JP2000500016A

JP2000500016A - 植物ｖｄｅ遺伝子及びそれに関連する方法

Info

Publication number: JP2000500016A
Application number: JP9518401A
Authority: JP
Inventors: ヤマモト，ハリー，ワイ．; ブゴス，ロバート，シー．; ロックホルム，デビッド，シー．
Original assignee: カルジーン，インコーポレーテッド
Priority date: 1995-11-07
Filing date: 1996-11-07
Publication date: 2000-01-11
Also published as: WO1997017447A2; CA2236267A1; EP0862632A2; US6015939A; WO1997017447A3; MXPA98003564A

Abstract

(57)【要約】本発明においては、植物vde酵素をコードするＤＮＡ配列が提供される。該配列は異種ＤＮＡ配列と結合してプローブとして使用することができ、また宿主生物の遺伝子型を改変するためのＤＮＡ構築物に使用することができる。宿主細胞に存在する光保護酵素の量を変化させることにより宿主細胞表現型を改変するためのＤＮＡ構築物及び方法が提供される。プラスチド含有宿主細胞において、vde酵素のレベルを変化させることによりゼアキサンチンレベル及び光に対する感受性を改変することができる。

Description

【発明の詳細な説明】植物vde遺伝子及びそれに関連する方法発明の分野本発明は、植物ビオラキサンチンデエポキシダーゼ(vde)をコードする遺伝子、並びに該タンパク質及び核酸配列に関連する使用方法に関する。本発明は、植物中における植物vde遺伝子の増強された発現、あるいは抑制された発現を起こす方法により例示される。本発明には、該方法により製造された植物も包含される。序論背景植物カロテノイドはクロロプラスト及びクロモプラストの膜中に見られる。これらは植物の光保護メカニズムの道具である。また植物カロテノイドは重要な食餌的意義を有する。従って、植物カロテノイド及びカロテノイドの生合成に関与する酵素の研究は、農業経営学及び栄養学的観点から興味が持たれる。特に興味深いのは、植物におけるカロテノイド生合成経路の後期段階、キサントフィルサイクル、及び光合成の光制御におけるその重要性である。光合成は植物が成長及び発生のために光エネルギーを利用することを可能とするプロセスである。従って、適当な質及び量の光が利用できること(光合成的に活性な照射、すなわち「ＰＡＲ」)は、植物の成長及び発生に重要である。しかし皮肉なことに、植物の光を利用する能力は限られているので、光が植物に損傷を与える場合もある。光の強度がそのような能力を越えると、修復不可能な損傷が起こり得る。植物は、葉の向きを変えたり反射表面を形成する等の、過剰な光を制御するための種々のメカニズムを発達させてきた。そのようなメカニズムは、ある種の植物に限定された特別の表現型上の戦略であるかに見える。これまで調べられた植物の全てにおいて使用されていると考えられる一つのメカニズムは、光合成装置のアンテナ(光吸収構造)における過剰なエネルギーの熱としての放散である。過剰なエネルギーの殆どは、トランスチラコイドΔpＨ、並びにキサントフィルサイクルにおいてビオラキサンチンデエポキシダーゼ(vde)により触媒されるアンテラキサンチン及びゼアキサンチンの形成を含む複雑なフィードバック制御系により熱として放出される。この系はエネルギー依存性非放射エネルギー放散(ene rgy dependent non-radiative energy dissipation)あるいは非光化学的蛍光消光(non-photochemical fluorescence quenching)と呼ばれ、光化学系II(ＰＳII) の量子効率を減少させ、ＰＳIIの過剰な減少と光阻害損傷とを防止するのに役立つ。実際に、この系は過剰なエネルギーが光合成装置に損傷を与える前にそれを放出する手段を与える。この系は質的及び量的に広いダイナミックレンジを有し、これにより広範な環境条件において系が効果的に機能することが可能となっている。遺伝子工学的技術によりキサントフィルサイクルの形態を操作できれば、改良された植物品種を早急に導入することが可能になると考えられる。しかし、前記経路に関与する酵素の精製された画分を得ることは困難であり、本発明以前においては対応する遺伝子はクローニングされていなかった。発明の概要本発明においては、植物vde酵素をコードするＤＮＡ配列が提供される。該配列は異種ＤＮＡ配列と結合して、プローブとして使用することができ、またＤＮＡ構築物中に使用して宿主生物の遺伝子型を改変することができる。宿主細胞中に存在する光保護酵素の量を変化させることにより宿主細胞表現型を改変するためのＤＮＡ構築物及び方法が提供される。プラスチドを含む宿主細胞においては、ゼアキサンチンレベル及び光に対する感受性を、vde酵素のレベルを変化させることにより改変することができる。例えば、vdeの過剰発現は高い光、乾燥、及び温度ストレスに対する植物の耐性を増強することが期待される(ストレス条件は過剰な光の条件を悪化させる)。また、現状では強い光あるいは低い温度に耐えられない植物の、これらのストレスに対する耐性がより強くなると考えられる。光ストレスに対してよりよく適応した植物は、より生産性が高く及び／または病害に対する抵抗性がより高くなると期待される。また、vde活性の過少な発現あるいは阻害は、弱い光での光合成効率を増強すると期待される。これにより植物、作物、樹木及び観葉植物の成長範囲を変化させることができる。具体的な植物のvdeを記載する。特に、図１に示したｃＤＮＡ配列及び推定アミノ酸配列を有する55kbレタスvde、図２に示したｃＤＮＡ配列及び推定アミノ酸配列を有するタバコvde、並びに図３に示したｃＤＮＡ配列及び推定アミノ酸配列を有するシロイヌナズナ(Ａrabidopsis)vdeを記載する。図４は、図１〜３のタンパク質のアミノ酸レベルの比較を示す。このアミノ酸配列の比較においては、３つの配列についての通過ペプチド(transit peptide)を線で囲んだ。同一のアミノ酸はハイフンで示す。配列アラインメントを最適にするために挿入したギャップはピリオドで示す。高度に保存された13のシステイン残基をアスタリスクで示す。図５は、プレタンパク質及び成熟タンパク質vdeの同一性及び類似性の比較を示す。図５から明らかなように、種々のvdeがアミノ酸レベルにおいて互いに約7 5％の配列同一性を有する配列を持っている。