JP2000253892A - ポリオールの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 生産工程上の負担となる種培養を省略すると
ともに、本培養の培養時間を簡便な方法で調節し、工業
的に効率のよいポリオールの生産方法を提供する。 【解決手段】 ポリオール生産中の培養液から微生物を
含んだ状態でその一部を抜き取る工程、抜き取った培養
液中の微生物を培養液とともに、別の培地に接種する工
程、微生物を増殖させ、ポリオールを生産させる工程を
順次繰り返すことにより、２回目のポリオール生産以降
は種培養工程を必要とせず、また、接種する培養液量
を、種培養工程を使用する生産方法における種菌として
接種される微生物量と比較して０．０５倍量〜１２．５
倍量の範囲で調整することにより、別の培地における培
養時間を調整することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、微生物の発酵によ
りポリオールを製造する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ポリオールを生産する微生物としては、
トルロプシス属（特公昭４７−８５８９号公報、特公昭
６３−９８３３号公報）に属する微生物がグリセリンを
生産することが知られており、カンジダ属、サッカロミ
セス属又はトルロプシス属（特公昭４７−２０３９４号
公報又は特公昭５３−６２３１号公報）、ブレタノミセ
ス属（特公昭６３−９８３４号公報）、ピヒア属（特公
昭５７−２６１１４号公報）もしくはローネラ属（特開
平２−６９１８６号公報）に属する微生物がアラビトー
ルを生産することが知られており、モニリエラ属（特開
昭６０−１１０２９５号公報）、オーレオバシデュウム
属（特公昭６３−９８３１号公報）又はトリコスポロノ
イデス属（ＷＯ９７／２６３２３号公報）に属する微生
物がエリスリトールを生産することが知られている。ま
た、その他にもマンニトール、ソルビトール、キシリト
ール生産能を有する微生物が多数知られている。

【０００３】微生物を利用し目的物質を生産する発酵方
法としては、回分発酵法、流加発酵法や連続発酵法が知
られているが、連続発酵法は微生物を継続的に使用する
際の安定性の面で操作が難しく、工業スケールのポリオ
ールを生産する方法としては一般的に回分発酵法が、ま
た一部では流加発酵法が実施されている。

【０００４】一般的な回分発酵法及び流加発酵法は、ま
ず、本培養用の種菌として、微生物を予め小規模の発酵
槽で培養し、種菌を準備する。次に、原料基質を含む培
地を仕込んだ本培養用の大規模の発酵槽に、予め用意し
た種菌を培養液ごと接種し、培養を行う。培養は目的物
質であるポリオールの濃度が最高点に達した時点又は原
料基質が消費された時点で終了させ、培養液から菌体を
分離し、菌体分離後の培養液からポリオールを精製し取
得している。

【０００５】種菌を準備する目的で実施される種培養
は、本培養の規模が大きければ大きいほど、種培養の規
模も大きくする必要がある。また、保存菌から１回の種
培養で必要な種培養液を得ることは困難であり、段階的
に培養の規模を大きくし種培養液を得ている。従って１
回の本培養のために種培養を数回実施する必要があり、
種培養の実施は非常に労力を必要とする。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】微生物の回分発酵法や
流加発酵法による発酵生産では、発酵を行う毎に種菌を
準備するために種培養を実施しており、本培養の生産計
画に合わせた種培養は生産上の負担となっている。

【０００７】また、回分発酵法や流加発酵法によるポリ
オール生産において、発酵工程に要する時間は数日間を
必要とするが、精製の各工程に要する時間は数十分から
数時間と非常に短い期間において実施される。従って、
精製工程で使用される装置は、発酵工程の装置と比較し
て小規模である。しかしながら、発酵工程を同時に多数
実施する場合、小規模な精製工程の効率的な運転が求め
られるため、発酵の終了時間を調節する必要が生ずる。

