JP2000338106A - 免疫反応による発色画像の処理定量方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】 発色像のバックグラウンドの影響を除去し、
色調の異なるラベル物質による発色像であっても正確に
処理定量可能とし、画像解析による凝集像の自動判定に
ついても応用可能で廉価なシステム構成を可能としたイ
ムノクロマトグラフィ又はイムノコンセントレーション
における発色画像の処理定量方法を提供する。 【解決手段】 試料検体を免疫反応におけるラベル物質
を有する発色デバイス上に滴下し、発色像を形成させ、
発色像を画像データとしてフルカラーで取り込み、画像
データの解析範囲を指定する。解析範囲の生データの三
原色のピクセル値の列平均値を算出し、各ピクセル値の
列平均の移動平均値を求め、移動平均値から発色の最小
ピクセル値を算出する。最小ピクセル値に対して、発色
像のバックグラウンドの補正を行ない、補正工程後のピ
クセル値と、既知濃度の検体との関係を示す検量線から
未知濃度の試料検体の濃度を求める。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、試料検体、例え
ば、便中のヒトヘモグロビンをイムノクロマトグラフィ
（Immuno Chromatography ：以下ＩＣＧ法ということが
ある）またはイムノコンセントレーション（Immuno Con
centration）の免疫反応によって定量するにあたり、イ
ムノクロマトグラフィにおけるニトロセルロース支持体
（以下ＩＣＧシートということがある）またはイムノコ
ンセントレーションにおけるフロースルーデバイス上に
形成される発色像を画像処理することによって行なう方
法及び装置に関する。

【０００２】

【関連技術】イムノクロマトグラフィは、抗原抗体反応
の高い特異性と検出感度を利用して抗原または抗体を定
量する方法として知られるイムノアッセイ（Immunoassa
y ：免疫定量法）をクロマトグラフィに応用したもので
あり、ラテラルフローアッセイとも呼ばれる。このＩＣ
Ｇ法は、検出すべき検体と特異的に反応する物質（ラベ
ル物質）を固相化したＩＣＧシートを用いる検体の濃度
測定方法である。

【０００３】例えば、便中ヒトヘモグロビン（以下Ｈｂ
ということがある）の測定をＩＣＧ法で行なう場合につ
いて、図２３及び図２４を参照して説明する。ニトロセ
ルロース支持体１２の一端部分の標識部位１６にラテッ
クス粒子標識抗ヒトヘモグロビン抗体（以下抗Ｈｂとい
うことがある）を固相化し、また他端部分の測定バンド
２０に抗Ｈｂ２２を固相化してＩＣＧシート１４を作成
する。

【０００４】このＩＣＧシート１４の一端部に試料検体
２４を加えると該試料検体２４は該ＩＣＧシート１４に
沿って他端方向に移行し、測定バンド２０において試料
検体２４中のＨｂ２６と抗Ｈｂ２２とラテックス粒子標
識抗Ｈｂ１８との測定複合体２８が形成される。この測
定複合体２８が形成されると、該測定バンド２０に形成
された測定複合体２８が発色するため該測定バンド２０
には発色像が形成されることとなる。この測定バンド２
０における発色の有無でヒトヘモグロビンの有無の判定
を行なう。

【０００５】つまり、ＩＣＧシート１４の測定バンド２
０での発色がない場合には、陰性と判断し、発色した場
合は、陽性と判断される。Ｈｂ２６の量が多い程発色濃
度が濃くなる。ラテックス粒子標識抗Ｈｂ１８に用いら
れるラテックス粒子が着色されているためにその着色さ
れた色が測定複合体２８の形成により集合して発色する
こととなる。

【０００６】ラテックス粒子は所望の色に着色すること
ができるが、通常は判定が容易なように、赤や青等の原
色が用いられる。図示の例では赤色に着色したラテック
ス粒子を用いた場合について説明した。また、上記ラテ
ックス粒子に代えて金コロイド粒子が用いられることも
ある。

【０００７】図２３及び図２４において、３０は上記測
定バンド２０の外側に設けられたコントロールバンドで
ある。該コントロールバンド３０には抗ウサギＩｇＧ３
２が固相化されている。この場合、ニトロセルロース支
持体１２の標識部位１６には、前記したラテックス粒子
標識抗Ｈｂ１８とともにラテックス粒子標識ウサギＩｇ
Ｇ３４が固相化される。

【０００８】このように構成したＩＣＧシート１４の一
端部に試料検体２４を加えると、該ラテックス粒子標識
ウサギＩｇＧ３４が該ＩＣＧシート１４に沿って他端方
向に移行し、コントロールバンド３０において抗ウサギ
ＩｇＧ３２とラテックス粒子標識ウサギＩｇＧ３４との
コントロール複合体３６が形成され、前記した測定複合
体２８とは異なる発色（図示の例では青色）を行なう。

【０００９】このコントロール複合体３６の発色によ
り、試料検体２４が間違いなくＩＣＧシート１４上に添
加されたかを確認することができる。したがって、陰
性、陽性の判定パターンは次の３種類となる。陰性：
赤色無、青色有。陽性：赤色有、青色有。判定不
能：赤色無、青色無。従来はこの判定を目視によって行
なっていたがヒトヘモグロビン量の正確な値を測定する
ことは不可能であった。

【００１０】このような、イムノクロマトグラフィ（ラ
テラルフローアッセイ）は、特開平１０−１６０７３６
号公報などに開示されている。

【００１１】また、イムノコンセントレーションは、微
孔質メンブレン上で行われるイムノアッセイであり、ア
ッセイ工程が、順次に各工程の液層を次の工程の開始前
にメンブレンに導通しながら行われることから、フロー
スルーアッセイとも呼ばれる。

【００１２】例えば、血清中の効ガラクトース欠損Ｉｇ
Ｇ抗体の検出をイムノコンセントレーションで行なう場
合について、図２５を参照して説明する。メンブレン４
４上にガラクトース欠損ＩｇＧ６６（抗原）を固相化
し、メンブレン４４の直下に吸収体４６を配置してフロ
ースルーデバイス４０を作成する。