従って以下においては、図１、図２あるいは図３に示したアミノ酸配列に少なくとも約75％の相同性を有するvde 配列も意図されるものである。図１、図２あるいは図３の配列と少なくとも約60％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約70％の配列同一性を有する植物vdeをコードする核酸配列も同様に本発明において意図される。例えば、タバコ及びレタスvde核酸配列を比較すると、通過ペプチドを除いて76％の同一性が見られる。Ｎ-末端における高度な配列の同一性が特に好ましい。示したvde配列の断片に高度の類似性を示すその他の関連植物光制御配列も意図される。本発明の別の態様においては、例示した本発明のレタス、タバコ及びシロイヌナズナのvde配列に関連した核酸配列について、種々のソースからそのような配列を得るための方法、及びその使用に関して詳細に記載する。さらに、成熟vde をコードするｃＤＮＡ配列を、通過ペプチド、ｍＲＮＡ、ゲノム植物vde、及び植物vde制御領域とともに示す。本発明のさらに別の態様においては、宿主細胞においてvdeを生産する方法を記載する。プラスチド含有細胞において、vdeの生産を増強すること、あるいはv deの生産を抑制することにより、キサントフィルサイクル、特にビオラキサンチンのゼアキサンチンに対する比を改変することが意図される。これは植物の飼料価値を高める用途がある。ゼアキサンチンレベルは、例えばアルファルファのような作物にとって重要であり、この植物の価値は、部分的にキサントフィル含量による。トランスジェニック植物の研究から得られた結果によれば、ＬＨＣIIにおけるキサントフィル媒介エネルギー放散は、強い光の強力な損傷効果に対してＰＳII を保護するようであることが示された。この保護は、チラコイドΔpＨ、並びにビオラキサンチンデエポキシダーゼ(vde)活性により形成されるゼアキサンチン及びアンテラキサンチンの存在の効果を合わせたものにより誘導される。図面の簡単な説明図1:コスレタス(romaine lettuce)vdeのｃＤＮＡ配列及び推定ポリペプチド配列。下線を付した配列は精製レタスvdeのペプチド配列決定から決められたものである。ポリペプチド配列はオープンリーディングフレームの最初のメチオニンから始まり、同じリーディングフレーム内の三つの終止コドンが先行している。図2:タバコ(Ｎicotiana tabacum cv.Ｘanthi)vdeのｃＤＮＡ配列及び推定ポリペプチド配列。図3:シロイヌナズナ(Ａrabidopsis thaliana var．columbia)vdeのｃＤＮＡ配列及び推定ポリペプチド配列。図４は図１〜３のタンパク質のアミノ酸配列の比較を示す。図５は図１〜３のタンパク質間の類似性の割合を示す。図６は三つの種のvdeのハイドロパシープロフィールの比較を示す。図７は発現vdeの効果の経時的比較を示す。図８は、対照及び18のvde-アンチセンスタバコ植物(ＴＡＳ-#)の葉の色素分析の結果を示す表である。図９はvdeについての対照植物抽出の結果を示す。図10はアンチセンスvde植物におけるvdeについての抽出の結果を示す。発明の詳細な説明本発明の植物ビオラキサンチンデエポキシダーゼ、即ち「vde」は、植物ソースから得られ、植物酵素反応条件下でビオラキサンチンからのゼアキサンチンの生産を触媒する能力を示す任意のアミノ酸の配列、例えばタンパク質、ポリペプチドあるいはペプチドを包含する。「酵素反応条件」とは、酵素が機能するのを可能とする、環境中において利用可能な任意の必要条件(即ち、温度、pＨ、阻害物質の不在等)を意味する。「植物」は任意のプラスチド含有生物を意味する。「高等植物」は任意の分化した多細胞プラスチド含有生物を意味する。特に重要なのは、被子植物（双子葉及び単子葉植物の両方）由来のvdeである。本発明においては、レタス(図1)、タバコ(図2)及びシロイヌナズナ(図3)vde遺伝子のｃＤＮＡ配列が提供される。通過ペプチド領域は図４に示す。これらの配列からゲノム配列が得ることができ、対応する転写及び翻訳制御領域が決定される。また、得られたレタス及び／またはタバコ配列を使用して、その他のソース由来のvde遺伝子を得ることができる。特に、レタス、タバコ、シロイヌナズナ及びホウレンソウタンパク質のＮ-末端領域が保存されていることが見出され、従って例えば「ＶＤＡＬＫＴＣＡＣＬＬＫ」のようなＮ-末端ペプチドは関連配列を獲得することにおいて特に有用である。前記方法において使用するための構築物は、構築物の意図される用途に応じていくつかの形態を包含し得る。即ち、構築物としては、例えばベクター、転写カセット、発現カセット及びプラスミドが挙げられる。転写及び翻訳開始領域(場合により「プロモーター」とも称する)は、好ましくは非翻訳5'配列の転写開始制御領域及び翻訳開始制御領域、ｍＲＮＡのリボソームへの結合及び翻訳開始に係わる「リボソーム」結合部位を含む。開始調節領域の全ての転写及び翻訳機能エレメントは同じ遺伝子から得たものであるか、得られるものであることが好ましい。ある態様においては、プロモーターは、エンハンサーのような配列の付加、あるいは非必須及び／または望ましくない配列の削除により修飾される。「得られる」は、対象のＤＮＡ配列の転写に関して所望の特異性を与える本来のプロモーターのＤＮＡ配列に十分類似したＤＮＡ配列を有するプロモーターを意図するものである。これは天然及び合成の配列、並びに合成及び天然の配列の組み合わせであり得る配列を包含する。対象のヌクレオチド配列の転写のための転写カセットは、転写の方向に、転写開始領域及び必要により翻訳開始領域、対象のＤＮＡ配列、並びに対象の宿主細胞中で機能する転写及び必要により翻訳終止領域を含む。カセットがＤＮＡ配列の転写及び翻訳を与える場合、それは発現カセットであるとみなされる。また一以上のイントロンが存在してもよい。また、通過ペプチドをコードする配列等のその他の配列が存在してもよい。レタスvdeをコードする核酸配列を得るための、vdeペプチド由来のアミノ酸配列の使用を本明細書中に記載する。例えば、vdeペプチド配列に対応する合成オリゴヌクレオチドを調製する。該オリゴヌクレオチドは、vde遺伝子の部分ＤＮＡ配列を得るためのポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)法においてプライマーとして使用する。次にそのようにして得られた部分配列をプローブとして使用して、レタス組織から作製した遺伝子ライブラリーからvdeクローンを得る。