【０００８】発酵生産物の生産性に影響がなく、かつ簡
便な発酵時間の調節方法としては、種菌の接種量を調整
する方法が挙げられる。種菌の接種量を少なくすると培
養時間は延長するが、種菌の接種量を多くすると培養時
間が短縮することがわかっている。しかしながら、本培
養に接種される種菌の量は、種培養用装置の容量により
ほぼ決定される。つまり生産現場では、設置した種培養
槽の容量以上の種菌を得ることはできない。従って、複
数の本培養用発酵槽における発酵時間の調節に対応する
ためには、常に必要とされる最大量の種菌を準備する必
要がある。しかし、発酵時間を調節する過程で必要量以
外の余分の種菌は廃棄することとなり、経済的に好まし
いとは言えない。

【０００９】従って、本発明の目的は、種培養という生
産工程上の負担を軽減し、本培養の培養時間を簡便な方
法で調節し、工業的に効率よくポリオールを生産する方
法を提供することにある。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記目的
を解決するために鋭意検討を重ねた結果、本培養の培養
液が種菌として使用可能であり、その接種量を調整する
ことによりポリオールを効率的に製造することを見出
し、本発明を完成するに至った。

【００１１】即ち、本発明の要旨は、微生物の発酵によ
るポリオールの製造方法において、ポリオール生産中の
培養液から微生物を含んだ状態でその一部を抜き取る工
程、抜き取った培養液中の微生物を培養液とともに、別
の培地に接種する工程、微生物を増殖させ、ポリオール
を生産させる工程を順次繰り返すことにより、２回目の
ポリオール生産以降は種培養工程を必要としないことを
特徴とするポリオールの製造方法に存する。

【００１２】本発明の好ましい態様によれば、トリコス
ポロノイデス・メガチリエンシスＳＮ−Ｇ４２（ＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−１４３０）によりエリスリトールを製造する
方法において、微生物の対数増殖期終了時から培地中に
基質が残存している期間の培養液から、計量装置を使用
してその一部を抜き取り、抜き取った微生物を含有する
培養液を別の培地に接種するにあたり、種培養工程を使
用するポリオールの生産方法において種菌として接種さ
れる微生物量と比較し０．０５倍量〜１２．５倍量の範
囲で調整することにより、別の培地における培養時間を
調節することができるエリスリトールの製造方法が提供
される。

【００１３】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。

【００１４】本発明で使用される微生物は、ポリオール
生産能を有する微生物であれば特に制限されないが、例
えばエリスリトール生産能を有する微生物としては、特
公昭６３−９８３１号公報に記載されるオーレオバシデ
ィウム属に属する微生物；特公平４−６３５号公報、公
報特開平９−１５４５８９号公報又はＷＯ９７／２６３
２３号公報に記載されるトリコスポロノイデス属に属す
る微生物；特開昭６０−１１０２９５号公報又は特開平
９−１５４５８９号公報に記載されるモニリエラ属に属
する微生物；特開平９−１５４５９０号公報に記載され
るイエロビア属、ウスチラゴ属、フィロバヂウム属又は
トリゴノプシス属に属する微生物；特公昭４７−４１５
４９号公報に記載されるトリグノプシス属又はカンジダ
属に属する微生物；特公昭５１−２１０７２号公報に記
載されるカンジダ属、トルロプシス属、ハンゼヌラ属、
ピヒア属又はデバリオミセス属に属する微生物；バイオ
テクノロジー・レターズ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．ｌｅ
ｔｔ．，７（４）、２２９−２３４（１９８５））に記
載されるハンゼニアスポラ属、サッカロミセス属、クロ
エケラ属、クリュベロミセズ属又はトルラスポラ属に属
する微生物；アスペルギルス属に属する微生物（Ｓ．
Ａ．Ｂａｒｅｒ，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２５３８−
２５８６（１９５８））；エクスペリメンタル・マイコ
ロジー（Ｇａｂｙ．Ｅ．，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ
Ｍｙｃｏｌｏｇｙ，４，１６０−１７０（１９８０））
に記載されるユーペニシリウム属、モナスカス属、ペニ
シリウム属、ベルチシリウム属に属する微生物；チゴピ
ヒア属（現在は、ヤマダジマ属に分類される）に属する
微生物（鈴木、発酵と工業，３５（６），（１９７
７）；ロドトルラ属に属する微生物（Ｊ．Ｇｅｎ，Ｍｉ
ｃｒｏｂｉｏｌ．，１８，２６９（１９５８））等が挙
げられる。

