JP2000028533A - Stable measurement reagent and measurement method therefor - Google Patents
Stable measurement reagent and measurement method thereforInfo
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Abstract
Description
【発明の属する技術分野】本発明は、酸化酵素により生
じた過酸化水素の検出反応系を使用し、色原体として電
子供与基を有するアニリン誘導体を用いる、試料中の被
検物質の測定試薬及び測定方法であり、前記色原体を含
有する第１の試薬のｐＨが７．５以上であり、第２の試
薬のｐＨが第１の試薬のｐＨ未満である測定試薬及び測
定方法に関し、開封状態においても長期間安定に使用す
ることができる測定試薬及び測定方法に関するものであ
る。本発明は、特に、化学、生命科学、及び臨床検査等
の分野において有用なものである。BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention The present invention relates to a reagent for measuring a test substance in a sample using a reaction system for detecting hydrogen peroxide generated by an oxidase and using an aniline derivative having an electron donating group as a chromogen. And a measuring method, wherein the pH of the first reagent containing the chromogen is 7.5 or more, and the pH of the second reagent is lower than the pH of the first reagent. The present invention relates to a measurement reagent and a measurement method that can be used stably for a long period of time even in an opened state. The invention is particularly useful in fields such as chemistry, life sciences, and clinical testing.
【０００２】[0002]
【従来の技術】試薬には、不安定なものが多く、保存中
に劣化して使用できなくなってしまうことが多々ある。
特に、臨床検査試薬を自動分析装置で使用するといっ
た、試薬を開封状態で使用せざるを得ない場合には、開
封状態とすることにより生じる種々の要因により、試薬
の劣化は著しい。2. Description of the Related Art Many reagents are unstable and often deteriorate during storage and become unusable.
In particular, when a reagent must be used in an opened state, such as when a clinical test reagent is used in an automatic analyzer, the deterioration of the reagent is remarkable due to various factors caused by opening the reagent.
【０００３】例えば、空気中の酸素が試薬に溶け込むこ
とにより、試薬中の成分が酸化され、劣化してしまうこ
とがある。また、空気中の二酸化炭素が試薬中に溶け込
むことにより、試薬のｐＨが低下し、本来の機能が果た
せなくなってしまうことがある。更に、試薬中に二酸化
炭素が溶け込むことにより、被検物質（測定しようとす
る物質）が二酸化炭素により阻害を受けてしまい、正確
な測定が出来なくなってしまう場合もある。For example, when oxygen in the air dissolves in a reagent, components in the reagent may be oxidized and deteriorated. In addition, when the carbon dioxide in the air dissolves in the reagent, the pH of the reagent decreases, and the original function may not be performed. Furthermore, when the carbon dioxide dissolves in the reagent, the test substance (the substance to be measured) is hindered by the carbon dioxide, which may make accurate measurement impossible.
【０００４】最近、近傍の他の試薬中の成分が気化し、
その気化した成分が試薬に溶け込むことにより、試薬が
劣化してしまうという問題が生じてきた。Recently, components in other reagents nearby have vaporized,
A problem has arisen in that the vaporized components dissolve in the reagent, thereby deteriorating the reagent.
【０００５】例えば、酸化酵素により生じた過酸化水素
を４−アミノアンチピリン等の色原体とアニリン誘導体
等のカプラーとパーオキシダーゼにより色素に導く検出
反応系を使用する試料中の被検物質の測定試薬（いわゆ
るトリンダー試薬）においては、他の試薬に防腐剤とし
て含有させたアジ化ナトリウムがアジ化水素として気化
し、その近傍のトリンダー試薬に溶け込み、被検物質が
存在しないにもかかわらず、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３
−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリンナト
リウム（ＨＤＡＯＳ）、Ｎ−スルホプロピル−３，５−
ジメトキシアニリン（ＨＤＡＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−
（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジ
メトキシアニリン（ＤＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−スル
ホプロピル−３，５−ジメトキシアニリン（ＤＡＰ
Ｓ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホ
プロピル）−３，５−ジメトキシ−４−フルオロアニリ
ン（ＦＤＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−
３，５−ジメトキシ−４−フルオロアニリン（ＦＤＡＰ
Ｓ）、又はＮ−（２−カルボキシエチル）−Ｎ−エチル
−３，５−ジメトキシアニリン（ＣＥＤＢ）等の電子供
与基を有するアニリン誘導体を発色させてしまい、測定
に用いることが出来なくなることが知られている。For example, measurement of a test substance in a sample using a detection reaction system in which hydrogen peroxide generated by an oxidase is led to a dye by a chromogen such as 4-aminoantipyrine or the like and a coupler such as an aniline derivative and peroxidase. In a reagent (a so-called Trinder reagent), sodium azide contained in another reagent as a preservative vaporizes as hydrogen azide, dissolves in a Triinder reagent in the vicinity, and despite the absence of a test substance, N -(2-hydroxy-3
-Sulfopropyl) -3,5-dimethoxyaniline sodium (HDAOS), N-sulfopropyl-3,5-
Dimethoxyaniline (HDAPS), N-ethyl-N-
(2-hydroxy-3-sulfopropyl) -3,5-dimethoxyaniline (DAOS), N-ethyl-N-sulfopropyl-3,5-dimethoxyaniline (DAP
S), N-ethyl-N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) -3,5-dimethoxy-4-fluoroaniline (FDAOS), N-ethyl-N-sulfopropyl-
3,5-dimethoxy-4-fluoroaniline (FDAP
S) or an aniline derivative having an electron donating group, such as N- (2-carboxyethyl) -N-ethyl-3,5-dimethoxyaniline (CEDB), which develops a color and cannot be used for measurement. Are known.
【０００６】更に、自動分析装置においては、アジ化物
等の試薬に含まれる成分が自動分析装置等の試薬プロー
ブ（試薬採取口）に付着することにより、この試薬プロ
ーブが次の試薬を採取した際に、試薬プローブに付着し
たアジ化物等がその試薬に混入し、上記等の電子供与基
を有するアニリン誘導体を発色させてしまい、測定に用
いることが出来なくなることが知られている。Further, in an automatic analyzer, when a component contained in a reagent such as an azide adheres to a reagent probe (reagent collecting port) of the automatic analyzer or the like, when the reagent probe collects the next reagent. In addition, it is known that azide and the like adhering to a reagent probe are mixed into the reagent, and the aniline derivative having an electron donating group as described above is colored, and cannot be used for measurement.
【０００７】[0007]
【発明が解決しようとする課題】前記のように従来の試
薬は、アジ化物等の近傍の試薬に含まれる成分が気化
し、これが試薬に溶け込み、試薬を劣化させ、機能を低
下させるものであった。As described above, in the conventional reagent, components contained in the reagent such as azide vaporize and evaporate, and this dissolves in the reagent, deteriorating the reagent and deteriorating its function. Was.
【０００８】更に、従来の試薬は、アジ化物等の試薬に
含まれる成分が自動分析装置等の試薬プローブ（試薬採
取口）に付着することにより、この試薬プローブが次の
試薬を採取した際に、試薬プローブに付着したアジ化物
等がその試薬に混入し、試薬を劣化させ、機能を低下さ
せるものであった。Further, in the conventional reagent, when a component contained in a reagent such as azide adheres to a reagent probe (reagent collecting port) of an automatic analyzer or the like, when the reagent probe collects the next reagent, In addition, azide and the like adhering to the reagent probe are mixed into the reagent, thereby deteriorating the reagent and deteriorating its function.
【０００９】本発明者らは、この従来の酸化酵素により
生じた過酸化水素の検出反応系を使用し、色原体として
電子供与基を有するアニリン誘導体を用いる被検物質の
測定試薬及び測定方法が有する問題点の解決を目指して
鋭意検討を行った結果、色原体を含有する第１の試薬の
ｐＨが７．５以上であり、且つ第２の試薬のｐＨが第１
の試薬のｐＨ未満になるように測定試薬を構成すること
により、試薬の劣化や機能の低下を防止できることを見
出し、開封状態においても長期間安定に使用することが
できる測定試薬及び測定方法を完成するに至った。The present inventors have used this conventional reaction system for detecting hydrogen peroxide generated by an oxidase, and used as a chromogen an aniline derivative having an electron donating group as a reagent and method for measuring a test substance. As a result of intensive studies aimed at solving the problems of the present invention, the pH of the first reagent containing the chromogen is 7.5 or more, and the pH of the second reagent is the first reagent.
Found that by configuring the measurement reagent so as to be less than the pH of the reagent, it is possible to prevent the deterioration and deterioration of the function of the reagent, and completed a measurement reagent and a measurement method that can be used stably for a long time even in the opened state. I came to.
【００１０】[0010]
【課題を解決するための手段】本発明は、酸化酵素によ
り生じた過酸化水素の検出反応系を使用し、色原体とし
て電子供与基を有するアニリン誘導体を用いる、試料中
の被検物質の測定試薬において、（イ）前記色原体を含
有する第１の試薬のｐＨが７．５以上であり、（ロ）も
う一方の試薬である第２の試薬のｐＨが第１の試薬のｐ
Ｈ未満である、ことを特徴とする、２試薬系の試料中の
被検物質の測定試薬である。SUMMARY OF THE INVENTION The present invention uses a reaction system for detecting hydrogen peroxide generated by an oxidase and uses an aniline derivative having an electron donating group as a chromogen. In the measurement reagent, (a) the pH of the first reagent containing the chromogen is 7.5 or more, and (b) the pH of the second reagent as the other reagent is p of the first reagent.
H is less than H. A reagent for measuring a test substance in a two-reagent sample.
【００１１】そして、本発明の測定試薬においては、色
原体を含有する第１の試薬のｐＨが７．８以上であるこ
とが好適である。[0011] In the measuring reagent of the present invention, the pH of the first reagent containing the chromogen is preferably 7.8 or more.
【００１２】更に、本発明の測定試薬においては、色原
体を含有する第１の試薬のｐＨが８．０以上であること
が特に好適である。Further, in the measuring reagent of the present invention, it is particularly preferable that the pH of the first reagent containing a chromogen is 8.0 or more.
【００１３】なお、本明細書におけるｐＨの値は、特に
言及していない限り２０℃における値である。The pH value in the present specification is a value at 20 ° C. unless otherwise specified.
【００１４】また、本発明は、酸化酵素により生じた過
酸化水素の検出反応系を使用し、色原体として電子供与
基を有するアニリン誘導体を用いる、試料中の被検物質
の測定方法において、（イ）前記色原体を含有する第１
の試薬のｐＨが７．５以上であり、（ロ）もう一方の試
薬である第２の試薬のｐＨが第１の試薬のｐＨ末満であ
る、２試薬系の測定試薬を用いることを特徴とする、試
料中の被検物質の測定方法である。The present invention also provides a method for measuring a test substance in a sample using a reaction system for detecting hydrogen peroxide generated by an oxidase and using an aniline derivative having an electron donating group as a chromogen. (A) First containing the chromogen
(2) using a two-reagent measuring reagent in which the pH of the second reagent is 7.5 or higher and the pH of the second reagent, which is the other reagent, is less than the pH of the first reagent. This is a method for measuring a test substance in a sample.
