JP2000157277A - 植物におけるｄｎａ断片の獲得方法とその利用 - Google Patents

植物におけるｄｎａ断片の獲得方法とその利用

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Abstract

(57)【要約】 【課題】 植物の育種における有効な選抜指標となるＤ
ＮＡ断片の獲得方法及びこれを活用した育種方法を提供
する。また人為的な遺伝子発現を行う方法を提供する。 【解決手段】 植物を材料とし、ゲノム比較によって得
られる多型ＤＮＡ断片を収集した後、これをＲＮＡ由来
の標識プローブを用いて選抜されたＤＮＡ断片を得るこ
とを特徴とする植物におけるＤＮＡ断片の獲得方法。該
ＤＮＡ断片をコードする遺伝子。該遺伝子を利用する、
プロモーター、発現ベクター、形質転換植物。該ＤＮＡ
断片を指標とする植物の育種方法。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は遺伝子工学及び分子
遺伝学の分野を用いた植物のＤＮＡ断片の獲得とこれら
を活用した植物、特に林木の育種方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】育種における典型的な手法は、経験者に
よる発現形質の観察データや分析データを基にした優良
個体候補の選抜に始まる。これらの優良個体候補は検定
試験を経過したのち、正式な優良個体として保存される
(品種の登録)。更には、選抜された優良個体間の交配に
より親形質の良い形質を併せ持った後代個体の作出を行
うことが重要である。多くの生物種において選抜あるい
は交雑育種の歴史は様々であるが、例えば、林木等の場
合はそれ自身の成長に時間がかかることから特に交雑育
種の歴史は浅く、これからの成果が期待される。育種上
有用とされる形質の多くは、多くの生理学的現象が統合
された結果として現れる(例えば、林木の場合では材の
性質、材の密度など)。１つ１つの現象は個体の特つす
べての遺伝子情報(ゲノム)に規定され、必要に応じて発
現していると考えられる。しかしながら、実際に鍵とな
る生理学的現象を正確に把握することや、個々の現象の
連携システムを知ることは非常に困難である。実際の育
種では、何世代にも及ぶ遺伝家系を作製し、後代検定に
より有用形質の絞り込みを行うことが一般的である。近
年表現形質に加えて、酵素や核酸の分子生物学的解析デ
ータを1つの形質のように扱うようになった。これによ
って、無作為ではあるもののゲノム上のマーカー数が飛
躍的に高まった。ある遺伝家系にこのような多くのマー
カーを適用し、得られる多型データを統計学的に処理す
ることで、その家系に特有な遺伝子連鎖地図が作製され
るようになった。地図上のマーカーが適度に分散しかつ
多数存在すれば、理論的にはある表現形質と強く連鎖す
るマーカーが見出せると考えられ、すなわち、統計遺伝
学的なレベルでの形質判定が可能と思われる。しかしな
がら、いままでのところ、こうした分子マーカーを選抜
基準として作用させた選抜の実施を公に報告した例はな
い。これの要因として、後述する問題点が考えられる。
【０００３】ゲノムには何らかの遺伝子情報を規定して
いる部分（コード領域）とそれ以外の部分〔非コード領
域（機能などは不明、繰り返し、反復などの塩基配列一
次構造上の特徴が認められている）〕が存在する。非コ
ード領域はゲノムの大部分を占めており、コード領域は
ゲノム全体に点在している。一般的に活用されている分
子マーカー（特にＤＮＡに由来するもの）は、無作為に
獲得されることがほとんどであり、多くの分子マーカー
がこのような非コード領域に由来することが否めない。
すなわち、現行の分子マーカーは個々の形質発現とは無
関係な任意なものである。したがって、ゲノム上の個体
間差あるいは種間差によっては、任意の分子マーカーが
普遍的に作用できない場合が生じる。すなわち、林木な
どを含め多くの生物種では、個体毎のヘテロ性が認めら
れるため、育種への応用を考えた場合に、現状のマーカ
ーでは特定個体を母材に用いた場合にのみ有効でしかな
い可能性が高い。このような状況を打開するために、有
用形質の判定が可能で、かつヘテロ性にとらわれない普
遍的な利用が可能な育種マーカーの獲得が望まれてい
