれかとして調製することができる。非経口投与には、 一定の投与量値が維持されるような徐放性又は持続性の形態の使用も含まれる。 例えば、米国特許第3710795号(これは本明細書に引用して組み入れる)を参照 されたい。 既述のように、主題のAHPN製剤は他の活性剤を含むことができる。このよ うな活性剤には癌の予防又は治療、或いは更に詳細には乳癌又は白血病の治療又 は予防に適する任意の化合物を含む。 例えば、主題のAHPN含有製剤は、抗癌活性を有していることが報告されて いる他のレチノイド、例えば、レチノイン酸、N−(4−ヒドロキシフェニル)レ チナミド(4−HPR)、9−シス−レチノイン酸、レチノイル−グルクロナイド N−グリコシド類似体(米国特許第5516792号参照)又は他の抗癌剤、例えばメ トトレキセート、抗エストロゲン、例えばタモキシフェン及びトレミフェン、ド キソルビシン、ダウノルビシン、アドリアマイシン等を含むことができる。主題 のAHPN製剤中に導入することができる他の活性剤には、サイトカイン、例え ば、γ、β又はαインターフェロンのようなインターフェロン、α又はβ腫瘍壊 死因子、インタ−ロイキン、コロニー刺激因子が含まれる。主題のAHPN製剤 中にインターフェロンを導入することは、レチノイドのなかにはインターフェロ ン、詳細にはαインターフェロン又はγインターフェロンと一緒に使用するとき 相乗的な抗癌活性を示すものがあることがこれまでに報告されているので、可能 であり、有利である。 同様に、抗エストロゲン、例えばタモキシフェン又はトレミフェンを主題のA HPN含有製剤中に導入することは、タモキシフェンをレチノイドフェンレチニ ミド(4−HPR)と組み合わせたとき乳癌の相乗的な化学的予防効果を示すこ とが報告されている(Costa,A.、Eur.J.Cancer、29A(4):589〜592(1993年) )ので、可能であり、有利である。 以下の実施例は本発明の特定の実施態様及び使用を説明するものであるが、決 して本発明の範囲を限定することを意図するものではない。 実施例 下記の材料および方法が実施例で使用された。 レチノイド材料 全てのトランスRAはシグマ社(ミズリー州セントルイス)から入手し、4-[1 ,5,6,7,8-テトラヒドロ-5,5,8,8-テトラメチル-2-ナフタレニル)シクロプロピ ル]安息香酸(SR11246)はDawsonら(レチノイドにおいて:研究および臨床的応用 における新しい傾向、Livrea,M.A.およびPacker,L(編集)、Marcel Dekker: ニューヨーク、205-221頁(1992))により説明されたように調製された。6-[3-[1- アダマンチル]-4-ヒドロキシフェニル]-2-ナフタレン・カルボン酸(AHPN) は米国特許第4717720号に説明されている(実施例13参照)。 供給 Dulbecco's調製されたEagle's培地(DMEM)、Ham's F−12培地およびウ シ胎仔血清(FBS)はGibco-BRL社(Grand Island,NY)から入手した。Dulbeccoの 調製されたEagle's培地(フェノール・レッド フリー)はBiofluids社(Rockvil le,MD)から購入した。HEPES、タモキシフェンおよびcharcoal limpetスルファ ターゼはシグマ・ケミカル社(St.Louis,MO)から入手した。[14C]クロラム フェニコール(53 mCi mmol-1)および[32P]αd CTP(3000Ci mmol-1はアマー シャム社(Arlington Heights.IL)により供給された。 細胞株と培養 MCF−7、T47DおよびMDA−MB−231細胞株はMarc Lippman博士 (Lombardi Cancer Center,Washington D.C.)からのご厚意により贈呈された もので、MDA-MB-468細胞はAnne Hambarger博士(University of Maryland Cance r Center,Baltimore,MD)により提供されたものである。細胞は、既に報告さ れたように(Fontana,J.A.,Exp.Cell Res.,55:136-144(1987))、5%のFBS を補給したDulbecco's調製されたEagle's培地(DMEM):Ham's F-12培地 で維持した。 増殖試験 細胞はDMEM:F−12(1:1)ハの培地にFBSを補給したものの中で24 時間培養した。MCF−7細胞は1ウエル当たり3×104個の初回細胞濃度で培 養し、T47D、MDA−MB−231およびMDA-MB-468は細胞濃度が1ウエル 当たり1×104で培養した。RAまたはAHPNの処理は同じ培地で3日間、6 日間または9日間行った。培地およびレチノイドは2日毎に交換した。レチノイ ドはジメチルスルホキシド(DMSO)に溶かした。全ての培養物にけるDMS Oの最終濃度は0.1%であって;コントロールの細胞は同じ最終濃度でDMS Oでインキュベートした。 