【００１５】そして、本発明の測定方法においては、色
原体を含有する第１の試薬のｐＨが７．８以上であるこ
とが好適である。In the measurement method of the present invention, it is preferable that the pH of the first reagent containing the chromogen is 7.8 or more.
【００１６】更に、本発明の測定方法においては、色原
体を含有する第１の試薬のｐＨが８．０以上であること
が特に好適である。Further, in the measuring method of the present invention, it is particularly preferable that the pH of the first reagent containing the chromogen is 8.0 or more.
【００１７】[0017]
【発明の実施の形態】本発明による試料中の被検物質の
測定方法及び測定試薬は、酸化酵素により生じた過酸化
水素の検出反応系を使用し、色原体として電子供与基を
有するアニリン誘導体を用い、試料中の被検物質の測定
を行うものであり、前記色原体を含有する第１の試薬
のｐＨが７．５以上であり、もう一方の試薬である第
２の試薬のｐＨが第１の試薬のｐＨ末満である、ことを
特徴とするものである。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION The method and reagent for measuring a test substance in a sample according to the present invention uses an aniline having an electron donating group as a chromogen using a reaction system for detecting hydrogen peroxide generated by an oxidase. The measurement of a test substance in a sample is performed using a derivative, wherein the pH of the first reagent containing the chromogen is 7.5 or more, and the pH of the second reagent, which is the other reagent, is measured. wherein the pH is below the pH of the first reagent.
【００１８】本発明における、電子供与基を有するアニ
リン誘導体としては、例えば、アニリンのアミノ基の１
つ又は２つの水素原子が置換されたアニリン誘導体から
なり、前記アニリン誘導体のベンゼン環の３位又は５位
の水素原子の一方又は両方が電子供与基で置換されてい
て、場合により、前記アニリン誘導体のベンゼン環の４
位の水素原子がハロゲン原子で置換されている化合物で
ある。なお、上記の電子供与基を有するアニリン誘導体
において、置換している官能基は、アニリン誘導体の４
位の炭素原子が活性化される官能基、又はマイナスＩ効
果を有する官能基であることが好ましい。また、本発明
の電子供与基を有するアニリン誘導体における電子供与
基としては、例えば、メトキシ基［−Ｏ−ＣＨ３］、エ
トキシ基［−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ３］、プロポキシ基［−
Ｏ−（ＣＨ２）２−ＣＨ３］、イソプロポキシ基［−Ｏ
−ＣＨ（ＣＨ３）２］、エチル基［−ＣＨ３−Ｃ
Ｈ３］、プロピル基［−（ＣＨ２）２−ＣＨ３］、イソ
プロピル基［−ＣＨ（ＣＨ３）２］等が挙げられる。ま
た、本発明の電子供与基を有するアニリン誘導体のアミ
ノ基の水素原子を置換する官能基としては、炭素数が１
〜５のアルキル基又は炭素数が１〜５のアミノアルキル
基等を挙げることができ、このアルキル基又はアミノア
ルキル基の水素原子は１つ又は２つ以上の水酸基、カル
ボキシル基、スルホン基、アシル基、サクシニル基、又
はこれらの塩等で置換されていてもよい。そして、本発
明の電子供与基を有するアニリン誘導体のベンゼン環の
４位の水素原子を置換するハロゲン原子としては、フッ
素原子、塩素原子、臭素原子、又はヨウ素原子等を挙げ
ることができる。The aniline derivative having an electron donating group in the present invention includes, for example, one of the amino groups of aniline.
One or two hydrogen atoms are substituted with an aniline derivative, wherein one or both of the hydrogen atoms at the 3- or 5-position of the benzene ring of the aniline derivative are substituted with an electron-donating group; 4 of the benzene ring of
It is a compound in which the hydrogen atom at the position is replaced by a halogen atom. In the aniline derivative having an electron donating group described above, the substituted functional group is 4% of the aniline derivative.
The functional group is preferably a functional group in which the carbon atom at the position is activated, or a functional group having a minus I effect. The electron donating group in the aniline derivative having an electron donating group of the present invention includes, for example, a methoxy group [—O—CH 3 ], an ethoxy group [—O—CH 2 —CH 3 ], a propoxy group [−
O- (CH 2) 2 -CH 3 ], isopropoxy [-O
-CH (CH 3) 2], an ethyl group [-CH 3 -C
H 3], propyl group [- (CH 2) 2 -CH 3], an isopropyl group [-CH (CH 3) 2], and the like. The functional group for substituting the hydrogen atom of the amino group of the aniline derivative having an electron donating group of the present invention has 1 carbon atom.
And an alkyl group having 1 to 5 carbon atoms, an aminoalkyl group having 1 to 5 carbon atoms, and the like, and the hydrogen atom of the alkyl group or the aminoalkyl group may be one or more hydroxyl group, carboxyl group, sulfone group, acyl group, Or a succinyl group or a salt thereof. The halogen atom that replaces the hydrogen atom at the 4-position on the benzene ring of the aniline derivative having an electron donating group of the present invention includes a fluorine atom, a chlorine atom, a bromine atom, and an iodine atom.
【００１９】本発明における、電子供与基を有するアニ
リン誘導体である色原体としては、例えば、Ｎ−（２−
ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキ
シアニリンナトリウム（ＨＤＡＯＳ）、Ｎ−スルホプロ
ピル−３，５−ジメトキシアニリン（ＨＤＡＰＳ）、Ｎ
−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピ
ル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＤＡＯＳ）、Ｎ−
エチル−Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメトキシアニ
リン（ＤＡＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ
−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシ−４−フ
ルオロアニリン（ＦＤＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−スル
ホプロピル−３，５−ジメトキシ−４−フルオロアニリ
ン（ＦＤＡＰＳ）、又はＮ−（２−カルボキシエチル）
−Ｎ−エチル−３，５−ジメトキシアニリン（ＣＥＤ
Ｂ）等を挙げることができる。In the present invention, examples of the chromogen which is an aniline derivative having an electron donating group include N- (2-
(Hydroxy-3-sulfopropyl) -3,5-dimethoxyaniline sodium (HDAOS), N-sulfopropyl-3,5-dimethoxyaniline (HDAPS), N
-Ethyl-N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) -3,5-dimethoxyaniline (DAOS), N-
Ethyl-N-sulfopropyl-3,5-dimethoxyaniline (DAPS), N-ethyl-N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) -3,5-dimethoxy-4-fluoroaniline (FDAOS), N- Ethyl-N-sulfopropyl-3,5-dimethoxy-4-fluoroaniline (FDAPS) or N- (2-carboxyethyl)
-N-ethyl-3,5-dimethoxyaniline (CED
B) and the like.
【００２０】また、本発明において、測定を行う試料と
しては、被検物質が存在する可能性があり、且つその被
検物質の存在の有無の確認又は定量を行おうとするもの
をいう。例えば、ヒト又は動物の血液、血清、血漿、
尿、精液、髄液、唾液、汗、涙、腹水、羊水等の体液；
ヒト若しくは動物の肝臓、胃、脳等の臓器、毛髪、皮
膚、爪、筋肉、又は神経組織等の抽出液；ヒト又は動物
の糞便の抽出液又は懸濁液；細胞或いは菌体の抽出液；
植物の抽出液等が挙げられる。In the present invention, the sample to be measured refers to a sample which may have a test substance, and for which the presence or absence of the test substance is to be confirmed or quantified. For example, human or animal blood, serum, plasma,
Body fluids such as urine, semen, cerebrospinal fluid, saliva, sweat, tears, ascites, and amniotic fluid;
Human or animal liver, stomach, brain and other organs, hair, skin, nails, muscle, and nerve tissue and other extracts; human or animal feces extract or suspension; cells or bacterial cells;
Examples include plant extracts.
【００２１】本発明において、測定を行う被検物質とし
ては、酸化酵素により生じた過酸化水素の検出反応系に
より測定が行えるものであればいずれのものでもよい。
例えば、総コレステロール、遊離型コレステロール、エ
ステル型コレステロール、ＨＤＬ−コレステロール、Ｌ
ＤＬ−コレステロール、レムナント様リポタンパク−コ
レステロール、β−リポタンパク質、トリグリセライド
（ＴＧ）、リン脂質（ＰＬ）、遊離脂肪酸（ＮＥＦＡＮ
ＦＦＡ）、グルコース、乳酸、ピルビン酸、ガラクトー
ス、２・３−ＤＰＧ、シアル酸、クエン酸、フルクトサ
ミン、１，５−アンヒドロ−Ｄ−グルシトール、グリコ
ーゲン、フコース、総ビリルビン、直接ビリルビン、間
接ビリルビン、抱合型ビリルビン、非抱合型ビリルビ
ン、クレアチニン、クレアチン、尿酸（ＵＡ）、ナトリ
ウム、クロール、カリウム、カルシウム、無機リン、マ
グネシウム、胆汁酸、リパーゼ、リポタンパクリパーゼ
（ＬＰＬ）、コリンエステラーゼ（Ｃｈ−Ｅ）等が挙げ
られる。In the present invention, the test substance to be measured may be any substance as long as it can be measured by a reaction system for detecting hydrogen peroxide generated by an oxidase.
For example, total cholesterol, free cholesterol, ester cholesterol, HDL-cholesterol, L
DL-cholesterol, remnant-like lipoprotein-cholesterol, β-lipoprotein, triglyceride (TG), phospholipid (PL), free fatty acid (NEFAN)
FFA), glucose, lactic acid, pyruvate, galactose, 2,3-DPG, sialic acid, citric acid, fructosamine, 1,5-anhydro-D-glucitol, glycogen, fucose, total bilirubin, direct bilirubin, indirect bilirubin, conjugation Type bilirubin, unconjugated bilirubin, creatinine, creatine, uric acid (UA), sodium, chlor, potassium, calcium, inorganic phosphorus, magnesium, bile acids, lipase, lipoprotein lipase (LPL), cholinesterase (Ch-E), etc. No.
【００２２】本発明における第１の試薬は、前記の電子
供与基を有するアニリン誘導体である色原体を含有する
ものであり、且つｐＨが７．５以上であるものである。
なお、後に実施例に示すように、本発明における測定試
薬及び測定方法の開封状態における安定性は、ｐＨに依
存している。即ち、この第１の試薬のｐＨが、７．５を
過ぎてアルカリ側に傾くにつれて、開封状態における安
定性が向上していくので、安定性の面から言うと、第１
の試薬のｐＨは、７．５以上であって、より高い方が望
ましい。この第１の試薬のｐＨは、７．８以上であるこ
とが好ましく、特に８．０以上であることが好ましい。
但し、ｐＨがあまり高すぎると、後記のようなこの第１
の試薬に含まれている、色原体、酵素の基質、共役酵
素、補酵素、又はタンパク質等が、変性、劣化、分解す
る恐れがあり好ましくない。よって、第１の試薬のｐＨ
は、１２以下とするのが好ましく、特にｐＨ１１以下と
することが好ましい。The first reagent in the present invention contains a chromogen which is the above-mentioned aniline derivative having an electron donating group, and has a pH of 7.5 or more.