た。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、植物におい
て、育種目標となる形質の発現に関わる遺伝子あるいは
遺伝子群に由来するＤＮＡ断片を単離することを目的と
する。また、本発明は、該ＤＮＡ断片を解析することに
よって得られるプロモーター配列の利用、更には該ＤＮ
Ａ断片を育種における選抜指標として活用する育種方法
を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明を概説すれば、
（１）植物を材料とし、ゲノム比較によって得られる多
型ＤＮＡ断片を収集した後、これをＲＮＡ由来の標識プ
ローブを用いて選抜されたＤＮＡ断片を得ることを特徴
とする植物におけるＤＮＡ断片の獲得方法、（２）
（１）記載の方法により得られるすべてのＤＮＡ断片、
（３）（２）記載のＤＮＡ断片をコードする遺伝子、
（４）（３）記載の遺伝子の少なくとも一部を含み、プ
ロモーター活性を有するＤＮＡ、（５）（４）記載のＤ
ＮＡを含む発現ベクター、（６）（５）記載の発現ベク
ターを保持する細胞に由来するか、これを含む形質転換
植物、（７）（２）記載のＤＮＡ断片を指標とすること
を特徴とする植物の育種方法からなる。
【０００６】本発明者らは、育種目標となる形質の発現
に関わる遺伝子あるいは遺伝子群の存在を見出す方法を
検討した。多くの植物種においては、人為的な選抜が行
われた作物品種と異なり、個体間の遺伝子型にばらつき
が見られるため（高いヘテロ性）、形質発現に顕著な差
が認められることが多い。すなわち、形質発現の差が大
きい個体間のゲノム比較を行うことにより、ゲノム上の
差異を拾い上げることが可能であると構想した。ゲノム
比較についての具体的な手段としては、近年複数の方法
が開示されており、リシチン（Lisitsyn）らにより示さ
れたゲノム比較法であるレプリゼンテーション ディフ
ァレンス アナリシス（representation difference an
alysis）を用いた。この方法により、ゲノム間差異に由
来すると考えられるＤＮＡ断片が多く検出される。これ
らのＤＮＡ断片は、両ゲノム間で認められる多型部位を
直接反映した結果として得られるが、多くのＤＮＡ断片
は特定の遺伝子をコードしていない非コード領域に由来
すると考えられる。これらを１つ１つ解析することは困
難であることから排除する方法を構想した。そうするこ
とによって、コード領域に由来するＤＮＡ断片のみを獲
得することができる。本発明者らは解析の対象となる個
体から全RNAを抽出し、これを鋳型に用いて相補的なＤ
ＮＡ（cＤＮＡ）を作製し、この際に化学標識物質を作
用させてcＤＮＡの化学標識を行った。先に述べたゲノ
ム間差異に由来するＤＮＡ断片をアクリルアミドゲル電
気泳動にて分画した後、ナイロンメンブランに転写、固
定後、常法に従ってハイブリダイゼーションを行い、ポ
ジティブなＤＮＡ断片をいくつか検出した。また、これ
らの断片をプローブに用いて常法に従いゲノムに対して
ハイブリダイゼーションを行い、ゲノム間差異を反映し
た多型が検出されることにより、本発明を完成した。
【０００７】
【発明の実施の形態】以下、本発明を具体的に説明す
る。以下に、本発明の実施の形態として、本発明におけ
るゲノム比較法、及び本発明のＤＮＡ断片の利用法を詳
細に説明する。なお、ＤＮＡの切断、連結、大腸菌の形
質転換、遺伝子の塩基配列決定、ハイブリダイゼーショ
ン等の遺伝子組換えに必要な一般的な方法は、各操作に
使用する市販の試薬、機械装置等に添付されている説明
書や実験書〔例えば、１９８２年、コールド スプリン
グ ハーバーラボラトリー発行、Ｔ．マニアティス
（Ｔ．Maniatis）ほか著、モレキュラー・クローニン
グ、ア・ラボラトリー・マニュアル（ Molecular Cloni
ng,A Laboratory Manual）参照〕に記載されている方法
に従った。
【０００８】＜１＞ゲノム比較並びにＲＮＡ由来の標識
プローブを用いて選抜されたＤＮＡ断片の獲得 本発明におけるゲノム比較並びにＲＮＡ由来の標識プロ
ーブを用いて選抜されたＤＮＡ断片の獲得方法、並びに
該方法により得られるＤＮＡ断片は、第１に、植物組
織、例えばアカシアの植物組織由来のゲノムＤＮＡをゲ