プラスミド作成物、一時的な移入およびCATアッセイ β2−RARE-tk-CATおよびCRBP II−tk CATおよびAPO-1-tk CATのリポーター・プラスミドは、ラジョラ癌センター(La Jolla,CA)のX-k Zhang博士のご厚意により提供され、CAT遺伝子を含んでいるチミジン・キナ ーゼ(tk)プロモーターの上流にそれぞれRAREおよびRXREを運んだ。 移入の有効なバリエーションは、プラスミドpRSV2(MacGregorらSomat.Cell Mol .Genet.,13:253-265(1987))を使って調節した。すなわち、ラウス肉腫ウイル スのLTR(長い末端反復配列)の支配下で大腸菌lac Z遺伝子を運び、β-ガラク トシダーゼ酵素を暗号化する。(AP-1)3-tk-CATリポーター作成物はRonald Evans博士(カリフォルニア州ラジョラ)から入手した。WWP-Lucはプロモータ ーのないルシフェラーゼ・リポーター遺伝子を2.4kb 5'-付近領域のWAF1/CIP1 遺伝子と融合させたものである(E1-Deiryら,Cell,75:817-825(1993))。 cDNAプローブ 全長のヒトのWAF1 cDNAプローブはKinzler博士およびVogelstein博士(John s Hopkins University Baltimore,MD)のご厚意により提供された。ヒトのサイ クリンD1およびEのDcDNAプローブ(Xiongら.,Cell,65:691-699(1991) およびXiongら.,Genomics,13:575-584(1992))はDavid Beach博士(Howard Hugh es,Cold Spring Harbor Laboratory,NY)から入手した。ヒトのサイクリンA およびB1のcDNAプローブ(Pinesら,Cell,58:833-846(1989);およびPines ら,Nature,346:760-763(1991))はTony Hunter博士(カリフォルニア州サンデ ィエゴのストーク研究所)から贈られたものである。プローブはFeinbergらの無 作為プライマー法に従ってラベルされたものである(Anal.Biochem.,132:6-13( 1983))。 一時的な移入、CATおよびルシフェラーゼアッセイ 一時的な移入が既述のとおり実施した(Sheikhら.,J.Cell.Biochem.,53:39 3-404(1993))。細胞は1プレート当たり3×106の密度で10cmのプレートに て培養した。培地は移入の2時間前に交換した。細胞は様々なプラスミドと共に 同時移入され、DNAの合計量はプラスミドpUCl9を加えることにより1プレー ト当たり20μgに訂正された。MDA−MB−231細胞およびMCF−7細 胞は、DNAを加えた後6時間後、それぞれ7分と2分間20%のグリセロール で衝撃を与えた。細胞を1×PBSで洗浄した後、新鮮な培地を加えた。細胞は 移入の48時間後に採取した。CATアッセイについて、細胞はトリプシン化さ れ、100μlの0.25Mトリス−HCl(pH8.0)で再懸濁した。凍結と解凍を3回繰り返 した後、細胞溶解物を集め、既述のCATアッセイを行った(Sheikhら.,J.Cel l.Biochem.,53:393-404(1993))。 ルシフェラーゼアッセイについて、細胞をPBSで洗浄し、細胞に300-400μl の溶解緩衝液(25mMのグリシルグリシン、pH7.8、1.5mMのMgS0.a、4mMのEGTA 、100mMのDTTおよび1%のトリトンX-100)を加え、細胞を採集した。細胞溶解物 は5分間マイクロ遠心器で遠心分離された。上清液に12mMのK2HP04と1.6mMのATP を加え、標準測光計で10秒間光単位を測定することによりルシフェラーゼ 分析した。相対的光単位はβーガラクトシダーゼ活性に関して訂正された。 ノーザンブロット 全RNAを抽出し、全RNAの20μgをアガロースゲルに加え、主として既に 説明したようにノーザンブロットを行った(Sheikhら.,Biophys.Res.Commun. ,183:1003-1010(1992))。 細胞周期の各時期分布の分析 既述のように細胞周期各時期の分布を分析するために、流動血球計算分析によ るDNA含有量が測定された(Sheikhら,Anticancer Res.,13:1387-1392(1993) )。AHPN(1μM)を加え、MCF−7またはMDA−MB−231の細胞を 対数的に増殖させた。様々な時間でトリプシン化させ、細胞を採集し、既述のヨ ウ化プロピオジウム蛍光を使ってDNA含有量を求めるために染色させた(Sheik hら,Anticancer Res.,13:1387-1392(1993))。フェニックス・フロー・システ ムズ(San Diego,CA)のコンピュータプログラムのマルチサイクルを使用し、 細胞周期各時期の分布を測定しヒストグラムを作成した。 アポトーシスアッセイ アポトーシスは末端のデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼによりジゴ キシゲニンを取り込み、DNAの3'OH末端をラベルすることにより検出された。 