As will be described later in Examples, the stability of the measurement reagent and the measurement method in the present invention in the opened state depends on the pH. That is, as the pH of the first reagent exceeds 7.5 and tilts toward the alkaline side, the stability in the opened state is improved.
The reagent has a pH of 7.5 or more, and is preferably higher. The pH of the first reagent is preferably 7.8 or more, and particularly preferably 8.0 or more.
However, if the pH is too high, this first
Chromogens, enzyme substrates, conjugate enzymes, coenzymes, proteins, etc., contained in the above reagents are not preferred because they may be denatured, deteriorated or decomposed. Therefore, the pH of the first reagent
Is preferably 12 or less, particularly preferably pH 11 or less.
【００２３】本発明におけるもう一方の試薬である第２
の試薬は、ｐＨが第１の試薬のｐＨ未満であるものであ
る。そして、第２の試薬のｐＨを第１の試薬のｐＨ未満
とすることにより、試料、第１の試薬及び第２の試薬を
混合した最終反応液のｐＨを第１の試薬のｐＨ未満とす
ることができるので、第１の試薬のｐＨが測定反応の至
適ｐＨ域より高かったとしても、最終反応液のｐＨを測
定反応の至適ｐＨ域に設定することができる。例えば、
尿酸、総コレステロール等の測定試薬においては、測定
反応の至適ｐＨが６．５〜７．２であるので、第１の試
薬のｐＨが７．５以上であっても、第１の試薬のｐＨ未
満である第２の試薬を混合することにより、最終反応液
のｐＨを至適ｐＨ、即ち６．５〜７．２に設定すること
ができるので、本発明の測定試薬及び測定方法は尿酸、
総コレステロール等の測定試薬においては特に有用であ
る。但し、この第２の試薬において、ｐＨがあまり低す
ぎると、後記のようなこの第２の試薬に含まれている、
酵素の基質、共役酵素、補酵素、又はタンパク質等が、
変性、劣化、分解する恐れがあり好ましくない。よっ
て、第２の試薬は、ｐＨ２以上とするのが好ましく、特
にｐＨ３以上とすることが好ましい。The second reagent of the present invention, the second reagent
Are those whose pH is less than the pH of the first reagent. Then, by making the pH of the second reagent less than the pH of the first reagent, the pH of the final reaction mixture obtained by mixing the sample, the first reagent, and the second reagent is made less than the pH of the first reagent. Therefore, even if the pH of the first reagent is higher than the optimum pH range of the measurement reaction, the pH of the final reaction solution can be set to the optimum pH range of the measurement reaction. For example,
In the measurement reagents such as uric acid and total cholesterol, the optimum pH of the measurement reaction is 6.5 to 7.2, so that even if the pH of the first reagent is 7.5 or more, the The pH of the final reaction solution can be set to an optimum pH, that is, 6.5 to 7.2 by mixing the second reagent having a pH lower than the pH. ,
It is particularly useful for measuring reagents such as total cholesterol. However, if the pH of the second reagent is too low, it is contained in the second reagent as described below.
Enzyme substrate, conjugate enzyme, coenzyme, or protein,
It is not preferable because it may be denatured, deteriorated or decomposed. Therefore, it is preferable that the second reagent has a pH of 2 or more, and particularly preferably a pH of 3 or more.
【００２４】また、電子供与基を有するアニリン誘導体
を色原体として用いることで、酸化酵素により生じた過
酸化水素の検出反応系におけるビリルビンによる負誤差
の影響を回避することができる。しかし、前記色原体を
含有する試薬は、アジ化物等により、試薬が劣化、又は
機能が低下してしまうものであった。本発明による測定
試薬及び測定方法によれば、前記色原体を含有する第１
の試薬のｐＨを７．５以上に設定することで、アジ化物
等による影響を回避することができるので、前記色原体
を使用してビリルビンによる影響をも回避することがで
きる。なお、このビリルビンの影響を回避する場合に
は、最終反応液のｐＨを７．５以下、好ましくは７．０
以下にすることが望ましい。そこで、第２の試薬のｐＨ
を第１の試薬のｐＨ未満とすることにより、試料、第１
の試薬及び第２の試薬を混合した最終反応液のｐＨを第
１の試薬のｐＨ未満とすることができるので、第１の試
薬のｐＨが７．５より高かったとしても、最終反応液の
ｐＨを７．５以下に設定することができる。Further, by using an aniline derivative having an electron donating group as a chromogen, it is possible to avoid the influence of a negative error due to bilirubin in a reaction system for detecting hydrogen peroxide generated by an oxidase. However, the reagent containing the chromogen has been deteriorated or deteriorated in function due to azide or the like. According to the measuring reagent and the measuring method of the present invention, the first chromogen-containing first
By setting the pH of the reagent to 7.5 or more, the influence of azide and the like can be avoided, and thus the effect of bilirubin can also be avoided using the chromogen. In order to avoid the influence of bilirubin, the pH of the final reaction solution is 7.5 or less, preferably 7.0.
It is desirable to make the following. Therefore, the pH of the second reagent
Is set to be less than the pH of the first reagent,
Since the pH of the final reaction mixture obtained by mixing the first reagent and the second reagent can be lower than the pH of the first reagent, even if the pH of the first reagent is higher than 7.5, The pH can be set below 7.5.
【００２５】なお、本発明の測定試薬及び測定方法にお
いて、最終反応液のｐＨを測定反応の至適ｐＨ域に設定
するには、例えば、以下のように行えばよい。まず、第
１の試薬において、色原体の発色の抑制に効果のあるｐ
Ｈ７．５以上のｐＨと緩衝剤濃度を選択する。次に、第
１の試薬のｐＨ未満の数種類のｐＨを有し、適当な緩衝
剤濃度の数種類の第２の試薬を、第１の試薬及び試料と
所定の量比で混合し、最終反応液のｐＨを確認し、測定
反応の至適ｐＨ域に入った第２の試薬のｐＨと緩衝剤濃
度を選択する。In the measuring reagent and the measuring method of the present invention, the pH of the final reaction solution can be set to the optimum pH range for the measuring reaction by, for example, the following. First, in the first reagent, p which is effective in suppressing the color formation of the chromogen is used.
Choose a pH and buffer concentration above H7.5. Next, several kinds of second reagents having several kinds of pH lower than that of the first reagent and having an appropriate buffer concentration are mixed with the first reagent and the sample in a predetermined volume ratio, and the final reaction solution is mixed. Is checked, and the pH and the buffer concentration of the second reagent which are in the optimum pH range for the measurement reaction are selected.
【００２６】ここで、ｐＨ７．５以上に緩衝能を持つ緩
衝剤としては、例えば、Ｔｒｉｓ、リン酸緩衝液、イミ
ダゾール、グリシルグリシン、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、
ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＤＩＰＳＯ、
ＴＡＰＳＯ、ＰＯＰＳＯ、ＨＥＰＰＳＯ、ＥＰＰＳ、Ｈ
ＥＰＰＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、Ｂｉｃｉｎｅ、ＴＡＰＳ、
ＣＨＥＳ、ＣＡＰＳＯ、ＣＡＰＳ等を挙げることができ
る。また、ｐＨ７．５未満に緩衝能を持つ緩衝剤として
は、例えば、Ｔｒｉｓ、リン酸緩衝液、イミダゾール、
ＭＥＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣ
ＥＳ、ＭＯＰＳＯ、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰ
ＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＴＡＰＳＯ、ＰＯＰＳＯ、ＨＥＰＰ
ＳＯ等を挙げることができる。更に、本発明における第
１の試薬には、ＤＩＰＳＯ又はＴＥＳを含有させること
が好ましい。The buffer having a buffering capacity at pH 7.5 or higher includes, for example, Tris, phosphate buffer, imidazole, glycylglycine, PIPES, ACES,
BES, MOPS, TES, HEPES, DIPSO,
TAPSO, POPSO, HEPPSO, EPPS, H
EPPS, Tricine, Bicine, TAPS,
CHES, CAPSO, CAPS, and the like. Examples of a buffer having a buffering capacity at a pH of less than 7.5 include Tris, phosphate buffer, imidazole, and the like.
MES, Bis-Tris, ADA, PIPES, AC
ES, MOPSO, BES, MOPS, TES, HEP
ES, DIPSO, TAPSO, POPSO, HEPP
SO etc. can be mentioned. Further, it is preferable that the first reagent of the present invention contains DIPSO or TES.
【００２７】なお、試料はその量比が小さく、最終反応
液のｐＨにほとんど寄与しないので、第１の試薬と第２
の試薬の混合液のｐＨをもって、ｐＨの確認を行っても
よい。Since the sample has a small volume ratio and hardly contributes to the pH of the final reaction solution, the first reagent and the second reagent
The pH may be confirmed using the pH of the mixed solution of the reagents.
【００２８】また、本発明における第１の試薬及び第２
の試薬には、酵素の基質、共役酵素、補酵素、金属イオ
ン若しくはこれを含む金属塩、キレート剤、アルブミン
などのタンパク質、糖類若しくは高分子化合物などの安
定化剤、アジ化ナトリウム若しくは抗生物質などの防腐
剤、試料中に含まれる測定妨害物質の消去剤若しくは影
響抑制剤、界面活性剤、賦形剤又は活性化剤等を適宜必
要に応じて含有させることができる。Further, the first reagent and the second reagent in the present invention
Reagents include enzyme substrates, conjugate enzymes, coenzymes, metal ions or metal salts containing them, chelating agents, proteins such as albumin, stabilizers such as saccharides or high molecular compounds, sodium azide or antibiotics, etc. , A preservative, an eliminator or suppressor of a measurement interfering substance contained in a sample, a surfactant, an excipient, an activator, and the like can be appropriately contained as necessary.
【００２９】本発明における、測定値に誤差を生じさせ
るアジ化物を含む試薬としては、例えば、防腐剤等の用
途のためアジ化ナトリウムなどのアジ化物が処方されて
いる各種の測定試薬等を挙げることができる。In the present invention, examples of the reagent containing an azide that causes an error in the measured value include, for example, various measuring reagents in which an azide such as sodium azide is prescribed for use as a preservative or the like. be able to.
【００３０】そして、このアジ化物が溶け込むことによ
り劣化し、機能が低下する試薬としては、前記の電子供
与基を有するアニリン誘導体を色原体として用いる試薬
を挙げることができる。Examples of the reagent which is deteriorated by dissolution of the azide and deteriorates in function include a reagent using the aniline derivative having an electron donating group as a chromogen.
【００３１】この測定試薬及び測定方法により測定を行
う場合、測定は反応速度法（レート法）又は終点法（エ
ンドポイント法）のいずれによるものでも良く、測定ス
テップは第１の試薬及び第２の試薬を用いて２ステップ
法により行えばよく、測定波長は紫外部、可視部、又は
赤外部の適当な波長を使用することができ、測定反応の
温度は３０℃又は３７℃等測定反応が進行し且つ測定反
応に係わる酵素等の反応成分が熱により失活、又は変質
しない範囲内の温度を設定すれば良く、測定反応の開始
方法は基質を加えることにより行う方法又は試料を加え
ることにより行う方法等のいずれの方法でも良く、そし
て測定の手法は用手法又は自動分析装置などの装置によ
る方法のいずれをも用いることができる。When the measurement is carried out using the measurement reagent and the measurement method, the measurement may be performed by either the reaction rate method (rate method) or the end point method (endpoint method), and the measurement step is performed by the first reagent and the second reagent. The reaction may be performed by a two-step method using a reagent. The measurement wavelength may be an appropriate wavelength in the ultraviolet, visible, or infrared region, and the measurement reaction may proceed at a temperature such as 30 ° C. or 37 ° C. It is sufficient to set a temperature within a range in which the reaction components such as enzymes involved in the measurement reaction are not inactivated or deteriorated by heat, and the measurement reaction is started by adding a substrate or by adding a sample. Any method such as a method may be used, and the method of measurement may be either a manual method or a method using an apparatus such as an automatic analyzer.