【００１３】上記メンブレン４４としては、ポリカーボ
ネート、ニトロセルロースおよびナイロンなどの薄膜が
用いられる。

【００１４】メンブレン４４上に血清を滴下すると、メ
ンブレン４４上に固定化されたガラクトース欠損ＩｇＧ
６６（抗原）と血清中のガラクトース欠損ＩｇＧ抗体６
２（各種免疫グロブリンクラスの効ガラクトース欠損Ｉ
ｇＧ抗体）が結合する。この際、血清中のその他の成分
はメンブレンを通過して吸収体４６に吸収される。

【００１５】その後、検出試薬であるレクチン（ＲＣＡ
１２０）感作ラテックス６８を含んだ溶液を添加し、抗
原と結合した抗体の糖鎖に存在するガラクトース残基６
４にレクチン（ＲＣＡ１２０）感作ラテックス６８を結
合させ、該ラテックスの色調に対応する色の発色像８０
をメンブレン上に形成せしめる。

【００１６】また必要な場合には、バックグラウンドを
軽減するための洗浄溶液（界面活性剤）をさらに添加す
ることで、メンブレン上の未反応の検出試薬を洗浄除去
することもできる。

【００１７】このメンブレン上の発色像８０により、陰
性、陽性の判定をすることができる。陰性：発色無。
陽性：発色有。従来はこの判定を目視によって行なっ
ていたが、検出すべき抗体の正確な値を測定すること
は、上述したＩＣＧ法の場合と同様に不可能であった。

【００１８】このような、イムノコンセントレーション
（フロースルーアッセイ）としては、米国特許第４６３
２９０１号明細書、特開平４−２１６４６８号公報、特
開平６−２６１７９７号公報などが知られている。

【００１９】一方、ニトロセルロースのような薄い膜、
濾紙及びメンブレン等で分画された蛋白等の濃淡を測定
する比色定量法として、デンシトメトリーが知られてい
る。このデンシトメトリーは、ヒト血清全体の蛋白分画
のパターンを測定する研究的要素の高い方法であるが、
近年この原理を応用して臨床試薬の測定に用いられてい
る。

【００２０】そこで、本発明者は、上記したイムノクロ
マトグラフィ法またはイムノコンセントレーション法に
おける目視判定の不正確を解消すべく、この判定に対し
てデンシトメーターを利用したデンシトメトリーが適用
できないかについて検討した。

【００２１】しかし、本発明者の検討によれば、デンシ
トメトリーは、次のような欠点を有しているので、上記
した判定に用いるには不適当であった。デンシトメー
ターは汎用機であるため、ベースラインの設定や各種計
測条件の設定をユーザーが設定しなければならない。
測定感度が良好でない。計測バンドをそのまま輪切りに
した計測方法のため、ＩＣＧ法に付随する計測誤差（試
薬・検体の拡散速度の不均一、シートのバラツキ等によ
る）を同時に計測データとしてしまう。測定可能な濃
度範囲が狭く限定されてしまう。測定値を算出するま
でに時間がかかるので多数検体処理が難かしい。測定時
間は、１検体あたり３〜５分が必要である。ＣＣＤカ
メラ、ビデオカメラを使用するので小型軽量化するのが
難かしくコストが高くなってしまう。

【００２２】そこで本発明者は、既に、上記したＩＣＧ
法の判定方法については、デンシトメトリー以外の方法
で、免疫反応における定量化測定システムの構築を可能
とし、しかも画像入力装置、表計算ソフト、コンピュー
タ等の市販品の若干の改造で、上記定量化測定システム
は利用できるため、コスト低減を図ることができ、抗原
−抗体反応や酵素−基質反応における反応の極大値及び
収束についてのデータ解析が容易となり、従来から画像
解析により行なっていた凝集像の自動判定についても応
用可能で、この分野においても廉価なシステム構成を可
能としたＩＣＧ法による検体の画像処理定量方法を提案
している。（特開平１０−２７４６５３号公報参照）。

【００２３】しかしながら、イムノクロマトグラフィま
たはイムノコンセントレーションによる免疫反応におい
て、その測定対象には、便中ヒトヘモグロビン以外にも
尿、血液（血清、血漿）または体液（脳液、髄液、腹水
等）等があるが、これらの検体には検体自体にそれぞれ
特有の色調がある場合がある。例えば、緑便と呼ばれる
緑色がかった便検体や、血漿検体の場合は溶血の影響
や、喀痰検体の場合は残留食物色素の影響などによる色
調である。このような検体の色調は、イムノクロマトグ
ラフィまたはイムノコンセントレーションによる免疫反
応を展開させた上での発色像のバックグラウンド（背景
色）となり、発色像の色調に影響を与える。

【００２４】例えば、試料検体が緑便（緑色がかった
便）であり、赤色に着色したラテックス粒子をラベル物
質として、免疫反応により発色せしめた場合、バックグ
ラウンドとなる該試料検体の緑色（ＲＧＢ＝０：２５
５：０）は、ラベル物質の赤色（ＲＧＢ＝２５５：０：
０）と補色に近い関係となるために、発色像は赤色では
なく黒色（ＲＧＢ＝０：０：０）に近くなってしまった
り、バックグラウンドの緑色が多い場合には、発色部位
全体が緑色を帯びてしまい赤色の発色像が判別できない
ことがある。

【００２５】また、イムノクロマトグラフィまたはイム
ノコンセントレーションによる免疫反応に用いられるラ
ベル物質は、近年多様化しており、ラテックス、金、
銀、鉄、セレニュウム、硫黄、テルニウム、炭素、染料
嚢、酸素、酸素−染料複合などがある。これらラベル物
質はそれぞれに色調が異なっている。特にラテックスな
どは着色自在であり、また金コロイドなどはその粒子径
によっても色調が異なる。そのため、どの色成分を捉え
て測定するかによって測定値は大きく異なる。