【００１５】グリセリン生産能を有する微生物として
は、特公平４７−８５８９号公報又は特公昭６３−９８
３３号公報に記載されるトルロプシス属に属する微生物
が挙げられる。

【００１６】アラビトール生産能を有する微生物として
は、特公昭４７−２０３９４号公報又は特公昭５３−６
２３１号公報に記載されるカンジダ属、サッカロミセス
属又はトルロプシス属に属する微生物；特開昭６３−９
８３４号公報に記載されるブレタノミセス属に属する微
生物；特公昭５７−２６１１４号公報に記載されるピヒ
ア属に属する微生物；特開平２−６９１８６号公報に記
載されるローネラ属に属する微生物が挙げられ、その他
にマンニトール、ソルビトール、キシリトール生産能を
有する微生物も挙げられる。

【００１７】本発明に使用される好ましい微生物として
は、特公平４−６３５号公報に記載されるトリコスポロ
ノイデス・メガチリエンシスＳＮ−Ｇ４２株（ＦＥＲＭ
ＢＰ−１４３０、旧名：オーレオバイデウム・ＳＮ−
Ｇ４２株）が挙げられる。

【００１８】本発明で微生物を培養する培地の栄養成分
は、一般的に炭素源、窒素源、無機塩類等からなる。炭
素源としては、グルコース、フラクトース、シュークロ
ース等の糖類及びこれらの糖類を含む澱粉糖化液、甘藷
糖蜜、甜菜糖蜜等の糖質が挙げられるが、好ましくはグ
ルコースが使用される。培地中の糖濃度は固形分換算で
１０〜６０％、好ましくは３０〜５０％の範囲で使用さ
れる。

【００１９】窒素源としては、菌体が利用可能な無機窒
素化合物又は有機窒素化合物が使用され、例えば酵母エ
キス、ペプトン、コーンスチープリカー、アンモニア、
アンモニウム塩、尿素、各種アミノ酸等が使用される。
無機塩類としては、リン酸、マグネシウム、カリウム、
カルシウム、鉄等の無機塩類が使用される。また、ビタ
ミン、ヌクレオチド等の微生物の生育を補助する成分を
必要に応じて添加することができる。

【００２０】更に、通気攪拌条件下で培養を行う場合
は、消泡剤、ｐＨ調整剤、緩衝液を添加することが好ま
しい。消泡剤としては、無機系、有機系の消泡剤が使用
され、例えばポリビニルアルコール、ソルビタン脂肪酸
エステル、シリコン系の化合物が挙げられ、ｐＨ調整剤
としては水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、硫酸、塩
酸、硝酸等が挙げられ、緩衝剤としては乳酸ナトリウ
ム、各種リン酸塩等が挙げられる。

【００２１】本発明は、ポリオール生産中の培養液から
微生物を含んだ状態でその一部を抜き取り、これを別の
培地に接種し、微生物を増殖させ、ポリオールを生産さ
せる。

【００２２】別の培地に接種される微生物は、微生物の
対数増殖期終了後から基質が残存している期間の培養液
中の微生物が好ましい。対数増殖期以前の培養液は、微
生物の菌体量が少なく、また微生物の状態が一定でな
い。また、基質が無くなった状態以降の培養液中の微生
物は、次第に死滅期に向かうためポリオール生産能が低
下しており種菌としての使用は避けた方が好ましい。

