JP2000350589A - Ｃ型肝炎ウイルス（ｈｃｖ）ｒｎａの効率的逆転写のためのオリゴヌクレオチドプライマーおよびそれの使用方法 - Google Patents
Ｃ型肝炎ウイルス（ｈｃｖ）ｒｎａの効率的逆転写のためのオリゴヌクレオチドプライマーおよびそれの使用方法Info
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ＲＮＡの効率的逆
転写のためのオリゴヌクレオチドプライマーの提供及び
生物学的試料中のＨＣＶＲＮＡの存在の検出方法の提
供。 【解決手段】血液、血清、血漿、唾液及び脳脊髄液から
成る群より選ばれる生物学的試料中のＨＣＶＲＮＡの逆
転写方法であって、（ａ）前記試料から誘導されたＲＮ
Ａを、１又は複数のオリゴヌクレオチドが前記ＲＮＡの
少なくとも一部分に相補的なｃＤＮＡの合成を開始する
ような条件下で、前記１又は複数のオリゴヌクレオチド
と接触させることを含んで成り、前記オリゴヌクレオチ
ドが下記式（Ｉ） から成る群より選ばれる方法。（ｂ）前記ｃＤＮＡを回
収することを更に含む。前記試料から誘導されたＲＮＡ
を鋳型として、プライマーとして前記ＲＮＡ中に含まれ
る配列に相補的なオリゴヌクレオチドを使用するＨＣＶ
ＲＮＡの存在の検出方法。
転写のためのオリゴヌクレオチドプライマーの提供及び
生物学的試料中のＨＣＶＲＮＡの存在の検出方法の提
供。 【解決手段】血液、血清、血漿、唾液及び脳脊髄液から
成る群より選ばれる生物学的試料中のＨＣＶＲＮＡの逆
転写方法であって、（ａ）前記試料から誘導されたＲＮ
Ａを、１又は複数のオリゴヌクレオチドが前記ＲＮＡの
少なくとも一部分に相補的なｃＤＮＡの合成を開始する
ような条件下で、前記１又は複数のオリゴヌクレオチド
と接触させることを含んで成り、前記オリゴヌクレオチ
ドが下記式（Ｉ） から成る群より選ばれる方法。（ｂ）前記ｃＤＮＡを回
収することを更に含む。前記試料から誘導されたＲＮＡ
を鋳型として、プライマーとして前記ＲＮＡ中に含まれ
る配列に相補的なオリゴヌクレオチドを使用するＨＣＶ
ＲＮＡの存在の検出方法。
Description
【０００１】
【発明が属する技術分野】本発明は、生物学的試料中の
核酸配列、特に感染性微生物に由来する配列の検出方法
に関する。
核酸配列、特に感染性微生物に由来する配列の検出方法
に関する。
【０００２】
【従来の技術】Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）は、世界中
の大部分の輸血後肝炎の症例とかなりの割合の散在性
（または地域社会獲得性）肝炎の症例の原因である、非
経口的に伝染するウイルスである。世界人口の１％超が
ＨＣＶに感染していると見積もられている。ＨＣＶ感染
は急性肝炎、慢性肝炎、肝硬変および続発する肝細胞癌
に関係がある。
の大部分の輸血後肝炎の症例とかなりの割合の散在性
（または地域社会獲得性）肝炎の症例の原因である、非
経口的に伝染するウイルスである。世界人口の１％超が
ＨＣＶに感染していると見積もられている。ＨＣＶ感染
は急性肝炎、慢性肝炎、肝硬変および続発する肝細胞癌
に関係がある。
【０００３】ＨＣＶは現在フラビウイルス科（Flavivir
idae）の中の独自のヘパチウイルス属（Hepacivirus ）
として分類されている。そのゲノムは、約3,000 アミノ
酸のポリタンパク質前駆体をコードする単一の大きな転
写解読枠（ＯＲＦ）を有する約9,500 ヌクレオチドの正
鎖ＲＮＡ分子から成る。この大きなＯＲＦの上流には、
ゲノムの最も高度に保存された領域である約340 ヌクレ
オチドの５′非コード領域（ＮＣＲ）がある。このＯＲ
Ｆの５′領域は（５′→３′方向で）キャプシドタンパ
ク質、２つのエンベロープ糖タンパク質（Ｅ１とＥ２）
および未知の機能を有する小さなタンパク質（Ｐ７）を
コードする。このＯＲＦの３′領域は、プロテアーゼ、
プロテアーゼ／ヘリカーゼ二機能性タンパク質、ＲＮＡ
ポリメラーゼおよび調節タンパク質を包含する非構造タ
ンパク質をコードする。
idae）の中の独自のヘパチウイルス属（Hepacivirus ）
として分類されている。そのゲノムは、約3,000 アミノ
酸のポリタンパク質前駆体をコードする単一の大きな転
写解読枠（ＯＲＦ）を有する約9,500 ヌクレオチドの正
鎖ＲＮＡ分子から成る。この大きなＯＲＦの上流には、
ゲノムの最も高度に保存された領域である約340 ヌクレ
オチドの５′非コード領域（ＮＣＲ）がある。このＯＲ
Ｆの５′領域は（５′→３′方向で）キャプシドタンパ
ク質、２つのエンベロープ糖タンパク質（Ｅ１とＥ２）
および未知の機能を有する小さなタンパク質（Ｐ７）を
コードする。このＯＲＦの３′領域は、プロテアーゼ、
プロテアーゼ／ヘリカーゼ二機能性タンパク質、ＲＮＡ
ポリメラーゼおよび調節タンパク質を包含する非構造タ
ンパク質をコードする。
【０００４】世界中からのＨＣＶコード配列の分析によ
り、個々のウイルス分離株間で相当な配列変異が明らか
になった。更に、個々の患者からのＨＣＶ配列の分析に
より、関連するが同一でない配列を含むいわゆる「準種
"quasi-species"」としてウイルスが流布することが示
された。分離株間と個々の患者間に存在する変異は、ウ
イルスによりコードされるＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラ
ーゼが低い信頼度を有することの結果であると考えられ
る。ＨＣＶの遺伝的変異の程度は、感染の予防、診断お
よび制御にとって重要な意味を持つ。
り、個々のウイルス分離株間で相当な配列変異が明らか
になった。更に、個々の患者からのＨＣＶ配列の分析に
より、関連するが同一でない配列を含むいわゆる「準種
"quasi-species"」としてウイルスが流布することが示
された。分離株間と個々の患者間に存在する変異は、ウ
イルスによりコードされるＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラ
ーゼが低い信頼度を有することの結果であると考えられ
る。ＨＣＶの遺伝的変異の程度は、感染の予防、診断お
よび制御にとって重要な意味を持つ。
【０００５】ＨＣＶ感染の血清学的診断は、典型的には
組換えＨＣＶタンパク質またはペプチドを結合する抗体
を検出する市販のエンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）
により測定される。陽性ＥＩＡ結果は組換え免疫ブロッ
トアッセイ（ＲＩＢＡ）により確かめることができる
が、ＥＩＡもＲＩＢＡ法も現在の感染と過去の感染を区
別することはできない。循環しているウイルスは典型的
には低いウイルス価であるために、ウイルスタンパク質
についての直接アッセイの開発は成功していない。更
に、抗体に依存するアッセイは一般に、暴露後２〜３カ
月間はＨＣＶ感染を検出することができない。
組換えＨＣＶタンパク質またはペプチドを結合する抗体
を検出する市販のエンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）
により測定される。陽性ＥＩＡ結果は組換え免疫ブロッ
トアッセイ（ＲＩＢＡ）により確かめることができる
が、ＥＩＡもＲＩＢＡ法も現在の感染と過去の感染を区
別することはできない。循環しているウイルスは典型的
には低いウイルス価であるために、ウイルスタンパク質
についての直接アッセイの開発は成功していない。更
に、抗体に依存するアッセイは一般に、暴露後２〜３カ
月間はＨＣＶ感染を検出することができない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】従って、ＨＣＶへの患
者の暴露後数日以内にＨＣＶウイルス血症を検出するの
に十分な位感受性であるＨＣＶについての改良アッセイ
が当該技術分野で必要とされている。
者の暴露後数日以内にＨＣＶウイルス血症を検出するの
に十分な位感受性であるＨＣＶについての改良アッセイ
が当該技術分野で必要とされている。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明は、一面では、生
物学的試料中のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ＲＮＡの逆
転写方法に向けられる。この方法は、(a) 前記試料から
誘導されたＲＮＡを、オリゴヌクレオチドが前記ＲＮＡ
の少なくとも一部分に相補的なｃＤＮＡの合成を開始す
るような条件下で、前記１または複数のオリゴヌクレオ
チドと接触させることを含んで成り、前記オリゴヌクレ
オチドが (i) 5'-AGGCCAGTATCAGCACTCTCTGCAGTC-3' (57R27)〔配
列番号１〕，(ii) 5'-GTATCAGCACTC-3' (66RT12)〔配列
番号２〕，(iii)5'-AGTATCAGCACTC-3' (66RT13) 〔配列
番号３〕，(iv) 5'-CAGTATCAGCACTC-3' (66RT14)〔配列
番号４〕，(v) 5'-CCAGTATCAGCACTC-3' (66RT15) 〔配
列番号５〕，(vi) 5'-GCCAGTATCAGCACTC-3' (66RT16)
〔配列番号６〕および(vii) 前記のものの任意組合せか
ら成る群より選ばれることを特徴とする。
物学的試料中のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ＲＮＡの逆
転写方法に向けられる。この方法は、(a) 前記試料から
誘導されたＲＮＡを、オリゴヌクレオチドが前記ＲＮＡ
の少なくとも一部分に相補的なｃＤＮＡの合成を開始す
るような条件下で、前記１または複数のオリゴヌクレオ
チドと接触させることを含んで成り、前記オリゴヌクレ
オチドが (i) 5'-AGGCCAGTATCAGCACTCTCTGCAGTC-3' (57R27)〔配
列番号１〕，(ii) 5'-GTATCAGCACTC-3' (66RT12)〔配列
