JP2000074900A - 人工レセプターの評価方法 - Google Patents

人工レセプターの評価方法

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Abstract

(57)【要約】 【課題】 人工レセプターの開発にコンビナトリアルケ
ミストリーの手法を取り入れ、分子認識物質の開発の効
率化とその高性能化を図る。 【解決手段】 認識対象化合物、機能性モノマーおよび
架橋剤をバイアル中で重合させてバイアルの内面に認識
対象化合物を内包したポリマーからなる薄膜を形成さ
せ、次いでバイアル内を洗浄して該ポリマーから認識対
象化合物を除去し、次いでバイアル内へ認識対象化合物
の溶液を注入した後、バイアル中の上清液を取り出し、
上清液中に含まれる認識対象化合物の量を測定し、その
結果に基づいてポリマーに結合している認識対象化合物
の量を算出することにより、人工レセプターを評価する
方法。

Description

【発明の詳細な説明】
【発明の属する技術分野】最近、分離剤、センサ素材、
アッセイ用試薬等として、人工レセプターが用いられて
いる。この発明は、その人工レセプターを開発する際の
評価法に関するものである。
【０００１】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】生体
内では、極めて多種の化学物質の分子認識が正確に行な
われることにより、生体が諸機能を発現している。例え
ば、酵素はある特定な物質のみを認識することにより、
生体内での化学反応を効率的に触媒している。また、細
胞膜に存在する各種レセプターは特定物質とのみ選択的
に結合して、その物質のもつ細胞外部の情報を細胞内に
伝達し、その情報により細胞は生体内で必要とされる様
々な抑制・調整等の機能を果たしている。
【０００２】このレセプター分子を模倣し、優れた分子
認識機能を有するように人為的に設計・合成されたもの
が人工レセプターと呼ばれている。人工レセプターの設
計・合成法としては様々な方法があるが、近年開発され
たモレキュラーインプリンティング法［Ｗｕｆｆ、
Ｇ．；アンゲバイテ・ケミー・インターナショナル・エ
ディション，２４，１８１２〜１８３２（１９９５）］
が特に優れており、好ましい方法であると言われてい
る。
【０００３】モレキュラーインプリンティング法（以
下、「ＭＩ法」と略す）によれば、認識対象化合物と、
該認識対象化合物と相互作用を有する重合可能な有機化
合物（機能性モノマー）とを、架橋剤の存在下に重合さ
せて得られた重合体から、前記認識対象化合物を遊離、
除去させて、分子認識物質を得ることができる。この分
子認識物質は、前記標的分子の分子形状構造に相当する
空間を有する重合体であることに特徴がある。
【０００４】この人工分子認識物質（人工抗体）の製造
法とその利用は、特表平８−５０６３２０号に開示され
ている。その人工抗体の利用としては、イムノアッセイ
による抗原抗体反応の検出法が挙げられている。また、
ＭＩ法で得られた薄膜ポリマー（以下、モレキュラーイ
ンプリンティングポリマーと称する）を利用したバイオ
ミメティックセンサーが、特開平８−１５１６０号で開
示されている。
【０００５】このＭＩ法により、認識対象化合物に対し
適切な機能性モノマーを配し、架橋性モノマーとの重合
を行なえば、認識対象化合物にぴったりあった分子認識
ポリマーすなわち人工レセプターを得ることが可能であ
る。しかも、このモレキュラーインプリンティングポリ
マーは物理的、化学的にも安定であり、耐久性に優れて
いる。
【０００６】しかし、ＭＩ法で最適なモレキュラーイン
プリンティングポリマーを得るためには、幾つかの問題