アポタッグ検出システムを用い、ジゴキシゲニン-ヌクレオチドを取り込んだこ とを実証するために抗ジゴキシゲニン抗体および免疫ペロキダーゼ染色した(Onc or,Gaithersburg,MD)。要するに、細胞を顕微鏡のスライドガラスに引き延ば し、PBSで洗浄し、最後に末端トランスフェラーゼおよびジゴキシゲニンdUTP を含有する反応混合物中で37℃で1時間インキュベートした。次に、試料を洗浄 し、次にセイヨウワサビのペルオキシダーゼに結合させた抗ジゴキシゲニン抗体 を加えた後、細胞を室温で30分間インキュベートした。PBSで洗浄した後、 四塩化ジアミノベンジジン(DAKO,Carpenteria,CA)を加え、細胞を10分間 インキュベートした。2つの独立の実験において、無作為で200の細胞を カウントし、ペルオキシダーゼ陽性の細胞の割合を測定した。 実施例1 AHPNの乳ガン増殖抑制 多数の研究者が、エストロゲンレセプター(ER)−陽性乳ガン細胞はRAの抗 増殖効果に対し感受性であるが、ER−陰性の細胞は抵抗性であることを実証し た(Romanら.,Cancer Res.,53:5940-5945(1993);Sheikhら,J.Cell.Biochem. ,53:393-404(1993);およびvan der Burgら.,Mol.Cell.Endo.,91:149-157(1 993))。従って、AHPNがRAと同じスペクトルの抗増殖活性を乳ガンに対し て示すかどうかを測定するために、ER−陽性とER−陰性の両方の乳ガン細胞の増 殖を抑制するAHPNの能力について研究した。図1の結果は、AHPNが、R Aに感受性でER−陽性のMCF−7およびT47Dの両方ばかりでなく、RAに 抵抗性でER−陰性のMDA−MB−231およびMDA−MB−468のヒト 乳ガン細胞株(HBC)の増殖をも有意に抑制したことを示している。さらに、AH PNはRAよりMCF−7細胞およびT47D細胞に対する抗増殖性活性が有意 的に大きいことを示した(データは示されていない)。増殖の50%の抑制(IC50 )に必要とされるAHPNの濃度はMCF−7細胞については300nMであり、MD A−MB−231細胞については150nMであった(図2参照)。比べてみると、 RAはMDA−MB−231細胞およびMDA-MB-468細胞の増殖を抑制しなかった し、MCF−7細胞およびT47D細胞に対して試験した場合に100nMのIC50 を示した(Sheikhら,J.Biol.Chem.,269:21440-21447(1994))。また、AHP NはG0/G1期においてMCF−7細胞およびMDA−MB−231細胞を抑え ることを発見した(図3Aと図3B)。これら両方の細胞株をAHPNに暴露したと ころ、G0/G1期における細胞を有意に増加させ、G2+MおよびS期における細胞 の割合を減少させた。RAはMDA−MD−231の細胞周期各時期の分布に何 の影響も与えなかった(データは示されていない)。 実施例2 AHPN結合および細胞内におけるレチノイドレセプターの活性化 AHPNはレチノイドレセプター結合および転写活性アッセイの両方において RARγ選択的であると報告された(Bernardら,Biochem.Biophys.Res.Commu n.,186:977-983(1992))。6-(5,6,7,8-テトラヒドロ-5,5,8,8-テトラメチル-2- アントラセニル)安息香酸をトリチウム化したところ、RARαのKd値はRAR γの値の32倍であり、RARβのKd値は84倍であった。 HeLa細胞における転写活性アッセイはレセプターの発現ベクターおよび(TRE) 3-tk-CATプラスミドを使用するが、50%最大活性化のために必要とされた AHPN濃度はRARαについてはRARγの19倍であり、RARβについて はRARγの3.9倍であった(Bernardら,Biochem.Biophys.Res.Commun., 186:977-983(1992))。 本発明者らは、もし乳ガンの増殖がAHPNの媒介で抑制されることがRAR γの活性化により誘起したとすれば、MDA−MB−231細胞において、RA Rγだけを有し、RAの抗増殖性効果に抵抗性であるAHPNを使用した場合に 、移入されたRARE媒介リポーター遺伝子の転写活性がRAで認められた場合 と同様またはそれ以上であること(Romanら,Cancer Res..53:5940-5945(1993)) ;Sheikhら,J.Cell.Biochem.,53:393-404(1993);van der Burgら,Mol.Cell .Endo.,91:149-157(1993))が期待されたはずである、という理論を立てた。従 って、MCF−7細胞およびMDA−MB−231細胞におるRARE経路を活 性化させるAHPNの能力をβ2ーRARE制御CATリポーター遺伝子を使って 比較した。このβ2ーRAREは主としてRAR/RXRヘテロ二量体により活性化さ れ、RXRホモ二量体により少々活性化され、RARβ2遺伝子のプロモーター領域 に位置する直列反復配列5(DR5)型応答配列を有する(Zhang,Nature,355:441-4 46(1992);Zhangら,Mol.Cell.Biol.,14:4311-4323(1994))。