【００２３】通常は、微生物の対数増殖期終了後から基
質が残存している期間の培養液の一部を抜き取り、これ
をそのまま別の培地に接種すれば良いが、対数増殖期以
前の培養液を抜き取った場合は、これを培養し、微生物
の対数増殖期終了時まで待って、別の培地に接種するこ
とも可能である。

【００２４】別の培地に接種する微生物量は、通常の回
分発酵では種培養装置の容量により制限を受けてしまう
が、本発明の方法は、一回目の本培養では種菌用の培養
を行う必要があるが、それ以後は、次の本培養に必要な
微生物量に相当する培養液を、必要な量だけ抜き取るこ
とができるため自由に調整できる。

【００２５】発酵によるポリオールの生産において、微
生物の接種量を少なくすると増殖に時間を要するため培
養時間は延長されるが、接種量を多くすると増殖に要す
る時間が短縮され、培養時間も短縮される。従って、微
生物の接種量を調整することにより培養時間を調節する
ことが可能となる。

【００２６】培養液中の微生物量は予め分光光度計によ
る濁度、乾燥菌体重量、生菌数、蛋白質量、核酸量、Ａ
ＴＰ量などとして測定できるため、本発明における接種
する微生物量は、抜き取った培養液量で調整すれば簡便
に調整することができる。

【００２７】次の培地の発酵時間を調節することを目的
とするため、接種される培養液量は、種培養工程を使用
するポリオールの生産方法において種菌として接種され
る微生物量と比較し０．０５倍量〜１２．５倍量の範囲
で選択されるが、接種量が少ないと次のポリオール生産
の発酵時間が長くなり、また接種量が多すぎると抜き取
られた側の本培養のポリオール生産量に影響するため、
０．２５倍量〜２．５倍量の範囲で抜き取り接種すれば
好ましい。

【００２８】また、エリスリトール発酵におて、接種さ
れる微生物量を乾燥菌体重量で調整する場合は、接種す
る別の培地あたり乾燥菌体重量として０．０６ｇ／Ｌ〜
０．６ｇ／Ｌの範囲が好ましい。

【００２９】抜き取る培養液の計量方法は、発酵槽間に
計量槽を設置し計量する方法や、電磁流量計、質量計等
の計量装置を用いる方法や、計量装置等を使用せず発酵
槽内の培養液液面の変化から計量する方法等が利用でき
るが、雑菌汚染の恐れが少ない流量計等の計量装置を用
いる方法や培養液を抜き取る側の発酵槽内の培養液量の
変化から計量する方法や抜き取った培養液を接種される
側の発酵槽内の培養液量の変化から計算する方法が好ま
しい。

【００３０】微生物を接種する方法としては、微生物が
含まれる抜き取った培養液をそのままの状態で、次の培
地に接種することが雑菌汚染を防止する観点から好まし
いが、抜き出して接種する培養液量が多い場合は、抜き
出された発酵槽のポリオール生産量に影響するため、そ
の場合には、培養液を濃縮し、菌体を含む濃縮物と培養
液に分離する。濃縮物は、別の培地に接種すればよく、
分離された培養液は抜き出した発酵槽に再び戻すか、ま
たは精製工程に挿入される。

【００３１】培養液を濃縮する方法としては、有機膜分
離器、セラミック膜分離器等の膜分離器や回分型遠心分
離器、連続遠心分離器等の遠心分離器を用いる方法や抜
き出した培養液を１〜6時間静置し菌体を沈降させる沈
降法等が挙げられる。

【００３２】通常の回分発酵法におけるポリオールを製
造する方法は、ポリオール生産能を有する微生物を小規
模の発酵槽で培養し、種菌用培養液を準備した後、必要
な栄養成分を含む液体培地を仕込んだ本培養用の大規模
発酵槽に種菌用培養液を接種し通気攪拌下で培養する。
培養はポリオール濃度が最高点に達した時点又は基質が
消費された時点で終了させ、培養液から菌体を分離し、
菌体分離後の培養液を精製しポリオールを得ることがで
きる。