【００２６】上記従来技術の画像処理定量方法では、画
像入力装置から可視領域の光を取り込み、すべて色情報
を取り込んでいる。これは光の三原色Ｒ、Ｇ、Ｂの数値
で表される色情報である。この色情報には、上述したバ
ックグラウンド（背景色）や、ラベル物質自体の色調が
混色されているが、上記従来技術では、色情報に対する
これらの影響は考慮されていない。

【００２７】そのため、上記従来技術では、次のような
問題が生じている。バックグラウンド（背景色）の影
響で発色像の色調が変色または消失し、測定すべき色成
分を正確に測定することができない。多様化したラベ
ル物質や着色自在なラベル物質による発色像の濃度を測
定する場合には、どの色成分を捉えて測定するかで測定
値が大きく異なる。したがって、バックグラウンドを
有し且つ色調の異なるラベル物質による発色像を正確に
処理定量することは困難である。

【００２８】

【発明が解決しようとする課題】本発明者は、免疫反応
による発色画像の処理定量方法について、さらなる改良
を行なうべく、鋭意研究を重ねた結果、本発明に到達し
たものである。

【００２９】本発明は、免疫反応、特にイムノクロマト
グラフィまたはイムノコンセントレーションにおける発
色画像の処理定量方法において、バックグラウンド（背
景色）を有する発色像であっても該バックグラウンドの
影響を除去して測定可能で、また、ラベル物質の多様化
に伴うラベル物質自体の色調の違いによっても測定すべ
き色成分を捉えて測定可能で、さらに、バックグラウン
ドを有し且つ色調の異なるラベル物質による発色像であ
っても正確に処理定量可能とし、さらにまた、従来から
画像解析により行なっていた凝集像の自動判定について
も応用可能で、しかも、従来装置に対して新たな設備を
追加することなく導入可能であり、廉価なシステム構成
を可能とした免疫反応における発色画像の処理定量方法
を提供することを目的とする。

【００３０】

【課題を解決するための手段】上記課題を解決するため
に、本発明の免疫反応による検体の画像処理定量方法の
第１の態様は、（１）試料検体を免疫反応におけるラベ
ル物質を有する発色デバイス上に滴下し、該発色デバイ
ス上に発色像を形成させる工程と、（２）該発色像を画
像データとしてフルカラーで取り込む工程と、（３）取
り込んだ画像データの解析範囲を指定する工程と、
（４）該解析範囲の生データの三原色のピクセル値の列
平均値を算出し、各ピクセル値の列平均の移動平均値を
求める工程と、（５）上記（４）工程で得られた移動平
均値から発色の最小ピクセル値を算出する工程と、
（６）前記最小ピクセル値に対して、前記発色像のバッ
クグラウンドの補正を行う工程と、（７）上記補正工程
（６）後のピクセル値と、既知濃度の検体との関係を示
す検量線から未知濃度の試料検体の濃度を求める工程と
からなることを特徴とする。

【００３１】本発明の免疫反応による検体の画像処理定
量方法の第２の態様は、（１）試料検体を免疫反応にお
けるラベル物質を有する発色デバイス上に滴下し、該発
色デバイス上に発色像を形成させる工程と、（２）該発
色像を画像データとしてフルカラーで取り込む工程と、
（３）取り込んだ画像データの解析範囲を指定する工程
と、（４）該解析範囲の生データの三原色のピクセル値
の列平均値を算出し、各ピクセル値の列平均の移動平均
値を求める工程と、（５）上記（４）工程で得られた移
動平均値から発色の最小ピクセル値を算出する工程と、
（６′）前記ラベル物質の色の特徴を捉えて三原色の利
用する割合を決定し、前記最小ピクセル値に対して補正
を行う工程と、（７′）上記補正工程（６′）後のピク
セル値と、既知濃度の検体との関係を示す検量線から未
知濃度の試料検体の濃度を求める工程とからなることを
特徴とする。

【００３２】本発明の免疫反応による検体の画像処理定
量方法の第３の態様は、（１）試料検体を免疫反応にお
けるラベル物質を有する発色デバイス上に滴下し、該発
色デバイス上に発色像を形成させる工程と、（２）該発
色像を画像データとしてフルカラーで取り込む工程と、
（３）取り込んだ画像データの解析範囲を指定する工程
と、（４）該解析範囲の生データの三原色のピクセル値
の列平均値を算出し、各ピクセル値の列平均の移動平均
値を求める工程と、（５）上記（４）工程で得られた移
動平均値から発色の最小ピクセル値を算出する工程と、
（６′）前記ラベル物質の色の特徴を捉えて三原色の利
用する割合を決定し、前記最小ピクセル値に対して補正
を行う工程と、（６）前記最小ピクセル値に対して、前
記発色像のバックグラウンドの補正を行う工程と、
（７″）上記（６′）および（６）補正工程後のピクセ
ル値と、既知濃度の検体との関係を示す検量線から未知
濃度の試料検体の濃度を求める工程とからなることを特
徴とする。

【００３３】前記工程（６）としては、（イ）ラベル物
質と等色の色見本を画像データとして、コンピュータに
フルカラーで取り込むステップと、（ロ）該取り込んだ
画像データの発色部位の解析範囲を指定するステップ
と、（ハ）該解析範囲の生データの三原色のピクセル値
の列平均を算出し、各ピクセル値の列平均の移動平均値
を求めるステップと、（ニ）上記ステップ（ハ）で得ら
れた移動平均値の平均値を求めるステップと、（ホ）色
見本としてカラーチャートを用いて階調に変化した既知
画像を上記ステップ（イ）〜（ニ）により処理加工し、
三原色それぞれについての平均値を算出するステップ
と、（ヘ）バックグラウンドに相当する色の色見本を画
像として取り込み、既知のバックグラウンド画像とする
ステップと、（ト）上記ステップ（イ）とステップ
（ヘ）で得られた画像を合成し、既知濃度であり且つバ
ックグランドを持つ試料画像とするステップと、（チ）
該試料画像について、上記ステップ（イ）〜（ト）を繰
り返すことにより、バックグラウンドのある段階濃度の
試料として作成し検量線とするステップと、（リ）上記
ステップ（ヘ）で得られたバックグラウンド画像の三原
色の値と、上記ステップ（チ）で得られた検量線の傾き
とを重回帰分析し、切片と係数を計算するステップと、
（ヌ）未知濃度の検体を測定して得られる上記ステップ
（ハ）で算出された移動平均値の最小ピクセル値に対し
て、上記ステップ（リ）で得られた切片と係数により、
バックグラウンドの補正を行うステップとから構成する
のが好適である。