番号２〕，(iii)5'-AGTATCAGCACTC-3' (66RT13) 〔配列
番号３〕，(iv) 5'-CAGTATCAGCACTC-3' (66RT14)〔配列
番号４〕，(v) 5'-CCAGTATCAGCACTC-3' (66RT15) 〔配
列番号５〕，(vi) 5'-GCCAGTATCAGCACTC-3' (66RT16)
〔配列番号６〕および(vii) 前記のものの任意組合せか
ら成る群より選ばれることを特徴とする。
【０００８】別の面では、本発明は、生物学的試料中の
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ＲＮＡの存在の検出方法に
向けられる。この方法は、(a) 鋳型として前記試料から
誘導されたＲＮＡを使用しそしてプライマーとして前記
ＲＮＡ中に含まれる配列に相補的なオリゴヌクレオチド
を使用して逆転写反応を行うことにより、ＨＣＶ特異的
逆転写生成物を生成させ、前記プライマーが (i) 5'-AGGCCAGTATCAGCACTCTCTGCAGTC-3' (57R27)〔配
列番号１〕，(ii) 5'-GTATCAGCACTC-3' (66RT12)〔配列
番号２〕，(iii)5'-AGTATCAGCACTC-3' (66RT13) 〔配列
番号３〕，(iv) 5'-CAGTATCAGCACTC-3' (66RT14)〔配列
番号４〕，(v) 5'-CCAGTATCAGCACTC-3' (66RT15) 〔配
列番号５〕，(vi) 5'-GCCAGTATCAGCACTC-3' (66RT16)
〔配列番号６〕および(vii) 前記のものの任意組合せ から成る群より選ばれ； (b) 前記逆転写反応の生成物を増幅させることにより増
幅生成物を生成させ；そして (c) 前記増幅生成物を検出する ことを含んで成り、前記増幅生成物の検出が前記試料中
のＨＣＶ ＲＮＡの存在を示すことを特徴とする。
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ＲＮＡの存在の検出方法に
向けられる。この方法は、(a) 鋳型として前記試料から
誘導されたＲＮＡを使用しそしてプライマーとして前記
ＲＮＡ中に含まれる配列に相補的なオリゴヌクレオチド
を使用して逆転写反応を行うことにより、ＨＣＶ特異的
逆転写生成物を生成させ、前記プライマーが (i) 5'-AGGCCAGTATCAGCACTCTCTGCAGTC-3' (57R27)〔配
列番号１〕，(ii) 5'-GTATCAGCACTC-3' (66RT12)〔配列
番号２〕，(iii)5'-AGTATCAGCACTC-3' (66RT13) 〔配列
番号３〕，(iv) 5'-CAGTATCAGCACTC-3' (66RT14)〔配列
番号４〕，(v) 5'-CCAGTATCAGCACTC-3' (66RT15) 〔配
列番号５〕，(vi) 5'-GCCAGTATCAGCACTC-3' (66RT16)
〔配列番号６〕および(vii) 前記のものの任意組合せ から成る群より選ばれ； (b) 前記逆転写反応の生成物を増幅させることにより増
幅生成物を生成させ；そして (c) 前記増幅生成物を検出する ことを含んで成り、前記増幅生成物の検出が前記試料中
のＨＣＶ ＲＮＡの存在を示すことを特徴とする。
【０００９】増幅は任意方法で実施できるが、ポリメラ
ーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が好ましい。本発明のＨＣＶ特
異的逆転写プライマーの使用は、試料、好ましくは血漿
中のＨＣＶの高感度検出方法を提供する。
ーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が好ましい。本発明のＨＣＶ特
異的逆転写プライマーの使用は、試料、好ましくは血漿
中のＨＣＶの高感度検出方法を提供する。
【００１０】別の面では、本発明は、生物学的試料中の
ＨＣＶの検出用のキットに向けられる。このキットは (i) 5'-AGGCCAGTATCAGCACTCTCTGCAGTC-3' (57R27)〔配
列番号１〕，(ii) 5'-GTATCAGCACTC-3' (66RT12)〔配列
番号２〕，(iii)5'-AGTATCAGCACTC-3' (66RT13) 〔配列
番号３〕，(iv) 5'-CAGTATCAGCACTC-3' (66RT14)〔配列
番号４〕，(v) 5'-CCAGTATCAGCACTC-3' (66RT15) 〔配
列番号５〕，(vi) 5'-GCCAGTATCAGCACTC-3' (66RT16)
〔配列番号６〕および(vii) 前記のものの任意組合せか
ら成る群より選ばれた逆転写プライマーを含んで成る。
ＨＣＶの検出用のキットに向けられる。このキットは (i) 5'-AGGCCAGTATCAGCACTCTCTGCAGTC-3' (57R27)〔配
列番号１〕，(ii) 5'-GTATCAGCACTC-3' (66RT12)〔配列
番号２〕，(iii)5'-AGTATCAGCACTC-3' (66RT13) 〔配列
番号３〕，(iv) 5'-CAGTATCAGCACTC-3' (66RT14)〔配列
番号４〕，(v) 5'-CCAGTATCAGCACTC-3' (66RT15) 〔配
列番号５〕，(vi) 5'-GCCAGTATCAGCACTC-3' (66RT16)
〔配列番号６〕および(vii) 前記のものの任意組合せか
ら成る群より選ばれた逆転写プライマーを含んで成る。
【００１１】このキットは逆転写、増幅および生成物検
出のための試薬および説明書を更に含んでもよい。
出のための試薬および説明書を更に含んでもよい。
【００１２】
【発明の実施態様】本発明者らは、Ｃ型肝炎ウイルス
（ＨＣＶ）ＲＮＡ中に存在する特定の配列に相補的な配
列を有するオリゴヌクレオチドを逆転写反応用のプライ
マーとして用いると、生物学的試料中のＨＣＶ ＲＮＡ
の検出がより効率的であることを発見した。好ましく
は、このプライマーの配列はＨＣＶ ＲＮＡの３′非コ
ード領域近隣の配列に相当する。
（ＨＣＶ）ＲＮＡ中に存在する特定の配列に相補的な配
列を有するオリゴヌクレオチドを逆転写反応用のプライ
マーとして用いると、生物学的試料中のＨＣＶ ＲＮＡ
の検出がより効率的であることを発見した。好ましく
は、このプライマーの配列はＨＣＶ ＲＮＡの３′非コ
ード領域近隣の配列に相当する。
【００１３】ＨＣＶの３′非コード（ＮＣ）領域はわず
か98ヌクレオチドの長さであり、その長さはこの領域で
逆転写を開始させるためにランダムプライマーの使用を
支持するには短すぎる。本発明は、ＨＣＶゲノムの３′
非コード領域から誘導された配列の逆転写（およびそれ
によって増幅および検出）を可能にする、新規特異的オ
リゴヌクレオチドプライマーを提供する。
か98ヌクレオチドの長さであり、その長さはこの領域で
逆転写を開始させるためにランダムプライマーの使用を
支持するには短すぎる。本発明は、ＨＣＶゲノムの３′
非コード領域から誘導された配列の逆転写（およびそれ
によって増幅および検出）を可能にする、新規特異的オ
リゴヌクレオチドプライマーを提供する。
【００１４】分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡおよ
びタンパク質生化学の多数の技術、例えばCurrent Prot
ocols in Molecular Biology, 第Ｉ，IIおよびIII 巻,
1997（F.M. Ausubel編）；Sambrook他, 1989, Molecula
r Cloning: A Laboratory Manual, 第２版，Cold Sprin
g Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New
York ; DNA Cloning: A Practical Approach,第Ｉおよ
びII巻, 1985 (D.N. Glover 編) ; Oligonucleotide Sy
nthesis, 1984 (M.L. Gait編) ; Transcription and Tr
anslation, 1984 (Hames & Higgins編) ; A Practical
Guide to Molecular Cloning; 双書, Methods in Enzym
ology (Academic Press, Inc.) ; Protein Purificatio
n: Principles and Practice, 第２版（Springer-Verla
g, N.Y.）中に説明された技術を、本発明を実施する際
に使用する。
びタンパク質生化学の多数の技術、例えばCurrent Prot
ocols in Molecular Biology, 第Ｉ，IIおよびIII 巻,
1997（F.M. Ausubel編）；Sambrook他, 1989, Molecula
r Cloning: A Laboratory Manual, 第２版，Cold Sprin
g Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New
York ; DNA Cloning: A Practical Approach,第Ｉおよ
びII巻, 1985 (D.N. Glover 編) ; Oligonucleotide Sy
nthesis, 1984 (M.L. Gait編) ; Transcription and Tr
anslation, 1984 (Hames & Higgins編) ; A Practical
Guide to Molecular Cloning; 双書, Methods in Enzym
ology (Academic Press, Inc.) ; Protein Purificatio
n: Principles and Practice, 第２版（Springer-Verla
g, N.Y.）中に説明された技術を、本発明を実施する際
に使用する。
【００１５】本明細書中で用いる「核酸」または「ポリ