【００３３】本発明のポリオールの製造方法は、通常の
回分発酵において、大規模発酵槽による本培養時に、培
養液を一部抜き取り、別の本培養用の種菌用培養液とし
て使用する以外は、通常の回分発酵と同様の公知の方法
にてポリオールを製造することができる。また、流加発
酵法においても同様である。

【００３４】従って、培養時のｐＨ、培養温度、通気条
件等の培養条件は、使用する微生物により最適条件が異
なるが、それぞれの回分培養時の条件を変更する必要は
ない。また、培養時間は、培養液中のポリオール濃度及
び原料基質の濃度を高速液体クロマトグラフィーやガス
クロマトグラフィー等の公知方法で適宜測定し、ポリオ
ール濃度が最高点に達した時点又は原料基質が消費され
た時点で停止させればよい。

【００３５】本発明のポリオールの製造方法では、通常
の回分発酵や流加発酵で使用する装置をそのまま使用で
き、他には培養液を抜き取るための計量装置があると好
ましいが、培養中の発酵槽の培養液量の変化から培養液
の抜き取る量を決定することができることから、計量装
置がなくても本発明の方法は実施可能である。

【００３６】

【実施例】以下に、実施例により本発明をさらに具体的
に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定され
るものではない。

【００３７】〔実施例１〕 （１）種培養 グルコース３０％（Ｗ／Ｖ）、酵母エキス１％を含む培
地５０ｍＬを５００ｍＬ容三角フラスコに入れ綿栓し、
１２０℃、２０分間滅菌後、斜面培地よりトリコスポロ
ノイデス・メガチリエンシスＳＮ−Ｇ４２（ＦＥＲＭ
ＢＰ−１４３０）を接種した。これを温度３５℃で３日
間振盪培養した。次に、グルコース３０％（Ｗ／Ｖ）、
コーンスチープリカー３．７％を含む培地１．５Ｌを３
Ｌ発酵槽に入れ、１２０℃、２０分間滅菌後、先に５０
０ｍＬ容三角フラスコで培養して得た培養液を接種し、
通気量０．５ｖｖｍ、攪拌速度６００ｒｐｍ、圧力０．
５ｋｇ／ｃｍ²、温度３５℃の条件で２日間培養し、得
られた培養液を種培養液とした。

【００３８】（２）１回目の本培養 グルコース４０％、コーンスチープリカー０．８％を含
む本培養培地１５Ｌに上記で得られた種培養液を接種
し、通気量０．５ｖｖｍ、攪拌速度３３０ｒｐｍ、圧力
０．５ｋｇ／ｃｍ²、温度３５℃の条件で培養し、グル
コースが消費された時点（培養開始後８９時間）で発酵
を終了させた。発酵液中のエリスリトール濃度を高速液
体クロマトグラフィーで測定した結果、２０６ｇ／Ｌで
あった。

【００３９】（３）２回目の本培養 １回目本培養の４８時間目の培養液１５０ｍＬ（種培養
工程を用いて微生物を接種する場合の微生物量の０．５
倍量）を無菌容器に抜き出し、１回目の本培養と同組成
の本培養培地１５Ｌに接種し、通気量０．５ｖｖｍ、攪
拌速度３３０ｒｐｍ、圧力０．５ｋｇ／ｃｍ²、温度３
５℃の条件で培養し、グルコースが消費された時点（培
養開始後８８時間）で発酵を終了させた。発酵液中のエ
リスリトール濃度を高速液体クロマトグラフィーで測定
した結果、２０８ｇ／Ｌであった。