図4に示される ように、AHPNはMCF−7細胞およびMDA−MB−231細胞の両方にお いて細胞内発生のレチノイドレセプターを転写活性化する能力がRAより有意に 減少したことを示した。 以上の結果に基づいて、AHPNは、RAよりもはるかに強力にMCF−7と MDA−MB−231の増殖を抑制するが、両方の細胞の型において、RAより もβ2RARE応答配列の転写活性が著しく少ないことを示しているので、RA R経路によりその抗増殖性効果を媒介しないという結論に達した。HL−60R 細胞は機能的なRARを有しないので、その増殖はRAにより抑制されない(Rob ertsonら、Blood,80:1885-1889(1982))。AHPNの媒介による増殖抑制に対す るRAR経路の役割をさらにアッセイするために、HL−60Rの増殖に及ぼす AHPNの効果についても研究した。AHPNはHL−60R白血病細胞の増殖 を著しく抑制することが判明したが、RAは何の効果もなかった(図5)。これら の結果は、RAR経路はAHPN媒介の増殖抑制に関係しないことをさらに実証 している。 AHPNがRXRホモ二量体選択性経路により機能するのかどうかを調べるた めに、2つの自然に発生するRXRE、すなわちMCF−7とMDA−MB−2 31に移入されたAPO-AIとCRBPIIを転写活性化するAHPNの能力を比較した。 このAPO-AIは、RXR/RXRホモ二量体により活性化され、RAR/RXRヘテロ二量 体により少々活性化されるが、APO-AI遺伝子のプロモーター領域に位置するDR-2 型応答配列である(Zhangら、Nature,358:587-597(1992);およびZhangら、Mol. Cell.Biol.,14:4311-4323(1994))。CRBPII RXREはRXR/RXRホモ二量体により活 性化される、DR-1型レチノイド応答配列である。RXRホモ二量体生成物を誘発 するSR11246はRXRE経路の優れた活性剤であったが、RXREの最小限度の活性 化がAHPNの存在下で認められた(図4)。 実施例3 AHPNによるAP-1活性の調節 AP-1媒介遺伝子転写の活性化は細胞の増殖と密接に関連する(Pardee,Science ,246:603-606(1989))。RAはそのRARおよびRXR核レセプターによりAP-1共 通配列のc-Fos/c-Jun媒介活性化を弱めることができる(Schuleら,Proc.Natl. Acad.Sci.USA,88:6092-6096(1991);Busamら,J.Biol.Chem.,267:19971-19 977(1992);Jaffeyら,Cancer Res.,52:2384-2388(1992);およびSalbertら,Mol .Endocrinol.,7:1347-1356(1993))。従って、AP-1媒介CAT活性に対するA HPNの効果をMCF−7細胞およびMDA−MB−231細胞において調べた 。図4に示されるように、1μMのRAはMCF−7細胞にお けるAP-1媒介CAT活性を有意に抑制したが、AHPNは全く効果がなかった。 RAもAHPNもMDA−MB−231細胞におけるAP-1媒介CAT活性を調節 しなかった。 実施例4 AHPN媒介アポトーシス MDA−MB−231細胞およびMCF−7細胞の数の減少(図1)、AHP Nに暴露しRAに暴露しない場合に現れた細胞の変化はプログラムされた細胞の 死、すなわちアポトーシスをもたらすことを示唆した。この可能性をさらに調べ るために、MDA−MB−231細胞およびMCF−7細胞を1μMのRAまた は1μMのAHPNに暴露した後、細胞の組織、的な試験、DNA電気泳動分析 を実施した。AHPNに暴露した後で、MCF−7細胞はアポトーシスのプロセ スに関連する組織的変化を実証した(Isaacs,J.T.,Curr.Opinion in Oncol., 6:82-89(1994))。該細胞は無傷のまま残っている細胞核と細胞膜において核分裂 およびクロマチン凝縮が観察された(データは示されていない)。このような変 化はRAに暴露した後のMCF−7細胞には見られなかった。MDA−MB−2 31細胞およびMCF−7細胞を1μMのAHPNでインキュベーションした結 果、ヌクレオソーム間の切断およびゲル電気泳動においてDNAの梯子形(ladde ring)が認められ(図6)、アポトーシスを示している(Isaacs,J.T.,Curr.Op inion in Oncol.,6:82-891994))。MDA−MB−231細胞およびMCF−7 細胞をRAに暴露した後では、ヌクレオソーム間の切断およびDNA梯子形は見 られなかった(図6)。 AHPN媒介アポトーシスもアポタッグアッセイを用い、MDA−MB−23 1細胞において評価した。その場合に、アポトーシスに関連するDNAの破壊の 3'OH末端は、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを用いジゴキシゲ ニン結合dUTPでラベルされたジゴキシゲニンが免疫ペルオキシダーゼ染色によっ て検出した。