ヌクレオチド」とは、ポリリボヌクレオチドもしくはポ
リデオキシリボヌクレオチドまたは混合ポリリボ／ポリ
デオキシリボヌクレオチドのいずれかの、任意の長さの
プリンおよびピリミジン含有ポリマーを言う。これには
一本鎖および二本鎖分子、例えばＤＮＡ−ＤＮＡ，ＤＮ
Ａ−ＲＮＡおよびＲＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、並びに
アミノ酸主鎖に塩基を結合することにより形成された
「タンパク質核酸」（ＰＮＡ）が含まれる。これには修
飾塩基を含有する核酸も含まれる。
ヌクレオチド」とは、ポリリボヌクレオチドもしくはポ
リデオキシリボヌクレオチドまたは混合ポリリボ／ポリ
デオキシリボヌクレオチドのいずれかの、任意の長さの
プリンおよびピリミジン含有ポリマーを言う。これには
一本鎖および二本鎖分子、例えばＤＮＡ−ＤＮＡ，ＤＮ
Ａ−ＲＮＡおよびＲＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、並びに
アミノ酸主鎖に塩基を結合することにより形成された
「タンパク質核酸」（ＰＮＡ）が含まれる。これには修
飾塩基を含有する核酸も含まれる。
【００１６】本明細書中で用いる核酸配列の「相補体」
とは、元の配列と共にワトソン−クリック塩基対合に参
加するアンチセンス配列を言う。
とは、元の配列と共にワトソン−クリック塩基対合に参
加するアンチセンス配列を言う。
【００１７】本明細書中で用いる「プライマー」は、着
目の一本鎖核酸配列と共に二重鎖を形成しそして例えば
逆転写酵素またはＤＮＡポリメラーゼを使って相補鎖の
重合を可能にする、長さ約10〜約50ヌクレオチド、好ま
しくは長さ約12〜約25ヌクレオチド、最も好ましくは約
12〜約18ヌクレオチドの単離されたオリゴヌクレオチド
である。
目の一本鎖核酸配列と共に二重鎖を形成しそして例えば
逆転写酵素またはＤＮＡポリメラーゼを使って相補鎖の
重合を可能にする、長さ約10〜約50ヌクレオチド、好ま
しくは長さ約12〜約25ヌクレオチド、最も好ましくは約
12〜約18ヌクレオチドの単離されたオリゴヌクレオチド
である。
【００１８】本明細書中で用いる「単離された」核酸と
は、それの元の環境（例えば、それが天然に存在する混
合物であるならそれの天然の環境、それが合成物である
なら反応混合物）から分離されている成分を言う。単離
された核酸は、典型的には、最初にそれが関連していた
成分の約50％未満、好ましくは約75％未満、そして最も
好ましくは約90％未満を含有する。
は、それの元の環境（例えば、それが天然に存在する混
合物であるならそれの天然の環境、それが合成物である
なら反応混合物）から分離されている成分を言う。単離
された核酸は、典型的には、最初にそれが関連していた
成分の約50％未満、好ましくは約75％未満、そして最も
好ましくは約90％未満を含有する。
【００１９】指摘した配列「から誘導された」核酸配列
とは、その指摘した配列の一領域に相当する配列を言
う。これには、その配列に相同であるかまたは相補的で
ある配列も含まれる。
とは、その指摘した配列の一領域に相当する配列を言
う。これには、その配列に相同であるかまたは相補的で
ある配列も含まれる。
【００２０】内部陽性対照（＝ＩＰＣ）標的核酸とは、
典型的には制限エンドヌクレアーゼの作用により後で直
鎖状にされるプラスミドベクター中にクローニングされ
た合成核酸配列を指して言う。ＩＰＣは、典型的には一
般的なプローブ結合領域を取り囲む複数のプライマー結
合配列を有し、そして核酸増幅反応において偽陽性結果
に対する包括的な対照として働く。
典型的には制限エンドヌクレアーゼの作用により後で直
鎖状にされるプラスミドベクター中にクローニングされ
た合成核酸配列を指して言う。ＩＰＣは、典型的には一
般的なプローブ結合領域を取り囲む複数のプライマー結
合配列を有し、そして核酸増幅反応において偽陽性結果
に対する包括的な対照として働く。
【００２１】好ましい内部陽性対照標的ＤＮＡの配列は
下記のものである：5'-CGCCAGCGTGGACCATCAAGTAGTAATGA
ACGCACGGACGAGGACATCATAGAGATTACACCTTTATCCACAGTTCTCG
GTCTAACGCAGCAGTCAGTGTATCAGCACCAGCATCCGTAGTGAGTCTTC
AGTGTCTGCTCCAGGATCGTG-3'〔配列番号７〕。
下記のものである：5'-CGCCAGCGTGGACCATCAAGTAGTAATGA
ACGCACGGACGAGGACATCATAGAGATTACACCTTTATCCACAGTTCTCG
GTCTAACGCAGCAGTCAGTGTATCAGCACCAGCATCCGTAGTGAGTCTTC
AGTGTCTGCTCCAGGATCGTG-3'〔配列番号７〕。
【００２２】本明細書中で用いる場合、逆転写に適した
条件、即ち、オリゴヌクレオチドがｃＤＮＡ合成を開始
させる条件は、ｃＤＮＡ合成をもたらす温度および時間
において、ＲＮＡおよびプライマーオリゴヌクレオチド
を逆転写酵素およびヌクレオチドとインキュベーション
することを包含する。
条件、即ち、オリゴヌクレオチドがｃＤＮＡ合成を開始
させる条件は、ｃＤＮＡ合成をもたらす温度および時間
において、ＲＮＡおよびプライマーオリゴヌクレオチド
を逆転写酵素およびヌクレオチドとインキュベーション
することを包含する。
【００２３】本明細書中に開示するいずれかの配列また
はそれの部分配列を含んで成る核酸は、常法により調製
することができる。例えば、Matteucci 他, 1981, J. A
m. Chem. Soc. 103:3185のホスホロアミダイト固体支持
体法、Yoo 他, 1989, J. Biol. Chem. 764:17078の方
法、または他の周知の方法を使って、ＤＮＡを合成する
ことができる。当該技術分野で既知である多数の手段に
より核酸を修飾することもできる。そのような修飾の非
限定例としては、メチル化、「キャップ付加」、類似体
による１もしくは複数の天然ヌクレオチドの置換、ヌク
レオチド間修飾、例えば無電荷結合（例えばメチルホス
ホネート、ホスホトリエステル、ホスホロアミデート、
カルバメートなど）もしくは荷電結合（例えばホスホロ
チオエート、ホスホロジチオエートなど）が挙げられ
る。核酸は１または複数の追加の共有結合した成分、例
えば、タンパク質（例えばヌクレアーゼ、毒素、抗体、
シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リジンなど）、挿入剤
（例えばアクリジン、ソラレンなど）、キレート化剤
（例えば金属、放射性金属、鉄、酸化金属など）および
アルキル化剤を含んでもよい。「核酸」なる用語にはＰ
ＮＡも含まれる。核酸は、メチルもしくはエチルホスホ
トリエステルまたはアルキルホスホロアミデート結合の
形成により誘導体にすることができる。更に、本発明の
核酸配列は、直接または間接的に検出可能なシグナルを
提供することができる標識により修飾されてもよい。典
型的な標識としては、放射性同位体、蛍光分子、ビオチ
ンなどが挙げられる。
はそれの部分配列を含んで成る核酸は、常法により調製
することができる。例えば、Matteucci 他, 1981, J. A
m. Chem. Soc. 103:3185のホスホロアミダイト固体支持
体法、Yoo 他, 1989, J. Biol. Chem. 764:17078の方
法、または他の周知の方法を使って、ＤＮＡを合成する
ことができる。当該技術分野で既知である多数の手段に
より核酸を修飾することもできる。そのような修飾の非
限定例としては、メチル化、「キャップ付加」、類似体
による１もしくは複数の天然ヌクレオチドの置換、ヌク
レオチド間修飾、例えば無電荷結合（例えばメチルホス
ホネート、ホスホトリエステル、ホスホロアミデート、
カルバメートなど）もしくは荷電結合（例えばホスホロ
チオエート、ホスホロジチオエートなど）が挙げられ
る。核酸は１または複数の追加の共有結合した成分、例
えば、タンパク質（例えばヌクレアーゼ、毒素、抗体、
シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リジンなど）、挿入剤
（例えばアクリジン、ソラレンなど）、キレート化剤
（例えば金属、放射性金属、鉄、酸化金属など）および
アルキル化剤を含んでもよい。「核酸」なる用語にはＰ
ＮＡも含まれる。核酸は、メチルもしくはエチルホスホ
トリエステルまたはアルキルホスホロアミデート結合の
形成により誘導体にすることができる。更に、本発明の
核酸配列は、直接または間接的に検出可能なシグナルを
提供することができる標識により修飾されてもよい。典
型的な標識としては、放射性同位体、蛍光分子、ビオチ
ンなどが挙げられる。
【００２４】本明細書中で用いる「増幅」とは、非限定
的に、核酸がコピーされる相互作用工程を言う。適当な
増幅方法としては、ポリメラーゼ連鎖反応、リガーゼ連
鎖反応、鎖置換増幅、核酸一塩基増幅、および転写媒介
増幅が挙げられる。
的に、核酸がコピーされる相互作用工程を言う。適当な
増幅方法としては、ポリメラーゼ連鎖反応、リガーゼ連
鎖反応、鎖置換増幅、核酸一塩基増幅、および転写媒介
増幅が挙げられる。
【００２５】本明細書中で用いる「Ｃ型肝炎ウイルス
（ＨＣＶ）」とは、ヘパシウイルス属（Hepacivirus ）
に属するウイルスを指す。本発明により検出することが
できるＨＣＶの分離株としては、非限定的に、血清型１
〜６が挙げられる。
（ＨＣＶ）」とは、ヘパシウイルス属（Hepacivirus ）
に属するウイルスを指す。本発明により検出することが
できるＨＣＶの分離株としては、非限定的に、血清型１
〜６が挙げられる。
【００２６】本発明は、生物学的試料中のＨＣＶの逆転
写方法を提供する。ＨＣＶ ＲＮＡの効率的逆転写は、
生物学的試料中のＨＣＶの高感度検出に備える。ＨＣＶ
ＲＮＡの逆転写は、本発明のオリゴヌクレオチドが前
記ＲＮＡの少なくとも一部分に相補的なＤＮＡの合成を
