JP2000191548A - 肝疾患予防・治療剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 新規な肝疾患予防・治療剤を提供する。 【解決手段】 ＢＤＮＦなどのニューロトロフィンを有
効成分として含有する新規な肝疾患予防・治療剤を提供
する。該肝疾患予防・治療剤は急性、慢性肝炎（ウィル
ス性、薬剤性、自己免疫性など）、肝硬変などの肝疾患
の治療に有用で、かつ、脂肪肝を防ぐほか、肝細胞の保
護作用を有する

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は肝疾患予防・治療
剤、より詳しくは、ニューロトロフィンを有効成分とし
て含有する肝疾患予防・治療剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】肝臓の疾患は肝炎ウイルスなどの感染や
低栄養状態あるいは逆に過剰栄養やアルコールの過剰摂
取など種々の原因により発症し、病変が進行すると肝硬
変という終末像に到達する。多くの肝疾患は肝実質細胞
の障害が発症の引き金となり、肝細胞壊死、脂肪肝など
の形態学的変化を生ずる。この中で脂肪肝は中性脂肪が
肝細胞内に過剰に蓄積した病態であり、特に脂質含量が
肝重量の５％を越えるものを言う。その発症の原因か
ら、アルコール性脂肪肝や、肥満・糖尿病性脂肪肝、飢
餓性脂肪肝、抗生物質や副腎皮質ホルモンなどの薬剤投
与による脂肪肝、またＣ型肝炎ウイルスの感染や遺伝性
の脂肪肝に分類される。脂肪肝の病態としては、脂肪変
性が広汎に生じ、血中トランスアミナーゼやコリンエス
テラーゼなど肝細胞障害を示す生化学的パラメーターが
高値を示すのが特徴である。脂肪肝には肝臓の線維化が
伴うことも多く、病態が長期に続けば肝硬変、肝ガンへ
の移行が高率に観察される。

【０００３】現在、脂肪肝は、食事療法と運動療法ある
いは原因疾患の治療が基本となっており、薬物療法とし
ては、ビタミンＥ、コリン、カルニチンなどのビタミン
類などが補助的に用いられているに過ぎない。また、肝
炎では、インターフェロンや免疫抑制剤のような病因治
療剤以外に、グリシルリチン製剤、ウルソデオキシコー
ル酸製剤、グルタチオン製剤などの肝細胞保護剤が良く
用いられている。肝細胞破壊の程度を示す生化学的パラ
メーターはこれらの薬剤で低下するが、おおむね対症療
法に過ぎない。

【０００４】ニューロトロフィンは、生体内で標的細胞
あるいは神経およびグリア細胞・シュワン細胞から供給
され、神経細胞の生存維持、分化促進などの作用を示す
神経栄養因子のうち、ファミリーを形成している一群の
タンパクをさし、アミノ酸配列の相同性が高いタンパク
質群である。具体的には、脳由来神経栄養因子（以下、
ＢＤＮＦと略す）、ニューロトロフィン−３などが代表
的であり、ｔｒｋ受容体の特異的リガンドとして作用す
ることが知られている（野々村健、畠中寛；実験医学
第１３巻 ３７６頁（１９９５年））。ニューロトロフ
ィンは、ＡＬＳなど神経変性疾患に対する治療剤として
の医薬用途が臨床で検討されているほか、糖尿病や高脂
血症の治療剤として、知られている（Ｂｉｏｃｈｅｍ．
Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕ．ｖｏｌ．２
３８，ｐ．６３３（１９９７））。しかし、脂肪肝の治
療剤あるいは肝細胞保護作用については、報告されてい
ない。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、肝臓
への脂肪の蓄積（脂肪肝）や肝細胞の破壊を防ぐ新規な
肝疾患予防・治療剤を提供することにある。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、ＢＤＮＦ
の薬理作用を検討していたところ、肥満糖尿病モデル動
物であるｄｂ／ｄｂマウス（石田均ほか、最新医学、第
４８巻、３４頁（１９９３年））に、ＢＤＮＦを投与す
ると、肝臓への脂肪蓄積を抑制し、肝細胞が保護される
という作用を見いだし、更なる検討を加え、本発明を完
成するに至った。