点がある。まず、認識対象化合物に対する機能性モノマ
ー、架橋性モノマー等の成分の組み合わせや使用割合、
重合時に用いる溶媒などの条件検討が必要である。さら
に、得られたモレキュラーインプリンティングポリマー
を評価するためには、得られたポリマーを粉砕し、カラ
ムに充填し、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）
を用いて認識対象化合物に対する認識の度合いを測定す
るのに、時間と手間がかかりすぎる。この時間と手間を
軽減するものとして開発された従来のｉｎ−ｓｉｔｕ法
［Ｊ．Ｍａｔｓｕｉ，Ｔ．Ｋａｔｏ，Ｔ．Ｔａｋｅｕｃ
ｈｉ，Ｍ．Ｓｕｚｕｋｉ，Ｋ．Ｙｏｋｏｙａｍａ，Ｅ．
Ｔａｍｉｙａ，Ｉ．Ｋａｒｕｂｅ，アナリティカル・ケ
ミストリー，６５，２２２３（１９９３）］は、認識対
象化合物、機能性モノマー、架橋性モノマー、重合溶
媒、反応開始剤等からなる混合液を、ＨＰＬＣ用のカラ
ムに充填し、その中で重合させることにより、カラム内
でモレキュラーインプリンティングポリマーを直接製造
する方法である。この方法によれば、カラムをＨＰＬＣ
用のポンプに接続するだけで、モレキュラーインプリン
ティングポリマーの分子認識能力を評価できるが、それ
でもなお満足できるものではない。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者は、人工レセプ
ターの開発にコンビナトリアルケミストリーの手法を採
り入れることにより、分子認識物質の開発の効率化とそ
の高性能化を図り得ることを見出した。すなわち、本発
明は、新規ｉｎ−ｓｉｔｕ法を用いて、多数のバイアル
内で多種類の分子認識ポリマーをそれぞれ製造し、その
生成物からなる薄膜を各バイアル内に形成させ、得られ
たポリマーの分子認識の程度を評価する方法に関するも
のである。
【０００８】この発明によれば、多種類のモレキュラー
インプリンティングポリマーを各バイアル内で同時に製
造し、得られたポリマーの分子認識性能をフローインジ
ェクション分析法またはＨＰＬＣにより迅速に、かつ簡
便に行なうことができる。
【０００９】
【発明の実施の形態】本発明によれば、認識対象化合
物、機能性モノマーおよび架橋剤をバイアル中で重合さ
せてバイアル内に生成ポリマーの薄膜を形成させ、次い
でバイアル内を洗浄して認識対象化合物をポリマーから
除去し、次いでバイアル内へ認識対象化合物の溶液を注
入した後、上清液中に含まれる認識対象化合物の量を測
定し、その結果に基づいて個々の認識対象化合物にとっ
て最適な人工レセプターを見出す評価法が提供される。
【００１０】この発明で使用される機能性モノマーとし
ては、アクリル酸、メタクリル酸、イタコン酸、トリフ
ルオロメタクリル酸、ビニルピリジン、ビニルイミダゾ
ール、ビニル安息香酸、４−ビニルベンジルイミドジ酢
酸、２−アクリルアミド−２−メチル−１−プロパンス
ルホン酸、２，６−ビスアクリルアミドピリジン等が挙
げられる。これらの機能性モノマーは複数種組み合わせ
て使用してもよい。
【００１１】この発明で使用される架橋剤としては、エ
チレングリコール、エチレングリコールジメチルアクリ
レート、１，４−ジビニルベンゼン、Ｎ，Ｎ’−メチレ
ンビスアクリルアミド、Ｎ，Ｎ’−フェニレンビスアク
リルアミド、トリメチルプロパントリメタクリレート等
が挙げられる。
【００１２】重合溶媒としては、機能性モノマーと認識
対象化合物の相互作用を損なわず、各成分を溶解するこ
とができ、かつポリマーを多孔性にするためのポロジエ
ンとなり得るものがよく、具体的にはトルエン、ジクロ
ロメタン、クロロホルム、アセトニトリル、テトラヒド
ロフラン等が挙げられ、なかでもトルエンおよびジクロ