ノム比較法によってＤＮＡ断片として収集・選抜するこ
とを特徴とする。ゲノム比較法については、イン ゲル
コムペティティブ リアソシエーション（in gel com
petitive reassociation）(IGCR)法〔ヨコタ H、（Yok
ota H.）ほか、１９９０〕、リストリクション ランド
マーク ゲノム スキャニング（restriction landmark
genome scanning）(RLGS)法〔ハタダ Ｉ、（Hatada
I.）ほか１９９１〕、既述のレプリゼンテーション デ
ィファレンス アナリシス(RDA)法（リシチン Ｎ．、
１９９３）が挙示される。RDA法については、宝酒造社
から解析用キットが販売されている。上記のどの方法を
用いても、任意の植物ゲノムを材料として多型検出が可
能である。更に、本発明のゲノム比較並びにＲＮＡ由来
の標識プローブを用いて選抜されたＤＮＡ断片の獲得方
法並びにＤＮＡ断片は、最終的に、上記で得られるＤＮ
Ａ多型断片に対し、ゲノム比較の材料として用いた個体
よりＲＮＡを抽出し、ファルマシア・アマシャム社製の
逆転写酵素を用いてcＤＮＡを合成する際に、例えばロ
ッシュ・ダイアグノスティクス社製の標識物質であるジ
ゴキシニゲン-dＵＴＰ（ＤＩＧ）を混合して作製された
ＤＩＧ標識cＤＮＡをプローブに用いて、常法によりハ
イブリダイゼーションを行い、ポジティブなバンドを選
択することを特徴とする。上記の工程によって得られた
ＤＮＡ断片は、ゲノム比較並びにＲＮＡ由来の標識プロ
ーブを用いて選抜されたＤＮＡ断片である。上記方法に
より、比較対象となる植物間においてゲノム上の差異に
由来し、かつ何らかの遺伝子発現を伴う領域、すなわ
ち、比較対象とした個体間の形質差異の要因となってい
る遺伝子の一部を取得することができる。
【０００９】本発明により、対象となる形質発現を司る
遺伝子の存在、あるいは発現の有無を判定するための指
標（ＤＮＡマーカー）を単離する方法が確立され、これ
らの指標は具体的には育種における選抜マーカーとして
活用することが可能である。本発明により得られたＤＮ
Ａ断片の具体的な提示は後述の実施例の項で詳細に説明
する。
【００１０】＜２＞本発明のＤＮＡ断片に由来するプロ
モーター領域の単離、及び解析 本発明によって得られるＤＮＡ断片は、対象となる形質
発現を司る重要な遺伝子の一部に由来することから、得
られたＤＮＡ断片を解析することによって、容易にプロ
モーター領域を獲得することが可能である。
【００１１】＜３＞本発明のＤＮＡ断片に由来するプロ
モーター領域を導入した形質転換植物の作製 上記で示したプロモーター領域の少なくとも一部を含む
領域の下流に、植物細胞で発現させることを所望する任
意の遺伝子のコード領域部分を順方向に転写されるよう
に結合し、形質転換ベクターに組込んで組換えＤＮＡを
作製する。この際、形質転換に利用可能なベクターは植
物の形質転換法に応じて異なる。例えば、パーティクル
ガン法、ＰＥＧ法、エレクトロポレーション法（電気穿
孔法）等により植物細胞を形質転換する際には、例えば
ブルースクリプト（Bluescript）（ストラータジーン社
製）等の大腸菌で利用可能なプラスミドベクターが形質
転換ベクターとして使用できる。また、リーフディスク
法、インフィルトレーション法等のアグロバクテリウム
感染法によって植物体や植物細胞を形質転換する際に
は、例えばＴｉプラスミド由来のpＢＩ121（クローンテ
ック社製）等のバイナリーベクターが利用可能である。
植物細胞の形質転換は、パーティクルガン法、ＰＥＧ
法、エレクトロポレーション法、アグロバクテリウム感
染法によって植物細胞あるいは植物体に組換えＤＮＡを
導入することによって可能である。なお、植物細胞に導
入した組換えＤＮＡは植物のゲノムＤＮＡに組込まれる
ことが望ましい。形質転換植物体、あるいは形質転換植
物細胞は、形質転換に用いる組換えＤＮＡ中にカナマイ
シンやハイグロマイシン等に対する薬剤耐性遺伝子を組
込んでおくことによって、これらの薬剤を含む寒天固定
培地上あるいは液体培地中で栽培あるいは培養すること
により安定的に維持することが可能である。本発明のＤ
ＮＡ断片に由来するプロモーター領域は、シロイヌナズ