開始させるような条件下で、本発明のオリゴヌクレオチ
ドを前記試料から誘導されたＤＮＡと接触させることに
より行われる。
写方法を提供する。ＨＣＶ ＲＮＡの効率的逆転写は、
生物学的試料中のＨＣＶの高感度検出に備える。ＨＣＶ
ＲＮＡの逆転写は、本発明のオリゴヌクレオチドが前
記ＲＮＡの少なくとも一部分に相補的なＤＮＡの合成を
開始させるような条件下で、本発明のオリゴヌクレオチ
ドを前記試料から誘導されたＤＮＡと接触させることに
より行われる。
【００２７】生物学的試料中のＨＣＶ ＲＮＡの検出
は、前記試料中に含まれるＲＮＡかまたは前記試料から
誘導されたＲＮＡを鋳型として使用し、ＨＣＶ ＲＮＡ
中に含まれる配列に相補的である本発明のオリゴヌクレ
オチドをプライマーとして使用して逆転写反応を行うこ
とにより、ＨＣＶ特異的逆転写生成物を生成させ、次い
で逆転写生成物を増幅させることによりＨＣＶ特異的増
幅生成物を生成させ、そしてＨＣＶ特異的増幅生成物を
検出することにより行われる。ＨＣＶ特異的増幅生成物
の検出が試料中にＨＣＶ ＲＮＡが存在することを示
す。
は、前記試料中に含まれるＲＮＡかまたは前記試料から
誘導されたＲＮＡを鋳型として使用し、ＨＣＶ ＲＮＡ
中に含まれる配列に相補的である本発明のオリゴヌクレ
オチドをプライマーとして使用して逆転写反応を行うこ
とにより、ＨＣＶ特異的逆転写生成物を生成させ、次い
で逆転写生成物を増幅させることによりＨＣＶ特異的増
幅生成物を生成させ、そしてＨＣＶ特異的増幅生成物を
検出することにより行われる。ＨＣＶ特異的増幅生成物
の検出が試料中にＨＣＶ ＲＮＡが存在することを示
す。
【００２８】本発明によれば、任意の常法により患者か
ら生物学的試料が得られる。適当な生物学的試料として
は、非限定的に、血液、血清、血漿、尿、母乳および脳
脊髄液が挙げられる。好ましくは血漿がＨＣＶ ＲＮＡ
の入手源として使われる。
ら生物学的試料が得られる。適当な生物学的試料として
は、非限定的に、血液、血清、血漿、尿、母乳および脳
脊髄液が挙げられる。好ましくは血漿がＨＣＶ ＲＮＡ
の入手源として使われる。
【００２９】生物学的試料は、試料中に含まれるＲＮ
Ａ、特にＨＣＶ ＲＮＡへの逆転写試薬の接近を与える
ようなやり方で処理する。生物学的試料「から誘導され
た」ＲＮＡは、最初は試料中に存在していたもので且つ
試料を処理することによってそのＲＮＡへの接近が増大
された任意のＲＮＡである。好ましくは、当該技術分野
で周知の方法、例えばチオシアン酸グアニジウムを使用
する方法、またはGentraSystems, Inc. (Minneapolis M
N) からのPureScriptのような市販の試薬と方法を使う
方法を用いて、試料からＲＮＡを抽出する。ＲＮアーゼ
からのＲＮＡ、別のタンパク質および／または逆転写反
応を妨害する可能性のある他の成分からの分離をもたら
すいずれの抽出方法を使ってもよい。
Ａ、特にＨＣＶ ＲＮＡへの逆転写試薬の接近を与える
ようなやり方で処理する。生物学的試料「から誘導され
た」ＲＮＡは、最初は試料中に存在していたもので且つ
試料を処理することによってそのＲＮＡへの接近が増大
された任意のＲＮＡである。好ましくは、当該技術分野
で周知の方法、例えばチオシアン酸グアニジウムを使用
する方法、またはGentraSystems, Inc. (Minneapolis M
N) からのPureScriptのような市販の試薬と方法を使う
方法を用いて、試料からＲＮＡを抽出する。ＲＮアーゼ
からのＲＮＡ、別のタンパク質および／または逆転写反
応を妨害する可能性のある他の成分からの分離をもたら
すいずれの抽出方法を使ってもよい。
【００３０】次いで、試料をＨＣＶの配列から誘導され
たプライマーを使った逆転写反応にかける。好ましく
は、プライマーは検出を所望する領域の下流、即ち３′
側にあるＨＣＶ ＲＮＡの領域に相当する。それらの領
域としては、例えば、ウイルスキャプシドタンパク質、
Ｅ１およびＥ２タンパク質、Ｐ７タンパク質、プロテア
ーゼ／ヘリカーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ並びに調節タン
パク質をコードする領域、並びに５′および３′非コー
ド領域が挙げられる。好ましくは、プライマーは３′末
端先端に98 bp の非ホモポリマー配列を含む、３′非コ
ード領域中の配列に相当する（Tanaka他, J. Virol. 7
0:3307, 1996 ; Kolykhalov他, J. Virol.70: 3363, 19
96）。プライマー配列は、ＨＣＶの特定の分離株または
血清型（例えば、ＨＣＶ １〜６）を具体的に同定する
ために使うこともできる。プライマーは、それが別の分
離株からのＲＮＡにはハイブリダイズしないような条件
下で、目的の分離株に由来するＲＮＡにハイブリダイズ
することにより特定の分離株または血清型を同定するこ
とができる。即ち、プライマーそれ自体が分離株間で異
なる配列を含んでもよい。あるいは、プライマー配列は
分離株間で異なるＨＣＶ ＲＮＡの断片の合成を開始さ
せるために用いることができる。即ち、分離株間で異な
る配列がプライマー配列の下流にあってもよい。
たプライマーを使った逆転写反応にかける。好ましく
は、プライマーは検出を所望する領域の下流、即ち３′
側にあるＨＣＶ ＲＮＡの領域に相当する。それらの領
域としては、例えば、ウイルスキャプシドタンパク質、
Ｅ１およびＥ２タンパク質、Ｐ７タンパク質、プロテア
ーゼ／ヘリカーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ並びに調節タン
パク質をコードする領域、並びに５′および３′非コー
ド領域が挙げられる。好ましくは、プライマーは３′末
端先端に98 bp の非ホモポリマー配列を含む、３′非コ
ード領域中の配列に相当する（Tanaka他, J. Virol. 7
0:3307, 1996 ; Kolykhalov他, J. Virol.70: 3363, 19
96）。プライマー配列は、ＨＣＶの特定の分離株または
血清型（例えば、ＨＣＶ １〜６）を具体的に同定する
ために使うこともできる。プライマーは、それが別の分
離株からのＲＮＡにはハイブリダイズしないような条件
下で、目的の分離株に由来するＲＮＡにハイブリダイズ
することにより特定の分離株または血清型を同定するこ
とができる。即ち、プライマーそれ自体が分離株間で異
なる配列を含んでもよい。あるいは、プライマー配列は
分離株間で異なるＨＣＶ ＲＮＡの断片の合成を開始さ
せるために用いることができる。即ち、分離株間で異な
る配列がプライマー配列の下流にあってもよい。
【００３１】本発明の実施の際に有用な逆転写プライマ
ーは、配列保存、分子内および分子間相互作用、並びに
アンプリコンおよび周辺配列の推定上の二次構造の理論
的考察に基づいて選択される。更に、プライマーおよび
アッセイ系は、ＨＣＶゲノムの複数領域、複数ウイルス
種、および内部陽性対照（ＩＰＣ）ＲＮＡ（またはＤＮ
Ａ）の同時増幅（および同時検出）を可能にするように
デザインされる。
ーは、配列保存、分子内および分子間相互作用、並びに
アンプリコンおよび周辺配列の推定上の二次構造の理論
的考察に基づいて選択される。更に、プライマーおよび
アッセイ系は、ＨＣＶゲノムの複数領域、複数ウイルス
種、および内部陽性対照（ＩＰＣ）ＲＮＡ（またはＤＮ
Ａ）の同時増幅（および同時検出）を可能にするように
デザインされる。
【００３２】本発明のＨＣＶ逆転写プライマーの非限定
例としては、5'-AGGCCAGTATCAGCACTCTCTGCAGTC-3' 〔配
列番号１〕（57R27 と命名；ＨＣＶの３′非コード領域
に関してヌクレオチド 57-83に相当する）；5'-TCAGCAC
TCTCT-3'〔配列番号８〕（63RT12と命名；ヌクレオチド
63-74に相当する）；5'-GTATCAGCACTC-3'〔配列番号
２〕（66RT12と命名；ヌクレオチド 66-77に相当す
る）；並びに66RT12の伸長変形種、即ち5'-AGTATCAGCAC
TC-3' 〔配列番号３〕（66RT13）；5'-CAGTATCAGCACTC-
3'〔配列番号４〕（66RT14）；5'-CCAGTATCAGCACTC-3'
〔配列番号５〕（66RT15）；および5'-GCCAGTATCAGCACT
C-3'〔配列番号６〕（66RT16）が挙げられる。
例としては、5'-AGGCCAGTATCAGCACTCTCTGCAGTC-3' 〔配
列番号１〕（57R27 と命名；ＨＣＶの３′非コード領域
に関してヌクレオチド 57-83に相当する）；5'-TCAGCAC
TCTCT-3'〔配列番号８〕（63RT12と命名；ヌクレオチド
63-74に相当する）；5'-GTATCAGCACTC-3'〔配列番号
２〕（66RT12と命名；ヌクレオチド 66-77に相当す
る）；並びに66RT12の伸長変形種、即ち5'-AGTATCAGCAC
TC-3' 〔配列番号３〕（66RT13）；5'-CAGTATCAGCACTC-
3'〔配列番号４〕（66RT14）；5'-CCAGTATCAGCACTC-3'
〔配列番号５〕（66RT15）；および5'-GCCAGTATCAGCACT
C-3'〔配列番号６〕（66RT16）が挙げられる。
【００３３】逆転写は上記プライマーのうちの１つまた
は複数を使って行われる。ランダムプライマー、例えば
ランダムヘキサマー逆転写プライマー（N6, Pharmacia
Biotech, Piscataway, NJ ）を加えてもよい。逆転写
は、例えばCurrent Protocolsin Molecular Biology,
第Ｉ, IIおよびIII 巻, 1997 (F.M. Ausubel編) ; 米国
特許第5,322,770 号明細書 ; Young他, J. Clin. Micro
biol. 31(4):882 (1993); Myers他, Biochemistry 30
(3):7661 (1991)中に記載されたような、常用手段を使