あるいは、特定のvdeペプチドから縮重の程度が低いオリゴヌクレオチドが調製できる場合は、前記のようなプローブを使用してvde遺伝子配列について遺伝子ライブラリーを直接スクリーニングすることができる。特に、ファージベクター中のｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングは、バックグラウンドハイブリダイゼーションのレベルが低いことからそのような方法において有用である。本発明の植物vdeの核酸配列は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡに由来するＤＮＡまたはＲＮＡ配列であってもよく、あるいは全体的または部分的に合成されたものであってもよい。前記遺伝子配列は、例えば、適当なソースからゲノムＤＮＡを単離し、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)を使用して対象の配列を増幅しクローニングすることによりクローン化することができる。あるいは、特に植物に好ましい配列を得るのが望ましい場合には、前記遺伝子配列を完全に、あるいは部分的に合成してもよい。即ち、所望の構造遺伝子(vdeタンパク質をコードする遺伝子の部分)の全体あるいは部分を、選択した宿主に好まれるコドンを用いて合成することができる。宿主に好まれるコドンは、例えば、所望の宿主種において発現されるタンパク質において最も頻繁に使用されるコドンから決定することができる。当業者には、抗体調製物、核酸プローブ(ＤＮＡ及びＲＮＡ)等を調製し、種々の植物ソースから「相同」または「関連」vdeをスクリーニングし回収するために使用することができることは容易に理解されるであろう。配列情報、核酸またはアミノ酸の比較により、あるいは公知のvdeと候補ソースとの間のハイブリダイゼーション反応により判定できる配列の同一性が存在する場合に、相同配列が発見される。例えばＧlu/Ａsp、Ｖal/Ｉle、Ｓer/Ｔhr、Ａrg/Ｌys及びＧln/Ａs n等のような保存的変化も配列相同性判定において考慮することができる。二つの完全な成熟タンパク質の間の少なくとも25％の配列同一性によりアミノ酸配列は相同であると考えられる(一般的には、Ｄoolittle，Ｒ.Ｆ.，ＯＦＵＲＦＳ a nd ＯＲＦＳ(Ｕniversity Ｓcience Ｂooks,ＣＡ,1986を参照)。このように本明細書で示した具体的な例示のレタス、タバコ及びシロイヌナズナ配列からその他の植物vdeを得ることができる。さらに、例示した植物vdeから、及びそのような例示配列を使用して得た植物vdeから、合成タンパク質モデリングに使用するための改変アミノ酸配列、出発物質等を含む、天然及び合成植物 vdeが得られることは明らかであろう。改変アミノ酸配列としては、突然変異を起こした配列、切断された配列、増加された配列等を挙げることができ、それらの配列は部分的あるいは完全に合成されたものであってもよい。植物調製物から実際に精製された配列、またはそれに同一な配列もしくは同一のタンパク質をコードする配列は、そのタンパク質または配列を得るのに使用した方法にかかわらず、いずれも天然に由来するものと考えられる。典型的には、核酸プローブを使用して得られる植物vde配列は、標的vde配列とプローブとして使用したコード配列との間で60〜70％の配列同一性を示す。但し、少なくとも50〜60％の配列同一性を示す長い配列が得られる場合もある。核酸プローブは前記核酸配列の長い断片であってもよく、あるいはより短いオリゴヌクレオチドプローブであってもよい。より長い核酸断片(約100bpを超える長さ) をプローブとして使用する場合は、プローブとして使用した配列から20〜50％の相違(即ち、50〜80％配列相同性)を有する標的サンプルから配列を得るために、より低いストリンジェンシーでスクリーニングすることができる。オリゴヌクレオチドプローブはvde酵素をコードする全核酸配列よりもかなり短くてもよいが、少なくとも約10、好ましくは少なくとも約15、さらに好ましくは少なくとも約20ヌクレオチドである。より短い領域を使用する場合は配列同一性の程度がより高いことが望ましく、より長い領域の場合とは異なる。従って、その他の関連vde遺伝子を検出し回収するためのオリゴヌクレオチドプローブを設計するためには、高度に保存されたアミノ酸配列の領域を同定することが望ましい場合がある。より短いプローブは、特に高度に保存された配列が同定できる場合に、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)に特に有用であることが多い(Ｇouldら、ＰＮＡＳＵＳＡ(1989)86:1934-1938参照)。関連する遺伝子が所与の配列とのハイブリダイゼーションにより単離できるかどうか判断するためには、その配列を検出できるように標識する。標識は典型的には放射能を使用して行われるが、その他の方法も利用できる。標識されたプローブをハイブリダイゼーション溶液に加え、ノーザンまたはサザンブロットのいずれかの、所望の核酸を含むフィルターと(相同性について所望のソースをスクリーニングするために)、あるいはスクリーニングされるｃＤＮＡまたはゲノムクローンを含むフィルターとインキュベートする。ハイブリダイゼーション及び洗浄条件は、対象の配列に対するプローブのハイブリダイゼーションを最適なものとするために変化させることができる。温度をより低くし、塩濃度をより高くすると、関連のより少ない配列のハイブリダイゼーションが可能となる(低ストリンジェンシー)。低ストリンジェンシー条件下でのバックグラウンドハイブリダイゼーションが問題となる場合は、ハイブリダイゼーションまたは洗浄段階での温度を高くし、及び／または塩濃度を低くして特定のハイブリダイゼーション配列の検出を改善することができる。ハイブリダイゼーション及び洗浄温度は、Ｂeltzら(Ｍethods in Ｅnzymology(1983)100:266-285)に記載されているように、推定されるプローブの融解温度に基づいて調整することができる。有用なプローブ及び適当なハイブリダイゼーション及び洗浄の条件は上記のようにして確認された。ｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーを、標識配列及び最適化された条件を使用してスクリーニングする。最初にライブラリーを固体寒天培地にプレート化し、ＤＮＡを適当な膜、通常はニトロセルロースまたはナイロンフィルター上に置く。そしてこのフィルターを上記のように標識プローブとハイブリダイズさせ、洗浄して関連配列を含むクローンを同定する。