図7に示されるように、AHPN濃度を増加させると、DNAの分 裂と核免疫ペルオキシダーゼ染色により示されるように、アポトーシス細胞の割 合がだんだん増加した。また、時問を変えて(72時間のうちの0,24,48 時間)1μMのAHPNに暴露したところ、アポトーシス細胞の割合が次第に増 加した(図8)。72時間にわたり1μMのRAに暴露したところ、MCF−7 細胞の8%はジゴキシゲニンUTPの取り込みを示したが、MDA−MB−231 細胞には全く着色は見られなかった(データは示されていない)。 実施例5 AHPNのWAF1/CIP1誘発 アポトーシスは様々な経路を経て細胞に誘発することができる(Isaacs,J.T. ,Curr.opinion in Oncol.,6:82-89(1994))。多数の細胞蛋白質がG1停止状態 またはプログラムされた細胞死を増大するかあるいは抑制するかのいずれかであ る。細胞蛋白質bcl−2(Vauz,proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:786-789(19 93)),bclXL(Boiseら,Cell,74:597-608(1993),Ich−Is(Wangら,Cell,78:739 -750(1994))は細胞の生存を促進するが、WAF1/CIP1はG1停止状態を誘発し(Hunt erら,Cell,79:573-582(1994)),およびbax(Oltvaiら,Cell.74:609-619(1 993)),IchL(Wangら,Cell,78:739-750(1994)およびTGFβ1(Polyakら,G enes Dev.,8:9-22(1994))は細胞死を増大した。従って、WA1/CIP1,bax,T GFβ1およびbcl−2 mRNAレベルを調節するAHPNの能力が評価さ れた。 図9に示されるように、1μmのAHPNはMDA−MB−231細胞およびMC F−7細胞の両方におけるWAF1/CIP1 mRNAレベルを著しく強くした。AHP NはMDA−MB−231細胞に添加した後1時間ほどで、およびMCF−7細 胞に添加した後6時間以内にWAF1/CIP1 mRNAレベルを上昇させた(図9)。 MDA−MB−231細胞およびMCF−7細胞においてAHPNで72時間培 養した後のWAF1/CIP1 mRNAレベルの増加はそれぞれ6倍と35倍であった。 既に実証されたように(Sheikhら,Oncogene,9:3407-3415(1994))、MDA−M B−231細胞は突然変異(非機能性)p53の存在によりMCF−7細胞より も有意に低いWAF1/CIP1 mRNAレベルを発現した。RAはいずれの細胞型にお いてもWAF1/CIP1 mRNAレベルを調節しなかった(データは示されていない) 。AHPNがWAF1/CIP1遺伝子転写を強化したことは図10に含まれる 結果から明らかである。MDA−MB−231細胞およびMCF−7細胞のルシ フェラーゼ活性が6倍と2倍にそれぞれ増加したことはWAF-lucリポーター作成 物がAHPNの存在下で細胞に移入された場合に観察された。 実施例6 AHPNによるbcl−2およびbax mRNA発現の調節 アポトーシスの陰性および陽性の調節剤が確認された。bcl−2発現は細胞 の生存を増大し、TGFβ1誘発細胞死を阻止するが、baxは細胞死を促進し 、p53媒介アポトーシスを増大する(Selvakumaranら,Oncogene,9:1791-1798 (1994))。従って、bcl−2およびbax mRNA発現に対するAHPNの効 果を調べた。これらの結果は、AHPNは6時間以内にMCF−7細胞において WAF1/CIP1 mRNAレベルを有意に高くしたが、bcl−2mRNAレベルを有 意に低減させることを示した(図11)。bcl−2 mRNA発現は、MDA− MB−231細胞においてAHPNの存在の有無に関係なく検出できなかった。 同様に、AHPN(1μM)はMCF−7細胞において6時間以内にbax mRN Aレベルを有意に上昇させたが、bax mRNA発現はMDA−MB−231 細胞において検出できなかった。また、AHPN(1μM)はMDA−MB−2 31細胞およびMCF−7細胞のいずれにおいてもTGFβ1 mRNAレベル または蛋白質レベルの調節を認められなかった(データは示されていない)。 実施例7 AHPNによるサイクリン発現の調節 サイクリンは細胞周期進行の重要な媒体である(van der Hevvelら,Science, 262:2050-2054(1994))。さらに、数多くの研究者が、サイクリンD1およびサイ クリンEは、G1による進行の速度を限定することを示唆した(Jiangら,Oncogen e,8:3447-3457(1993);Quelleら,Genes Dev.,7:1559-1571(1993);Baldinら,G enes Dev.,7:812-821(1994))。