【００３４】前記工程（６′）としては、（イ）ラベル
物質と等色の色見本を画像データとしてコンピュータに
フルカラーで取り込むステップと、（ロ）該取り込んだ
画像データの発色部位の解析範囲を指定するステップ
と、（ハ）該解析範囲の生データの三原色のピクセル値
の列平均値を算出し、各ピクセル値の列平均の移動平均
値を求めるステップと、（ニ）上記ステップ（ハ）で得
られた移動平均値の平均値を算出するステップと、
（ホ）色見本としてカラーチャートを用いて階調に変化
した既知濃度の画像を上記ステップ（イ）〜（ニ）によ
り処理加工し、三原色の平均値を算出するステップと、
（ヘ′）上記ステップ（イ）〜（ニ）を繰り返すことに
より、既知の段階濃度の試料とするステップと、
（ト′）上記ステップ（ヘ′）で得られた段階濃度の画
像の三原色の値と、上記ステップ（ヘ′）で得られた既
知の段階濃度（アミ点濃度）を従属変数とし、そのとき
Ｒ、Ｇ、Ｂ値を独立変数として重回帰分析し、切片と
Ｒ、Ｇ、Ｂ値の係数を算出することにより、当該ラベル
物質の発色の特徴を捉えて三原色の利用すべき割合を決
定し、前記最小ピクセル値に対して補正を行うステップ
とから構成するのが好適である。

【００３５】前記ラベル物質としては、ラテックス、
金、銀、鉄、セレニュウム、硫黄、テルニウム、炭素、
染料嚢、酸素または酸素−染料複合等を用いることがで
きる。

【００３６】本発明方法は、免疫反応における発色が、
イムノクロマトグラフィまたはイムノコンセントレーシ
ョンによって行われる場合に特に好ましいものである。

【００３７】前記試料検体としては、便、尿、喀痰、血
液（血清、血漿）または体液（脳液、髄液、腹水）など
を用いることができる。また、バックグラウンドに相当
する色としては、試料検体が緑便であれば緑便相当色を
用いることとなる。血漿献体を用いる場合には溶血の影
響、喀痰献体の場合には残留食物色素の影響が考えられ
るので、これらについても応用可能である。

【００３８】本発明装置は、画像入力装置と、データ解
析部と、出力装置とからなり、上述した免疫反応による
発色画像の処理定量方法を実施するものである。

【００３９】

【発明の実施の形態】以下に本発明の実施の形態を添付
図面に基づいて説明する。図１は本発明方法の第１の態
様の手順を示すフローチャートであり、図２は本発明方
法の第２の態様の手順を示すフローチャートであり、図
３は本発明方法の第３の態様の手順を示すフローチャー
トである。また、図４は本発明方法の補正工程（６）の
手順を示すフローチャートであり、図５は本発明の補正
工程（６′）の手順を示すフローチャートである。

【００４０】図６は本発明方法を実施するための装置の
基本的な機器の設置例を示すブロック図であり、図７は
発色デバイスとしてのＩＣＧシートを示す基本構成図で
あり、図８は発色デバイスとしてのフロースルーデバイ
スを示す基本構成図である。

【００４１】図９はイエロー８０％、シアン４０％の下
地に、マゼンダを０〜１００％まで階調変化させた色見
本画像である。図１０は、図９の色見本画像においてマ
ゼンダが０％（Ｍ０）の画像がバックグラウンドである
ので、Ｍ０％の画像をコンピュータ上で切り取りＭ０〜
Ｍ１００％の画像の下に貼り付けてバックグラウンドの
ある色見本画像としたものである。

【００４２】本発明方法を実施するための装置は、図６
に示すごとく、画像入力装置５０、例えばイメージスキ
ャナーやＣＣＤカメラ／ビデオカメラと、パーソナルコ
ンピュータから構成されるデータ解析部５２と、プリン
ター５４やディスプレイ５６から構成される出力装置を
有している。なお、画像データとしては、画像入力装置
５０によって予め入力された画像データを収容するハー
ドディスクやその他のメディアを利用することもでき
る。

【００４３】本発明方法の第１の態様は、図１に示した
ごとく、工程（１）〜工程（７）によって構成される。
工程（１）においては、前述した従来のイムノクロマト
グラフィまたはイムノコンセントレーションによる免疫
反応と同様に、試料検体を発色デバイス上に滴下し、該
発色デバイス上に発色像を形成せしめる。

【００４４】試料検体としては、便、尿、喀痰、血液
（血清、血漿）または体液（脳液、髄液、腹水）などを
用いることができる。この試料検体は緑便などのように
検体自体に特有の色を有するものであってよい。

【００４５】ラベル物質としては、ラテックス、金、
銀、鉄、セレニュウム、硫黄、テルニウム、炭素、染料
嚢、酸素または酸素−染料複合などを用いることができ
る。

【００４６】発色デバイスとしては、イムノクロマトグ
ラフィにおけるＩＣＧシートまたはイムノコンセントレ
ーションにおけるフロースルーデバイスを用いることが
できる。

【００４７】工程（２）においては、発色デバイス上に
形成された発色像を画像入力装置５０、例えばイメージ
スキャナーを用いてフルカラーの画像データとして取り
込む。この画像データは、各ピクセル値の生データとし
て表示される。