【００３２】本発明における測定においては、試料、第
１の試薬及び第２の試薬を混合する順序は、特に制限は
なく、用いる測定試薬、測定装置に応じて適宜定めれば
よい。In the measurement according to the present invention, the order in which the sample, the first reagent and the second reagent are mixed is not particularly limited, and may be determined as appropriate according to the measuring reagent and the measuring device to be used.
【００３３】[0033]
【実施例】以下、実施例により本発明をより具体的に詳
述するが、本発明はこれらの実施例により限定されるも
のではない。 ［実施例１］ （気体の溶け込みによる試薬の劣化防止効果の実証）ア
ジ化物を気化するアジ化ナトリウム含有試薬、及び気化
したアジ化物の溶け込みにより発色してしまうＮ−（２
−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメト
キシアニリンナトリウム（ＨＤＡＯＳ）含有試薬の組み
合わせにおける、ＨＤＡＯＳ含有試薬の気化したアジ化
物の溶け込みによる発色、劣化の度合いを確かめた。EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples. [Example 1] (Demonstration of effect of preventing deterioration of reagent due to dissolution of gas) Sodium azide-containing reagent that vaporizes azide, and N- (2) that develops color by dissolution of vaporized azide
-Hydroxy-3-sulfopropyl) -3,5-dimethoxyaniline sodium (HDAOS) The combination of the reagents containing HDAOS was checked for the degree of color development and deterioration due to the dissolution of the vaporized azide of the HDAOS-containing reagent.
【００３４】（１）試薬の調製 アジ化ナトリウム含有試薬 下記の測定試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように
純水に溶解し、ｐＨを５．２（２０℃）に調整した。 測定試薬成分 濃 度 Ｎ−（２−ヒドロキシエチルピペラジン） −Ｎ’−２−エタンスルホン酸［ＨＥＰＥＳ］ １００ｍＭ アジ化ナトリウム １０ｍＭ(1) Preparation of Reagent Reagents containing sodium azide The following reagent components were dissolved in pure water so as to have the concentrations described, and the pH was adjusted to 5.2 (20 ° C.). Measurement reagent component Concentration N- (2-hydroxyethylpiperazine) -N'-2-ethanesulfonic acid [HEPES] 100 mM Sodium azide 10 mM
【００３５】次に、試験管（容量１０ｍＬ、長さ１０５
ｍｍ、内径１３ｍｍ）に、このアジ化ナトリウム含有試
薬の３ｍＬを注入し、これを「アジ化ナトリウム含有試
薬」とした。Next, test tubes (capacity 10 mL, length 105
mm, inner diameter 13 mm), 3 mL of this sodium azide-containing reagent was injected, and this was designated as "sodium azide-containing reagent".
【００３６】ＨＤＡＯＳ含有試薬 下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水
に溶解し、ｐＨ６．５、７．０、７．５、８．０、８．
５（２０℃）のものをそれぞれ調製した。 測定試薬成分 濃 度 Ｎ−（２−ヒドロキシエチルピペラジン） −Ｎ’−２−エタンスルホン酸［ＨＥＰＥＳ］ １００ｍＭ Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル） −３，５−ジメトキシアニリンナトリウム［ＨＤＡＯＳ］ ２ｍＭHDAOS-Containing Reagents The following reagent components are dissolved in pure water so as to have the respective concentrations described below, and the pH is 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, and 8.0.
5 (20 ° C.) were prepared. Measurement reagent components Concentration N- (2-hydroxyethylpiperazine) -N'-2-ethanesulfonic acid [HEPES] 100 mM N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) -3,5-dimethoxyaniline sodium [HDAOS] 2 mM
【００３７】５種類のｐＨに調整した前記の試薬を各々
試験管（容量１０ｍＬ、長さ１０５ｍｍ、内径１３ｍ
ｍ）に３ｍＬずつ注入し、これをｐＨの異なる５種類の
「ＨＤＡＯＳ含有試薬」とした。Each of the above reagents adjusted to five kinds of pH was placed in a test tube (capacity: 10 mL, length: 105 mm, inner diameter: 13 m).
m) was injected in 3 mL increments, which were used as five types of “HDAOS-containing reagents” having different pH values.
【００３８】（２）試薬の保存 上記（１）で調製した、アジ化ナトリウム含有試薬、及
びＨＤＡＯＳ含有試薬を下記の５種類の組み合わせでビ
ニール袋（１３５ｍｍ×８５ｍｍ；チャック付き）に入
れ、チャックを閉めて密封し、５℃の冷蔵庫にて１７日
間保存した。なお、各試験管の口に栓はしなかった。 ａ）アジ化ナトリウム含有試薬 及び ＨＤＡＯＳ含有
試薬（ｐＨ６．５） ｂ）アジ化ナトリウム含有試薬 及び ＨＤＡＯＳ含有
試薬（ｐＨ７．０） ｃ）アジ化ナトリウム含有試薬 及び ＨＤＡＯＳ含有
試薬（ｐＨ７．５） ｄ）アジ化ナトリウム含有試薬 及び ＨＤＡＯＳ含有
試薬（ｐＨ８．０） ｅ）アジ化ナトリウム含有試薬 及び ＨＤＡＯＳ含有
試薬（ｐＨ８．５）(2) Storage of Reagents The sodium azide-containing reagent and the HDAOS-containing reagent prepared in (1) above were put into a plastic bag (135 mm × 85 mm; with a chuck) in the following five combinations, and the chuck was Closed and sealed, and stored in a refrigerator at 5 ° C. for 17 days. In addition, the mouth of each test tube was not plugged. a) Reagent containing sodium azide and HDAOS (pH 6.5) b) Reagent containing sodium azide and HDAOS (pH 7.0) c) Reagent containing sodium azide and HDAOS (pH 7.5) d) Reagent containing sodium azide and HDAOS (pH 8.0) e) Reagent containing sodium azide and HDAOS (pH 8.5)
【００３９】（３）保存した試薬の発色の判定 保存開始時及び保存１日後、４日後、７日後、１１日
後、並びに１７日後に、上記（２）で５℃の冷蔵庫にて
保存した、ｐＨの異なる５種類のＨＤＡＯＳ含有試薬
が、発色しているか否かを目視で判定した。(3) Judgment of color development of the stored reagent At the start of storage and at 1 day, 4 days, 7 days, 11 days, and 17 days after storage, stored in a refrigerator at 5 ° C. in the above (2), pH It was visually determined whether or not five different HDAOS-containing reagents had different colors.
【００４０】（４）判定結果 試薬の発色の判定結果を表１に示した。(4) Judgment Results Table 1 shows the judgment results of the coloring of the reagents.
【００４１】[0041]
【表１】 [Table 1]
【００４２】この表より、「アジ化ナトリウム含有試薬
及びＨＤＡＯＳ含有試薬（ｐＨ６．５）」の組み合わせ
の場合は、保存１日後にして、「アジ化ナトリウム含有
試薬及びＨＤＡＯＳ含有試薬（ｐＨ７．０）」の組み合
わせの場合は、保存４日後で既に発色してしまっている
ことが分かる。これに対して、「アジ化ナトリウム含有
試薬及びＨＤＡＯＳ含有試薬（ｐＨ７．５）」の組み合
わせの場合は、保存４日後でも発色しておらず、「アジ
化ナトリウム含有試薬及びＨＤＡＯＳ含有試薬（ｐＨ
８．０）」の組み合わせの場合は、保存７日後でも発色
していないことが分かる。更に、「アジ化ナトリウム含
有試薬及びＨＤＡＯＳ含有試薬（ｐＨ８．５）」の組み
合わせの場合は、保存１７日後でさえも発色していない
ことが分かる。According to this table, in the case of the combination of the "reagent containing sodium azide and HDAOS (pH 6.5)", one day after storage, the "reagent containing sodium azide and HDAOS (pH 7.0)" was used. It can be seen that the color has already been developed 4 days after storage. On the other hand, in the case of the combination of the “sodium azide-containing reagent and the HDAOS-containing reagent (pH 7.5)”, the color did not develop even after 4 days of storage, and the “sodium azide-containing reagent and the HDAOS-containing reagent (pH 7.5)
8.0)), it can be seen that no color was developed even after 7 days of storage. Furthermore, in the case of the combination of the “reagent containing sodium azide and the reagent containing HDAOS (pH 8.5)”, it can be seen that color was not developed even after 17 days of storage.
【００４３】このことにより、ＨＤＡＯＳ含有試薬（第
１の試薬）のｐＨを７．５以上に設定すれば、アジ化ナ
トリウム含有試薬から気化したアジ化物がＨＤＡＯＳ含
有試薬に溶け込んでもＨＤＡＯＳ含有試薬の発色を抑
え、試薬の劣化、機能の低下を防ぐことが出来ることが
確かめられた。Thus, if the pH of the HDAOS-containing reagent (first reagent) is set to 7.5 or more, the color of the HDAOS-containing reagent is developed even if the azide vaporized from the sodium azide-containing reagent dissolves in the HDAOS-containing reagent. It was confirmed that deterioration of reagents and deterioration of functions could be prevented.
【００４４】［実施例２］ （アジ化物の混入による試薬の劣化防止効果の実証）ア
ジ化ナトリウムの混入により発色してしまうＮ−（２−
ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキ
シアニリンナトリウム（ＨＤＡＯＳ）含有試薬にアジ化
ナトリウムを添加して、試薬プローブ等よりアジ化ナト
リウムが混入した場合の試薬を作り出し、ＨＤＡＯＳ含
有試薬のｐＨを変更したことによる発色、劣化の度合い
を確かめた。Example 2 (Demonstration of Effect of Preventing Deterioration of Reagent by Incorporation of Azide) N- (2-
Sodium azide is added to a reagent containing sodium (hydroxy-3-sulfopropyl) -3,5-dimethoxyaniline (HDAOS) to create a reagent when sodium azide is mixed in from a reagent probe or the like, and the pH of the reagent containing HDAOS is adjusted. And the degree of color development and deterioration due to the change of.
【００４５】（１）試薬の調製 アジ化ナトリウムを添加したＨＤＡＯＳ含有試薬 下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水
に溶解し、ｐＨ６．５、７．０、７．５、８．０、８．
５（２０℃）のものをそれぞれ調整した。 測定試薬成分 濃 度 Ｎ−（２−ヒドロキシエチルピペラジン） −Ｎ’−２−エタンスルホン酸［ＨＥＰＥＳ］ １００ｍＭ Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル） −３，５−ジメトキシアニリンナトリウム［ＨＤＡＯＳ］ ２ｍＭ アジ化ナトリウム ０．０１％(1) Preparation of Reagent A HDAOS-containing reagent to which sodium azide was added The following reagent components were dissolved in pure water so as to have the concentrations described, respectively, and the pH was 6.5, 7.0, 7.5, and 8: 0.0,8.