って実施される。逆転写プライマーとしての使用に適し
た他のプライマーおよび本発明において使用することが
できる逆転写方法としては、同時係属米国特許出願第 0
9/ 号, 代理人書類番号2094/0E287に記載された
ものが挙げられる。
は複数を使って行われる。ランダムプライマー、例えば
ランダムヘキサマー逆転写プライマー（N6, Pharmacia
Biotech, Piscataway, NJ ）を加えてもよい。逆転写
は、例えばCurrent Protocolsin Molecular Biology,
第Ｉ, IIおよびIII 巻, 1997 (F.M. Ausubel編) ; 米国
特許第5,322,770 号明細書 ; Young他, J. Clin. Micro
biol. 31(4):882 (1993); Myers他, Biochemistry 30
(3):7661 (1991)中に記載されたような、常用手段を使
って実施される。逆転写プライマーとしての使用に適し
た他のプライマーおよび本発明において使用することが
できる逆転写方法としては、同時係属米国特許出願第 0
9/ 号, 代理人書類番号2094/0E287に記載された
ものが挙げられる。
【００３４】逆転写反応の後、生成物を回収しそして増
幅させることができる。任意の増幅方法を使ってもよ
く、増幅法の非限定例としては、ポリメラーゼ連鎖反応
（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応、鎖置換反応、核酸一塩
基増幅および転写媒介増幅が挙げられる。好ましくはＰ
ＣＲが使われる。典型的には、ＰＣＲに必要な全ての成
分（ＨＣＶ特異的増幅プライマーを含む）を含有する反
応混合物が直接逆転写反応混合物に添加される。次い
で、使用するプライマー対により特定される条件を使っ
て増幅反応を実施する。本発明の逆転写プライマーを使
った逆転写により製造されたＨＣＶ ＤＮＡを増幅する
のに使われる適当なプライマーは、米国特許出願第 09/
号，代理人書類番号2094/0E26 に開示されてい
る。
幅させることができる。任意の増幅方法を使ってもよ
く、増幅法の非限定例としては、ポリメラーゼ連鎖反応
（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応、鎖置換反応、核酸一塩
基増幅および転写媒介増幅が挙げられる。好ましくはＰ
ＣＲが使われる。典型的には、ＰＣＲに必要な全ての成
分（ＨＣＶ特異的増幅プライマーを含む）を含有する反
応混合物が直接逆転写反応混合物に添加される。次い
で、使用するプライマー対により特定される条件を使っ
て増幅反応を実施する。本発明の逆転写プライマーを使
った逆転写により製造されたＨＣＶ ＤＮＡを増幅する
のに使われる適当なプライマーは、米国特許出願第 09/
号，代理人書類番号2094/0E26 に開示されてい
る。
【００３５】増幅後、増幅生成物は、当該技術分野で周
知の任意方法、例えば非限定的に、アガロースまたはア
クリルアミドゲル中でのゲル電気泳動法；固体支持体上
での増幅生成物の捕捉に続く比色検出法（例えば、下記
の実施例１を参照のこと）；ＥＣｉ検出法；化学発光検
出法，放射性同位体検出法および蛍光検出法を使って検
出することができる。そのような検出法に用いる試薬
は、例えばMolecular Probes, Eugene, OregonおよびOr
tho Clinical Diagnostics, Rochester, NY から市販さ
れている。
知の任意方法、例えば非限定的に、アガロースまたはア
クリルアミドゲル中でのゲル電気泳動法；固体支持体上
での増幅生成物の捕捉に続く比色検出法（例えば、下記
の実施例１を参照のこと）；ＥＣｉ検出法；化学発光検
出法，放射性同位体検出法および蛍光検出法を使って検
出することができる。そのような検出法に用いる試薬
は、例えばMolecular Probes, Eugene, OregonおよびOr
tho Clinical Diagnostics, Rochester, NY から市販さ
れている。
【００３６】ＨＣＶ特異的増幅生成物の検出は試料中に
ＨＣＶ ＲＮＡが存在することを示す。ゲル電気泳動を
用いた場合、ＨＣＶ特異的増幅生成物は、反応に用いた
増幅プライマーに相当する配列を有するＨＣＶ ＲＮＡ
中の位置により推定されるような、それらのサイズによ
り確認される。
ＨＣＶ ＲＮＡが存在することを示す。ゲル電気泳動を
用いた場合、ＨＣＶ特異的増幅生成物は、反応に用いた
増幅プライマーに相当する配列を有するＨＣＶ ＲＮＡ
中の位置により推定されるような、それらのサイズによ
り確認される。
【００３７】(i) 5'-AGGCCAGTATCAGCACTCTCTGCAGTC-3'
(57R27)〔配列番号１〕，(ii) 5'-GTATCAGCACTC-3' (6
6RT12)〔配列番号２〕，(iii)5'-AGTATCAGCACTC-3' (66
RT13) 〔配列番号３〕，(iv) 5'-CAGTATCAGCACTC-3' (6
6RT14)〔配列番号４〕，(v) 5'-CCAGTATCAGCACTC-3'
(66RT15) 〔配列番号５〕，(vi) 5'-GCCAGTATCAGCACTC-
3' (66RT16)〔配列番号６〕および(vii) 前記のものの
任意組合せから成る群より選ばれた逆転写プライマーを
含有する、生物学的試料中のＨＣＶの検出用のキットを
調製することができる。
(57R27)〔配列番号１〕，(ii) 5'-GTATCAGCACTC-3' (6
6RT12)〔配列番号２〕，(iii)5'-AGTATCAGCACTC-3' (66
RT13) 〔配列番号３〕，(iv) 5'-CAGTATCAGCACTC-3' (6
6RT14)〔配列番号４〕，(v) 5'-CCAGTATCAGCACTC-3'
(66RT15) 〔配列番号５〕，(vi) 5'-GCCAGTATCAGCACTC-
3' (66RT16)〔配列番号６〕および(vii) 前記のものの
任意組合せから成る群より選ばれた逆転写プライマーを
含有する、生物学的試料中のＨＣＶの検出用のキットを
調製することができる。
【００３８】それらのキットは逆転写、増幅および生成
物検出のための試薬および説明書を更に含んでもよい。
例えば、該キットは逆転写酵素、デオキシヌクレオチ
ド、ＤＮＡ増幅反応に適した耐熱性ポリメラーゼ、並び
に核酸の標識および検出用の試薬を含むことができる。
物検出のための試薬および説明書を更に含んでもよい。
例えば、該キットは逆転写酵素、デオキシヌクレオチ
ド、ＤＮＡ増幅反応に適した耐熱性ポリメラーゼ、並び
に核酸の標識および検出用の試薬を含むことができる。
【００３９】本発明の方法および組成物は、患者のＨＣ
Ｖ感染の診断において；抗ＨＣＶ療法処置の効能の試験
において；およびＨＣＶ感染試料についての輸血用血液
のスクリーニングにおいて利用することができる。
Ｖ感染の診断において；抗ＨＣＶ療法処置の効能の試験
において；およびＨＣＶ感染試料についての輸血用血液
のスクリーニングにおいて利用することができる。
【００４０】
【実施例】下記の実施例は非限定的に本発明を例証す
る。 方法： １．試料調製：血漿試料から、PureScriptTMＲＮＡ単離
試薬（Gentra Systems, MinneapolisMN）を使ってＲＮ
Ａを調製した。体液についての製造業者のプロトコルへ
の変更として、20 gではなく40 gのグリコーゲンをウイ
ルスＲＮＡの沈澱に役立つ担体として使用することを含
んだ。更に、大部分において、ＲＮＡのイソプロピルア
ルコール沈澱とエタノールによるＲＮＡペレットの洗浄
の後に、製造業者により提供されるＲＮＡハイブリダイ
ゼーション溶液ではなく、ＲＴ緩衝液混合物中にＲＮＡ
ペレットを再懸濁した。
る。 方法： １．試料調製：血漿試料から、PureScriptTMＲＮＡ単離
試薬（Gentra Systems, MinneapolisMN）を使ってＲＮ
Ａを調製した。体液についての製造業者のプロトコルへ
の変更として、20 gではなく40 gのグリコーゲンをウイ
ルスＲＮＡの沈澱に役立つ担体として使用することを含
んだ。更に、大部分において、ＲＮＡのイソプロピルア
ルコール沈澱とエタノールによるＲＮＡペレットの洗浄
の後に、製造業者により提供されるＲＮＡハイブリダイ
ゼーション溶液ではなく、ＲＴ緩衝液混合物中にＲＮＡ
ペレットを再懸濁した。
【００４１】２．逆転写：ジエチルピロカルボネート
（DEPC）で処理した水の中に50 mM Tris-HCl (pH 8.3),
75 mM KCl, 3 mM MgCl2, 10 mM DTT, 0.4 mM 各dNTP
(Pharmacia Biotech), 4 M のランダムヘキサマー (Pha
rmacia Biotech, Piscataway, NJ)または特異的逆転写
プライマーおよび20単位のRNasin（Promega, Madison,
Wisoconsin）を含有する溶液50 Ｌ中の100 Ｕの組換え
モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍ−ＭＬＶ）逆転写酵
素（ＲＴ）（Gibco BRL, Gaithersburg, Maryland ）を
添加することにより、ＲＮＡからのｃＤＮＡの合成を触
媒した。42℃で30分間のインキュベーション後、ＲＴ反
応液を100 ℃に５分間維持してＲＴ活性を破壊した。各
反応液を１分間冷却した後、16000 ×ｇで４秒間超遠心
した。
（DEPC）で処理した水の中に50 mM Tris-HCl (pH 8.3),
75 mM KCl, 3 mM MgCl2, 10 mM DTT, 0.4 mM 各dNTP
(Pharmacia Biotech), 4 M のランダムヘキサマー (Pha
rmacia Biotech, Piscataway, NJ)または特異的逆転写
プライマーおよび20単位のRNasin（Promega, Madison,