ゲノムライブラリーを使用する場合は、そのような植物ソースからのvde遺伝子のコード領域及び転写制御領域エレメントの両方を与える一以上の配列を同定することができる。免疫学的スクリーニングのためには、オリジナルの植物ソースから精製されたタンパク質または宿主細胞から発現されたタンパク質をウサギまたはマウスに注射することによりvdeタンパク質に対する抗体を調製することができ、そのような抗体の調製方法は当分野で周知である。モノクローナルまたはポリクローナル抗体のいずれも製造することができるが、遺伝子単離のためには通常はポリクローナル抗体がより有用である。ウェスタン分析を行って、所望の植物種の粗抽出物中に関連タンパク質が存在するかどうかを判断することができ、これは抗体の vdeに対する交差反応により判定できる。交差反応性が観察された場合、関連タンパク質をコードする遺伝子は、所望の植物種を表す発現ライブラリーをスクリーニングすることにより単離される。発現ライブラリーは、λgt11等の市販品として利用できる種々のベクター中にＭaniatisら(上掲)に記載されたようにして構築することができる。これまで調べた植物は全てキサントフィルサイクルを利用しており、従って任意の所与の植物種を別のvdeタンパク質のソースと考えることができる。植物vdeタンパク質に関連する核酸配列には多くの用途がある。例えば、プローブとして使用できる組換体構築物、または宿主細胞中でvdeタンパク質の発現を与え、手近な(ready)該酵素のソースを製造することができる組換体構築物を調製することができる。その他の有用な用途は、宿主細胞が植物宿主細胞である場合にin vitroまたはin vivoで見出すことができる。例えば、植物キサントフィルサイクルに利用できる各vdeの量を増加させることにより、ゼアキサンチンのパーセンテージを増加させることができる。いくつかの用途においては、同様な方法で、アンチセンスまたは共抑制(co-supression)のようなその他の抑制法により植物細胞中に内因的に発現されたvdeの量を減少させることが望ましい場合がある。例えば、弱い光の下における光合成効率を改善するためにはvdeの発現を抑制することが望ましい場合がある。従って、意図する用途により、構築物は完全vdeタンパク質またはその部分をコードする配列を含み得る。例えば、所与のvdeタンパク質のアンチセンス阻害が望まれる場合は、完全vde配列は必要ない。さらに、vde構築物をプローブとして使用することを意図する場合は、vdeコード配列の特定の部分、例えば高度に保存されたvde領域をコードすることが発見された配列のみを含む構築物を調製することが有利である場合がある。上記のように、本発明の植物vdeをコードする核酸配列は、ゲノム配列、ｃＤＮＡ配列、またはｍＲＮＡ配列を含み得る。「コードする」は、センスまたはアンチセンス方向のいずれかにおいて配列が特定のアミノ酸配列に対応することを意味する。「染色体外の」は、配列が、天然においては結合している植物ゲノムの外側にあることをいう。「組換体」は、配列が、突然変異誘発、制限酵素等の操作による遺伝子工学的修飾を含むことを意味する。ｃＤＮＡ配列は、例えば通過ペプチド配列、またはvdeタンパク質の所与のオルガネラまたは膜の位置への送達を促進するための標的化配列のようなプレプロセシング配列を含んでもよく、また含まなくてもよい。そのような任意の前駆体 vdeＤＮＡ配列は、植物細胞発現における使用に好ましい。ゲノムvde配列は、植物vdeの転写及び翻訳開始領域、イントロン、及び／または転写終止領域を含んでもよく、これらの配列はvde構造遺伝子とともに、またはそれなしに、種々のＤＮＡ構築物において使用できるものである。即ち、本発明の植物vdeに対応する核酸配列はまた、特定のオルガネラまたは膜の位置へのタンパク質の直接の送達を起こすのに有用なシグナル配列、有用な組織及びタイミングプロフィールを有する5'上流非コード調節領域(プロモーター)、転写及び翻訳調節領域として有用な3'下流非コード調節領域を与えるものであってもよく、前記遺伝子のその他の特徴についての洞察を与え得る。所望の植物vde核酸配列が得られたら、種々の方法によりそれを操作することができる。配列が非コード隣接(flanking)領域を含む場合、この隣接領域を制限消化、突然変異誘発等にかけることができる。即ち、天然に存在する配列に対してトランジション、トランスバージョン、削除、及び挿入を加えることができる。さらに配列の全部または一部を合成することができる。構造遺伝子においては、一以上のコドンを修飾して修飾アミノ酸配列を与えてもよく、好適に利用できる制限部位を与えたり、または構築もしくは発現に関連するその他の目的で一以上のコドンの突然変異を導入してもよい。合成アダプター、一以上の好適に利用できる制限部位を導入するためのリンカー等を使用して構造遺伝子をさらに修飾することもできる。本発明の植物vdeをコードする核酸配列またはアミノ酸配列は、その他の本来のものではない、即ち「異種の」配列と種々の方法により組み合わせることができる。「異種の」配列は、植物vdeとは天然には結合しているのが見られない任意の配列をいうものであり、例えば、天然には一体に結合しているのが見られない同じ植物からの核酸配列の組み合わせ等が挙げられる。本発明の植物vdeをコードするＤＮＡ配列は、vdeと通常結合している遺伝子配列の全体または一部とともに使用することができる。その成分部分においては、 vdeをコードするＤＮＡ配列を、転写の5'から3'への方向に、宿主細胞中での転写及び翻訳を促進することができる転写開始制御領域、植物vdeをコードするＤＮＡ配列、及び転写及び翻訳終結領域を有する構築物と組み合わせる。利用できる宿主細胞としては、原核生物及び真核生物細胞の両者が挙げられる。宿主細胞は、意図する用途により、単細胞でもよく、または分化したもしくは未分化の多細胞生物に見られるものでもよい。本発明の細胞は、野性型の細胞には外来の植物vdeをその中に有することにより区別することができ、例えばその中に植物vdeをコードする組換体核酸構築物を有することにより区別することができる。宿主により調節領域は変化し、ウイルス、プラスミドまたは染色体遺伝子等からの領域が含まれる。原核または真核微生物における発現のためには、特に単細胞の宿主、広範な種類の構成的もしくは調節可能なプロモーターを使用することができる。微生物中での発現により前記植物酵素の手近な(ready)ソースを提供することができる。これまでに記載された転写開始領域としては、大腸菌、Ｂ． subtilis、Ｓacchromyces cerevisiae等の細菌及び酵母からの領域があり、例えばβ-ガラクトシダーゼ、Ｔ7ポリメラーゼ、トリプトファンＥの遺伝子等が挙げられる。