5 (20 ° C.) were prepared. Measurement reagent components Concentration N- (2-hydroxyethylpiperazine) -N'-2-ethanesulfonic acid [HEPES] 100 mM N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) -3,5-dimethoxyaniline sodium [HDAOS] 2 mM sodium azide 0.01%
【００４６】５種類のｐＨに調整した試薬を各々試験管
（容量１０ｍＬ、長さ１０５ｍｍ、内径１３ｍｍ）に、
３ｍＬずつ注入し、これを「アジ化ナトリウムを添加し
たＨＤＡＯＳ含有試薬」とした。Each of the reagents adjusted to the five pH values was placed in a test tube (volume: 10 mL, length: 105 mm, inner diameter: 13 mm).
Each 3 mL was injected, and this was designated as "HDAOS-containing reagent to which sodium azide was added".
【００４７】（２）試薬の保存 上記（１）で調製した５種類の「アジ化ナトリウムを添
加したＨＤＡＯＳ含有試薬」を密栓して、５℃の冷蔵庫
にて１７日間保存した。 ａ）アジ化ナトリウムを添加したＨＤＡＯＳ含有試薬
（ｐＨ６．５） ｂ）アジ化ナトリウムを添加したＨＤＡＯＳ含有試薬
（ｐＨ７．０） ｃ）アジ化ナトリウムを添加したＨＤＡＯＳ含有試薬
（ｐＨ７．５） ｄ）アジ化ナトリウムを添加したＨＤＡＯＳ含有試薬
（ｐＨ８．０） ｅ）アジ化ナトリウムを添加したＨＤＡＯＳ含有試薬
（ｐＨ８．５）(2) Storage of Reagents Five kinds of “HDAOS-containing reagents to which sodium azide was added” prepared in the above (1) were sealed and stored in a refrigerator at 5 ° C. for 17 days. a) HDAOS-containing reagent with sodium azide added (pH 6.5) b) HDAOS-containing reagent with sodium azide added (pH 7.0) c) HDAOS-containing reagent with sodium azide added (pH 7.5) d) HDAOS-containing reagent with sodium azide added (pH 8.0) e) HDAOS-containing reagent with sodium azide added (pH 8.5)
【００４８】（３）試薬の発色の判定 保存開始時及び保存１日後、４日後、７日後、１１日
後、並びに１７日後に、ｐＨの異なる５種類の「アジ化
ナトリウムを添加したＨＤＡＯＳ含有試薬」が、発色し
ているか否かを目視で判定した。(3) Determination of Reagent Color Development Five kinds of “HDAOS-containing reagents to which sodium azide was added” having different pHs at the start of storage and at 1, 4, 7, 11, and 17 days after storage. However, it was visually determined whether or not color was developed.
【００４９】（４）測定結果 試薬の発色の判定結果を表２に示した。(4) Results of measurement Table 2 shows the results of determination of color development of the reagent.
【００５０】[0050]
【表２】 [Table 2]
【００５１】この表より、ｐＨ６．５の「アジ化ナトリ
ウムを添加したＨＤＡＯＳ含有試薬」は、保存１日後に
して、ｐＨ７．０の「アジ化ナトリウムを添加したＨＤ
ＡＯＳ含有試薬」は、保存４日後で既に発色しているこ
とが分かる。これに対して、ｐＨ７．５の「アジ化ナト
リウムを添加したＨＤＡＯＳ含有試薬」は、保存４日後
でも発色しておらず、ｐＨ８．０の「アジ化ナトリウム
を添加したＨＤＡＯＳ含有試薬」は、保存７日後でも発
色していないことがわかる。更に、ｐＨ８．５の「アジ
化ナトリウムを添加したＨＤＡＯＳ含有試薬」は、保存
１７日後でさえも発色していないことが分かる。According to this table, the “HDAOS-containing reagent to which sodium azide was added” having a pH of 6.5 was replaced with the “HDAOS-containing reagent to which sodium azide was added” at pH 7.0 after one day of storage.
It can be seen that the “AOS-containing reagent” has already developed color four days after storage. On the other hand, the “HDAOS-containing reagent to which sodium azide was added” at pH 7.5 did not develop color even after 4 days of storage, and the “HDAOS-containing reagent to which sodium azide was added” at pH 8.0 was stored. It can be seen that no color was developed even after 7 days. Further, it can be seen that the “HDAOS-containing reagent to which sodium azide was added” at pH 8.5 did not develop color even after 17 days of storage.
【００５２】このことにより、ＨＤＡＯＳ含有試薬のｐ
Ｈを７．５以上に設定すれば、アジ化物が混入してもＨ
ＤＡＯＳ含有試薬の発色を抑え、試薬の劣化、機能の低
下を防ぐことが出来ることが確かめられた。Thus, the pA of the HDAOS-containing reagent
If H is set to 7.5 or more, even if azide is mixed in, H
It was confirmed that the color development of the DAOS-containing reagent can be suppressed, and deterioration of the reagent and deterioration of the function can be prevented.
【００５３】［実施例３］ （尿酸測定試薬への応用例）ＨＤＡＯＳを含有する尿酸
測定用の第１試薬（第１の試薬）、及び４−アミノアン
チピリンを含有する尿酸測定用の第２試薬（第２の試
薬）より構成される尿酸測定用試薬を調製し、アジ化物
を気化するアジ化ナトリウム含有試薬を近傍に置いた場
合の安定性を検討した。Example 3 (Application to Uric Acid Measurement Reagent) A first reagent (first reagent) for measuring uric acid containing HDAOS and a second reagent for measuring uric acid containing 4-aminoantipyrine A uric acid measurement reagent composed of (second reagent) was prepared, and the stability when a sodium azide-containing reagent that vaporizes azide was placed in the vicinity was examined.
【００５４】（１）試薬の調製 アジ化ナトリウム含有試薬の調製 下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水
に溶解し、ｐＨを５．２（２０℃）に調整した。 測定試薬成分 濃 度 Ｎ−（２−ヒドロキシエチルピペラジン） −Ｎ’−２−エタンスルホン酸［ＨＥＰＥＳ］ １００ｍＭ アジ化ナトリウム １０ｍＭ(1) Preparation of Reagent Preparation of Reagent Containing Sodium Azide The following reagent components were dissolved in pure water so as to have the respective concentrations described, and the pH was adjusted to 5.2 (20 ° C.). Measurement reagent component Concentration N- (2-hydroxyethylpiperazine) -N'-2-ethanesulfonic acid [HEPES] 100 mM Sodium azide 10 mM
【００５５】本発明・尿酸測定用第１試薬の調製 下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水
に溶解し、ｐＨ８．５（２０℃）に調整したものを調製
した。 測定試薬成分 濃 度 Ｎ−（２−ヒドロキシエチルピペラジン） −Ｎ’−２−エタンスルホン酸［ＨＥＰＥＳ］ １０ｍＭ Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル） −３，５−ジメトキシアニリンナトリウム［ＨＤＡＯＳ］ ２ｍＭ ペルオキシダーゼ ３０００単位／Ｌ アスコルビン酸オキシダーゼ ３０００単位／ＬPreparation of the First Reagent for Uric Acid Measurement of the Present Invention The following reagent components were dissolved in pure water so as to have the respective concentrations described below, and adjusted to pH 8.5 (20 ° C.). Measurement reagent component Concentration N- (2-hydroxyethylpiperazine) -N'-2-ethanesulfonic acid [HEPES] 10 mM N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) -3,5-dimethoxyaniline sodium [HDAOS] 2 mM peroxidase 3000 units / L Ascorbate oxidase 3000 units / L
【００５６】対照・尿酸測定用第１試薬の調製 ｐＨを７．０（２０℃）に調整すること以外は、上記
の本発明・尿酸測定用第１試薬と同じ試薬成分及び濃度
で調製を行った。Preparation of Control / First Reagent for Uric Acid Measurement Except for adjusting the pH to 7.0 (20 ° C.), preparation was carried out with the same reagent components and concentration as the above-mentioned first reagent for uric acid measurement. Was.
【００５７】尿酸測定用第２試薬の調製 下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水
に溶解し、ｐＨ７．０（２０℃）に調整したものを調製
した。 測定試薬成分 濃 度 Ｎ−（２−ヒドロキシエチルピペラジン） −Ｎ’−２−エタンスルホン酸［ＨＥＰＥＳ］ ２００ｍＭ ４−アミノアンチピリン ２．５ｍＭ ウリカーゼ １０００単位／ＬPreparation of the Second Reagent for Uric Acid Measurement The following reagent components were dissolved in pure water so as to have the respective concentrations described, and adjusted to pH 7.0 (20 ° C.). Measuring reagent component Concentration N- (2-hydroxyethylpiperazine) -N'-2-ethanesulfonic acid [HEPES] 200 mM 4-aminoantipyrine 2.5 mM uricase 1000 units / L
【００５８】（２）安定性検討のための試薬の保存 上記（１）で調製した、アジ化ナトリウム含有試薬、対
照及び本発明尿酸測定用第１試薬、並びに第２試薬を、
図１のようにそれぞれ試験管（容量１０ｍＬ、長さ１０
５ｍｍ、内径１３ｍｍ）に充填し、下記の組み合わせで
ビニール袋（１３５ｍｍ×８５ｍｍ；チャック付き）に
入れ、チャックを閉めて密封し、５℃の冷蔵庫にて１０
日間保存した。なお、各試験管の口に栓はしなかった。 ａ）本発明・尿酸測定用第１試薬（ｐＨ８．５）、第２
試薬及びアジ化ナトリウム含有試薬 ｂ）対 照・尿酸測定用第１試薬（ｐＨ７．０）、第２
試薬及びアジ化ナトリウム含有試薬(2) Storage of Reagent for Stability Study The sodium azide-containing reagent, control and first and second reagents for uric acid measurement of the present invention prepared in (1) above were
As shown in FIG. 1, each test tube (capacity 10 mL, length 10
5 mm, inner diameter 13 mm), put in a plastic bag (135 mm x 85 mm; with a zipper) in the following combination, close the zipper box, seal, and place in a refrigerator at 5 ° C.
Saved for days. In addition, the mouth of each test tube was not plugged. a) The present invention, the first reagent for measuring uric acid (pH 8.5), the second reagent
Reagents and reagents containing sodium azide b) First reagent (pH 7.0) for control and uric acid measurement, second reagent
Reagents and reagents containing sodium azide
【００５９】（３）保存した試薬の安定性の判定 保存開始時及び、保存１日後、５日後、並びに１０日後
に、本発明及び対照の尿酸測定用第１試薬が発色してい
るか否かを目視で判定した。(3) Determination of Stability of Stored Reagent At the start of storage, and after 1, 5 and 10 days of storage, it was determined whether or not the first reagent for uric acid measurement of the present invention and the control was colored. It was determined visually.