ナやタバコのような双子葉植物、イネやトウモロコシの
ような単子葉植物、ポプラ、ユーカリ、アカシア等の木
本性植物の植物体及び植物細胞に導入可能である。本発
明におけるプロモーター活性を有するＤＮＡの制御下に
ある遺伝子としては、あらゆる外来遺伝子が考えられ
る。特にレポーター遺伝子を結合した組換えＤＮＡを導
入した植物体では、育種の対象となる形質を向上させる
ための薬剤のスクリーニングに用いるなどの利用方法が
あり、これらの産業の発展にも貢献することが可能であ
る。
【００１２】
【実施例】以下、本発明を実施例によって更に具体的に
説明するが、本発明は実施例に限定されない。
【００１３】実施例１ ゲノム比較並びにＲＮＡ由来の
標識プローブを用いて選抜されたＤＮＡ断片の獲得 「材料と方法」ゲノム比較法として、ＲＤＡ法を用い
た。材料にはアカシア属のアウリカリフォルミス種の兄
弟個体群より、成長差の著しい２個体を用いた。これら
は同時期に播種し、同一の環境下で栽培を行い２年を経
過した段階では樹高で約５０センチの差が認められた。
根本径についても約２センチの差が認められた。各々の
葉から常法により調製したゲノムＤＮＡを用いてリシチ
ンらの方法に従い、ゲノムサブトラクションを行った。
【００１４】上記の２個体より、全ＲＮＡを抽出した。
抽出方法は日尾野らの方法（特開平８−８０１９１号）
に従った。当該抽出方法の発明は、木本性植物組織をバ
ナジルリボヌクレオシド化合物及び臭化ヘキサデシルト
リメチルアンモニウムを含有する緩衝液中で処理するこ
とを特徴とする木本性植物からの核酸抽出方法に関す
る。得られたＲＮＡ及びオリゴヌクレオチド〔配列表の
配列番号１（5'-GGGAGGCCCCTTTTTTTTTTTTTTTT-3'）〕を
基にファルマシア社製のcＤＮＡ合成キットを用いて一
本鎖cＤＮＡを作製した。得られた一本鎖cＤＮＡの5'末
端側に宝酒造社製のターミナルデオキシヌクレオチジル
トランスフェラーゼ及びデオキシグアニンを用いて十数
個のグアニン鎖を連結した。次いで２種のオリゴヌクレ
オチド〔配列表の配列番号１、及び配列表の配列番号２
（5'-AAGGAATTCCCCCCCCCCCCCC-3'）〕をプライマーに用
いたＰＣＲ法によってcＤＮＡ断片の増幅を行った。こ
の際の増幅反応溶液中に、ロッシュ・ダイアグノスティ
クス社製の標識物質であるジゴキシニゲン-dＵＴＰ（Ｄ
ＩＧ）を混合することにより、増幅ＤＮＡを化学標識
し、cＤＮＡ由来の発現プローブとした。リシチンらの
方法により得られたサブトラクション後のＤＮＡ断片
を、アクリルアミドゲル電気泳動法により分画後、日本
エイドー社製の核酸転写装置を用いて、ロッシュ・ダイ
アグノスティクス社製のナイロン膜に転写し、サブトラ
クションフィルターとした。上記の発現プローブを用い
て、これらのフィルターのハイブリダイゼーションを常
法に従い行った。ポジティブなＤＮＡ断片をインビトロ
ゲン社製のTAクローニングキットを用いてサブクローニ
ングし、ダイデオキシ法により塩基配列を決定した。
【００１５】「結果」サブトラクションが十分に作用し
た場合、材料に同一のゲノムを用いたときは、理論的に
はＤＮＡ断片が残存しないことになる。しかしながら、
実際の条件下では多くのＤＮＡ断片が認められることが
判明した。これはゲノム上における細かな差異に因るも
のと考えられ、ヘテロ性を有する生物を材料に用いた場
合にはこれらをいかにして排除するかが必要である。こ
れに対応する手段として、本発明者らは同一個体間にお
けるサブトラクションを行うことによって、内在性のヘ
テロ変異の検出を試みた。すなわちこれを対照実験とし
て用いることにより、目的とする個体間のサブトラクシ
ョン結果に対比させることで本来の個体間におけるゲノ
ム比較を正確に判断できるように工夫した。これは発現
プローブを用いたハイブリダイゼーションにおいても反
映できるためヘテロ性の高い材料を用いる場合の必須条
件と言える。
【００１６】実験対象とした２個体について、相互にサ
ブトラクションを行い最終的に６つのＤＮＡ断片を獲得
した（図１参照）。なお、図１は、アカシアにおけるゲ
ノムサブトラクション（上段）及び発現プローブによる
ハイブリダイゼーション（下段）の結果を示す図であ
る。図１は個体番号２（成長の良いアカシア個体）をサ