【００４８】工程（３）においては、取り込んだ画像デ
ータの解析範囲についての指定を数値またはマウス等で
指定することによって行なう。また、取り込む画像の行
列間隔が均一なら自動指定を使用することもできる。

【００４９】工程（４）においては、解析範囲の生デー
タの三原色のピクセル値について列平均値を算出し、各
ピクセル値の列平均の移動平均値を求める。

【００５０】工程（５）においては、上記（４）工程で
得られた移動平均値から発色の最小ピクセル値を算出す
る。

【００５１】工程（６）においては、前記最小ピクセル
値に対して、前記発色像のバックグラウンドの補正を行
う。当該バックグラウンド補正の手順については後述す
る。

【００５２】工程（７）においては、上記バックグラウ
ンドの補正工程後のピクセル値と、既知濃度の検体との
関係を示す検量線から、未知濃度の試料検体の濃度を求
めることができる。

【００５３】本発明方法の第２の態様は、図２に示した
ごとく、工程（１）〜工程（７′）によって構成され
る。図２において、工程（１）〜（５）は図１に示した
本発明の第１の態様の場合と同様であるので、再度の説
明は省略する。

【００５４】工程（６′）においては、前記ラベル物質
の色の特徴を捉えて三原色の利用する割合を決定し、前
記最小ピクセル値に対して補正を行う。当該三原色の利
用割合の補正の手順については後述する。

【００５５】工程（７′）においては、上記補正工程
（６′）後のピクセル値と、既知濃度の検体との関係を
示す検量線から未知濃度の試料検体の濃度を求めること
ができる。

【００５６】本発明方法の第３の態様は、図３に示した
ごとく、工程（１）〜工程（７″）によって構成され
る。図３において、工程（１）〜（６′）および（６）
は図１及び図２に示した本発明の第１及び第２の態様の
場合と同様であるので、再度の説明は省略する。

【００５７】工程（７″）においては、上記（６′）お
よび（６）補正工程後のピクセル値と、既知濃度の検体
との関係を示す検量線から未知濃度の試料検体の濃度を
求めることができる。

【００５８】上記バックグランドの補正工程（６）は、
図４に示したごとく、ステップ（イ）〜（ヌ）によって
構成される。ステップ（イ）においては、ラベル物質と
等色の色見本を画像データとして、コンピュータにフル
カラーで取り込む。色見本としては、市販のカラーチャ
ートを用いて、ラベル物質と等色な色を選択する。

【００５９】ステップ（ロ）においては、上記取り込ん
だ画像データの発色部位の解析範囲を指定を数値または
マウス等で指定することによって行なう。

【００６０】ステップ（ハ）においては、上記指定され
た解析範囲の生データの三原色のピクセル値の列平均を
算出し、各ピクセル値の列平均の移動平均値を求める。

【００６１】ステップ（ニ）においては、上記求められ
た移動平均値の平均値を求める。

【００６２】ステップ（ホ）においては、色見本として
カラーチャートを用いて階調に変化した既知画像を上記
ステップ（イ）〜（ニ）により処理加工し、三原色それ
ぞれについての平均値を算出する。カラーチャートとし
ては市販のものが利用できるが、１０段階程度に階調変
化しているものが好ましい。また、ラベル物質自体を１
０段階程度に希釈して、希釈系列の色見本とすることも
できる。

【００６３】ステップ（ヘ）においては、便検体の中で
緑便相当色の色見本を画像として取り込み、既知のバッ
クグラウンド画像とする。

【００６４】ステップ（ト）においては、上記ステップ
（イ）とステップ（ヘ）で得られた画像を合成し、既知
濃度であり且つバックグランドを持つ試料画像とする。

【００６５】ステップ（チ）においては、上記ステップ
（ト）で得られた試料画像について、上記ステップ
（イ）〜（ト）を繰り返すことにより、バックグラウン
ドのある段階濃度の試料として作成し検量線とする。

【００６６】ステップ（リ）においては、上記ステップ
（ヘ）で得られたバックグラウンド画像の三原色の値
と、上記ステップ（チ）で得られた検量線の傾きとを重
回帰分析し、切片と係数を計算する。

【００６７】ステップ（ヌ）においては、未知濃度の検
体を測定して得られる上記ステップ（ハ）で算出された
移動平均値の最小ピクセル値に対して、上記ステップ
（リ）で得られた切片と係数により、バックグラウンド
の補正を行うことができる。

【００６８】上記三原色の利用割合の補正工程（６′）
は、図５に示したごとく、ステップ（イ）〜（ト′）に
よって構成される。図５において、ステップ（イ）〜
（ホ）は図４に示した本発明の補正工程（６）の場合と
同様であるので、再度の説明は省略する。

【００６９】ステップ（ヘ′）においては、上記ステッ
プ（イ）〜（ニ）を繰り返すことにより、既知の段階濃
度の試料とする。

【００７０】ステップ（ト′）においては、上記ステッ
プ（ヘ′）で得られた段階濃度の画像の三原色の値と、
上記ステップ（ヘ′）で得られた既知の段階濃度（アミ
点濃度）を従属変数とし、そのときＲ、Ｇ、Ｂ値を独立
変数として重回帰分析し、切片とＲ、Ｇ、Ｂ値の係数を
算出することにより、当該ラベル物質の発色の特徴を捉
えて三原色の利用すべき割合を決定し、前記最小ピクセ
ル値に対して補正を行うことができる。

【００７１】

【実施例】以下に本発明方法の実施例を挙げてさらに具
体的に説明するが、これらの実施例は例示的に示される
もので限定的に解釈すべきでないことはいうまでもな
い。

【００７２】本実施例における使用機器は、データ解析
部として、パーソナルコンピュータ：ＦＭＶ−ＤＥＳＫ
ＰＯＷＥＲ ＳＰ（富士通株式会社製）、画像入力装
置として、イメージスキャナー：ＳＣＡＮＭＡＫＥＲ
Ｘ６（日本マイクロテック株式会社製）、出力装置とし
て、上記パーソナルコンピュータに備えられたディスプ
レイを用いた。また、色見本として、ＤＩＣカラーチャ
ート（大日本インキ化学工業株式会社製）を用いた。