殆どの場合については、構築物は植物中で機能する調節領域を含む。植物vde またはその機能性断片をコードするオープンリーディングフレームを、その5'末端で、例えば天然にvde構造遺伝子の5'上流に見られる野性型配列のような転写開始調節領域に結合する。構造遺伝子機能の、構成的、または調節可能な、例えば誘導可能な、広範な種類の転写を与える多数の転写開始領域が利用できる。Ｃ aＭＶ 35Ｓプロモーター、二重35Ｓプロモーター、34Ｓ figwortプロモーター等の構成的プロモーターが有用であり得る。プラスチド含有細胞中で発現するプロモーターは特に重要である。そのようなプロモーターのいくつかはプラスチド含有組織中で優先的に発現され、例えばssuプロモーター等である。そのような構造遺伝子に対応する転写/翻訳開始領域は、それぞれの開始コドンのすぐ5'上流に見られる。植物宿主中におけるvdeタンパク質の発現が所望される態様においては、完全な植物vde遺伝子の全体または一部を使用することが望ましい。即ち、5'上流非コード領域(プロモーター)の全部または一部を、構造遺伝子配列及び 3'下流非コード領域とともに使用することができる。例えば、対象の宿主植物本来のプロモーター、または修飾プロモーター、即ち一つの遺伝子ソースから得た転写開始領域と異なる遺伝子ソースから得た翻訳開始領域を有し、対象の植物vd eをコードする配列を含むプロモーター、または二重35ＳＣaＭＶプロモーターのような増強(enhanced)プロモーターのような異なるプロモーターが所望される場合は、各配列は標準的な方法で一体に結合することができる。 vde転写物の発現を、不特定な期間暗順応させた市販のコスレタス(romaine le ttuce)の葉において追跡した。黄色の葉と急速に伸長する緑色の葉の両方で同じレベルの転写物が検出された。しかし、成熟した緑色の葉でより高い転写物のレベルが検出された。各サンプルにおいて二種のハイブリダイズする転写物が見られ、上位のより大きい転写物が、より大きいハイブリダイゼーションのレベルを有するやや小さい転写物(1.7kb)にプロセシングされ得る可能性を示している。レタスの成熟した緑色の葉における増加した転写物のレベルの理由として二つの理由の可能性が考えられ、即ち、完全に発生したクロロプラストのより高い密度を有する組織でより高い発現が起こるということか、または成熟した緑色の葉が、レタスの頭部の中心で部分的に蔭になっている未成熟な葉よりも高い強度の光を受けるので、発現が光の強度により調節されている可能性があるということである。従って、vdeプロモーターを使用することは、vde核酸配列の転写において、またはその他の対象の核酸配列の発現に特に有用であり得る。調節転写終結領域も本発明のＤＮＡ構築物中に与えられ得る。転写終結領域は、植物vdeをコードするＤＮＡ配列または異なる遺伝子ソースから得た好適に利用できる転写終結領域、例えば、自然において転写開始領域に結合している転写終結領域により与えられ得る。転写終結領域が異なる遺伝子ソースからのものである場合、それは少なくとも約0.5kb、好ましくは約1〜3kbの、配列3'から、終結領域が由来する構造遺伝子までを含む。その増強された、または抑制された発現のための対象ＤＮＡ配列としての植物 vdeを有する植物発現または転写構築物は、広範な種類の植物生物、特に光調節またはゼアキサンチンレベルが重要である植物生物とともに使用することができる。対象となる植物としては、限定するものではないが、観葉植物品種、アルファルファや樹木などの農作物や飼料作物が挙げられる。組換体構築物を宿主細胞に導入するための方法によっては、その他のＤＮＡ配列が必要となり得る。重要なことは、本発明は双子葉及び単子葉種の両方に同様に適用でき、新規な及び／または改良された形質転換及び調節技術に容易に適用できるということである。そのようなトランスジェニック植物を得る際の形質転換の方法は本発明にとって重要ではなく、植物形質転換の種々の方法が現在利用可能である。さらに、より新しい方法が作物を形質転換するのに利用可能となれば、以後それらも直接適用できる。例えば、自然においてはアグロバクテリウム感染に感受性を有する多くの植物種を、アグロバクテリウム媒介形質転換の三分割またはバイナリーベクター法によりうまく形質転換することができる。多くの場合において、Ｔ-ＤＮＡにより一方の側または両側にボーダー(border)を有する構築物、特に左及び右のボーダーを有するもの、格別には右のボーダーを有するものを用意することが望ましい。これは、構築物がＡ．tumefaciensまたはＡ．rhizogenesを形質転換の手段として使用する場合に特に有用であるが、Ｔ-ＤＮＡボーダーはその他の形質転換手段においても使用できる。さらに、マイクロインジェクション、ＤＮＡ粒子ボンバードメント、及びエレクトロポレーションの技術が開発されており、これらは種々の単子葉及び双子葉植物種の形質転換を可能とするものである。通常は、宿主中での発現のために必要な調節領域を有し、形質転換細胞の選択を与える構造遺伝子をＤＮＡ構築物とともに含ませる。そのような遺伝子は、細胞毒性物質、例えば抗生物質、重金属、毒素等に対する抵抗性、栄養要求性宿主に無機栄養特性を与える補完機能、ウイルス免疫性等を与えるものとし得る。発現構築物またはその要素を導入する異なる宿主種の数に応じて、一以上のマーカーを使用することができ、種々の宿主について種々の選択条件を使用することができる。アグロバクテリウムを植物細胞形質転換に使用する場合は、Ｔ-ＤＮＡまたはアグロバクテリウム宿主に存在するＴi-またはＲi-プラスミドとの相同組換えのためにアグロバクテリウム宿主中に導入することができるベクターを使用することができる。組換えのためのＴ-ＤＮＡを含むＴi-またはＲi-プラスミドは、武装(えい瘤形成を起こすことができる)または非武装(えい瘤形成を起こすことができない)のいずれでもよく、後者は形質転換されたアグロバクテリウム宿主中にvir遺伝子が存在する場合に許容される。武装プラスミドは正常植物細胞及びえい瘤の混合物を与えることができる。アグロバクテリウムを、宿主植物細胞を形質転換するためのビヒクルとして使用する場合は、場合により、Ｔ-ＤＮＡボーダー領域で境界を設けられた発現または転写構築物を、大腸菌及びアグロバクテリウムにおいて複製できる広範な宿主範囲のベクターに挿入する。広範な宿主範囲のベクターは文献に記載されている。通常に使用されているのはpＲＫ2またはその誘導体である。例えばＤittaら (Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.