ブトラクションされる側（testerと示した）とし、個体
番号４（成長のよくないアカシア個体）をサブトラクシ
ョンする側（driverと示した）に用いた場合の結果であ
る。サブトラクションは原法に従い３回連続して行って
おり、制限酵素は３種類（BamHI, EcoRI, HindIII）を
用いた。 tester及びdriver双方とも個体番号２となっ
ているものは、比較のための対照実験として行った同一
個体間によるサブトラクションを示す。図１中の丸印
は、サブトラクションにより選抜されてきたＤＮＡ断片
の中で、更に発現プローブと相補的であると判断される
ものを示す。
【００１７】得られたＤＮＡ断片を実験に用いた２種の
アカシアのゲノムに対してサザン分析を行い、多型が認
められることを確認した。
【００１８】
【発明の効果】本発明により、植物よりゲノム比較によ
って得られる多型ＤＮＡ断片を収集した後、これをＲＮ
Ａ由来の標識プローブを用いて選抜されたＤＮＡ断片を
得るための方法が確立された。これによって、個体に特
異的な形質発現の有無を判定でき、かつゲノム上のヘテ
ロ性にとらわれない普遍的な育種マーカーの獲得が可能
となった。更には、本方法により得られるＤＮＡ断片が
コードする遺伝子、あるいはプロモーター領域を利用す
ることによって人為的な発現調節も可能である。
【００１９】
【配列表】 SEQUENCE LISTING < 110 > Junko Koshiyama,. Takashi Hibino < 120 > Isolation of DNA fragments from plant and application of those < 130 > １−９８１１０２−１ < 160 > ２ < 170 > patentln version 2.0
【００２０】 < 210 > １ < 211 > ２６ < 212 > DNA < 213 > Artificial Sequence < 220 > Synthetic primer for PCR < 400 > １ gggaggcccc tttttttttt tttttt
【００２１】 < 210 > ２ < 211 > ２２ < 212 > DNA < 213 > Artificial Sequence < 220 > Synthetic primer for PCR < 400 > １ aaggaattcc cccccccccc cc
【図面の簡単な説明】
【図１】アカシアにおけるゲノムサブトラクション（上
段）及び発現プローブによるハイブリダイゼーション
（下段）の結果を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｆターム(参考） 2B030 AA03 AB03 AD06 CA06 CA17 CA19 CB03 4B024 AA08 CA01 CA04 CA09 CA11 CA20 DA01 FA02 HA09 HA13 HA14 4B065 AA88X AA88Y AA89X AA89Y AB01 BA02 BD50 CA46 CA53

Claims (7)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 植物を材料とし、ゲノム比較によって得
    られる多型ＤＮＡ断片を収集した後、これをＲＮＡ由来
    の標識プローブを用いて選抜されたＤＮＡ断片を得るこ
    とを特徴とする植物におけるＤＮＡ断片の獲得方法。
  2. 【請求項２】 請求項１に記載の方法により得られるす
    べてのＤＮＡ断片。
  3. 【請求項３】 請求項２に記載のＤＮＡ断片をコードす
    る遺伝子。
  4. 【請求項４】 請求項３に記載の遺伝子の少なくとも一
    部を含み、プロモーター活性を有するＤＮＡ。
  5. 【請求項５】 請求項４に記載のＤＮＡを含む発現ベク
    ター。
  6. 【請求項６】 請求項５に記載の発現ベクターを保持す
    る細胞に由来するか、これを含む形質転換植物。
  7. 【請求項７】 請求項２に記載のＤＮＡ断片を指標とす
    ることを特徴とする植物の育種方法。
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