JP2000256389A - ビピリジン結合dnaオリゴマー - Google Patents

ビピリジン結合dnaオリゴマー

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烈 斎藤
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和彦 中谷
Shinya Hagiwara
伸也 萩原
Shinsuke Santo
信介 山東
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 本発明は、DNA鎖中に存在する複数のチミ
ン塩基の内、ひとつのチミン塩基だけをジヒドロキシル
化し、その位置でDNAを切断する方法を提供する。 【解決手段】 本発明は、DNAオリゴマーの3’又は
5’末端に2,2’−ビピリジル基を含有する基が結合
したビピリジン結合DNAオリゴマーに関し、このビピ
リジン結合DNAオリゴマーを用いてDNA中のひとつ
のチミン塩基を選択的にジヒドロキシル化する方法、及
び、当該チミン塩基の位置でDNAを切断する方法に関
する。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【発明の属する技術分野】本発明は、DNAオリゴマー
の3’又は5’末端に2,2’−ビピリジル基を含有す
る基が結合したビピリジン結合DNAオリゴマー、当該
ビピリジン結合DNAオリゴマーを用いてDNA中のひ
とつのチミン塩基をジヒドロキシル化し、その位置でD
NAを切断する方法に関する。
【0002】
【従来の技術】四酸化オスミウムとビピリジンを用いる
チミンのジヒドロキシル化は良く知られた反応である
が、複数のチミン塩基が存在する場合にはそれらを区別
することは出来ない。したがって、この方法ではDNA
中の全てのチミン塩基の位置でDNAが切断されてしま
い、特定のチミンの位置で選択的にDNAを切断するこ
とはできなかった。従来、特定のチミンの位置でDNA
を切断する方法としては、チミン塩基を一つしか含まな
いオリゴマーを用いて、チミンをジヒドロキシル化した
後、別のオリゴマーと結合させて結果として複数のチミ
ンと一つのジヒドロキシル化されたチミンを持つオリゴ
マーを合成する方法が知られているが、その合成効率は
極めて低いものであった。
【0003】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、DNA鎖中
に存在する複数のチミン塩基の内、ひとつのチミン塩基
だけをジヒドロキシル化し、その位置でDNAを切断す
る方法を提供する。
【0004】
【課題を解決するための手段】上記課題を解決するため
に、四酸化オスミウムの配位子であるビピリジンをDN
Aオリゴマーの末端に結合させたビピリジン結合DNA
オリゴマーを創出した。即ち、本発明は、DNAオリゴ
マーの3’又は5’末端に2,2’−ビピリジル基を含
有する基が結合したビピリジン結合DNAオリゴマー又
はその塩に関する。また、本発明は、前記したビピリジ
ン結合DNAオリゴマー又はその塩を用いてDNA中の
ひとつのチミン塩基を選択的にジヒドロキシル化する方
法に関する。さらに本発明は、前記したビピリジン結合
DNAオリゴマー又はその塩を用いてDNA中の特定の
チミン塩基の位置でDNAを切断する方法に関する。
【0005】本発明のビピリジン結合DNAオリゴマー
のDNAオリゴマーの長さには特に制限はないが、ジヒ
ドロキシル化又は切断されるDNA鎖にハイブリダイズ
できるに充分な長さがあればよい。DNAオリゴマーは
長いものでもあってもよいが、ビピリジン部分を結合さ
せる処理を行うために、位置選択的に目的のDNA鎖と
ハイブリダイズするに充分な長さを有する比較的短いも
のが好ましい。好ましいDNAオリゴマーとしては、6
塩基以上のものであり、30塩基以上の長さであっても
よいが、6〜30塩基、好ましくは6〜20塩基のもの
が挙げられる。
【0006】本発明のビピリジン結合DNAオリゴマー
における2,2’−ビピリジル基を含有する基として
は、DNAオリゴマーの3’又は5’末端から適当な距
離を隔てられるリンカー部分を有する2,2’−ビピリ