【０００７】すなわち、本発明は、下記の医薬に関する
ものである。 （１）ニューロトロフィンを有効成分として含有する肝
疾患予防・治療剤。 （２）ニューロトロフィンが脳由来神経栄養因子である
（１）の肝疾患予防・治療剤。 （３）ニューロトロフィンを有効成分として含有する脂
肪肝予防・治療剤。 （４）ｔｒｋＡ、ｔｒｋＢおよび／またはｔｒｋＣ受容
体のアゴニストを有効成分として含有する肝疾患予防・
治療剤。

【０００８】以下、詳細に本発明を説明する。「ニュー
ロトロフィン」とは、生体で、神経成長の標的となる細
胞から分泌され、または自己分泌や傍分泌により神経
（ニューロン）の成長、分化、生存を助けて、神経回路
（シナプス）を形成させる神経栄養因子を意味する。具
体的には、ＢＤＮＦ、神経成長因子（以下、ＮＧＦと略
す）、ニューロトロフィン−３（以下、ＮＴ−３と略
す）、ニューロトロフィン−４（以下、ＮＴ−４と略
す）、ニューロトロフィン−５（以下、ＮＴ−５と略
す）、ニューロトロフィン−６（以下、ＮＴ−６と略
す）等が挙げられる。好ましいものとしては、ＢＤＮ
Ｆ、ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−５、ＮＴ−６等が挙げ
られる。特に好ましいものとしては、ｔｒｋＢまたはｔ
ｒｋＣ受容体を介して、生理活性を発現するＢＤＮＦ、
ＮＴ−３、ＮＴ−４が挙げられる。

【０００９】「ｔｒｋＡ、ｔｒｋＢおよび／またはｔｒ
ｋＣ受容体アゴニスト」とは、「ニューロトロフィン」
の受容体として知られるｔｒｋ遺伝子発現産物のうち、
ｔｒｋＡ、ｔｒｋＢまたはｔｒｋＣに結合してこれらの
受容体を活性化させ、作用を発現させる物質の総称であ
る。具体的には既知のニューロトロフィンとしてｔｒｋ
Ａに結合するＮＧＦ、ｔｒｋＢに結合するＢＤＮＦ、Ｎ
Ｔ−４、ｔｒｋＣに結合するＮＴ−３等が挙げられる。
この概念には、それぞれの「ニューロトロフィン」の改
変体（アミノ酸置換、欠失、付加改変体、糖鎖改変）の
みならず、より低分子のペプチド、有機化合物もｔｒｋ
Ａ、ｔｒｋＢまたはｔｒｋＣ受容体に対する結合能およ
び活性化能、例えばチロシン残基のリン酸化などを有す
る限り、「ｔｒｋＡ、ｔｒｋＢおよび／またはｔｒｋＣ
受容体アゴニスト」の概念に含まれる。

【００１０】本明細書において、「肝疾患予防・治療
剤」とは、肝臓への脂肪蓄積の防止あるいは肝実質細胞
の生存維持作用を有し、肝疾患患者に投与することによ
り、肝臓への脂肪の蓄積を防ぎ、肝機能を改善する薬剤
を意味する。肝疾患の代表例としては、脂肪肝、慢性肝
炎（ウィルス性、薬剤性、自己免疫性など）、肝硬変な
どが挙げられる。