Ｕ.Ｓ.Ａ.(1980)77:7347-7351)及びＥＰＡ 0 120 515 を参照。これらは引用により本明細書の一部とする。または、植物細胞中で発現される配列を、一つはベクターを大腸菌中で安定化させ、他の一つはベクターをアグロバクテリウム中で安定化させる、別の複製配列を含むベクター中に挿入することができる。例えば、ＭcＢride及びＳummerfelt(Ｐlant Ｍol.Ｂiol.(1990 )14:269-276)を参照。この文献ではpＲiＨＲＩ(Ｊouaninら、ＭoL．Ｇen．Ｇene t.(1985)201:370-374)複製開始起点が使用され、アグロバクテリウム細胞中での植物発現ベクターの付加的な安定性が与えられている。発現構築物及びＴ-ＤＮＡとともに、形質転換されたアグロバクテリウム及び形質転換された植物細胞の選択を可能とする一以上のマーカーを含める。植物細胞で使用するための多くのマーカーが開発されており、例えばクロラムフェニコール、カナマイシン、アミノグリコシドＧ418、ハイグロマイシン等に対する耐性が挙げられる。使用する特定のマーカーは本発明の必須の事項ではなく、特定の宿主及び構築の方法により好ましい任意のマーカーである。アグロバクテリウムを使用した植物細胞の形質転換のためには、外植物を組み合わせて形質転換に十分な時間形質転換したアグロバクテリウムとインキュベートし、該細菌を死滅させ、植物細胞を適当な選択培地中で培養する。カルスが形成したら、公知の方法に従い適当な植物ホルモンを使用してシュート(shoot)形成を促進することができ、植物の再生のためにシュートを根付媒体に移すことができる。そして植物を成長させて結実させ、種子を使用して反復世代を樹立することができる。本発明を一般的に記載したが、以下の実施例を参照することによりさらに容易に理解できるであろう。実施例は説明のためだけの目的で記載するものであり、本発明を限定することを意図するものではない。実施例実施例１‐レタスvdeｃＤＮＡ vdeをコスレタス(Ｌaccuca sativa Ｌ.cv Ｒomaine)クロロプラストから精製し、トリプシン消化からのペプチドをＮ-末端とともに配列決定した(Ｒockholm ，Ｐlant Ｐhysiol.(1996)110:697-703)。二種のペプチド(Ｎ-末端及びトリプシン断片#15、図１に示す)を使用してオリゴヌクレオチド 5'-ＧＡＹＧＣＨＹＴＢＡＡＧＡＣＨＴＧＹＧＣ-3' (216-倍縮重)及び 5'ＴＴＧＶＡＲＲＴＴＤＧＧＲＡＴＲＡＴ-3' (144-倍縮重) を製造した。vdeの部分ｃＤＮＡを、25pmolの各プライマー及びレタスｃＤＮＡを含むポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)の35サイクルで50℃のアニーリング温度を使用して増幅した。ＰＣＲ産物を、平滑末端クローニングによりpＧＥＭ-7Ｚf( Ｐromega)中にサブクローン化し、配列決定した。ｃＤＮＡライブラリーは、Ｔimesaver cＤＮＡＳynthesis Ｋit(Ｐharmacia)を用いて種々の年齢のコスレタス葉のプールしたサンプルから単離したポリ(Ａ)＋ＲＮＡから構築し、λ-ＺＡＰII(Ｓtratagene)に連結した。合計で2.5ｘ10⁵の組換体プラークを、ランダムプライミングで標識したＰＣＲ産物によりスクリーニングし、陽性クローンをプラーク精製し、その後プラスミドをin vivoで切り出した。ｃＤＮＡをpＧＥＭ -5ＺfのＮot1部位にサブクローン化し、Ａpplied Ｂiosystems Ｍodel 373Ａ自動シークエンサーを使用してｃＤＮＡの両方の鎖を完全に配列決定した。Ｇenba nk受託番号はＵ31462である。前記vdeｃＤＮＡは、計算上のＭr 54,447を有する473アミノ酸タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを包含していた。推定(deduced)タンパク質は、前記酵素が位置するクロロプラスト内腔への輸送のための125アミノ酸の推定(putative)通過ペプチドを含む(Ｈager，Ｐlanta(1969)89:224-243)。これは二つのvde(図１のvde1:-234〜1526 bp及びvde2:-65〜1578 bp)ｃＤＮＡのin vitro転写/翻訳により確認され、これらはドデシル硫酸ナトリウム(ＳＤＳ)-ポリアクリルアミドゲル上で55Ｋd産物を生成した。成熟vdeタンパク質のＮ-末端（アミノ酪#126）を、コスレタスからの精製vdeのＮ-末端配列決定により決定した。即ち、成熟vdeは、計算上のＭr、39,929及び計算上のpＩ、4.57を有する348 アミノ酸タンパク質からなる。推定成熟vdeの一次構造は、いくつかの特徴的な性質を示した。該タンパク質は、全アミノ酸残基の57.2％が極性側鎖を有しており、全体として親水性であった。推定成熟vdeにおいて三つの興味深いドメインが同定され、即ちシステインに富むドメイン、リポカリン特性(signature)及び高い電荷を有するドメインである。最初のドメインにおいては、成熟vde中の合計13のシステインのうち11が存在し、これが公知のvdeの阻害剤であるジチオトレイトール(ＤＴＴ)がその効果を示す部位である可能性が非常に高いことを示唆していた。ＤＴＴによるvde 活性の部分的阻害はアンテラキサンチンの蓄積を生じることから、これらのシステインはおそらく一つより多いジスルフィド結合を形成しているものと思われた。また、推定成熟vdeはリポカリン特性を含み、これは小さい疎水性分子が結合する多くの種類の多数のタンパク質中に同定されるドメインである。例えば、ロブスターの甲殻からのリポカリン特性を含むタンパク質であるクラスタシアニンはカロテノイドアスタキサンチンに結合する。同様に、このドメインは基質ビオラキサンチンの結合において役割を有し得る。三番目のドメインにおいては、残基の約47％が荷電側鎖を有していた。このドメインの最も特徴的な性質は、グルタミン酸残基の高い濃度であった。このドメイン中の残基の27.6％( 成熟vde中の合計の69.2％)がグルタミン酸であり、一方2％のみがアスパラギン酸であった。図４はvdeの推定アミノ酸配列の詳細な分析を示す。上の部分は三種の植物種からのvdeの推定アミノ酸配列の比較を示す。通過ペプチドは線で囲んだ部分に位置する。同一の残基はハイフン(-)で示す。配列アラインメントを最大にするために導入したギャップはピリオド(.)で示す。アスタリスク(^*)は、三種の配列に保存されている13のシステイン残基を示す。図４の下のマップは同定された三つのドメインを示す。