AHPNに暴露した結果G0/G1が停止状態にな り、MCF−7細胞におけるサイクリンE、D1、AおよびB1発現 に対するAHPN治療の効果を試験した。図12に示されるように、サイクリン D1 mRNAレベルはAHPNに暴露してから6時間以内に有意に減少した。 サイクリンAおよびサイクリンB1 mRNAの減少もAHPNの添加後6時間 以内に認められたが、サイクリンE mRNAレベルの調節は認められなかった (図12)。 結 論 以上の結果に基づいて、AHPNはRARγレセプターへの結合および転写活 性の増強を示すが、AHPNはまたRARおよびRXRとは独立したメカニズム により機能することも明白である。また、AHPNはER−陽性のMCF−7細 胞およびT47D細胞の両方の増殖ばかりでなく、ER−陰性のMDA−MB− 231細胞およびMDA−MB−468細胞の増殖を有意に抑制することを発見 し、RAはER−陽性の乳ガン細胞の増殖だけを抑制したことを発見した。さら に、MDA−MB−231細胞において、AHPNはAPO-1 RXREと同様にR ARβ2RAREに対してRARレセプターのRAよりも有意に低い転写活性を 示すことが判明したが、これはまたRAR-RXRヘテロ二量体により活性化さ れることが可能である。これらの結果は、唯一機能的なRARγレセプターを有 するMDA−MB−231細胞においてさえも、AHPNによるRARγレセプ ターの転写活性と乳ガン細胞増殖を抑制するAHPNの能力との間に相関関係は ないことを示している。また、その結果は、AHPNはRXRE経路を活性化し ないことを示している(AHPNの存在下でCRBPIIおよびAPO-1 RXRE-TK CATリポーター作成物でMCF−7細胞およびMDA−MB−231細胞の移 入を行った際にCAT活性が欠けていたことにより実証された通りである)。 さらに、AHPNはRARγ遺伝子の点変異によりその先端を切り欠き、RA に結合できなくなった不完全なRARγを有するRA耐性HL−60R細胞の増 殖を抑制することが判明した。(Robertsonら,Blood,80:1885-1889(1982))。H L−60R細胞はRARβまたはRARγレセプターを持たない(Nerviら,Proc .Natl.Acad.Sci.USA,86:5854-5858(1989))。従って、これらの結果は、A HPNによる増殖抑制がこれらの細胞におけるRAR経路により媒介され ないことを示している。 乳ガン細胞においてRAで認められた細胞増殖抑制効果とは対照的に(Fontana ,J.A.,Exp.Cell Res.,55:136-144(1987))、これらの結果はAHPNに暴露 するとアポトーシスが発生することを示している。AHPNがアポトーシスを誘 発することは証拠となる複数の細胞株により実証された。例えば、MCF−7細 胞およびMDA−MB−231細胞のAHPN処理によりクロマチン凝集とDN A分裂が発生したが、核および血漿の膜は無傷のままであった。これらの所見は アポトーシスのプロセスと一致しており、細胞浮腫および細胞の浸透性溶解に伴 う血漿膜透過性の増加が見られる細胞壊死とは対照的である(Isaacs,J.T.,Cur r.opinion in Oncol.,6:82-89(1994))。 また、AHPNは細胞周期のG0/G1期におけるMCF−7細胞およびMDA −MB−231細胞を停止状態にした。このG0/G1期における停止状態になる 前にWAF1/CIP1 mRNAの転写が著しく増加した。WAF1/CIP1は、サイクリンA-C DK2、サイクリンE-CDK2およびサイクリンD-CDKを含む多数のサイクリン/サイク リンー依存性蛋白質キナーゼ(CDK)複合体の機能を抑制し、G1期の細胞を停止状 態にする(HunterらCell,79:573-582 1994))。DNA損傷に反応したp53媒介 のG1期の停止状態はWAF1/CIP1濃度の上昇を必要とするようである(Hunterら,C ell,79:573-582(1994))。 WAF1/CIP1プロモーターはp53共通配列を有するので、DNA損傷の後のp 53濃度の転写後の上昇はWAF1/CIP1遺伝子転写を増大し、その後のG1停止状態 を引き起こす。MCF−7細胞は野生型(機能性)p53を有するが、MDA− MB−231細胞は変異体(非機能性)p53を有することは以前に明らかにさ れた(Sheikhら,Oncogene,9:3407-3415(1994))。Niewolikら(Oncogene,10:881 -890(1995))はまたMDA−MB−231細胞から誘導されたp53はp53共 通配列に結合しないことを報告した。従って、MDA−MB−231細胞および 多分MCF−7細胞においてWAF1/CIP1転写がAHPN媒介により増加すること は、p53とは無関係のメカニズムにより発生するに違いない。DNA損傷剤ば かりでなく、血清飢餓誘発増殖停止状態は、変異体p53を運んでいる細胞のp 53レベルを増加させなかったが、WAF1/CIP1 mRNAレベルを増加させ た(Sheikhら,Oncogene,9:3407-3415(1994))。