【００６０】（４）安定性の判定結果 試薬の安定性について、発色の判定結果を表３に示し
た。(4) Results of Judgment of Stability Table 3 shows the results of judgment of color development regarding the stability of the reagent.
【００６１】[0061]
【表３】 [Table 3]
【００６２】この表より、対照・尿酸測定用第１試薬
は、保存１日後にして既に発色してしまっているのに対
して、本発明・尿酸測定用第１試薬は、保存１０日後で
さえも発色していないことが分かる。From the table, it can be seen that the control / first reagent for uric acid measurement has already developed color after one day of storage, whereas the first reagent for uric acid measurement of the present invention has a color even after 10 days of storage. It can be seen that no color has developed.
【００６３】このことにより、本発明・尿酸測定用第１
試薬では、アジ化ナトリウム含有試薬から気化したアジ
化物が尿酸測定試薬に溶け込んでも試薬の劣化、機能の
低下を防ぐことが出来ることが確かめられた。Thus, according to the present invention, the first uric acid measurement
In the case of the reagent, it was confirmed that even if the azide vaporized from the sodium azide-containing reagent dissolves in the uric acid measurement reagent, the reagent can be prevented from deteriorating and its function being reduced.
【００６４】（５）相関の測定 本発明・尿酸測定用第１試薬及び対照・尿酸測定用第１
試薬並びに尿酸測定用第２試薬にて、５０検体のヒト血
清試料の尿酸値を測定して、本発明試薬及び対照試薬の
相関を確認した。(5) Measurement of correlation The present invention, the first reagent for measuring uric acid and the control, the first reagent for measuring uric acid
The uric acid level of 50 human serum samples was measured with the reagent and the second reagent for uric acid measurement, and the correlation between the reagent of the present invention and the control reagent was confirmed.
【００６５】ヒト血清試料中の尿酸の測定は、日立製作
所製７１５０形自動分析装置にて行い、ヒト血清試料５
μＬに第１試薬として尿酸測定用第１試薬を３２０μＬ
加え３７℃で５分間反応させた後、第２試薬として尿酸
測定用第２試薬を８０μＬ添加し混合液（最終反応液）
とした。この時の最終反応液のｐＨは、本発明及び対照
・尿酸測定用試薬ともに７．０であった。３７℃で反応
を行わせ、主波長６００ｎｍ及び副波長７００ｎｍにお
ける第２試薬添加直前（２４ポイント）と、第２試薬添
加５分目（５０ポイント）の吸光度の増加分より、既知
濃度の尿酸標準液を測定した時の吸光度との比例計算に
よって尿酸値を求めた。なお、純水を試料とした時の吸
光度を試薬盲検値として、各ポイントにおいて測定した
吸光度より各ポイントの試薬盲検値を差し引いた吸光度
を尿酸値の算出に用いた。The measurement of uric acid in a human serum sample was performed using an automatic analyzer 7150 manufactured by Hitachi, Ltd.
320 μL of the first reagent for uric acid measurement as the first reagent in μL
After the reaction at 37 ° C. for 5 minutes, 80 μL of a second reagent for uric acid measurement was added as a second reagent, and a mixed solution (final reaction solution) was added.
And At this time, the pH of the final reaction solution was 7.0 for both the present invention and the control / reagent for measuring uric acid. The reaction was carried out at 37 ° C., and the uric acid standard having a known concentration was determined based on the increase in absorbance immediately before the addition of the second reagent (600 points) at the main wavelength of 600 nm and the auxiliary wavelength of 700 nm (24 points) and at 5 minutes after the addition of the second reagent (50 points). The uric acid value was determined by proportional calculation with the absorbance when the liquid was measured. The absorbance when pure water was used as a sample was used as the reagent blind value, and the absorbance obtained by subtracting the reagent blind value at each point from the absorbance measured at each point was used for calculating the uric acid value.
【００６６】（６）測定結果 本発明・尿酸測定用第１試薬及び対照・尿酸測定用第１
試薬並びに尿酸測定用第２試薬を用いてヒト血清試料中
の尿酸を測定した時の測定結果を図２に示した。この図
において、横軸は対照試薬による測定値を表し、縦軸は
本発明試薬による測定値を表す。(6) Measurement results The present invention: the first reagent for measuring uric acid and the control, the first reagent for measuring uric acid
FIG. 2 shows the measurement results when uric acid in a human serum sample was measured using the reagent and the second reagent for uric acid measurement. In this figure, the abscissa represents the value measured by the control reagent, and the ordinate represents the value measured by the reagent of the present invention.
【００６７】[0067]
【図２】FIG. 2
【００６８】この図より本発明試薬（ｙ）と対照試薬
（ｘ）との回帰式がｙ＝１．００４ｘ−０．０７４であ
り、相関係数がｒ＝０．９９９であって、良好な相関を
示していることがわかる。From this figure, the regression equation between the reagent of the present invention (y) and the control reagent (x) is y = 1.004x-0.074, the correlation coefficient is r = 0.999, It turns out that it shows a correlation.
【００６９】このことにより、本発明・尿酸測定用第１
試薬及び尿酸測定用第２試薬による尿酸の測定は、アジ
化物の溶け込み、混入を受けておらず誤差を生じていな
い対照・尿酸測定用第１試薬及び尿酸測定用第２試薬と
測定値が同一であり、正確な尿酸値を得られることが確
かめられた。Thus, according to the present invention, the first uric acid measurement
The measurement of uric acid with the reagent and the second reagent for uric acid measurement is the same as that of the control / first reagent for uric acid measurement and the second reagent for uric acid measurement, in which no azide is dissolved or mixed and no error occurs. It was confirmed that an accurate uric acid value could be obtained.
【００７０】［実施例４］ （総コレステロール測定試薬への応用例）４−アミノア
ンチピリンを含有する総コレステロール測定用の第１試
薬（第２の試薬）、及びＨＤＡＯＳを含有する総コレス
テロール測定用の第２試薬（第１の試薬）より構成され
る総コレステロール測定用試薬を調製し、第２試薬にア
ジ化ナトリウムを添加した場合の安定性を検討した。Example 4 (Application to Total Cholesterol Measurement Reagent) First reagent (second reagent) for measuring total cholesterol containing 4-aminoantipyrine and total reagent for measuring total cholesterol containing HDAOS A reagent for measuring total cholesterol composed of the second reagent (first reagent) was prepared, and the stability when sodium azide was added to the second reagent was examined.
【００７１】（１）試薬の調製 総コレステロール測定用第１試薬の調製 下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水
に溶解し、ｐＨ６．９（２０℃）に調整した。 測定試薬成分 濃 度 Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸［ＡＤＡ］ １００ｍＭ ４−アミノアンチピリン ０．４４ｍＭ コレステロールエステラーゼ ４００単位／Ｌ アスコルビン酸オキシダーゼ ３００単位／Ｌ(1) Preparation of Reagent Preparation of First Reagent for Measurement of Total Cholesterol The following reagent components were dissolved in pure water so as to have the concentrations described respectively, and the pH was adjusted to 6.9 (20 ° C.). Measurement reagent components Concentration N- (2-acetamido) iminodiacetic acid [ADA] 100 mM 4-aminoantipyrine 0.44 mM cholesterol esterase 400 units / L Ascorbate oxidase 300 units / L
【００７２】アジ化ナトリウムを添加した本発明・総
コレステロール測定用第２試薬の調製 下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水
に溶解し、ｐＨ８．０、９．０（２０℃）のものをそれ
ぞれ調整した。 測定試薬成分 濃 度 Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル −２−アミノエタンスルホン酸［ＴＥＳ］ ２０ｍＭ Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル） −３，５−ジメトキシアニリンナトリウム［ＨＤＡＯＳ］ １．６ｍＭ コレステロールオキシダーゼ ３００単位／Ｌ ペルオキシダーゼ １６００単位／Ｌ アジ化ナトリウム ０．０１％Preparation of Second Reagent for Total Cholesterol Measurement of the Present Invention to which Sodium Azide was Added The following reagent components were dissolved in pure water so as to have the respective concentrations described below, and pH 8.0, 9.0 (20 ° C.) ) Was adjusted respectively. Measurement reagent components Concentration N-tris (hydroxymethyl) methyl-2-aminoethanesulfonic acid [TES] 20 mM N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) -3,5-dimethoxyaniline sodium [HDAOS] 1.6 mM Cholesterol oxidase 300 units / L Peroxidase 1600 units / L Sodium azide 0.01%
【００７３】アジ化ナトリウムを添加した対照・総コ
レステロール測定用第２試薬の調製 ｐＨを７．０（２０℃）に調整すること以外は、上記
の本発明・総コレステロール測定用第２試薬と同じ試薬
成分及び濃度で調製を行った。Preparation of Control / Second Reagent for Total Cholesterol Measurement with Addition of Sodium Azide Same as the above-mentioned second reagent for total cholesterol measurement of the present invention except that the pH was adjusted to 7.0 (20 ° C.). Preparations were made with reagent components and concentrations.
【００７４】（２）安定性検討のための試薬の保存 上記（１）で調製した「第１試薬及びアジ化ナトリウム
を添加した本発明及び対照の総コレステロール測定用第
２試薬」を密栓して、室温（２５℃）にて１１日間保存
した。 ａ）アジ化ナトリウムを添加した本発明・総コレステロ
ール測定用第２試薬（ｐＨ８．０） ｂ）アジ化ナトリウムを添加した本発明・総コレステロ
ール測定用第２試薬（ｐＨ９．０） ｃ）アジ化ナトリウムを添加した対照・総コレステロー
ル測定用第２試薬（ｐＨ７．０） ｄ）総コレステロール測定用第１試薬(2) Storage of Reagents for Studying Stability The “second reagent for measuring total cholesterol of the present invention and the control to which the first reagent and sodium azide are added” prepared in the above (1) is sealed. And stored at room temperature (25 ° C.) for 11 days. a) Second reagent for measuring total cholesterol of the present invention to which sodium azide is added (pH 8.0) b) Second reagent for measuring total cholesterol of the present invention to which sodium azide is added (pH 9.0) c) Azide Control / second reagent for measuring total cholesterol (pH 7.0) to which sodium was added d) First reagent for measuring total cholesterol
【００７５】（３）保存した試薬の安定性の判定 保存開始時及び、保存２日後、４日後、７日後、９日
後、並びに１１日後に、本発明及び対照の総コレステロ
ール測定用第２試薬が発色しているか否かを目視で判定
した。(3) Determination of Stability of Stored Reagent At the start of storage and at 2, 4, 7, 9, and 11 days after storage, the second reagent for measuring total cholesterol of the present invention and the control was used. It was visually determined whether or not color had developed.
【００７６】（４）安定性の判定結果 試薬の安定性について、発色の判定結果を表４に示し
た。(4) Results of Judgment of Stability Table 4 shows the results of judgment of color development regarding the stability of the reagent.