Wisoconsin）を含有する溶液50 Ｌ中の100 Ｕの組換え
モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍ−ＭＬＶ）逆転写酵
素（ＲＴ）（Gibco BRL, Gaithersburg, Maryland ）を
添加することにより、ＲＮＡからのｃＤＮＡの合成を触
媒した。42℃で30分間のインキュベーション後、ＲＴ反
応液を100 ℃に５分間維持してＲＴ活性を破壊した。各
反応液を１分間冷却した後、16000 ×ｇで４秒間超遠心
した。
【００４２】３．ＰＣＲ増幅：ＰＣＲは、25 mM Tris-H
Cl, 3 mM MgCl2, 0.725 mM EDTA, 54 mM KCl, 3.72 mM
NaCl, 40 M DTT, 108 g/mlのゼラチン（IV型）, 9.5
％グリセロール, 0.02％Tween 20, 0.02％NP40, 子ウシ
胸腺ＤＮＡ(2 g), 1.2 mMの各dNTP, 0.4 M の各プライ
マー, 10コピーの線状化した内部陽性対照（ＩＰＣ）プ
ラスミドＤＮＡおよび16 ＵのTaq ポリメラーゼを含む
溶液 100 Ｌ中でPE9600サーモサイクラー（Perkin-Elm
er）中で行った。Taq に対するモノクローナル抗体 TP1
-12 とTP4-9 （それらの調製は米国特許第5,338,671 号
明細書に開示されている）をそれぞれ50：１と５：１の
モル比で反応液に添加して、Taq ポリメラーゼに対する
抗体のモル比55：１を提供した。96℃で３分間の最初の
変性の後、96℃で５秒と68℃で40秒から成る40サイクル
の増幅を行った。サイクルの終了後、103 ℃で５分間の
最終加熱段階を行ってTaq ポリメラーゼを失活させた。
使用したプライマーを下記の第３表に示す。
Cl, 3 mM MgCl2, 0.725 mM EDTA, 54 mM KCl, 3.72 mM
NaCl, 40 M DTT, 108 g/mlのゼラチン（IV型）, 9.5
％グリセロール, 0.02％Tween 20, 0.02％NP40, 子ウシ
胸腺ＤＮＡ(2 g), 1.2 mMの各dNTP, 0.4 M の各プライ
マー, 10コピーの線状化した内部陽性対照（ＩＰＣ）プ
ラスミドＤＮＡおよび16 ＵのTaq ポリメラーゼを含む
溶液 100 Ｌ中でPE9600サーモサイクラー（Perkin-Elm
er）中で行った。Taq に対するモノクローナル抗体 TP1
-12 とTP4-9 （それらの調製は米国特許第5,338,671 号
明細書に開示されている）をそれぞれ50：１と５：１の
モル比で反応液に添加して、Taq ポリメラーゼに対する
抗体のモル比55：１を提供した。96℃で３分間の最初の
変性の後、96℃で５秒と68℃で40秒から成る40サイクル
の増幅を行った。サイクルの終了後、103 ℃で５分間の
最終加熱段階を行ってTaq ポリメラーゼを失活させた。
使用したプライマーを下記の第３表に示す。
【００４３】４．ＰＣＲ生成物の検出：増幅中に５′−
ビオチン標識プライマー（センス鎖）を使用してＰＣＲ
生成物をビオチン化した。フロースルー膜の表面上に付
着させたラテックス粒子に共有結合せしめたオリゴヌク
レオチドプローブへのハイブリダイセーションにより、
生成物を捕捉した（SureCell試験）。プローブは 5'-GC
GGCTCACGGACCTTTCACAGCTA-3'〔配列番号９〕および 5'-
ATGCGGCTCACGGACCTTTCACAGC-3'〔配列番号10〕であっ
た。生じたプローブ／生成物複合体を、色素前駆体から
色素（青色）への酸化的変換を触媒するストレプトアビ
ジン（ＳＡ）−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）
接合体と反応させた。色の強度を色標準に比較すること
により、青色の強度を目視により採点した（０〜10）。
目に見える色の得点＞３は、全て陽性結果であると見な
した。
ビオチン標識プライマー（センス鎖）を使用してＰＣＲ
生成物をビオチン化した。フロースルー膜の表面上に付
着させたラテックス粒子に共有結合せしめたオリゴヌク
レオチドプローブへのハイブリダイセーションにより、
生成物を捕捉した（SureCell試験）。プローブは 5'-GC
GGCTCACGGACCTTTCACAGCTA-3'〔配列番号９〕および 5'-
ATGCGGCTCACGGACCTTTCACAGC-3'〔配列番号10〕であっ
た。生じたプローブ／生成物複合体を、色素前駆体から
色素（青色）への酸化的変換を触媒するストレプトアビ
ジン（ＳＡ）−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）
接合体と反応させた。色の強度を色標準に比較すること
により、青色の強度を目視により採点した（０〜10）。
目に見える色の得点＞３は、全て陽性結果であると見な
した。
【００４４】５．Roche Amplicorアッセイ：Roche Ampl
icorアッセイ（Roche Diagnostics, Kaiseraugst, Swit
hland ）を製造業者の教示に従って実施した。
icorアッセイ（Roche Diagnostics, Kaiseraugst, Swit
hland ）を製造業者の教示に従って実施した。
【００４５】実施例１：３′非コード領域由来のＨＣＶ
特異的逆転写プライマーのデザイン 次の実験は、ＨＣＶ特異的３′非コード領域プライマー
を使ってヒト血漿試料から誘導したＨＣＶ ＲＮＡの逆
転写の効率を調べるために行った。鋳型としてＨＣＶ
ＲＮＡを使って逆転写反応を開始させるのに、配列 5'-
AGGCCAGTATCAGCACTCTCTGCAGTC-3'〔配列番号１〕（57R2
7 と命名）を有するオリゴヌクレオチドプライマーを使
った。正プライマーとして5'-GGTGGCTCCATCTTAGCCCTAGT
CACG-3' 〔配列番号11〕（1F27と命名）を使いそして逆
プライマーとして57R27 を使って増幅を行った。
特異的逆転写プライマーのデザイン 次の実験は、ＨＣＶ特異的３′非コード領域プライマー
を使ってヒト血漿試料から誘導したＨＣＶ ＲＮＡの逆
転写の効率を調べるために行った。鋳型としてＨＣＶ
ＲＮＡを使って逆転写反応を開始させるのに、配列 5'-
AGGCCAGTATCAGCACTCTCTGCAGTC-3'〔配列番号１〕（57R2
7 と命名）を有するオリゴヌクレオチドプライマーを使
った。正プライマーとして5'-GGTGGCTCCATCTTAGCCCTAGT
CACG-3' 〔配列番号11〕（1F27と命名）を使いそして逆
プライマーとして57R27 を使って増幅を行った。
【００４６】反応により推定サイズのものである83ヌク
レオチド（nt）生成物が得られた。しかしながら、多重
逆転写／増幅反応、即ち内部陽性対照（ＩＰＣ）も更に
含む反応における57R27 の使用は、100 ntと70 nt の２
種類の非特異的（即ち非ＨＣＶ）生成物を与えた。
レオチド（nt）生成物が得られた。しかしながら、多重
逆転写／増幅反応、即ち内部陽性対照（ＩＰＣ）も更に
含む反応における57R27 の使用は、100 ntと70 nt の２
種類の非特異的（即ち非ＨＣＶ）生成物を与えた。
【００４７】実施例２：多重反応に使用される３′非コ
ードＨＣＶ逆転写プライマーの最適化 次の実験は、多重逆転写／増幅アッセイにおける57R27
から誘導したプライマーの使用を試験するために行っ
た。
ードＨＣＶ逆転写プライマーの最適化 次の実験は、多重逆転写／増幅アッセイにおける57R27
から誘導したプライマーの使用を試験するために行っ
た。
【００４８】実施例１に記載したように、ＩＰＣと複合
せしめた場合、57R27 逆プライマーは臭化エチジウム染
色すると70 bp の強いゲルバンドと100 bpの弱いゲルバ
ンドを含む２つの「副生成物」バンドを形成した。それ
らの副生成物バンドは優先的に形成され、その結果とし
てＨＣＶ生成物バンドが欠けていた。より厳密な分析に
より、57R27 プライマーとＩＰＣ逆プライマー間には強
力な相互作用があることが明らかになった。
せしめた場合、57R27 逆プライマーは臭化エチジウム染
色すると70 bp の強いゲルバンドと100 bpの弱いゲルバ
ンドを含む２つの「副生成物」バンドを形成した。それ
らの副生成物バンドは優先的に形成され、その結果とし
てＨＣＶ生成物バンドが欠けていた。より厳密な分析に
より、57R27 プライマーとＩＰＣ逆プライマー間には強
力な相互作用があることが明らかになった。
【００４９】この問題を解決するために、ＰＣＲ工程中
のＲＴプライマーとＰＣＲプライマーとの直接的競合を
なくすようなより小さい逆転写（ＲＴ）プライマーをデ
ザインした。これらの新規ＲＴプライマーは長さが８〜
16塩基であり、そしてそれらの３′末端が57R27 の３′
末端より下流になるようにデザインした。
のＲＴプライマーとＰＣＲプライマーとの直接的競合を
なくすようなより小さい逆転写（ＲＴ）プライマーをデ
ザインした。これらの新規ＲＴプライマーは長さが８〜
16塩基であり、そしてそれらの３′末端が57R27 の３′
末端より下流になるようにデザインした。
【００５０】これらのプライマーを次の通り試験した。
ＲＮＡ抽出と精製の後、それらのプライマーを使って逆
転写を行い、そして正プライマーとしての同プライマー
と27マーの逆プライマーを使ってＰＣＲを行った。
ＲＮＡ抽出と精製の後、それらのプライマーを使って逆
転写を行い、そして正プライマーとしての同プライマー
と27マーの逆プライマーを使ってＰＣＲを行った。
【００５１】この新デザインは４つの明らかな利点を有
した： 1) それらのプライマーのＴｍは27マーのＴｍより低
く、そのためそれらはＰＣＲ条件下でアニーリングと伸
長が起こりにくかった。 2) ＲＴプライマーの３′末端は27マーの３′末端の下
流であり、従って27マーと正確に同じ標的ＤＮＡと交差
反応を起こす可能性がなく、よってプライマー二量体の