【００７３】（実施例１）バックグラウンドの補正の方
法 実施方法： 便検体の色として、緑便相当の色をカラーチャートか
らさがす。 シアンが６０％、イエローが８０％の場合を緑便のバ
ックグラウンドとして、そのときのマゼンダのアミ点濃
度０〜１００％（０，１０，２０，３０，４０，５０，
６０，７０，８０，９０，１００％）の１１階調の画像
をイメージスキャナーで取り込む。発色１〜１１を示
す。 次に取り込んだ画像について縦・横各々２５ピクセル
の範囲でＲＧＢに数値化する。 で得られた各ＲＧＢのそれぞれ２５行×２５列の方
形ピクセル値に対して次の演算をおこなう。 １）列平均を求める。 ２）さらに１）で得られた列平均値の移動平均を求め
る。（３〜５時点） ３）２）で得られた移動平均値の平均を求める。 ０〜１００％の発色と、それに対するで求めたＲ，
Ｇ，Ｂの値を図１１に示す。

【００７４】図１１はシアン６０％イエロー８０％がバ
ックグラウンドとなったものである。図１１において、
発色１は１００% の濃さを示す。以下、発色１１まで段
階的に薄くなっていることを示す。これをグラフに表す
と図１２のようになる。

【００７５】図１２において、発色変化を最もよく表現
しているのは、Ｇ（緑色）であることがわかる。また、
Ｇの傾きは１７．４７となる。このときのバックグラウ
ンドをバックグラウンドのないものと比較すると、アミ
点濃度が０％の時が発色のない状態を示し、バックグラ
ウンドとなるので表１に示すようになる。

【００７６】

【表１】

【００７７】表１において、Ｙはイエロー成分、Ｃはシ
アン成分を示す。Ｙが８０％のときＣを０−２０−４０
−６０−８０％まで変化させてその時の検量線を求める
と図１３に示すグラフとなる。バックグラウンドの影響
による検量線の傾きの変化が図１３に示されている。

【００７８】図１３において、Ｙはイエロー、Ｃはシア
ンを表わす。単位は％である。横軸の濃度はマゼンダ色
のアミ点濃度の％を示す。緑便相当のバックグラウンド
の影響により、検量線の傾きが変化することがわかる。

【００７９】次に、この検量線の傾きとその時のバック
グラウンドに着目すると、表２に示すようになる。

【００８０】

【表２】

【００８１】表２において、ここで傾きを従属変数、バ
ックＲ、Ｇ、Ｂ、を独立変数として重回帰分析を行う
と、表３に示す係数を得る。

【００８２】

【表３】

【００８３】この係数をもとに、補正計算をおこなった
結果を図１４のグラフに示す。図１４から明らかなよう
に、傾き補正を行うことで、バックグラウンドの影響を
押さえることができた。

【００８４】（実施例２）ラベルの発色の特徴を捉えて
三原色の利用する割り合いを決定する方法 実施方法：バックグラウンドのない場合（バックグラウ
ンドが白色） カラーチャートから抗原−抗体反応に用いるラベルに
発色に近い色をさがす。（本実施例の場合：マゼンダ） マゼンダのアミ点濃度０〜１００％（０，１０，２
０，３０，４０，５０，６０，７０，８０，９０，１０
０％）の１１階調の画像をイメージスキャナーで取り込
む。発色１〜１１を示す。 次に取り込んだ画像について縦・横各々２５ピクセル
の範囲でＲＧＢに数値化する。 で得られた各ＲＧＢのそれぞれ２５行×２５列の方
形ピクセル値に対して次の演算をおこなう。 １）列平均を求める。 ２）さらに１）で得られた列平均値の移動平均を求め
る。（３〜５時点） ３）２）で得られた移動平均値の平均を求める。 ０〜１００％の発色と、それに対するで求めたＲ、
Ｇ、Ｂの値を図１５に示す。

【００８５】図１５は、ラベルとして使用された色素相
当のM （マゼンダ）の発色の段階を示すものである。図
１５において、発色の１〜１１は１００% 〜０% の濃さ
を示す。グラフに示すと図１６のようになる。

【００８６】図１６において、発色の変化を最もよく表
現しているのは、Ｇであることがわかる。Ｒについては
変化が見られない。Ｂは変化に追従しているがＧより
も、変化が少ない。また、Ｇの傾きは２４．７９７６と
なる。

【００８７】ここでアミ点濃度を従属変数、Ｒ，Ｇ，
Ｂ，を独立変数として重回帰分析を行うと以下の様に
Ｒ，Ｇ，Ｂの利用すべき割り合いがきまる。

【００８８】

【表４】

【００８９】アミ点濃度を逆算すると、アミ点濃度＝切
片係数＋（Ｒ係数×Ｒ）＋（Ｇ係数×Ｇ）＋（Ｂ係数×
Ｂ）となるから、表５に示す数値を得る。

【００９０】

【表５】

【００９１】相関係数＝０．９９９３２２と良い相関を
示し、この割合がアミ点濃度を反映していることを示し
ている。また、この方法はラベル物質が変わって色が変
わっても応用可能なことは容易に推測できる。

【００９２】（実施例３）実試薬を用いた評価

【００９３】ヒトヘモグロビン溶液を用いてイムノクロ
マトグラフィーをおこなった結果を以下に示す。 250 ｎｇ/ ｍＬ相当のヒトヘモグロビン溶液を展開さ
せた。 ビリルビンコントロールで250ng/mlに希釈して表６及
び表７に示すように展開させた。