ロメタンが好ましい。機能性モノマーの使用割合として
は、認識対象化合物および機能性モノマーの種類にもよ
るが、通常、認識対象化合物１モルに対して機能性モノ
マーが１から１００モルの割合で用いられる。
【００１３】重合反応の条件としては、ラジカル重合
（塊状重合、懸濁重合、溶液重合、乳化重合、シード重
合、分散重合、逆懸濁重合、ソープフリー重合）、イオ
ン重合（アニオン重合、カチオン重合）、溶融重合、固
相重合、界面重合等が挙げられる。
【００１４】重合終了後のポリマーを洗浄するための洗
浄液としては、認識対象化合物とポリマーとの結合様式
にもよるが、通常、アルコール、水、各種の酸もしくは
塩基またはそれらの混合物等が挙げられる。
【００１５】本発明の方法では、コンビナトリアルケミ
ストリーの手法により、複数のバイアルを使用して、ポ
リマーの製造から得られたポリマーの評価までが一貫し
て行なわれる。具体的には、認識対象化合物、機能性モ
ノマー、架橋剤、重合溶媒、重合開始剤等のポリマー製
造のための試剤の分注；重合反応終了後、得られたポリ
マーから認識対象化合物等を除去するための洗浄液の注
入および排出；認識対象化合物の溶液のバイアル内への
注入およびバイアル内での上清液のバイアルからの排
出、得られた上清液中に含まれる認識対象化合物の定量
等を、コンビナトリアルライブラリー製造のための合成
ロボット、ライブラリーを評価するためのアッセイロボ
ット等を使用することにより、この発明の方法を効率よ
く実施することができる。
【００１６】認識対象化合物の定量方法は、吸光度、蛍
光、化学発光、生物発光、電気化学的検出、酵素活性を
指標とするものなどをＨＰＬＣやフローインジェクショ
ン分析法と組み合わせて行なうことができる。
【００１７】なお、この発明の方法を簡略化した次の方
法によっても、人工レセプターを評価することができ
る。すなわち、認識対象化合物、機能性モノマーおよび
架橋剤をバイアル中で重合させてバイアル内に生成ポリ
マーの薄膜を形成させたのち、反応混合物の上清液中に
含まれる未結合の認識対象化合物の量を測定し、その結
果に基づいて人工レセプターを評価することを特徴とす
る人工レセプターの評価方法によっても、ある程度の精
度でもって人工レセプターを評価することができる。
【００１８】
【実施例】実施例１ （１）ポリマーライブラリー［ＰＬ（Ａｍｅ）］の合成 トリアジン系除草剤であるアメトリン［４−（エチルア
ミノ）−６−（イソプロピルアミノ）−２−メチルチオ
−１，３，５−トリアジン］およびアトラジン［２−ク
ロロ−４−（エチルアミノ）−６−（イソプロピルアミ
ノ）−１，３，５−トリアジン］の選択性ポリマーを、
公知の方法［Ｊ．Ｍａｔｓｕｉ，Ｙ．Ｍｉｙｏｓｈｉ、
Ｏ．Ｄｏｂｌｈｏｆｆ−Ｄｉｅｒ、Ｔ．Ｔａｋｅｕｃｈ
ｉ，アナリティカル・ケミストリー６７，４４０４−４
４０８（１９９５）およびＪ．Ｍａｔｓｕｉ，Ｏ．Ｄｏ
ｂｌｈｏｆｆ−Ｄｉｅｒ、Ｔ．Ｔａｋｅｕｃｈｉ，ケミ
ストリー・レターズ、４８９（１９９５）］を参考にし
て製造した。
【００１９】図１は合成および評価の手順を示すフロー
チャートである。認識対象化合物（テンプレート分子）
としてアメトリン１．９５μｍｏｌ、（和光純薬工
業）、機能性モノマーとしてメタクリル酸（以下、「Ｍ
ＭＡ」と略す、片山化学工業）および２−トリフルオロ
メチルアクリル酸（以下、「ＴＦＭＡＡ」と略す、東京
化成工業）を用いた。架橋剤にはエチレングリコールジ
メタクリレート３０．０ｍｇ（以下、「ＥＧＤＭＡ」と
略す、片山化学工業）、重合開始剤に２，２’−アゾビ
スイソブチロニトリル０．７４７ｍｇ（以下、「ＡＩＢ
Ｎ」と略す、和光純薬工業）、重合溶媒にはクロロホル
ム５９．０μＬ（片山化学工業）を用いた。この際、上