ジル基が好ましい。リンカー部分としては3〜20原
子、好ましくは5〜15原子の鎖状の基からなるもので
あり、直鎖又は分枝状の炭素原子であってもよいが、製
造の容易さからリンカー部分中にエステル基、アミド
基、炭酸基やウレタン基などの官能基が存在するものが
好ましい。
【0007】2,2’−ビピリジル基を含有する基は前
記したDNAオリゴマーの3’末端又は5’末端のいず
れに結合していてもよい。本発明の好ましいビピリジン
結合DNAオリゴマー又はその塩を例示すれば、次式
(I)、
【化2】 (式中、DNAはDNAオリゴマーを示す。)で示され
るビピリジン結合DNAオリゴマーが挙げられる。
【0008】本発明のビピリジン結合DNAオリゴマー
の製造方法としては、2,2’−ビピリジル基にリンカ
ー部分を反応させて2,2’−ビピリジル基を含有する
基の部分を製造し、次いでDNAオリゴマーに結合させ
て製造することもできるが、後述する実施例に記載のよ
うに、2,2’−ビピリジル基とリンカー部分の一部を
製造し、これに3’末端又は5’末端が修飾されたDN
Aオリゴマーとを反応させて製造することもできる。
【0009】本発明のビピリジン結合DNAオリゴマー
は、DNAオリゴマーと相補的なDNAの配列を認識
し、その部分にハイブリダイズし、2本鎖になったDN
Aの外側の最も近傍のチミン塩基を選択に処理可能にす
る。例えば、図1に示されるように、本発明のビピリジ
ン結合DNAオリゴマーとして、次式 3’−TCACGGTGGACAGAG−Bpy (式中、Bpyは2,2’−ビピリジル基を含有する基
を示す。)を用いた場合には、その相補鎖を認識し、ハ
イブリダイズした後に本発明のビピリジン結合DNAオ
リゴマー中の2,2’−ビピリジル基を含有する基の中
の2,2’−ビピリジル基は、その最も近傍のチミン塩
基を認識する。例えば、図1の場合には、図1中でT
16と記載されているチミン塩基が認識される。
【0010】図2は、5’末端を32Pでラベル化した
DNA 5’−32P−AGTGCCACCTGTCTCTGT
GTATGCT を前記した本発明のビピリジン結合DNAオリゴマーを
用いて特定の位置のチミン塩基をジヒドロキシル化した
結果をポリアクリルアミドゲル電気泳動によりその配列
選択性を解析したものである。図2のレーン1は四酸化
オスミウムとビリジンによるT切断を示し、レーン2は
Maxam−Gilbert法によるA+Gを示し、レ
ーン3はビビリジン結合DNAオリゴマーと四酸化オス
ミウム処理したものを示し、レーン4はビペリジン処理
が無かった場合を示し、レーン5は四酸化オスミウムに
よる処理が無かった場合を示す。図2の矢印(→)は、
16番目のチミンだけがジヒドロキシル化されているこ
とを示している。
【0011】本発明のビピリジン結合DNAオリゴマー
は四酸化オスミウムの共存下、オリゴマーの配列に相補
的な塩基配列を認識し、かつその近傍のチミン塩基を選
択的にジヒドロキシル化する。そして、常法によりこの
位置で目的のDNAを切断することが可能となる。四酸
化オスミウムによるジヒドロキシル化、及び、その後の
切断の方法は公知の任意の方法により行うことができ
る。
【0012】このように、本発明はDNA中の特定のチ
ミン塩基のみを選択的にジヒドロキシル化するための方
法及びそのためのビピリジン結合DNAオリゴマーを提
供するものであり、本発明は特定のビピリジン結合DN
Aオリゴマーに限定されるものではない。本発明の方法
によれば、任意の塩基配列内にある特定のチミン塩基を
ひとつだけジヒドロキシル化することも可能となり、
1)DNA損傷研究、2)アンチセンスDNA、3)D
NA切断反応の解析、4)損傷DNA−修復タンパクと
の相互作用解析等への利用が期待される。
【0013】
【実施例】次に実施例により本発明をより具体的に説明
するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものでは
ない。
【0014】以下の実施例に記載する本発明のビピリジ
ン結合DNAオリゴマーの製造例を次の化学反応式で示
す。
【化3】
【0015】実施例1(ステップ1) 2’−ヒドロキシメチルビピリジン(306mg、1.