形成をなくした。 3) 全ての遺伝子型を増幅させるためにはゲノム内の位
置が重要であり、そのためＨＣＶゲノム内の保存配列と
一致するように逆プライマーをデザインした。 4) 短鎖ＲＴプライマーを使った逆転写の後に多重ＰＣ
Ｒが可能であった。
した： 1) それらのプライマーのＴｍは27マーのＴｍより低
く、そのためそれらはＰＣＲ条件下でアニーリングと伸
長が起こりにくかった。 2) ＲＴプライマーの３′末端は27マーの３′末端の下
流であり、従って27マーと正確に同じ標的ＤＮＡと交差
反応を起こす可能性がなく、よってプライマー二量体の
形成をなくした。 3) 全ての遺伝子型を増幅させるためにはゲノム内の位
置が重要であり、そのためＨＣＶゲノム内の保存配列と
一致するように逆プライマーをデザインした。 4) 短鎖ＲＴプライマーを使った逆転写の後に多重ＰＣ
Ｒが可能であった。
【００５２】Ａ．12マープライマーの特徴づけ 最初に４つの短鎖ＲＴプライマー（12マー）をデザイン
し、そして対に組み合わせて試験した。目標は、(i) そ
れらが逆転写工程において使った組合せＲＴプライマー
または単一ＲＴプライマー間で生成するＰＣＲバンド強
度に何か差があるかどうか、そして(ii)それらの短鎖Ｒ
Ｔプライマーが互いに組み合わせて使用できるかどうか
を調べることであった。短鎖ＲＴプライマーを組み合わ
せて使用すれば、３′末端での不正対合（ミスマッチ）
を避けるという利点があるかもしれない。
し、そして対に組み合わせて試験した。目標は、(i) そ
れらが逆転写工程において使った組合せＲＴプライマー
または単一ＲＴプライマー間で生成するＰＣＲバンド強
度に何か差があるかどうか、そして(ii)それらの短鎖Ｒ
Ｔプライマーが互いに組み合わせて使用できるかどうか
を調べることであった。短鎖ＲＴプライマーを組み合わ
せて使用すれば、３′末端での不正対合（ミスマッチ）
を避けるという利点があるかもしれない。
【００５３】結果は、短鎖ＲＴプライマーを使うことに
何も悪影響がないことを示した。プライマーが２倍濃度
で使われていると思われるかもしれない場合でも（プラ
イマーが自分自身と共に使われている）、プライマーは
事実上は他のいずれのプライマーとも組み合わせること
なく標準濃度で使われている。
何も悪影響がないことを示した。プライマーが２倍濃度
で使われていると思われるかもしれない場合でも（プラ
イマーが自分自身と共に使われている）、プライマーは
事実上は他のいずれのプライマーとも組み合わせること
なく標準濃度で使われている。
【００５４】下記の第１表に示すように12マーＲＴプラ
イマーの対組合せを逆転写反応に使った。ＰＣＲは３′
ＮＣ領域プライマー 3x1F27 正プライマーと 3x57R27逆
プライマーそれぞれを使って行った（上記実施例１を参
照のこと）。ＨＣＶ標的は反応あたり50コピーで使用し
た。標準ＲＴ−ＰＣＲ条件を使用した。
イマーの対組合せを逆転写反応に使った。ＰＣＲは３′
ＮＣ領域プライマー 3x1F27 正プライマーと 3x57R27逆
プライマーそれぞれを使って行った（上記実施例１を参
照のこと）。ＨＣＶ標的は反応あたり50コピーで使用し
た。標準ＲＴ−ＰＣＲ条件を使用した。
【００５５】
【表１】
【００５６】3x84RTは単独で使っても3x76RTと組合せて
使っても逆転写できなかった。3x63RTに対して悪影響が
あるようにも見えた。3x66RTと3x63RTは両方とも良好に
逆転写を行い、生成した（臭化エチジウム染色した）Ｐ
ＣＲゲルバンドは、どのプライマー組合せを使用したか
に関係なく強力であった。12マーＲＴプライマーを組み
合わせることに何ら有利であるように見えなかった。
使っても逆転写できなかった。3x63RTに対して悪影響が
あるようにも見えた。3x66RTと3x63RTは両方とも良好に
逆転写を行い、生成した（臭化エチジウム染色した）Ｐ
ＣＲゲルバンドは、どのプライマー組合せを使用したか
に関係なく強力であった。12マーＲＴプライマーを組み
合わせることに何ら有利であるように見えなかった。
【００５７】Ｂ．プライマー濃度範囲：3x63RTと3x66RT
の両者を更なる試験のために選択した。逆転写反応に用
いる27マー（3x57RT）の場合の標準濃度は１ Ｍであっ
た。12マーは、それらが短鎖であるために、潜在的に27
マーほど効率的にはアニールし伸長しないようであり、
故に逆転写のためにより高い濃度が必要であると思われ
た。個別に１，２，３または４ Ｍ濃度で使用した時、
3x63RT, 3x66RTおよび27マーについての結果は濃度に関
係なく同等であった。標準プラクチスは、ＲＴ反応に12
マーを使用しそしてＰＣＲに正逆プライマーそれぞれと
して27マー（および3x1F27）を加えることであった。
の両者を更なる試験のために選択した。逆転写反応に用
いる27マー（3x57RT）の場合の標準濃度は１ Ｍであっ
た。12マーは、それらが短鎖であるために、潜在的に27
マーほど効率的にはアニールし伸長しないようであり、
故に逆転写のためにより高い濃度が必要であると思われ
た。個別に１，２，３または４ Ｍ濃度で使用した時、
3x63RT, 3x66RTおよび27マーについての結果は濃度に関
係なく同等であった。標準プラクチスは、ＲＴ反応に12
マーを使用しそしてＰＣＲに正逆プライマーそれぞれと
して27マー（および3x1F27）を加えることであった。
【００５８】Ｃ．試料処理の効果：12マー（3x66RT）逆
転写と27マー（3x57R27 ）逆転写を比較した。同様に、
逆転写プライマーとして12マーを使用した時、27マー正
プライマー（3x1F27）を対応するＰＣＲ中に使用した。
試料を様々な条件下に置き、生成する臭化エチジウム染
色ＰＣＲゲルバンドを比較して、いずれかの条件がゲル
バンドの質または強度に対して効果をもつかどうかを調
べた。
転写と27マー（3x57R27 ）逆転写を比較した。同様に、
逆転写プライマーとして12マーを使用した時、27マー正
プライマー（3x1F27）を対応するＰＣＲ中に使用した。
試料を様々な条件下に置き、生成する臭化エチジウム染
色ＰＣＲゲルバンドを比較して、いずれかの条件がゲル
バンドの質または強度に対して効果をもつかどうかを調
べた。
【００５９】ＲＮＡ調製段階の間に、氷冷イソプロパノ
ール（ＩＰＡ）を各試料試験管に添加し、試験管を室温
で２分間振盪した。−80℃で（ＩＰＡ中で）ＲＮＡを更
に沈澱させるか、または即座に室温で調製した。逆転写
反応を行う前に、ＲＮＡを完全ＲＴミックス中に再懸濁
し、そして氷上に置くかまたは室温に10分間置いた。
ール（ＩＰＡ）を各試料試験管に添加し、試験管を室温
で２分間振盪した。−80℃で（ＩＰＡ中で）ＲＮＡを更
に沈澱させるか、または即座に室温で調製した。逆転写
反応を行う前に、ＲＮＡを完全ＲＴミックス中に再懸濁
し、そして氷上に置くかまたは室温に10分間置いた。
【００６０】逆転写は37℃か42℃のいずれかの温度で行
った。増幅前に、ｃＤＮＡを完全ＰＣＲミックス中で室
温に4.5 時間置くか、または増幅反応を行う直前にｃＤ
ＮＡを添加した。
った。増幅前に、ｃＤＮＡを完全ＰＣＲミックス中で室
温に4.5 時間置くか、または増幅反応を行う直前にｃＤ
ＮＡを添加した。
【００６１】結果：12マーＲＴプライマー（3x66RT）
は、上述の条件のいずれの下でも良好に機能した。12マ
ーと27マーのＲＴプライマーは、バンド強度の点では同
等に見えたが、12マーの方が生成するＰＣＲバンドが単
一できれいなバンドであり、副生成物がないので、全体
的に優れていた。
は、上述の条件のいずれの下でも良好に機能した。12マ
ーと27マーのＲＴプライマーは、バンド強度の点では同
等に見えたが、12マーの方が生成するＰＣＲバンドが単
一できれいなバンドであり、副生成物がないので、全体
的に優れていた。
【００６２】実施例３：50コピー／反応でのＨＣＶ Ｒ
ＮＡの検出のための12マー逆転写プライマーの使用 次の実験は、異なる血清型のＨＣＶを含む患者試料中の
ＨＣＶを検出する前記12マープライマーの能力を試験す
るために行った。
ＮＡの検出のための12マー逆転写プライマーの使用 次の実験は、異なる血清型のＨＣＶを含む患者試料中の
ＨＣＶを検出する前記12マープライマーの能力を試験す
るために行った。
【００６３】遺伝子型決定した患者血清をRoche Monito
r アッセイにより定量し、反応あたり50コピーにまで系
列希釈した。改良Purescript法を使ってＲＮＡを抽出
し、そして3x63RTか3x66RT（12マー）プライマーを使っ
て逆転写反応を行った。ＰＣＲは、内部陽性対照プライ
マー（IPCF1 とIPCR1 ）と複合させて、3x57RT／3x1F27
（それぞれＨＣＶ逆プライマーと正プライマー）を使っ
て行った。12マーＲＴプライマーのいずれを使っても全
てのＲＮＡ遺伝子型が逆転写された。結果を下記の第２
表に示す。＋は陽性結果を示す。
r アッセイにより定量し、反応あたり50コピーにまで系
列希釈した。改良Purescript法を使ってＲＮＡを抽出
し、そして3x63RTか3x66RT（12マー）プライマーを使っ
て逆転写反応を行った。ＰＣＲは、内部陽性対照プライ
マー（IPCF1 とIPCR1 ）と複合させて、3x57RT／3x1F27
（それぞれＨＣＶ逆プライマーと正プライマー）を使っ
て行った。12マーＲＴプライマーのいずれを使っても全
てのＲＮＡ遺伝子型が逆転写された。結果を下記の第２
表に示す。＋は陽性結果を示す。
【００６４】
【表２】
【００６５】12マーＲＴプライマーを使用し、次いで複
合（３′ＮＣとＩＰＣ）ＰＣＲを行うと、ＨＣＶ遺伝子
型の高感度検出をもたらした。Roche Monitor （商標）
定量アッセイ（Roche Diagnostics, Kaiseraugst, Swit
zerland ）は50コピー／反応の遺伝子型１〜６を検出し
た。（遺伝子型５は反応あたり100 コピーでしか試験し
なかった。この遺伝子型のコピー数は終点希釈により決
定した。）