【００９４】

【表６】

【００９５】

【表７】

【００９６】ヒトヘモグロビン純系の波形を図１７にグ
ラフ化して示す。ヒトヘモグロビン＋ビリルビン添加の
波形を図１８にグラフ化して示す。

【００９７】図１９に示すように、発色の変化を最もよ
く表現しているGreen のデータを比較する。

【００９８】次に、実施例２で先に得られた切片と、
Ｒ、Ｇ、Ｂの係数を用いて計算し、比較すると図２０の
グラフとなる。

【００９９】さらに実施例１で得られた切片と係数によ
り、ビリルビンによるバックグラウンドの補正計算を行
うと図２１のグラフとなる。同一座標に記録すると図２
２となる。

【０１００】ここで、ヒトヘモグロビン純系の展開の場
合、バックグラウンドの補正をおこなっても、元の値に
対する影響がほとんどなく、また、ビリルビンのバック
グラウンドのある展開の場合ピーク値がより純系に近づ
いていることがわかる。

【０１０１】

【発明の効果】本発明は、免疫反応、特にイムノクロマ
トグラフィまたはイムノコンセントレーションにおける
発色画像の処理定量方法において、バックグラウンド
（背景色）を有する発色像であっても該バックグラウン
ドの影響を除去して測定可能で、また、ラベル物質の多
様化に伴うラベル物質自体の色調の違いによっても測定
すべき色成分を捉えて測定可能で、さらに、バックグラ
ウンドを有し且つ色調の異なるラベル物質による発色像
であっても正確に処理定量可能とし、さらにまた、従来
から画像解析により行なっていた凝集像の自動判定につ
いても応用可能で、しかも、従来装置に対して新たな設
備を追加することなく導入可能であり、廉価なシステム
構成を可能となるという大きな効果を奏する。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明方法の第１の態様の工程を示すフローチ
ャートである。

【図２】本発明方法の第２の態様の工程を示すフローチ
ャートである。

【図３】本発明方法の第３の態様の工程を示すフローチ
ャートである。

【図４】本発明方法の補正工程（６）の手順を示すフロ
ーチャートである。

【図５】本発明方法の補正工程（６′）の手順を示すフ
ローチャートである。

【図６】本発明方法を実施するための装置における各部
材の配列を示すブロック図である。

【図７】発色デバイスとしてのＩＣＧシートを示す基本
構成図である。

【図８】発色デバイスとしてのフロースルーデバイスを
示す基本構成図である。

【図９】階調変化させた色見本画像の一例を示す図であ
る。

【図１０】バックグラウンドのある色見本画像の一例を
示す図である。

【図１１】実施例１における０〜１００％の発色とそれ
に対するＲ、Ｇ、Ｂの値を示す図表である。

【図１２】図１１のＲ、Ｇ、Ｂの値を示すグラフであ
る。

【図１３】実施例１におけるバックグラウンドの影響に
よる検量線の傾きの変化を示すグラフである。

【図１４】実施例１におけるバックグラウンド補正を行
なった検量線を示すグラフである。

【図１５】実施例２における０〜１００％の発色とそれ
に対するＲ、Ｇ、Ｂの値を示す図表である。

【図１６】実施例２におけるマゼンタの発色検量線を示
すグラフである。

【図１７】実施例３におけるヒトヘモグロビン純系の波
形を示すグラフである。

【図１８】実施例３におけるヒトヘモグロビン＋ビリル
ビン添加の波形を示すグラフである。

【図１９】実施例３におけるＧｒｅｅｎの値の変化を示
すグラフである。

【図２０】実施例３におけるラベル色の補正結果を示す
グラフである。

【図２１】実施例３におけるバックグラウンドの補正結
果を示すグラフである。

【図２２】実施例３におけるラベル色およびバックグラ
ウンドの補正結果を示すグラフである。

【図２３】ＩＣＧ法の原理を示す説明図である。

【図２４】ＩＣＧシートを示す上面説明図である。

【図２５】イムノコンセントレーションの原理を示す説
明図である。

【符号の説明】

１２ ニトロセルロース支持体 １４ ＩＣＧシート １６ 標識部位 ２０ 測定バンド ２４ 試料検体 ２８ 測定複合体 ３０ コントロールバンド ３６ コントロール複合体 ４０ フロースルーデバイス ４４ メンブレン ４６ 吸収体 ５０ 画像入力装置 ５２ データ解析部 ５４ プリンター ５６ ディスプレイ ６０ シアン ６２ 抗体 ６４ ガラクトース残基 ６８ レクチン（ＲＣＡ１２０）感作ラテックス ８０ 発色像