【００１１】

【発明の実施の形態】（製造方法とアッセイ方法）本発
明の肝疾患予防・治療剤に用いるニューロトロフィン
（ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＮＴ−３、ＮＴ−４など）は、そ
れぞれ固有の生理活性を示すものであれば、天然抽出
品、遺伝子組換え品を問わず、精製して本発明に使用す
ることができる。例えば、ＢＤＮＦの場合、Ｂａｒｄ
ｅ，Ｙ．Ｅ（Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊ．，ｖｏｌ．５、ｐ．
５４９−５５３（１９８２））らによって、最初ブタ脳
から単離され、その後、１１９個のアミノ酸から成る一
次構造が解析されたものであるが（Ｌｅｉｂｌｏｃｋ，
Ｊ．ｅｔ ａｌ．：Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．３４１ ｐ．
１４９（１９８９））、Ｎ末端にメチオニン残基を有す
るＭｅｔ−ＢＤＮＦ、現在公知の手法にて上記の天然配
列の一部を置換、欠失あるいは付加して作成した組換Ｂ
ＤＮＦ改変体も、ＢＤＮＦ活性を有する医薬製剤である
限り、本発明に含まれる。

【００１２】ＢＤＮＦ活性とは、後根神経節、迷走神経
下神経節、運動ニューロン、網膜神経節、黒質ドーパミ
ン作動性ニューロン、前脳基底野コリン作動性ニューロ
ン等の生存維持・分化促進作用などを意味する。この生
体での作用は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで
確認する事ができる（特開平５−３２８９７４、ＵＳ
５,１８０,８２０）。

【００１３】ＢＤＮＦの製造方法は種々報告されてお
り、何れの製法によるＢＤＮＦも本発明の製剤に用いる
ことができる。動物組織からの抽出品の場合、医薬とし
て使用できる程度に精製されたものであれば良い（Ｔｈ
ｅ ＥＭＢＯ Ｊ．，ｖｏｌ．５，ｐ．５４９（１９８
２））。また、ＢＤＮＦを産生する初代培養細胞や株化
細胞を培養し、培養物（培養上清、培養細胞）から分離
精製してＢＤＮＦを得ることもできる。さらに、遺伝子
工学的手法によりＢＤＮＦをコードする遺伝子を適切な
ベクターに組み込み、これを適切な宿主に挿入して形質
転換し、この形質転換体の培養上清から目的とする組換
えＢＤＮＦを得ることができる（例えば、Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．８８，
ｐ．９６１（１９９１）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈ
ｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．ｖｏｌ．１８６，ｐ．１
５５３（１９９２））。遺伝子工学的手法は均質かつ大
量のＢＤＮＦの製造に好適である。上記宿主細胞は特に
限定されず、従来から遺伝子工学的手法で用いられてい
る各種の宿主細胞、例えば大腸菌、枯草菌、酵母、植物
又は動物細胞を用いることができる。他のニューロトロ
フィンのＮＧＦ、ＮＴ−３、ＮＴ−４等についても、遺
伝子組換え品の製造が報告されている。ＮＧＦはＢＤＮ
Ｆと同様に、種々の宿主細胞で発現させ、製造すること
ができる（ＣＨＯ細胞：Ｓｃｈｍｅｌｚｅｒ Ｃ．
Ｈ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｏｒｙ，ｖｏｌ．
５９，ｐ．１６７５（１９９２）大腸菌：日本特許２６
３７３９２号）。ＮＴ−３はＢＤＮＦと同様に、種々の
宿主細胞で発現させ、生産することができる。Ｎｅｕｒ
ｏｎ，ｖｏｌ．４，ｐ．７６７（１９９０）、あるいは
特開平５−１６１４９３（ＷＯ９１／３６５９）にその
製法、アッセイ法が開示されている。ＮＴ−４はＢＤＮ
Ｆと同様に、種々の宿主細胞で発現させ、製造すること
ができる。Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ，ｖｏｌ．８９，ｐ．３０６０（１９９２）、特表
平７−５０９６００（ＷＯ９３／２５６８４）、あるい
は特表平６−５０１６１７（ＷＯ９２５２５４）に組換
えＮＴ−４の発現方法およびアッセイ方法が記載されて
いる。