【００７７】[0077]
【表４】 [Table 4]
【００７８】この表より、対照・総コレステロール測定
用第２試薬（ｐＨ７．０）は、２５℃保存２日後にし
て、既に発色してしまっているのに対して、本発明・総
コレステロール測定用第２試薬（ｐＨ８．０及びｐＨ
９．０）は、保存１１日後でさえも発色していないこと
が分かる。From this table, it can be seen from the table that the control / second reagent for measuring total cholesterol (pH 7.0) has already developed color two days after storage at 25 ° C. Second reagent (pH 8.0 and pH
9.0) shows no color development even after 11 days of storage.
【００７９】このことにより、本発明の第２試薬では、
試薬プローブ等よりアジ化ナトリウムが総コレステロー
ル測定用試薬に溶け込んでも試薬の劣化、機能の低下を
防ぐことが出来ることが確かめられた。As a result, in the second reagent of the present invention,
It was confirmed from a reagent probe and the like that even if sodium azide was dissolved in the reagent for measuring total cholesterol, it was possible to prevent the reagent from deteriorating and its function from decreasing.
【００８０】（５）相関の測定 総コレステロール測定用第１試薬並びに本発明（ｐＨ
８．０）及び対照の総コレステロール測定用第２試薬に
て、６０検体のヒト血清試料の総コレステロール値を測
定して、本発明試薬及び対照試薬の相関を確認した。(5) Measurement of correlation The first reagent for measuring total cholesterol and the present invention (pH
8.0) and a control total cholesterol second reagent, the total cholesterol value of 60 human serum samples was measured to confirm the correlation between the reagent of the present invention and the control reagent.
【００８１】ヒト血清試料中の総コレステロールの測定
は、日立製作所製７１５０形自動分析装置にて行い、ヒ
ト血清試料４μＬに第１試薬として総コレステロール測
定用第１試薬を３００μＬ加え３７℃で５分間反応させ
た後、第２試薬として総コレステロール測定用第２試薬
を１００μＬ添加し混合液（最終反応液）とした。この
時の最終反応液のｐＨは、本発明及び対象・総コレステ
ロール測定用試薬ともに７．０であった。３７℃で反応
を行わせ、主波長６００ｎｍ及び副波長７００ｎｍにお
ける第２試薬添加直前（２４ポイント）と、第２試薬添
加５分目（５０ポイント）の吸光度の増加分より、既知
濃度の総コレステロール標準液を測定した時の吸光度と
の比例計算によって総コレステロール値を求めた。な
お、純水を試料とした時の吸光度を試薬盲検値として、
各ポイントにおいて測定した吸光度より各ポイントの試
薬盲検値を差し引いた吸光度を総コレステロール値の算
出に用いた。The total cholesterol in the human serum sample was measured using a Hitachi 7150 type automatic analyzer, and 300 μL of the first reagent for total cholesterol measurement was added to 4 μL of the human serum sample as the first reagent at 37 ° C. for 5 minutes. After the reaction, 100 μL of a second reagent for measuring total cholesterol was added as a second reagent to prepare a mixed solution (final reaction solution). At this time, the pH of the final reaction solution was 7.0 for both the present invention and the target / total cholesterol measurement reagent. The reaction was carried out at 37 ° C., and a known concentration of total cholesterol was determined from the increase in the absorbance immediately before the addition of the second reagent (24 points) at the main wavelength of 600 nm and the auxiliary wavelength of 700 nm (24 points) and at 5 minutes after the addition of the second reagent (50 points). The total cholesterol value was determined by a proportional calculation with the absorbance when the standard solution was measured. The absorbance when pure water was used as the sample was used as the reagent blind value,
The absorbance obtained by subtracting the reagent blind value at each point from the absorbance measured at each point was used for calculating the total cholesterol value.
【００８２】（６）測定結果 本発明・総コレステロール測定用第２試薬及び対照・総
コレステロール測定用第２試薬並びに総コレステロール
測定用第１試薬を用いてヒト血清試料中の総コレステロ
ールを測定した時の測定結果を図３に示した。この図に
おいて、横軸は対照試薬による測定値を表し、縦軸は本
発明試薬による測定値を表す。(6) Measurement Results When total cholesterol in a human serum sample was measured using the present invention, the second reagent for measuring total cholesterol, the control, the second reagent for measuring total cholesterol, and the first reagent for measuring total cholesterol. FIG. 3 shows the measurement results. In this figure, the abscissa represents the value measured by the control reagent, and the ordinate represents the value measured by the reagent of the present invention.
【００８３】[0083]
【図３】FIG. 3
【００８４】この図より本発明試薬（ｙ）と対照試薬
（ｘ）との回帰式がｙ＝０．９９７ｘ−０．７０２であ
り、相関係数がｒ＝０．９９７であって、良好な相関を
示していることがわかる。From this figure, it is found that the regression equation between the reagent (y) of the present invention and the control reagent (x) is y = 0.997x-0.702, the correlation coefficient is r = 0.997, and It turns out that it shows a correlation.
【００８５】このことにより、総コレステロール測定用
第１試薬及び本発明・総コレステロール測定用第２試薬
による総コレステロールの測定は、アジ化物の溶け込
み、混入を受けておらず誤差を生じていない総コレステ
ロール測定用第１試薬及び対照・総コレステロール測定
用第２試薬と測定値が同一であり、正確な総コレステロ
ール値を得られることが確かめられた。Thus, the measurement of total cholesterol using the first reagent for measuring total cholesterol and the second reagent for measuring total cholesterol of the present invention can be performed by measuring total cholesterol in which no azide is dissolved or mixed and no error occurs. The measured values were the same as those of the first reagent for measurement and the second reagent for control / total cholesterol measurement, and it was confirmed that accurate total cholesterol values could be obtained.
【００８６】［実施例５］ （尿酸測定試薬におけるビリルビンの影響回避効果の実
証）ＨＤＡＯＳ含有第１試薬（第１の試薬）、及びｐＨ
７．０の４−アミノアンチピリン含有第２試薬（第２の
試薬）より構成される本発明・尿酸測定用試薬、ＴＯＯ
Ｓ含有第１試薬、及びｐＨ７．５の４−アミノアンチピ
リン含有第２試薬（第２の試薬）より構成される対照１
・尿酸測定用試薬、並びにＴＯＯＳ含有第１試薬、及び
ｐＨ７．０の４−アミノアンチピリン含有第２試薬（第
２の試薬）より構成される対照２・尿酸測定用試薬を調
製し、ビリルビンによる負誤差の影響を検討した。[Example 5] (Demonstration of effect of avoiding the effect of bilirubin in uric acid measurement reagent) HDAOS-containing first reagent (first reagent) and pH
The present invention comprising the 4-aminoantipyrine-containing second reagent (second reagent) of 7.0, uric acid measurement reagent, TOO
Control 1 composed of a first reagent containing S and a second reagent (second reagent) containing 4-aminoantipyrine having a pH of 7.5.
Control 2 composed of a uric acid measuring reagent, a TOOS-containing first reagent, and a 4-aminoantipyrine-containing second reagent (second reagent) having a pH of 7.0. The effects of errors were studied.
【００８７】（１）試薬の調製 本発明・ＨＤＡＯＳ含有第１試薬の調製 下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水
に溶解し、ｐＨ７．５（２０℃）に調整した。 測定試薬成分 濃 度 ３−（Ｎ−モルホリン）プロパンスルホン酸［ＭＯＰＳ］ １０ｍＭ Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル） −３，５−ジメトキシアニリンナトリウム［ＨＤＡＯＳ］ １ｍＭ ペルオキシダーゼ １０００単位／Ｌ アスコルビン酸オキシダーゼ １５００単位／Ｌ(1) Preparation of Reagent Preparation of the First Reagent Containing HDAOS of the Present Invention The following reagent components were dissolved in pure water so as to have the concentrations described respectively, and the pH was adjusted to 7.5 (20 ° C.). Measurement reagent components Concentration 3- (N-morpholine) propanesulfonic acid [MOPS] 10 mM N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) -3,5-dimethoxyaniline sodium [HDAOS] 1 mM peroxidase 1000 units / L ascorbic acid Oxidase 1500 units / L
【００８８】対照・ＴＯＯＳ含有第１試薬の調製 下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水
に溶解し、ｐＨ７．５（２０℃）に調整した。 測定試薬成分 濃 度 ３−（Ｎ−モルホリン）プロパンスルホン酸［ＭＯＰＳ］ １０ｍＭ Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル） −３−メチルアニリン［ＴＯＯＳ］ ２ｍＭ ペルオキシダーゼ １０００単位／Ｌ アスコルビン酸オキシダーゼ １５００単位／ＬControl / Preparation of TOOS-Containing First Reagent The following reagent components were dissolved in pure water so as to have the concentrations described, respectively, and adjusted to pH 7.5 (20 ° C.). Measurement reagent components Concentration 3- (N-morpholine) propanesulfonic acid [MOPS] 10 mM N-ethyl-N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) -3-methylaniline [TOOS] 2 mM peroxidase 1000 units / L ascorbin Acid oxidase 1500 units / L
【００８９】第２試薬の調製 下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水
に溶解し、ｐＨ７．０（２０℃）に調整した。 測定試薬成分 濃 度 Ｎ−（２−ヒドロキシエチルピペラジン） −Ｎ’−２−エタンスルホン酸［ＨＥＰＥＳ］ ２００ｍＭ ４−アミノアンチピリン ２．５ｍＭ ウリカーゼ １０００単位／ＬPreparation of Second Reagent The following reagent components were dissolved in pure water so as to have the concentrations described, respectively, and adjusted to pH 7.0 (20 ° C.). Measuring reagent component Concentration N- (2-hydroxyethylpiperazine) -N'-2-ethanesulfonic acid [HEPES] 200 mM 4-aminoantipyrine 2.5 mM uricase 1000 units / L
【００９０】第２試薬の調製 ｐＨを７．５（２０℃）に調整すること以外は、上記
の第２試薬と同じ試薬成分及び濃度で調製を行った。Preparation of Second Reagent Preparation was carried out with the same reagent components and concentration as in the above second reagent, except that the pH was adjusted to 7.5 (20 ° C.).
【００９１】（２）ビリルビンの影響の測定 ヒト血清試料に干渉チェック・ビリルビン−Ｃ（国際試
薬社製）を加えビリルビン濃度２０及び５０ｍｇ／ｄｌ
の血清試料を作製した。また、希釈血清試料を、ビリル
ビン濃度２０及び５０ｍｇ／ｄｌの血清試料の調製と同
様に、ヒト血清試料と生理食塩水を９：１の割合で混合
し調製した。この３種類の血清試料の尿酸値を、ＨＤＡ
ＯＳ含有第１試薬及びｐＨ７．０の第２試薬（本発
明）、ＴＯＯＳ含有第１試薬及びｐＨ７．５の第２試薬
（対照１）、ＴＯＯＳ含有第１試薬及びｐＨ７．０の第
２試薬（対照２）の各々の試薬にて５回ずつ測定し、本
発明試薬、対照１試薬及び対照２試薬のビリルビンの影
響を確認した。(2) Measurement of the effect of bilirubin Interference check bilirubin-C (manufactured by International Reagents) was added to a human serum sample, and the bilirubin concentrations were 20 and 50 mg / dl.