レタスvdeについてのアミノ酸架橋領域をドメインの下に示す。図６は三つの種からのvdeのヒドロパシープロフィールを示す。実施例２‐大腸菌中でのレタスvdeｃＤＮＡの発現レタスvdeｃＤＮＡの真正度(authenticity)を、大腸菌中での断片vde2の発現により確認した。vde2を、lacＺに対してセンス及びアンチセンスの両方の方向で、pＧＥＭ-5ＺfのＮot1部位にサブクローン化し、大腸菌ＤＨ5α中に形質転換した。全ての培養物をインキュベートし、10mＭＩＰＴＧにより誘導した(Ｂugo s，Ｐlant Ｍol．Ｂiol.(1991)17:1203-1215)。２時間の誘導の後、細胞を4000 ｘｇで10分間４℃で遠心分離した。細胞を３mlの50mＭトリス(pＨ 7.4)、１mＭＥＤＴＡに再懸濁し、氷浴中で冷却しながらマイクロプローブを備えた超音波細胞破砕機で10サイクル（30秒オン/30秒オフ）の間溶解した。得られた抽出物を1 0,000ｘｇで10分間４℃において遠心分離し、上清を回収してin vitroアッセイ及び502nm-540nmでの吸収変化によりvde活性を測定した(Ｙamamoto，Ｍethods Ｅnzymol.(1985)110:303-312)。ペレットを３mlの50mＭトリス(pＨ 7.4)、１mＭＥＤＴＡで洗浄し、遠心分離した。ペレットを３mlのバッファーに再懸濁し、アッセイした。全てのアッセイにおいて100μl大腸菌抽出物またはペレット再懸濁物を含ませた。キサントフィル色素の定量のために、複数の時点において固体トリスの添加により反応を停止し、ジエチルエーテルでキサントフィルを３回抽出した。エーテルをＮ₂流下で乾燥させ、キサントフィルを100μlの9 0％アセトン中に可溶化し、その後ＨＰＬＣ分析を行った(Ｇilmore，Ｊ．Ｃhrom atogr.(1991)543:137-145)。 lacＺと向きを合わせた（センス）断片を発現する大腸菌からの抽出物は強いv de活性を有していたが、アンチセンス方向のvde2またはpＧＥＭ-5Ｚfのみで形質転換した大腸菌の抽出物からは検出可能な活性は観察されなかった。さらに、デエポキシダーゼ活性の強力な阻害剤であるＤＴＴの添加により全てのvde活性が消失した。ＤＴＴ(3mＭ、最終濃度)を、アスコルビン酸塩(30mＭ、最終濃度)添加の50秒後にアッセイに直接添加した。酵素の比活性は、64.9±5.4nmol脱エポキシ化ビオラキサンチン/分/mgタンパク質であった。vde2センスの膜フラクションにおいてかすかな活性が検出され、酵素のいくらかが細胞溶解の後に洗浄されていなかったか、溶解が完全でなかったことを示唆していた。vde1断片を発現させる試みは成功しなかった。pＧＥＭ-5zfにサブクローン化しlacＺと方向を合わせたvde1で形質転換した大腸菌は増殖しなかった。脱エポキシ化の生成物を確認するため、vde2センス抽出物での反応を複数の時点で終止させ、キサントフィルをＨＰＬＣで分析した。アンテラキサンチン及びゼアキサンチンは連続的な脱エポキシ化と一致しており、ビオラキサンチンの急速な減少に合致しているようであり、強い光に露出されたライマメ(Ｐhaseolus leunatus)の葉における脱エポキシ化について30年前に報告された観察(Ｙamamot o，Ａrch．Ｂiochem．Ｂiophys.(1962)97:168-173)と同様なものであった。該酵素の比活性は19.4±0.9nmol脱エポキシ化ビオラキサンチン/分/mgタンパク質であった。これは、同じ酵素が二段階のモノ脱エポキシ化反応を触媒することの最初の明確な証拠である。実施例３‐その他の植物におけるvde 種々のＣ₃植物のクロロプラストからのvde及び大腸菌で発現されたvdeのウェスタン分析によりＮ-末端が保存されていることが示された。そのままの(intact)クロロプラストを単離し(Ｎeubauer，Ｐlant Physiol.(19 92)99:1354-1361)、液体Ｎ₂を使用した５回の凍結/解凍サイクルにより溶解した (Ｈager，Ｐlanta(1975)88:27-44)。大腸菌ＤＨ5-α中でのvde2の発現は実施例２に記載した通りであり、細胞は凍結/解凍法により溶解した。タンパク質を12 ％ＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル上で分離し、電気泳動によりＰＶＤＦに移した。アルカリホスファターゼ抱合第二抗体とのインキュベートの後、発色(color development)を行った。調整済みの試薬(Ｂiorad)を使用し、ウシγグロブリンを標準として使用してタンパク質を測定した。レタスvde(ＶＤＡＬＫＴＣＡＣＬＬＫ)のＮ-末端からの合成ペプチドに対して調製したポリクローナル抗体をプローブとしてブロットを分析した。vdeは約43k Ｄのサイズで移動した。市販のコスレタス、タバコ(Ｎicotiana tabacum Ｌ，cv Ｘanthi)及び市販のホウレンソウ(Ｓpinacia oleracea Ｌ.)からの成熟vdeはいずれもほぼ同じ43ＫのＭrで移動した。前記抗体はこれらの三種の植物種中のvdeを認識し、Ｎ-末端が保存されていることが示された。大腸菌で発現されたvde2はコスレタスvdeと同じＭrで移動したが、pＧＥＭ-5Ｚfのみを含む大腸菌からの抽出物はいくつかの少量の交差反応タンパク質を生成し、これらはいずれも43ＫのＭrを有していなかった。上記のvdeタンパク質のＭrは、推定成熟vdeの計算上のＭr(39.9Ｋ)に一致した。大腸菌で発現されたvdeから二つの興味深い観察が明らかである。第一に、大腸菌発現vdeはより小さい分子量の多くの免疫反応性バンドを生成した。この理由としては、大腸菌によりタンパク質のＣ-末端にかなりのプロセシングが起こったこと（前記抗体がＮ-末端を認識することによる）、または翻訳が停止したことによる可能性がある。二番目は、細菌で発現されたvdeタンパク質がコスレタスからの成熟vdeと同じ分子量で移動し、通過ペプチドを有する推定v deプレタンパク質の予想されたサイズ(54.4Ｋ)と同じでなかったということである。これは、大腸菌がクロロプラスト通過ペプチドを認識し、それを切断し得ることを示唆している。この細菌発現vdeのＮ-末端を配列決定して切断が起こる実際の部位を決定する必要があるであろう。大腸菌で発現された場合のナズナ(Ａrabidopsis)からの核コードクロロプラスト酵素アセトラクテートシンターゼについても同様な観察が報告されている。図７は、吸収変化の動力学を示すものであり、大腸菌ＤＨ5中の活性ビオラキサンチンデエポキシダーゼの発現を示している（図７上）。