AHPNで培養したところ、M CF−7細胞またはMDA−MB−231細胞のいずれにおいてもp53レベル を上昇させなかった(データは示されていない)。複数の研究者たちが、RA媒 介によるHL−60細胞の分化はp53とは独立のWAF1/CIP1レベルの上昇に関 連することを実証した(Jiangら,Oncogene,9:3397-34061994);Steinmanら,Onc ogene,9:3389-3396(1994))。(Michielら(Cancer Res.,54:3391-3395(1994))は WAF1/CIP1を誘発するために2つの別の経路、マイトジェン活性化のp53と無 関係のメカニズムおよびDNA損傷活性化のp53に依存するメカニズムが存在 するという仮説を立てた。WAF1/CIP1レベルを上昇させ、サイクリン/サイクリ ン依存性蛋白質キナーゼ活性を抑制することのほかに、AHPNはサイクリンD 1、BmRNAのレベルを有意に減少させたが、これも多分G1の停止状態に寄 与すると思われる。 bcl−2腫瘍性タンパク質はミトコンドリア内膜ばかりでなく、他の細胞区 画、すなわち小胞体や核膜にも認められるが(Oltvaiら,Cell,74:609-619(1993 ))、それが過剰発現結果、細胞の生存が延長されることになる(Hockenberryら, Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:6961-6965(1991))。bcl−2は数種の他の 蛋白質、bax,bcl XL,bcl XSおよびMcl-1を含む、に関するホモ二量化およ びヘテロ二量化の両方について報告されている(Satoら,Proc.Natl.Acad.sci .USA,91:9238-9242(1994))。bcl XSまたはbaxによるヘテロ二量体の形成ば かりでなく、baxによるホモ二量体の形成はbcl−2を不活性化する。Selv akumaranら(Oncogene,9:1791-1798(1994))およびMiyashitaら(Oncogene,9:179 9-1805(1994))は、p53の上昇によりbaxの上方制御およびbcl−2の下 方制御をもたらすことを報告した。これらの観察結果は、p53が著しくbcl −2 mRNAの発現を抑制するが、bax mRNAのレベルを高めることを示 唆している。興味深いことに、bcl−2も変異体p53により下方制御され(H aldarら,Cancer Res.,54:2095-2097(1994)、Zhanら,Oncogene,9:3743-3751( 1994))、baxの上昇とbcl−2の低下は、照射で誘発されたアポトーシスに おいて大きな役割を果たすと推測された。AHPN媒介によるbax mRNA レベルの上昇およびbcl−2mRNAの低下がMCF− 7細胞に発生したが、この細胞は野生型p53を有する。MDA−MB−231 細胞におけるbcl−2またはbax mRNAの発現は既に説明した実験にお いて検出されなかった。対照的に、Haldarら(Cancer res.,54:2095-2097(1994) はMDA−MB−231細胞において低レベルのbcl−2蛋白質を検出した。 この矛盾はMDA−MB−231の異なる様々な菌株に原因があるかもしれない 。その結果はまたMDA−MB−231細胞がAHPN媒介によるG0/G1の停 止状態およびプログラミングされた細胞死に対して高い感受性を示している。低 レベルのbcl−2はこのレチノイドに対するMDA−MB−231の感度を増 強できる可能性がある。 さらに、前述の結果は、AHPNはER−陽性およびER−陰性の両方の乳ガ ン細胞株の増殖を抑制することにより広い範囲の作用を示すことを明らかにして いる。さらに、他のレチノイド類とは対照的に、AHPNに暴露することにより 、乳ガンおよび白血病細胞のプログラミングされた死をもたらす。従って、これ らの結果に基づいて、AHPNは乳ガンまたは白血病の治療または予防に非常に 適している。 本発明は特定の実施態様および特徴に関して説明したが、様々な変更および修 正は発明の範囲を逸脱することなく行うことができることは明らかである。
【手続補正書】特許法第184条の8第1項 【提出日】1997年4月4日(1997.4.4) 【補正内容】 明細書 AHPNを用いる癌の治療方法 発明の分野 本発明は乳癌又は白血病の治療又は予防に対し独特の性質を有するレチノイド の使用に関する。更に具体的には、乳癌又は白血病を治療又は予防するための6 −[3−(1−アダマンチル)−4−ヒドロキシフェニル]−2−ナフタレンカルボ ン酸(AHPN)の使用に関する。 発明の背景 レチノイドは、1個又は1組の特異的レセプターと結合し、活性化することに よって特異的な生物学的応答を誘発し得る物質として定義されている。レチノイ ドは正常な細胞増殖及び分化で基本的な役割を果たすことが知られている。(Rob erts,A.B.