【００１４】（再生または精製）組換え技術により生産
されたニューロトロフィンは、生化学の分野で公知の方
法にて、再生または精製が可能である。変性剤と還元剤
による処理、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾
過、逆相ＨＰＬＣ、硫安沈澱、限外濾過などが適宜組み
合わせて用いられる。ニューロトロフィンに対する抗体
は、ポリクローナル、モノクローナル共に、自体公知の
方法で作製し得る。特異的抗体は抗体カラムやＥＬＩＳ
Ａ等の免疫化学的定量法に使用できる。ニューロトロフ
ィンの再生や精製に関する報告は下記の通りである。

【００１５】（１）Ｊ．ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａ
ｐｈｙ，ｖｏｌ．６３２，ｐ．２９（１９９３） （２）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ．３２，ｐ．
１０８１２（１９９３） （３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ．３３，ｐ．
４６６７（１９９４）

【００１６】（製剤）製剤としては、注射剤、経口剤、
液剤、凍結乾燥品いずれも用いることが出来るが、特に
皮下または筋肉内投与用注射製剤が好ましい。これら非
経口投与製剤には、当該分野にて公知の安定化剤、緩衝
剤、担体を用いることができる。例えば、アルブミン等
の血漿由来蛋白、グリシン等のアミノ酸、マンニトール
等の糖を用いることができる。凝集を防ぐためにＴｗｅ
ｅｎ８０などの界面活性剤や長期保存のため殺菌剤を添
加しても良い。長期の薬効を要する場合は、公知のタン
パク徐放性製剤担体（ポリ乳酸−ポリグリコール酸共重
合体、コラーゲン、シリコンなど）を用いて製剤する事
もできる。

【００１７】（使用方法）本発明の肝疾患予防・治療剤
は、主成分がＢＤＮＦの場合、通常成人キログラムあた
り０.５μｇ〜５０ｍｇを静脈内、皮下、または筋肉内
投与する。投与回数は投与量、投与経路や患者の症状に
より適宜増減されるものであるが、月１回から１日３回
の投与が可能であり、一般的には週１から７回、数週間
の投薬治療が行われる。この治療により、肝細胞は保
護、再生あるいは賦活され、肝疾患が改善される。イン
ターフェロンや他の肝疾患治療剤と併用も可能である。

【００１８】（毒性）ニューロトロフィン、特にＢＤＮ
Ｆの場合、毒性は低いことが知られている。ラットおよ
びカニクイザルで、それぞれを１００ｍｇ／ｋｇ、６０
ｍｇ／ｋｇの皮下投与を４週間実施したが、死亡例はな
く、また、急性毒性の点についても、ラットおよびカニ
クイザルで２００ｍｇ／ｋｇ以上の投与量でも死亡の発
現は無かった。他のニューロトロフィンについても、特
に重篤な副作用は報告されていない。

【００１９】

【実施例】以下、本発明を実施例にて説明する。 実施例１ 肥満糖尿病モデル動物（ｄｂ／ｄｂマウス）の肝臓肥
大、脂肪肝に対するＢＤＮＦの作用 （１）実験材料と方法 試薬：ＢＤＮＦはリジェネロン社より入手し、使用し
た。溶媒として市販のダルベッコ燐酸緩衝溶液（Ｄｕｌ
ｂｅｃｃｏ'ｓ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ
Ｓａｌｉｎｅ：Ｄ−ＰＢＳ、ギブコ社）を使用した。そ
の他の試薬は市販の特級試薬を用いた。 実験動物：雌性Ｃ５７ＢＬ／ＫｓＪ−ｄｂ／ｄｂマウス
（ＳＰＦ規格）を日本クレア（株）より購入した。予備
飼育の後、１２週齢時より実験を開始した。マウスは飼
育環境として、温度２３±２℃（設定値）、湿度５５±
１０％（設定値）、照明のサイクルは８：００〜２０：
００に点灯、２０：００〜８：００に消灯するように常
時設定されている部屋で飼育した。飼料は固形飼料（Ｃ
Ｅ−２、日本クレア）を用い、飲料水は滅菌水を給水瓶
にて自由に摂取させた。