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 （１）試料検体を免疫反応におけるラベ
   ル物質を有する発色デバイス上に滴下し、該発色デバイ
   ス上に発色像を形成させる工程と、（２）該発色像を画
   像データとしてフルカラーで取り込む工程と、（３）取
   り込んだ画像データの解析範囲を指定する工程と、
   （４）該解析範囲の生データの三原色のピクセル値の列
   平均値を算出し、各ピクセル値の列平均の移動平均値を
   求める工程と、（５）上記工程（４）で得られた移動平
   均値から発色の最小ピクセル値を算出する工程と、
   （６）前記最小ピクセル値に対して、前記発色像のバッ
   クグラウンドの補正を行う工程と、（７）上記補正工程
   （６）後のピクセル値と、既知濃度の検体との関係を示
   す検量線から未知濃度の試料検体の濃度を求める工程と
   からなることを特徴とする免疫反応による発色画像の処
   理定量方法。
2. 【請求項２】 （１）試料検体を免疫反応におけるラベ
   ル物質を有する発色デバイス上に滴下し、該発色デバイ
   ス上に発色像を形成させる工程と、（２）該発色像を画
   像データとしてフルカラーで取り込む工程と、（３）取
   り込んだ画像データの解析範囲を指定する工程と、
   （４）該解析範囲の生データの三原色のピクセル値の列
   平均値を算出し、各ピクセル値の列平均の移動平均値を
   求める工程と、（５）上記工程（４）で得られた移動平
   均値から発色の最小ピクセル値を算出する工程と、
   （６′）前記ラベル物質の色の特徴を捉えて三原色の利
   用する割合を決定し、前記最小ピクセル値に対して補正
   を行う工程と、（７′）上記補正工程（６′）後のピク
   セル値と、既知濃度の検体との関係を示す検量線から未
   知濃度の試料検体の濃度を求める工程とからなることを
   特徴とする免疫反応による発色画像の処理定量方法。
3. 【請求項３】 （１）試料検体を免疫反応におけるラベ
   ル物質を有する発色デバイス上に滴下し、該発色デバイ
   ス上に発色像を形成させる工程と、（２）該発色像を画
   像データとしてフルカラーで取り込む工程と、（３）取
   り込んだ画像データの解析範囲を指定する工程と、
   （４）該解析範囲の生データの三原色のピクセル値の列
   平均値を算出し、各ピクセル値の列平均の移動平均値を
   求める工程と、（５）上記工程（４）で得られた移動平
   均値から発色の最小ピクセル値を算出する工程と、
   （６′）前記ラベル物質の色の特徴を捉えて三原色の利
   用する割合を決定し、前記最小ピクセル値に対して補正
   を行う工程と、（６）前記最小ピクセル値に対して、前
   記発色像のバックグラウンドの補正を行う工程と、
   （７″）上記補正工程（６′）および（６）後のピクセ
   ル値と、既知濃度の検体との関係を示す検量線から未知
   濃度の試料検体の濃度を求める工程とからなることを特
   徴とする免疫反応による発色画像の処理定量方法。
4. 【請求項４】 前記補正工程（６）が、（イ）ラベル物
   質と等色の色見本を画像データとして、コンピュータに
   フルカラーで取り込むステップと、（ロ）該取り込んだ
   画像データの発色部位の解析範囲を指定するステップ
   と、（ハ）該解析範囲の生データの三原色のピクセル値
   の列平均を算出し、各ピクセル値の列平均の移動平均値
   を求めるステップと、（ニ）上記ステップ（ハ）で得ら
   れた移動平均値の平均値を求めるステップと、（ホ）色
   見本としてカラーチャートを用いて階調に変化した既知
   画像を上記ステップ（イ）〜（ニ）により処理加工し、
   三原色それぞれについての平均値を算出するステップ
   と、（ヘ）バックグラウンドに相当する色の色見本を画
   像として取り込み、既知のバックグラウンド画像とする
   ステップと、（ト）上記ステップ（イ）とステップ
   （ヘ）で得られた画像を合成し、既知濃度であり且つバ
   ックグランドを持つ試料画像とするステップと、（チ）
   該試料画像について、上記ステップ（イ）〜（ト）を繰
   り返すことにより、バックグラウンドのある段階濃度の
   試料として作成し検量線とするステップと、（リ）上記
   ステップ（ヘ）で得られたバックグラウンド画像の三原
   色の値と、上記ステップ（チ）で得られた検量線の傾き
   とを重回帰分析し、切片と係数を計算するステップと、
   （ヌ）未知濃度の検体を測定して得られる上記ステップ
   （ハ）で算出された移動平均値の最小ピクセル値に対し
   て、上記ステップ（リ）で得られた切片と係数により、
   バックグラウンドの補正を行うステップと、からなるこ
   とを特徴とする請求項１または３記載の免疫反応による
   発色画像の処理定量方法。
5. 【請求項５】 前記補正工程（６′）が、（イ）ラベル
   物質と等色の色見本を画像データとしてコンピュータに
   フルカラーで取り込むステップと、（ロ）該取り込んだ
   画像データの発色部位の解析範囲を指定するステップ
   と、（ハ）該解析範囲の生データの三原色のピクセル値
   の列平均値を算出し、各ピクセル値の列平均の移動平均
   値を求めるステップと、（ニ）上記ステップ（ハ）で得
   られた移動平均値の平均値を算出するステップと、
   （ホ）色見本としてカラーチャートを用いて階調に変化
   した既知濃度の画像を上記ステップ（イ）〜（ニ）によ
   り処理加工し、三原色の平均値を算出するステップと、
   （ヘ′）上記ステップ（イ）〜（ニ）を繰り返すことに
   より、既知の段階濃度の試料とするステップと、
   （ト′）上記ステップ（ヘ′）で得られた段階濃度の画
   像の三原色の値と、上記ステップ（ヘ′）で得られた既
   知の段階濃度（アミ点濃度）を従属変数とし、そのとき
   Ｒ、Ｇ、Ｂ値を独立変数として重回帰分析し、切片と
   Ｒ、Ｇ、Ｂ値の係数を算出することにより、当該ラベル
   物質の発色の特徴を捉えて三原色の利用すべき割合を決
   定し、前記最小ピクセル値に対して補正を行うステップ
   と、からなることを特徴とする請求項２または３記載の
   免疫反応による発色画像の処理定量方法。
6. 【請求項６】 前記ラベル物質が、ラテックス、金、
   銀、鉄、セレニュウム、硫黄、テルニウム、炭素、染料
   嚢、酸素または酸素−染料複合であることを特徴とする
   請求項１〜５のいずれか１項記載の免疫反応による発色
   画像の処理定量方法。
7. 【請求項７】 前記免疫反応における発色が、イムノク
   ロマトグラフィまたはイムノコンセントレーションによ
   って行われることを特徴とする請求項１〜６のいずれか
   １項記載の免疫反応による発色画像の処理定量方法。
8. 【請求項８】 前記試料検体が、便、尿、喀痰、血液ま
   たは体液であることを特徴とする請求項１〜７のいずれ
   か１項記載の免疫反応による発色画像の処理定量方法。
9. 【請求項９】 前記バックグラウンドに相当する色が、
   便検体中で緑便相当色であることを特徴とする請求項１
   〜８のいずれか１項記載の免疫反応による発色画像の処
   理定量方法。
10. 【請求項１０】 画像入力装置と、データ解析部と、出
    力装置とからなり、請求項１〜９のいずれか１項記載の
    免疫反応による発色画像の処理定量方法を実施するため
    の装置。