65mmol)のDMF溶液に、ジスクシンイミジルカ
ーボネート(1.18g、4.62mmol)とルチジ
ン(525mg、4.90mmol)を加え室温5時間
反応させた。反応溶液を抽出操作により精製し、活性化
ビピリジン誘導体を得た(352mg、65%)。
【0016】 H NMR(400MHz,CDCl) d=8.66(s,1H),8.45(d,1H,J=
7.7Hz),8.36(d,1H,J=7.3H
z),7.85(dd,2H,J=7.8,17.8H
z),7.39(d,1H,J=7.5Hz),7.3
1(m,1H),5.49(s,2H),2.83
(s,4H); MSm/e(%)327(M)(100),283
(19),212(33),184(46),169
(64),155(68),142(40),115
(29),78(44); HRMS C1613(M)として計算
値、327.0813; 実測値、327.0834.
【0017】実施例2(ステップ2) 活性化ビピリジン(42μg、100nmol)をアセ
トニトリル(20μL)に溶解し、市販の5’末端がア
ミノ化されたDNAオリゴマー(0.42mM、10μ
L)と飽和炭酸水素ナトリウム溶液(10μL)を加え
て室温−時間反応させた。生成物は直接高速液体クロマ
トにより精製した。
【0018】実施例3(ビピリジン結合DNAオリゴマ
ーによる配列選択的チミン塩基のジヒドロキシル化) ポリアクリルアミドゲル電気泳動による配列選択性の解
析を行った。5’末端を32Pでラベル化したオリゴマ
ーを、100 mM NaClを含んだTris−HC
l緩衝液(10mM、pH7.6)中で30μMのピピ
リジン結合DNAオリゴマーと室温で12時間放置し、
二本鎖を形成させ、3mMの四酸化オスミウムを加えて
室温で30分間反応させチミン塩基のジヒドロキシル化
を行った。ジヒドロキシル化されたチミン塩基は、10
%のピペリジンで90℃で30分間加熱処理し、7Mの
尿素を含んだ15%ポリアクリルアミドゲル電気泳動に
より切断バンドとして確認した。
【0019】結果を図2に図面に代わる写真により示
す。図2のレーン1は四酸化オスミウムとビリジンによ
るT切断を示し、レーン2はMaxam−Gilber
t法によるA+Gを示し、レーン3はビビリジン結合D
NAオリゴマーと四酸化オスミウムを示し、レーン4は
ビベリジン処理が無しの場合を示し、レーン5は四酸化
オスミウム処理が無しの場合を示す。図2の矢印(→)
は、16番目のチミンだけがジヒドロキシル化されてい
ることを示す。
【0020】
【発明の効果】本発明のビピリジン結合DNAオリゴマ
ーを用いることにより、任意の塩基配列内にあるチミン
塩基をジヒドロキシル化することが可能となり、従来の
方法では供給できない同一オリゴマー上の複数のチミン
塩基の中から選択的にーつだけがジヒドロキシル化され
たオリゴマーの合成を可能とする。
【図面の簡単な説明】
【図1】図1は、本発明のビピリジン結合DNAオリゴ
マーと標的のDNAとがハイブリダイズしている様子を
模式的に示したものである。
【図2】図2は、本発明のビピリジン結合DNAオリゴ
マーを用いたDNAのジヒドロキシル化および切断の結
果を示す図面に代わる写真である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 山東 信介 京都府京都市左京区吉田泉殿町49 プルミ エール有園408号 Fターム(参考) 4B024 AA20 BA80 HA14 HA19 4C057 AA18 BB02 CC01 DD01 MM04

Claims (5)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 DNAオリゴマーの3’又は5’末端に
    2,2’−ビピリジル基を含有する基が結合したビピリ
    ジン結合DNAオリゴマー。
  2. 【請求項2】 DNAオリゴマーが6塩基以上である請
    求項1に記載のビピリジン結合DNAオリゴマー。
  3. 【請求項3】 次式(I)、 【化1】 (式中、DNAはDNAオリゴマーを示す。)で示され
    るビピリジン結合DNAオリゴマー。
  4. 【請求項4】 請求項1〜3に記載のビピリジン結合D
    NAオリゴマーを用いてDNA中のひとつのチミン塩基
    を選択的にジヒドロキシル化する方法。
  5. 【請求項5】 請求項1〜3に記載のビピリジン結合D
    NAオリゴマーを用いてDNA中のひとつのチミン塩基
    の位置でDNAを切断する方法。
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