合（３′ＮＣとＩＰＣ）ＰＣＲを行うと、ＨＣＶ遺伝子
型の高感度検出をもたらした。Roche Monitor （商標）
定量アッセイ（Roche Diagnostics, Kaiseraugst, Swit
zerland ）は50コピー／反応の遺伝子型１〜６を検出し
た。（遺伝子型５は反応あたり100 コピーでしか試験し
なかった。この遺伝子型のコピー数は終点希釈により決
定した。）
【００６６】実施例４：13〜16ヌクレオチドプライマー
を使った感度の改良 次の実験は、短鎖逆転写プライマーを使ったＨＣＶの検
出を更に最適化するために行った。
を使った感度の改良 次の実験は、短鎖逆転写プライマーを使ったＨＣＶの検
出を更に最適化するために行った。
【００６７】改良Purescript法を使って一般ＨＣＶ陽性
血漿源からＲＮＡを調製した。次のプライマーのうちの
１つを使ってＲＴを行った：5'-GTATCAGCACTC-3'〔配列
番号２〕（66RT12と命名；ヌクレオチド66〜77に相当す
る）；並びに66RT12の延長形、即ち5'-AGTATCAGCACTC-
3' 〔配列番号３〕（66RT13）；5'-CAGTATCAGCACTC-3'
〔配列番号４〕（66RT14）；5'-CCAGTATCAGCACTC-3'
〔配列番号５〕（66RT15）；および5'-GCCAGTATCAGCACT
C-3'〔配列番号６〕（66RT16）。
血漿源からＲＮＡを調製した。次のプライマーのうちの
１つを使ってＲＴを行った：5'-GTATCAGCACTC-3'〔配列
番号２〕（66RT12と命名；ヌクレオチド66〜77に相当す
る）；並びに66RT12の延長形、即ち5'-AGTATCAGCACTC-
3' 〔配列番号３〕（66RT13）；5'-CAGTATCAGCACTC-3'
〔配列番号４〕（66RT14）；5'-CCAGTATCAGCACTC-3'
〔配列番号５〕（66RT15）；および5'-GCCAGTATCAGCACT
C-3'〔配列番号６〕（66RT16）。
【００６８】1F27および57R27 プライマーを使ってＰＣ
Ｒを行った。3x32R25 または3x30R25 プローブのいずれ
かを含むビーズ上にＰＣＲ生成物を通過させた。その結
果を陽性結果を与える試料の百分率として下記の第３表
に示す。
Ｒを行った。3x32R25 または3x30R25 プローブのいずれ
かを含むビーズ上にＰＣＲ生成物を通過させた。その結
果を陽性結果を与える試料の百分率として下記の第３表
に示す。
【００６９】
【表３】
【００７０】この表は、増加していくＲＴプライマー長
さを使用した時の％プローブ陽性結果を要約する。長さ
16ヌクレオチドまでのＲＴプライマーを逆転写反応に使
った時にコピー数感度の更なる改善が見られる。ＨＣＶ
標的を反応あたり３コピーで使用した時には感度の相違
が見られる。総括的考察として、14〜16マーをＲＴプラ
イマーとして使った場合に大きな感度が達成された。更
に、コピー数やＲＴプライマー長さに関係なく、副生成
物形成には有意な相違が見られなかった。感度に関して
は、わずかに長いＲＴプライマー（例えば14〜16マー）
を使って逆転写を開始させた時に３′ＮＣ増幅は一層感
受性であるだろう。この実験では、反応あたり50コピー
数では感度に相違がなかったが、３コピー数では相違が
観察され、長いＲＴプライマーがより大きいコピー数感
度を提供するようである。
さを使用した時の％プローブ陽性結果を要約する。長さ
16ヌクレオチドまでのＲＴプライマーを逆転写反応に使
った時にコピー数感度の更なる改善が見られる。ＨＣＶ
標的を反応あたり３コピーで使用した時には感度の相違
が見られる。総括的考察として、14〜16マーをＲＴプラ
イマーとして使った場合に大きな感度が達成された。更
に、コピー数やＲＴプライマー長さに関係なく、副生成
物形成には有意な相違が見られなかった。感度に関して
は、わずかに長いＲＴプライマー（例えば14〜16マー）
を使って逆転写を開始させた時に３′ＮＣ増幅は一層感
受性であるだろう。この実験では、反応あたり50コピー
数では感度に相違がなかったが、３コピー数では相違が
観察され、長いＲＴプライマーがより大きいコピー数感
度を提供するようである。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:93） (72)発明者 ケビン エム．ゴーマン アメリカ合衆国，ニューヨーク 14616, ロチェスター，コンラッド ドライブ 204
Claims (10)
- 【請求項１】 生物学的試料中のＣ型肝炎ウイルス（Ｈ
ＣＶ）ＲＮＡの逆転写方法であって、(a) 前記試料から
誘導されたＲＮＡを、１または複数のオリゴヌクレオチ
ドが前記ＲＮＡの少なくとも一部分に相補的なｃＤＮＡ
の合成を開始するような条件下で、前記１または複数の
オリゴヌクレオチドと接触させることを含んで成り、前
記オリゴヌクレオチドが (i) 5'-AGGCCAGTATCAGCACTCTCTGCAGTC-3' (57R27)〔配
列番号１〕， (ii) 5'-GTATCAGCACTC-3' (66RT12)〔配列番号２〕， (iii)5'-AGTATCAGCACTC-3' (66RT13) 〔配列番号３〕， (iv) 5'-CAGTATCAGCACTC-3' (66RT14)〔配列番号４〕， (v) 5'-CCAGTATCAGCACTC-3' (66RT15) 〔配列番号
５〕， (vi) 5'-GCCAGTATCAGCACTC-3' (66RT16)〔配列番号６〕
および (vii) 前記のものの任意組合せから成る群より選ばれる
ことを特徴とする方法。 - 【請求項２】 前記試料が血液、血清、血漿、唾液およ
び脳脊髄液から成る群より選ばれる、請求項１に記載の
方法。 - 【請求項３】 (b) 前記ｃＤＮＡを回収することを更に
含んで成る、請求項１に記載の方法。 - 【請求項４】 生物学的試料中のＣ型肝炎ウイルス（Ｈ
ＣＶ）ＲＮＡの存在の検出方法であって、(a) 鋳型とし
て前記試料から誘導されたＲＮＡを使用しそしてプライ
マーとして前記ＲＮＡ中に含まれる配列に相補的なオリ
ゴヌクレオチドを使用して逆転写反応を行うことによ
り、ＨＣＶ特異的逆転写生成物を生成させ、前記プライ
マーが (i) 5'-AGGCCAGTATCAGCACTCTCTGCAGTC-3' (57R27)〔配
列番号１〕， (ii) 5'-GTATCAGCACTC-3' (66RT12)〔配列番号２〕， (iii)5'-AGTATCAGCACTC-3' (66RT13) 〔配列番号３〕， (iv) 5'-CAGTATCAGCACTC-3' (66RT14)〔配列番号４〕， (v) 5'-CCAGTATCAGCACTC-3' (66RT15) 〔配列番号
５〕， (vi) 5'-GCCAGTATCAGCACTC-3' (66RT16)〔配列番号６〕
および (vii) 前記のものの任意組合せから成る群より選ばれ； (b) 前記逆転写反応の生成物を増幅させることにより増
幅生成物を生成させ；そして (c) 前記増幅生成物を検出することを含んで成り、前記
増幅生成物の検出が前記試料中のＨＣＶ ＲＮＡの存在
を示すことを特徴とする方法。 - 【請求項５】 前記試料が血液、血清、血漿、唾液およ
び脳脊髄液から成る群より選ばれる、請求項４に記載の
方法。 - 【請求項６】 前記増幅が、ポリメラーゼ連鎖反応、リ
ガーゼ連鎖反応、鎖置換反応、核酸一塩基置換および転
写媒介増幅から成る群より選ばれた方法により行われ
る、請求項４に記載の方法。 - 【請求項７】 前記検出が、アガロースゲル電気泳動、
アクリルアミドゲル電気泳動、比色検出、ＥＣｉ検出、
蛍光検出、放射性同位体検出および化学発光検出から成
る群より選ばれた方法により行われる、請求項４に記載
の方法。 - 【請求項８】 次のオリゴヌクレオチド： 5'-AGGCCAGTATCAGCACTCTCTGCAGTC-3' (57R27) 〔配列番
号１〕， 5'-GTATCAGCACTC-3' (66RT12) 〔配列番号２〕， 5'-AGTATCAGCACTC-3' (66RT13)〔配列番号３〕， 5'-CAGTATCAGCACTC-3' (66RT14) 〔配列番号４〕， 5'-CCAGTATCAGCACTC-3' (66RT15)〔配列番号５〕および 5'-GCCAGTATCAGCACTC-3' (66RT16) 〔配列番号６〕 から成る群より選ばれたオリゴヌクレオチド。 - 【請求項９】 次のオリゴヌクレオチド： 5'-AGGCCAGTATCAGCACTCTCTGCAGTC-3' (57R27) 〔配列番
号１〕， 5'-GTATCAGCACTC-3' (66RT12) 〔配列番号２〕， 5'-AGTATCAGCACTC-3' (66RT13)〔配列番号３〕， 5'-CAGTATCAGCACTC-3' (66RT14) 〔配列番号４〕， 5'-CCAGTATCAGCACTC-3' (66RT15)〔配列番号５〕および 5'-GCCAGTATCAGCACTC-3' (66RT16) 〔配列番号６〕 から成る群より選ばれたＨＣＶ特異的逆転写プライマ
ー。 - 【請求項１０】 生物学的試料中のＨＣＶの検出用のキ
ットであって、 (i) 5'-AGGCCAGTATCAGCACTCTCTGCAGTC-3' (57R27)〔配
列番号１〕， (ii) 5'-GTATCAGCACTC-3' (66RT12)〔配列番号２〕， (iii)5'-AGTATCAGCACTC-3' (66RT13) 〔配列番号３〕， (iv) 5'-CAGTATCAGCACTC-3' (66RT14)〔配列番号４〕， (v) 5'-CCAGTATCAGCACTC-3' (66RT15) 〔配列番号
５〕， (vi) 5'-GCCAGTATCAGCACTC-3' (66RT16)〔配列番号６〕
および (vii) 前記のものの任意組合せ から成る群より選ばれた１または複数の逆転写プライマ
ーを含んで成るキット。
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