lacＺに対してセンス及びアンチセンスの両方の方向のvde2構築物からの発現を、ベクターのみ(pＧＥＭ-5Ｚf)を含む大腸菌とともにアッセイした。アスコルビン酸塩(30mＭ、最終濃度)添加の70秒後にＤＴＴ(3mＭ、最終濃度)をアッセイに直接加えた。酵素の比活性は64.9±5.4nmol脱エポキシ化ビオラキサンチン・分-1・mgタンパク質-1 であった。図７下は、大腸菌で発現されたvde2(センス構築物)のキサントフィル変換の経時変化である。酵素の比活性は19.4±0.9nmol脱エポキシ化ビオラキサンチン・分-1・mgタンパク質-1であった。実施例４‐植物におけるvdeの発現の効果図８においては、212の対照タバコ植物(Ｃt-#)の葉の色素分析を示し、また脱エポキシ化されたビオラキサンチンの平均パーセンテージを示す。18のvde-アンチセンスタバコ植物(ＴＡＳ-#)の葉の色素分析についても図８に示す。タバコ植物は、Ａgrobacterium tumefaciens ＬＢＡ4404を使用して、ＣaＭＶ 35Ｓプロモーター(pＢ1121)の制御下にタバコvdeｃＤＮＡのアンチセンス構築物により形質転換した。合計40のアンチセンス植物を分析し、18が脱エポキシ化の阻害の種々のレベルを示した。タバコ(Ｎicotiana tabacum Ｌ.cv.Ｘanthi)の葉の相対色素濃度を、数時間暗順応させたタバコの葉から切り取った葉ディスクにより測定した。一つの葉ディスク（暗順応させたもの）をアセトンで抽出し、ＨＰＬＣで分析し、もう一つのものについては葉ディスクを20℃に冷却したウォータージャケット(water-jacke ted)ビーカー中の水に浮遊させ、このディスクを1800 umol・m-2・s-1白色光に2 0分露光することにより光誘導した。光による処理の後、葉ディスクを抽出し、ＨＰＬＣで分析した。二種のvde-アンチセンスタバコ植物(ＴＡＳ-32及びＴＡＳ-39)を回収したが、これらは明るい白色光での照射の後、ゼアキサンチンのレベルは検出不可能なものであった。低レベルのアンテラキサンチン(〜2-3％)がいくつかの暗順応させた葉に見られ、不完全なエポキシダーゼ活性を示すものと推定される。図９及び10には、いずれも24時間暗順応させた対照植物(Ｃt-30)及びvde-アンチセンス植物(ＴＡＳ-5)からのタバコ葉についての測定の比較の結果を示す。弱い光条件下では、各葉から三つの葉ディスクを切り出した。一つの葉ディスク（暗順応させたもの）を抽出し、ＨＰＬＣで分析した。残りの二つの葉ディスクを、500umol・m-2・s-1赤色光で15分間前照射した。その後これらのディスクの一つを抽出してＨＰＬＣで分析し、他方は蛍光分析及びＨＰＬＣ分析の前に10分暗所に置いた。また、35Ｓ構築物からレタスvdeが過剰発現されたタバコ植物においては、開花が送れ、花はいくらか大きいことが観察された。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＣＡ，ＪＰ，ＭＸ (72)発明者ロックホルム，デビッド，シー. アメリカ合衆国 96822 ハワイ州，ホノルル，アナプニストリート 1704

Claims

【特許請求の範囲】１．植物ビオラキサンチンデエポキシダーゼをコードする、単離されたＤＮＡ配列。２．ビオラキサンチンデエポキシダーゼＤＮＡ配列が異種核酸配列に結合している請求項１記載のＤＮＡ配列。３．植物細胞中でＲＮＡの転写を起こすことができる組換えＤＮＡ構築物であって、転写の順に、植物転写開始領域、請求項１記載のビオラキサンチンデエポキシダーゼコード配列、及び転写終結領域を含む前記構築物。４．図１、図２及び図３に示す核酸配列からなる群から選択される配列に対して、ＤＮＡレベルで少なくとも約70％の相同性を有する請求項１記載のＤＮＡ配列。５．前記配列が、図１、図２及び図３の核酸配列からなる群から選択される請求項４記載のＤＮＡ配列。６．前記配列が、図１、図２及び図３の植物ビオラキサンチンデエポキシダーゼタンパク質からなる群から選択されるタンパク質の少なくとも約20のＮ-末端アミノ酸をコードする請求項１記載のＤＮＡ配列。７．前記配列が、図１、図２及び図３のタンパク質からなる群から選択される植物ビオラキサンチンデエポキシダーゼタンパク質をコードする請求項６記載のＤＮＡ配列。８．前記配列が、アミノ酸ＶＤＡＬＫＴＣＡＣＬＬＫをコードする請求項１記載のＤＮＡ配列。９．請求項３記載の構築物により形質転換された植物を成長させることを含む、植物中の植物ビオラキサンチンデエポキシダーゼレベルを改変する方法。 10．コード配列がセンス方向にある請求項９記載の方法。 11．構築物がさらにプラスチド転位配列を含む請求項10記載の方法。 12．コード配列が前記構築物中の制御エレメントに対してアンチセンス方向にある請求項９記載の方法。 13 請求項３記載の構築物により形質転換された植物を成長させることを含む、トランスジェニック植物の光に対する感受性を改変する方法。 14．ビオラキサンチンデエポキシダーゼ活性を増加させることにより、ゼアキサンチン及びアンテラキサンチン産生を増加させる請求項11記載の方法。 15．ビオラキサンチンデエポキシダーゼ活性を減少させることにより、植物中のゼアキサンチン及びアンテラキサンチンレベルを減少させる請求項12記載の方法。 16．ゼアキサンチン及びアンテラキサンチンレベルを増加させることにより、植物を、同じ型の非形質転換対照植物とは異なり、増加した光レベルに耐性を有するようにする請求項14記載の方法。 17．ゼアキサンチン及びアンテラキサンチンレベルを減少させることにより、植物を、同じ型の非形質転換対照植物が耐えられる光レベルに耐えられなくする請求項15記載の方法。 18．トランスジェニック植物の細胞中のゼアキサンチン及びアンテラキサンチンレベルを変化させるように機能する導入された構築物の活性により、改変された光に対する感受性を有するトランスジェニック植物。 19．請求項３記載の構築物を含む植物、植物細胞またはその他の植物部分。 20．請求項９記載の方法により作製された植物、植物細胞またはその他の植物部分。 21．請求項11記載の方法により作製された植物、植物細胞またはその他の植物部分であって、その植物の開花が、請求項11記載の方法により作製されたものではない対照植物の開花と比較して遅れている前記植物、植物細胞またはその他の植物部分。 22．請求項11記載の方法により作製された植物、植物細胞またはその他の植物部分であって、その植物の花が、請求項11記載の方法により作製されたものではない対照植物の花と比較してより大きい前記植物、植物細胞またはその他の植物部分。