記の二つの機能性モノマーをアメトリンに対してそれぞ
れ０〜６当量の範囲で使用することにより、４９通りに
テンプレート分子と機能性モノマー間の量比を変えた。
そして、アメトリンに対して機能性モノマーの合計が１
２当量になるように、不足分をメチルメタクリレート
（和光純薬工業）を添加して補った。
【００２０】合成ロボットを用いてこれらの試剤をバイ
アルに分注した後、各バイアルを窒素ガスで置換し、５
℃で１２時間、ＵＶを照射して重合反応を行なった。各
バイアルに洗浄液（メタノール／水／酢酸、７／２／
１、ｖ／ｖ／ｖ）の注入および吸引を１０回繰り返し、
認識対象化合物、未反応の機能性モノマー、架橋剤、重
合開始剤等を各バイアルから除去した。さらに、各バイ
アルにクロロホルムの注入および吸引を３回繰り返し、
各バイアル内の洗浄液をクロロホルムで置換した。その
結果、バイアル瓶の内面を被覆する形で４９種のポリマ
ーからなるポリマーライブラリー（以下、「ＰＬ（Ａｍ
ｅ）」と略す）を得た。
【００２１】（２）ＰＬ（Ａｍｅ）とアメトリンの結合
実験 ＰＬ（Ａｍｅ）が生成した上記の各バイアルにアメトリ
ン（５００μＭ）のクロロホルム溶液１．５ｍｌを注入
し、２４時間放置した後、ＨＰＬＣまたはフローインジ
ェクション分析法により上清液中の未結合アメトリンの
濃度を測定した。アメトリンの初期濃度５００μＭと上
清液中のアメトリン濃度の差からアメトリンとＰＬ（Ａ
ｍｅ）との結合量を算出した。その結果を図２に示す。
【００２２】（３）ＰＬ（Ａｍｅ）とアトラジンの結合
実験 上記（２）の試験後の各バイアルに洗浄液（メタノール
／水／酢酸、７／２／１、ｖ／ｖ／ｖ）の注入および吸
引を１０回繰り返し、各バイアルからアメトリンを除去
した。さらに、各バイアルにクロロホルムの注入・吸引
を３回繰り返して各バイアル中の洗浄液をクロロホルム
で置換した。ＰＬ（Ａｍｅ）にアトラジン（５００μ
Ｍ）のクロロホルム溶液を注入する以外は、実施例１
（２）と同様にして、アトラジンとＰＬ（Ａｍｅ）との
結合量を算出した。その結果を、図３に示す。
【００２３】なお、上清液中のアメトリンおよびアトラ
ジンのＨＰＬＣ測定には、カラム（Ｓｕｐｅｌｃｏ Ｌ
Ｃ−８−ＤＢ（４．６ｍｍ×１５０ｍｍ、Ｉ．Ｄ．））
を備えた日立ＨＰＬＣシステム（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｌ−
６２００ Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ Ｐｕｍｐ、Ｌー３
０００ ｐｈｏｔｏｄｉｏｄｅ ａｒｒａｙ ｄｅｔｅ
ｃｔｏｒ）を使用した。上清液のインジェクションには
オートサンプラー（Ｇｉｌｓｏｎ ２３１ＸＬ ｓａｍ
ｐｌｉｎｇ ｉｎｊｅｃｔｏｒ）を使用した。ＨＰＬＣ
の測定に際しては、溶出液には酢酸アンモニウム緩衝液
（ｐＨ６．０、０．１Ｍ）／アセトニトリル（アメトリ
ン検出時には６／４、アトラジン検出時には７／３、そ
れぞれｖ／ｖ）を流量１．０ｍｌ／分で流し、検出器の
吸収波長を２６０ｎｍに設定した。なお、フローインジ
ェクション分析法は、上記のシステムからカラムを除
き、キャリア溶液としてクロロホルムを用いた。
【００２４】（４）ＰＬ（Ａｍｅ）のアメトリンへの選
択性評価 ＰＬ（Ａｍｅ）に属する各ライブラリーメンバーのアメ
トリンへの選択性について検討するため、［ＰＬ（Ａｍ
ｅ）におけるアメトリン結合量］／［ＰＬ（Ａｍｅ）に
おけるアトラジン結合量］の比を選択性として算出し
た。その結果を図４に示す。図２より、ＭＡＡとＴＦＭ
ＡＡのいずれが増加してもインプリントポリマーのアメ
トリンへの結合量が増加する傾向が見られた。また、図
３より、ＭＡＡとＴＦＭＡＡのいずれが増加してもイン