【００２０】（２）ＢＤＮＦ投与液の調製 ＢＤＮＦ投与液はＤ−ＰＢＳで３.５ｍｇ／ｍｌに希釈
し、３５ｍｇ／ｋｇ／回の用量を週２回投与した。溶媒
としてＤ−ＰＢＳを同量投与した。

【００２１】（３）肝臓湿重量に対するＢＤＮＦの作用 予備飼育の完了したｄｂ／ｄｂマウスをその血糖値を指
標に溶媒投与群、ＢＤＮＦ投与群に群分けし、それぞれ
ＢＤＮＦあるいは溶媒を週２回皮下投与した（各群８
匹）。３週間投与を行ったマウスより肝臓を摘出し、湿
重量を測定した結果を図１ａに示した。また、肝臓湿重
量を体重で補正した結果を図１ｂに示した。その結果、
ＢＤＮＦ投与群の肝臓湿重量は溶媒投与群よりも有意に
低く、肥満糖尿病モデル動物で見られる肝臓の肥大がＢ
ＤＮＦの投与により改善されていることが分かった。ま
た、この肝臓の肥大の抑制効果は体重で補正しても統計
学的に有意であることから、体重変化の影響ではないこ
とが確認できた。

【００２２】（４）肝臓組織中の脂質含量に対するＢＤ
ＮＦの作用 ＢＤＮＦの肝臓組織中の脂質含量への作用について調べ
るため、摘出した肝臓中のトリグリセリド含量を酵素法
にて測定した（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．ｖｏｌ．３６，
ｐ．１６０５（１９９０））。肝臓を破砕し、クロロホ
ルム：メタノール（２：１）混液を用いて懸濁し、０.
６％ＮａＣｌを加えて攪拌後、遠心分離により有機層と
水層を分離した。有機層から溶媒を気化させることによ
り得られた沈殿を、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含
むリン酸緩衝液で溶解し、Ｎ−トリグラーゼ「ニッスイ」
（日水製薬）を用いてトリグリセリド含量を測定した
（図２）。その結果、溶媒投与群と比較して、ＢＤＮＦ
投与群の肝臓組織中トリグリセリド含量が有意に減少し
ており、脂肪肝が改善されていることが明らかとなっ
た。

【００２３】（５）肝漏出酵素に対するＢＤＮＦの作用 脂肪肝の患者では血清中のアラニンアミノトランスフェ
ラーゼ（ＡＬＴ）が上昇していることが知られている
（Ｅｎｚｙｍｅ ｖｏｌ．３６、ｐ．２６６（１９８
６））。そこで、ＢＤＮＦあるいは溶媒を３週間投与し
たｄｂ／ｄｂマウスより血液を採取し、血清中のＡＬＴ
を測定した（図３）。その結果、溶媒投与群と比較し
て、ＢＤＮＦ投与群ではＡＬＴが有意に低いことが分か
り、肝臓からの漏出酵素を指標にしても、ＢＤＮＦが脂
肪肝を改善していることが確認できた。

【００２４】（６）肝臓組織像に対するＢＤＮＦの作用 実践病理組織細胞染色法カラー図鑑ｐ.９６（ＨＢＪ出
版局）に記載の方法により、肝臓組織の凍結切片に対し
てオイルレッドＯ染色を施し、肝臓組織中の脂肪含量を
観察した。溶媒投与群の肝臓組織像を図４ａ、ＢＤＮＦ
投与群の肝臓組織像を図４ｂに示した。図中、オイルレ
ッドＯで染色される脂肪滴は黒い点として表される。図
４ａおよび図４ｂを比較すれば明らかなように、溶媒投
与群の肝臓では脂肪滴が大きくかつ多数観察されるのに
対して、ＢＤＮＦ投与群では脂肪滴が非常に小さく、脂
肪含量が著しく少なくなっていることが認められた。

【００２５】（製剤例１）本発明の肝疾患予防・治療剤
のうち、代表的なものであるＢＤＮＦ含有皮下投与用水
溶製剤は、以下のように製造することができる。 （１）精製組換えＢＤＮＦ（リジェネロン社より入手）
２０ｍｇに対し、マンニトール１０ｍｇ、非イオン性界
面活性剤：ポリソルベート８０、０.１ｍｇを加え、燐
酸緩衝液１ｍｌ（ｐＨ７.０、１０ｍＭ）に溶解させ
る。