ら、「The Retinoids」中、M.B.Sporn、A.B.Roberts及びD.S.Good man編、2巻、209〜256頁、Academic Press、Orlando Fla、(1984);Sporn,M.B. ら、J.Amer.Acad.Dermatol.、15:756〜764(1986))。複数のレチノイン酸核 レセプター(RARα、β及びγ)及びレチノイドXレセプター(RXRα、β 及びγ)が同定されている(Evans,R.M.、Science、240:889〜895(1988);0'Mall ey,B.W.、Mol.Endocrin.、4:363〜364(1990年);Gudas,L.J.Cell Growth Dif fer、3:655〜662(1992年);Lohnesら、Cell Sci.、16(増刊):69〜76(1992))。 その上、両者択一のスプライシングの結果、種々の核レセプターの異性体が多数 存在する(Gudas L.J.、J.Biol.Chem.、269:15399〜15402(1994))。 レチノイン酸レセプターは多様なメカニズムで遺伝子の転写を媒介する。これ らの核レセプターは、レチノイド標的遺伝子の調節領域に存在しているレチノイ ドレセプター応答エレメント(RARE又はRXRE)と呼ばれる特異的なDN A共通配列と結合することができる(Gudas L.J.、Cell Growth
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 FI テーマコート゛(参考) A61K 31/517 A61K 31/505 605 31/704 31/70 611 38/22 37/24

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 1.治療的又は予防的に有効量の6−[3−(1−アダマンチル)−4−ヒドロ キシフェニル]−2−ナフタレンカルボン酸(AHPN)を投与することを含む 、乳癌の治療又は予防を必要としている患者の乳癌を治療又は予防する方法。 2.AHPNが少なくとも1つの他の活性剤と組み合わせて投与される請求項 1に記載の方法。 3.上記活性剤がサイトカイン、抗エストロゲン、メトトレキセート、ドキソ ルビシン、ダウノルビシン及びアドリアマイシンを含む請求項2に記載の方法。 4.上記サイトカインがアルファインターフェロン、ベータインターフェロン 、ガンマインターフェロン、インターロイキン1、インターロイキン2、アルフ ァ腫瘍壊死因子、ベータ腫瘍壊死因子及びコロニー刺激因子を含む請求項3に記 載の方法。 5.上記抗エストロゲンがタモキシフェン、トレミフェン及びこれらの誘導体 を含む請求項3に記載の方法。 6.AHPNが非経口的又は経口的に投与される請求項1に記載の方法。 7.非経口的投与が皮下、筋肉内及び静脈内投与からなる群から選択される請 求項6に記載の方法。 8.AHPNの投与量が約0.001mg/kgから約10mg/kg(体重)までの範囲で ある請求項1に記載の方法。 9.AHPNの1日の投与量が約2μg/kgから約2mg/kg(体重)までの範 囲である請求項1に記載の方法。 10.乳癌がエストロゲンレセプター発現(ER+)癌細胞によって特徴付け られる癌である請求項1に記載の方法。 11.上記の治療が抗エストロゲン投与と組み合わせて実施される請求項10 に記載の方法。 12.抗エストロゲンがタモキシフェン、トレミフェン又はこれらの誘導体で ある請求項11に記載の方法。 13.乳癌がエストロゲンレセプターを発現しない(ER−)癌細胞によって 特徴付けられる癌である請求項1に記載の方法。 14.治療的又は予防的に有効量の6−[3−(1−アダマンチル)−4−ヒド ロキシフェニル]−2−ナフタレンカルボン酸(AHPN)を投与することを含 む、白血病の治療又は予防を必要としている患者の白血病を治療又は予防する方 法。 15.AHPNが少なくとも1つの他の活性剤と組み合わせて投与される請求 項14に記載の方法。 16.上記活性剤がサイトカイン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、アドリ アマイシン及びメトトレキセートを含む請求項15に記載の方法。 17.上記サイトカインがインターフェロン、インターロイキン、コロニー刺 激因子及び腫瘍壊死因子を含む請求項16に記載の方法。 18.白血病が機能的なレチノイン酸レセプター(RAR)を発現しない癌細 胞によって特徴付けられる白血病である請求項14に記載の方法。 19.AHPNの投与量が約0.001mg/kgから約10mg/kg(体重)までの範囲 である請求項14に記載の方法。 20.AHPNの1日の投与量が約2μg/kgから約2mg/kg(体重)までの 範囲である請求項14に記載の方法。 21.AHPNがαインターフェロン又はγインターフェロンと組み合わせて 投与される請求項14に記載の方法。 22.乳癌又は白血病を治療又は予防する薬剤を製造するための6−[3−(1− アダマンチル)−4−ヒドロキシフェニル]−2−ナフタレンカルボン酸(AHP N)の使用。
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