プリントポリマーのアトラジンへの結合量があまり増加
しない傾向が見られた。また図４より、ＭＡＡはポリマ
ーのアメトリンへの選択性に寄与していないが、ＴＦＭ
ＡＡを多く含んでいるポリマーほどアメトリンに対する
選択性が向上する傾向が認められた。よって、アメトリ
ンに対しては、ＴＦＭＡＡがＭＡＡより優れた機能性モ
ノマーであることが示唆され、アメトリンに対してＴＦ
ＭＡＡ６当量を用いるポリマーが特に優れていることが
わかった。
【００２５】実施例２ （１）ポリマーライブラリー［ＰＬ（Ａｔｒ）］の合成 認識対象化合物をアトラジン（農薬から精製して得た）
に変えた以外は前記の実施例１（１）と同様にして、４
９種のポリマーからなるポリマーライブラリー（以下、
「ＰＬ（Ａｔｒ）」と略す）を合成した。
【００２６】（２）ＰＬ（Ａｔｒ）とアトラジンの結合
実験 ＰＬ（Ａｔｒ）にアトラジン（５００μＭ）のクロロホ
ルム溶液を注入する以外は、実施例１（２）と同様にし
て、ＰＬ（Ａｔｒ）とアトラジンの結合量を算出した。
その結果を、図５に示す。
【００２７】（３）ＰＬ（Ａｔｒ）とアメトリンの結合
実験 ＰＬ（Ａｔｒ）にアメトリン（５００μＭ）のクロロホ
ルム溶液を注入する以外は、実施例１（３）と同様にし
てアメトリンとＰＬ（Ａｔｒ）との結合量を算出した。
その結果を図６に示す。
【００２８】（４）ＰＬ（Ａｔｒ）のアトラジンへの選
択性評価 ＰＬ（Ａｔｒ）に属する各ライブラリーメンバーのアト
ラジンへの選択性について検討するため、［ＰＬ（Ａｔ
ｒ）におけるアトラジン結合量］／「ＰＬ（Ａｔｒ）に
おけるアメトリン結合量］の比を算出した。その結果を
図７に示す。
【００２９】図５より、ＴＦＭＡＡを機能性モノマーと
して含んでいないポリマー、つまりＴＦＭＡＡ量が０の
ときに認識対象分子に対するＭＡＡの量比を増加させた
とき、アトラジンに対するインプリントポリマーの結合
量増加が見られた。また、ＭＡＡ量が少ないときにＴＦ
ＭＡＡの量比増大に伴ない、アトラジンに対するインプ
リントポリマーの結合量増加が見られた。また、図７よ
り、認識対象分子に対しＴＦＭＡＡ量比が少ないインプ
リントポリマーほどアトラジンに対する選択結合性が向
上していることが確認された。よって、アトラジンに対
しては、ＴＦＭＡＡよりＭＡＡがより優れた機能性モノ
マーであることが示唆され、アトラジンに対し、ＭＡＡ
６当量を用いたポリマーが特に優れていることがわかっ
た。
【００３０】実施例３ 実施例１（１）と同様にポリマーライブラリー［ＰＬ
（Ａｍｅ）］を合成した後、各バイアルにアセトニトリ
ルを１．５ｍｌずつ注入し、２４時間放置した。上清を
ＨＰＬＣにて分析し、未結合アメトリンの濃度を測定し
た。アメトリンの初期量（ポリマー合成に使われたアメ
トリン量）１．９５μｍｏｌを上清中のアメトリン濃度
の差からアメトリンとＰＬ（Ａｍｅ）との結合量を算出
した。その結果を図８に示す。この結果は実施例１のパ
ターンと類似しており、実施例１のように洗浄液（メタ
ノール／水／酢酸、７／２／１、ｖ／ｖ／ｖ）でアメト
リンを完全に除去しなくても、ある程度予備的な結果が
得られることがわかった。
【００３１】実施例４ 実施例１（４）の結果に基づいて、認識対象化合物１当
量に対して、ＭＡＡ１当量およびＴＦＭＡＡ６当量を用
いて合成したポリマーが、最適な人工レセプターと判明
した。そこで、認識対象化合物１当量に対してＭＡＡ１
当量およびＴＦＭＡＡ６当量を用いて、実施例１（１）
と同様にしてポリマーを合成した。得られたポリマー
は、アメトリンとの強い結合活性を示した。
【００３２】実施例５ 実施例２（４）の結果に基づいて、認識対象化合物１当
量に対して、ＭＡＡ４当量（ＴＦＭＡＡ０当量）を用い