【００２６】

【発明の効果】本発明の肝疾患予防・治療剤は、脂肪肝
の防止および肝実質細胞の保護作用により、種々の肝臓
障害を改善しうる。

【図面の簡単な説明】

【図１】 ｄｂ／ｄｂマウスの肝臓肥大に対するＢＤＮ
Ｆの作用。白色のカラムは溶媒投与群、黒色のカラムは
ＢＤＮＦ投与群を示す。縦軸は肝臓の湿重量（図１
ａ）、肝湿重量を体重で補正した割合（％）（図１ｂ）
を示す。溶媒投与群で見られる肝臓の肥大がＢＤＮＦ投
与群では顕著に改善されていることが分かった。データ
は各群（８匹）の平均値＋ＳＤで示した。＃＃はＳｔｕ
ｄｅｎｔのｔ検定においてＰ＜０．０１で溶媒投与群に
対して有意であることを示している。

【図２】 ｄｂ／ｄｂマウスの肝臓組織中の脂肪含量に
対するＢＤＮＦの作用。縦軸は溶媒投与群の肝臓組織中
のトリグリセリド含量を１００％とした相対値を示す。
白色のカラムは溶媒投与群、黒色のカラムはＢＤＮＦ投
与群を示す。データは各群（８匹）の平均値＋ＳＤで示
した。＃＃はＳｔｕｄｅｎｔのt検定において溶媒投与
群に対してＰ＜０．０１の有意差があることを示してい
る。

【図３】 ｄｂ／ｄｂマウスの肝漏出酵素（ＡＬＴ）に
対するＢＤＮＦの作用。縦軸はＡＬＴ値を示す。白色の
カラムは溶媒投与群、黒色のカラムはＢＤＮＦ投与群を
示す。データは各群（８匹）の平均値＋ＳＤで示した。
＃＃はＳｔｕｄｅｎｔのt検定において溶媒投与群に対
してＰ＜０．０１の有意差があることを示している。

【図４】 ｄｂ／ｄｂマウスの肝臓組織像（溶媒投与
群：図４ａ、ＢＤＮＦ投与群：図４ｂ）。オイルレッド
Ｏで染色される脂肪滴は黒い点として表される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 中川 勉 大阪府大阪市此花区春日出中３丁目１番98 号 住友製薬株式会社内 (72)発明者 岸野 道子 大阪府大阪市此花区春日出中３丁目１番98 号 住友製薬株式会社内 (72)発明者 ジェームズ・アール・トンラ アメリカ合衆国01845マサチューセッツ州 ノース・アンドーバー、ロイヤル・クレス ト・ドライブ30番、アパートメント２

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ニューロトロフィンを有効成分として含
   有する肝疾患予防・治療剤。
2. 【請求項２】 ニューロトロフィンが脳由来神経栄養因
   子である請求項１の肝疾患予防・治療剤。
3. 【請求項３】 ニューロトロフィンを有効成分として含
   有する脂肪肝予防・治療剤。
4. 【請求項４】 ｔｒｋＡ、ｔｒｋＢまたはｔｒｋＣ受容
   体のリガンドを有効成分として含有する肝疾患予防・治
   療剤。
5. 【請求項５】 ニューロトロフィンの肝疾患予防・治療
   用製剤の調製における使用。
6. 【請求項６】 ニューロトロフィンが脳由来神経栄養因
   子である請求項５の使用。
7. 【請求項７】 肝疾患患者にニューロトロフィンの有効
   量を投与することを特徴とする肝疾患の予防・治療法。
8. 【請求項８】 ニューロトロフィンを静脈内、皮下また
   は筋肉内注射によって投与する請求項７の方法。
9. 【請求項９】 ニューロトロフィンが脳由来神経栄養因
   子である請求項７または８の方法。