【００４０】〔実施例２〕実施例１と同様に種培養と１
回目本培養を行い、その後２回目本培養の操作を１０回
繰り返した。１回目本培養の発酵液中のエリスリトール
濃度２０７ｇ／Ｌ、培養時間８９時間であった。２回目
本培養の操作を１０回繰り返したときの発酵結果は、発
酵液中のエリスリトール濃度２００〜２１０ｇ／Ｌ、培
養時間８７〜９０時間であり、１回目本培養と同等の結
果が得られた。

【００４１】〔実施例３〕実施例１と同様に種培養と１
回目本培養を行い、２回目本培養の操作において、１回
目本培養液から抜き出し、２回目本培養の培地に摂取す
る培養液量を７５０ｍＬ（種培養工程を用いて微生物を
接種する場合の微生物量の２．５倍量）とした以外は、
実施例１の２回目本培養と同条件で培養を行った。

【００４２】１回目本培養の発酵液中のエリスリトール
濃度２０２ｇ／Ｌ、培養時間８９時間であったが、２回
目本培養の発酵液中のエリスリトール濃度１９４ｇ／
Ｌ、培養時間７３時間となり、エリスリトール生産量は
ほぼ同等であったが、発酵時間を大幅に短縮することが
できた。

【００４３】

【発明の効果】本発明の方法によると、通常の回分発酵
では必須の種培養工程を省略できるため、生産工程上の
負担を軽減することが可能となり、また、本培養の種菌
接種量を自由に調整できることにより発酵時間の調節が
可能となるため、効率的な精製工程の実施が可能とな
り、ポリオールを効率的に製造することができる。

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 微生物の発酵によるポリオールの製造方
   法において、ポリオール生産中の培養液から微生物を含
   んだ状態でその一部を抜き取る工程、抜き取った培養液
   中の微生物を培養液とともに、別の培地に接種する工
   程、微生物を増殖させ、ポリオールを生産させる工程を
   順次繰り返すことにより、２回目のポリオール生産以降
   は種培養工程を必要としないことを特徴とするポリオー
   ルの製造方法。
2. 【請求項２】 培養液を抜き取る工程と、微生物を別の
   培地に接種する工程の間に、抜き取った培養液を濾過法
   又は遠心分離法により濃縮する工程を加えたことを特徴
   とする請求項１に記載のポリオールの製造方法。
3. 【請求項３】 別の培地に接種する微生物が、対数増殖
   期終了時から基質が残存している期間の培養液中の微生
   物であることを特徴とする請求項１又は請求項２に記載
   のポリオールの製造方法。
4. 【請求項４】 別の培地に接種する微生物量を、種培養
   工程を使用するポリオールの生産方法において種菌とし
   て接種される微生物量と比較し０．０５倍量〜１２．５
   倍量の範囲で調整することにより、別の培地における培
   養時間を調節することを特徴とする請求項１〜請求項３
   のいずれか一つに記載ポリオールの製造方法。
5. 【請求項５】 抜き取る培養液の計量手段が、計量槽を
   使用する方法、計量装置を使用する方法、培養液を抜き
   取る側の発酵槽内の培養液量の変化から計量する方法又
   は抜き取った培養液を接種される側の発酵槽内の培養液
   量の変化から計算する方法のいずれかであることを特徴
   とする請求項１〜請求項４のいずれか一つに記載のポリ
   オールの製造方法。
6. 【請求項６】 微生物がエリスリトール生産能を有する
   微生物であり、製造されるポリオールの主成分がエリス
   リトールであることを特徴とする請求項１〜請求項５の
   いずれか一つに記載のポリオールの製造方法。
7. 【請求項７】 微生物がトリコスポロノイデス属に属す
   る微生物であることを特徴とする請求項１〜請求項６の
   いずれか一つに記載のポリオールの製造方法。
8. 【請求項８】 微生物がトリコスポロノイデス・メガチ
   リエンシスＳＮ−Ｇ４２であることを特徴とする請求項
   １〜請求項７のいずれか一つに記載のポリオールの製造
   方法。