て合成したポリマーが、最適な人工レセプターと判明し
た。そこで、認識対象化合物１当量に対してＭＡＡ４当
量（ＴＦＭＡＡ０当量）を用いて、実施例２（１）と同
様にしてポリマーを合成した。得られたポリマーは、ア
トラジンとの強い結合活性を示した。
【００３３】
【発明の効果】本発明は、モレキュラーインプリントポ
リマーをコンビナトリアルケミストリーの手法およびｉ
ｎ−ｓｉｔｕ法を用いることにより、同時に多種合成、
多種評価することを可能とした。すなわち、本発明は、
モレキュラーインプリントポリマー設計・合成に際し
て、認識対象分子と相性のよい機能性モノマーの種類、
認識対象分子に対する機能性モノマーの量比、さらに機
能性モノマーを複数種用いるときはそれらの混合比とい
ったような条件検討を、簡便に行なうことを可能とし
た。
【図面の簡単な説明】
【図１】人工レセプターの合成および評価の手順を示す
フローチャートである。
【図２】ＰＬ（Ａｍｅ）とアメトリンとの結合量を示す
グラフである。
【図３】ＰＬ（Ａｍｅ）とアトラジンとの結合量を示す
グラフである。
【図４】アメトリンに対するアメトリンインプリントポ
リマーの選択性を示すグラフである。
【図５】ＰＬ（Ａｔｒ）とアトラジンとのとの結合量を
示すグラフである。
【図６】ＰＬ（Ａｔｒ）とアメトリンとの結合量を示す
グラフである。
【図７】アトラジンに対するアトラジンインプリントポ
リマーの選択性を示すグラフである。
【図８】ＰＬ（Ａｍｅ）とアメトリンとの結合量を示す
グラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 松井 淳 広島市安佐南区大塚西６丁目９番１号501 号室 (72)発明者 福間 大吾 広島市安佐南区沼田町伴3244−１−304 (72)発明者 水上 利洋 神戸市西区高塚台４丁目４番地の４ 東亞 医用電子株式会社内 Ｆターム(参考） 4J100 AB07P AB16Q AJ02P AJ03P AJ08P AL62Q AL63Q AM19P AM24Q AM25P AM25Q AQ12P AQ19P BA16P BA34P BA56P BB07P BC43Q BC69P BC73P CA04 FA02 GD00 JA53

Claims (4)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 認識対象化合物、機能性モノマーおよび
    架橋剤をバイアル中で重合させてバイアル内に生成ポリ
    マーの薄膜を形成させ、バイアル内を洗浄して認識対象
    化合物等をポリマーから除去し、バイアル内へ認識対象
    化合物の溶液を注入した後、上清液中に含まれる認識対
    象化合物の量を測定し、その結果に基づいて人工レセプ
    ターを評価することを特徴とする人工レセプターの評価
    方法。
  2. 【請求項２】 使用されるバイアルが複数である請求項
    １に記載の方法。
  3. 【請求項３】 コンビナトリアルケミストリーの手法に
    より行なわれる請求項２に記載の方法。
  4. 【請求項４】 認識対象化合物、機能性モノマーおよび
    架橋剤をバイアル中で重合させてバイアル内に生成ポリ
    マーの薄膜を形成させ、バイアル内を洗浄して認識対象
    化合物等をポリマーから除去し、バイアル内へ認識対象
    化合物の溶液を注入した後、上清液中に含まれる認識対
    象化合物の量を測定し、その結果に基づいて人工レセプ
    ターをコンビナトリアルケミストリーの手法で評価する
    ことにより選択された人工レセプター。
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