Of serum samples were prepared. A diluted serum sample was prepared by mixing a human serum sample and physiological saline at a ratio of 9: 1, similarly to the preparation of a serum sample having a bilirubin concentration of 20 and 50 mg / dl. The uric acid levels of these three serum samples were determined by HDA
OS-containing first reagent and pH 7.0 second reagent (invention), TOOS-containing first reagent and pH 7.5 second reagent (control 1), TOOS-containing first reagent and pH 7.0 second reagent ( The measurement was performed five times with each of the reagents of Control 2), and the effects of bilirubin of the reagent of the present invention, the control 1 reagent and the control 2 reagent were confirmed.
【００９２】上記（２）の血清試料中の尿酸の測定は、
日立製作所製７１５０形自動分析装置にて行い、血清試
料５μＬに第１試薬を３２０μＬ加え３７℃で５分間反
応させた後、第２試薬として尿酸測定用第２試薬を８０
μＬ添加し混合液（最終反応液）とした。この時の最終
反応液のｐＨは、本発明試薬及び対照１試薬では７．０
であり、対照２試薬では７．５であった。３７℃で反応
を行わせ、主波長６００ｎｍ及び副波長７００ｎｍにお
ける第２試薬添加直前（２４ポイント）と、第２試薬添
加５分目（５０ポイント）の吸光度の増加分より、既知
濃度の尿酸標準液を測定した時の吸光度との比例計算に
よって尿酸値を求めた。なお、純水を試料とした時の吸
光度を試薬盲検値として、各ポイントにおいて測定した
吸光度より各ポイントの試薬盲検値を差し引いた吸光度
を尿酸値の算出に用いた。The measurement of uric acid in the serum sample in the above (2)
This was performed using a Hitachi 7150-type automatic analyzer. After adding 320 μL of the first reagent to 5 μL of the serum sample and reacting at 37 ° C. for 5 minutes, the second reagent for uric acid measurement was added as a second reagent to 80 μL.
μL was added to obtain a mixed solution (final reaction solution). At this time, the pH of the final reaction solution was 7.0 for the reagent of the present invention and the control 1 reagent.
And 7.5 for the control 2 reagent. The reaction was carried out at 37 ° C., and the uric acid standard having a known concentration was determined based on the increase in absorbance immediately before the addition of the second reagent (600 points) at the main wavelength of 600 nm and the auxiliary wavelength of 700 nm (24 points) and at 5 minutes after the addition of the second reagent (50 points). The uric acid value was determined by proportional calculation with the absorbance when the liquid was measured. The absorbance when pure water was used as a sample was used as the reagent blind value, and the absorbance obtained by subtracting the reagent blind value at each point from the absorbance measured at each point was used for calculating the uric acid value.
【００９３】（３）測定結果 ＨＤＡＯＳ含有第１試薬及びｐＨ７．０の第２試薬（本
発明）、ＴＯＯＳ含有第１試薬及びｐＨ７．５の第２試
薬（対照１）、ＴＯＯＳ含有第１試薬及びｐＨ７．０の
第２試薬（対照２）の各々の試薬にて尿酸を測定した時
の測定結果を表５に示した。(3) Measurement Results The first reagent containing HDAOS and the second reagent having a pH of 7.0 (the present invention), the first reagent containing TOOS and the second reagent having a pH of 7.5 (control 1), the first reagent containing TOOS, Table 5 shows the measurement results when uric acid was measured with each of the pH 7.0 second reagents (Control 2).
【００９４】[0094]
【表５】 [Table 5]
【００９５】この表より対照１試薬では、ビリルビン濃
度２０ｍｇ／ｄｌで１０．１０％、ビリルビン濃度５０
ｍｇ／ｄｌで２８．８７％の負誤差を示し、対照２試薬
では、ビリルビン濃度２０ｍｇ／ｄｌで７．２０％、ビ
リルビン濃度５０ｍｇ／ｄｌで２１．１９％の負誤差を
示しているのに対し、本発明試薬では、ビリルビン濃度
２０ｍｇ／ｄｌで１．７０％、ビリルビン濃度５０ｍｇ
／ｄｌでも４．４７％の負誤差にとどまっていることが
分かる。According to the table, the control 1 reagent has a bilirubin concentration of 20 mg / dl at 10.10% and a bilirubin concentration of 50 mg / dl.
mg / dl shows a negative error of 28.87%, and the control 2 reagent shows a negative error of 7.20% at a bilirubin concentration of 20 mg / dl and 21.19% at a bilirubin concentration of 50 mg / dl. In the reagent of the present invention, the bilirubin concentration is 20 mg / dl, 1.70%, and the bilirubin concentration is 50 mg / dl.
It can be seen that a negative error of 4.47% is also maintained at / dl.
【００９６】このことにより、本発明・尿酸測定用第１
試薬及び尿酸測定用第２試薬による尿酸の測定は、ビリ
ルビンによる影響を受けておらず、正確な尿酸値が得ら
れることが確かめられた。また、本結果より最終反応液
のｐＨが低いほど、ビリルビンの影響を受けないことも
分かる。Thus, according to the present invention, the first uric acid measurement
The measurement of uric acid by the reagent and the second reagent for uric acid measurement was not affected by bilirubin, and it was confirmed that an accurate uric acid value was obtained. The results also show that the lower the pH of the final reaction solution, the less the effect of bilirubin.
【００９７】［実施例６］ （トリグリセライド測定試薬におけるアジ化物の混入に
よる劣化防止効果の実証）ＨＤＡＯＳを含有するトリグ
リセライド測定用の第１試薬（第１の試薬）において、
緩衝剤としてＭＯＰＳ、ＤＩＰＳＯ又はＢｉｃｉｎｅを
使用したもの、及び４−アミノアンチピリンを含有する
トリグリセライド測定用の第２試薬（第２の試薬）より
構成されるトリグリセライド測定用試薬を調製し、アジ
化物を気化するアジ化ナトリウム含有試薬を近傍に置い
て、１０℃及び２５℃で保存した場合の安定性を検討し
た。Example 6 Demonstration of Effect of Preventing Deterioration Due to Mixing of Azide in Triglyceride Measuring Reagent In the first reagent (first reagent) for measuring triglyceride containing HDAOS,
A reagent using MOPS, DIPSO or Bicine as a buffer, and a reagent for measuring triglyceride comprising a second reagent (second reagent) for measuring triglyceride containing 4-aminoantipyrine are prepared, and the azide is vaporized. The stability when stored at 10 ° C. and 25 ° C. with a sodium azide-containing reagent placed nearby was examined.
【００９８】（１）試薬の調製 アジ化ナトリウム含有試薬の調製 下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水
に溶解し、ｐＨを５．２（２０℃）に調整した。 測定試薬成分 濃 度 Ｎ−（２−ヒドロキシエチルピペラジン） −Ｎ’−２−エタンスルホン酸［ＨＥＰＥＳ］ １００ｍＭ アジ化ナトリウム ０．３％(1) Preparation of Reagent Preparation of Reagent Containing Sodium Azide The following reagent components were dissolved in pure water so as to have the concentrations described respectively, and the pH was adjusted to 5.2 (20 ° C.). Measuring reagent component Concentration N- (2-hydroxyethylpiperazine) -N'-2-ethanesulfonic acid [HEPES] 100 mM Sodium azide 0.3%
【００９９】本発明・ＤＩＰＳＯ含有トリグリセライ
ド測定用第１試薬の調製 下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水
に溶解し、ｐＨ７．５、８．０（２０℃）のものをそれ
ぞれ調製した。 測定試薬成分 濃 度 ３−（Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ） −２−ヒドロキシプロパンスルホン酸［ＤＩＰＳＯ］（緩衝液） ２０ｍＭ Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５ −ジメトキシアニリンナトリウム［ＨＤＡＯＳ］（色原体） １．５ｍＭ グリセロールキナーゼ １５０単位／Ｌ グリセロール−３−リン酸オキシダーゼ ３，０００単位／Ｌ アデノシン三リン酸二ナトリウム ０．５ｍＭPreparation of the First Reagent for Measuring Triglyceride Containing DIPSO The following reagent components were dissolved in pure water so as to have the respective concentrations described below, and those having a pH of 7.5 and 8.0 (at 20 ° C.) were used. Prepared. Measurement reagent components Concentration 3- (N, N-bis (2-hydroxyethyl) amino) -2-hydroxypropanesulfonic acid [DIPSO] (buffer) 20 mM N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) -3 1,5-Dimethoxyaniline sodium [HDAOS] (chromogen) 1.5 mM Glycerol kinase 150 units / L Glycerol-3-phosphate oxidase 3,000 units / L Adenosine trisodium disodium 0.5 mM
【０１００】本発明・ＭＯＰＳ含有トリグリセライド
測定用第１試薬の調製 緩衝液をＤＩＰＳＯからＭＯＰＳに変えること、及びｐ
Ｈを７．５（２０℃）に調整すること以外は、上記の
本発明・トリグリセライド測定用第１試薬と同じ測定試
薬成分、及び濃度で調製を行った。Preparation of the First Reagent for Measuring Triglycerides Containing MOPS According to the present invention, the buffer was changed from DIPSO to MOPS, and p
Except that H was adjusted to 7.5 (20 ° C.), preparation was carried out using the same measurement reagent components and concentrations as the above-mentioned first reagent for measuring triglyceride of the present invention.
【０１０１】本発明・Ｂｉｃｉｎｅ含有トリグリセラ
イド測定用第１試薬の調製 緩衝液をＤＩＰＳＯからＢｉｃｉｎｅに変えること、及
びｐＨを８．０、８．５及び９．０（２０℃）に調整す
ること以外は、上記の本発明・トリグリセライド測定
用第１試薬と同じ測定試薬成分、及び濃度で調製を行っ
た。Preparation of First Reagent for Measurement of Bicine-Containing Triglyceride of the Present Invention Except for changing the buffer from DIPSO to Bicine and adjusting the pH to 8.0, 8.5 and 9.0 (20 ° C.). Preparation was performed using the same reagent components and concentrations as those of the first reagent for measuring triglyceride of the present invention described above.
【０１０２】対照・ＭＯＰＳ含有トリグリセライド測
定用第１試薬の調製 緩衝液をＤＩＰＳＯからＭＯＰＳに変えること、及びｐ
Ｈを６．５（２０℃）及び７．０に調整すること以外
は、上記の本発明・トリグリセライド測定用第１試薬
と同じ測定試薬成分、及び濃度で調製を行った。Preparation of Control / First Reagent for Measuring Triglyceride Containing MOPS Changing the buffer from DIPSO to MOPS, and p
Except that H was adjusted to 6.5 (20 ° C.) and 7.0, the preparation was carried out using the same measurement reagent components and concentrations as the above-mentioned first reagent for measuring triglyceride of the present invention.
【０１０３】対照・ＤＩＰＳＯ含有トリグリセライド
測定用第１試薬の調製 ｐＨを７．０（２０℃）に調整すること以外は、上記
の本発明・トリグリセライド測定用第１試薬と同じ測定
試薬成分、及び濃度で調製を行った。Control: Preparation of DIPSO-Containing Triglyceride Measurement First Reagent Same measurement reagent components and concentrations as in the above-described present invention / triglyceride measurement first reagent, except that the pH was adjusted to 7.0 (20 ° C.). Was prepared.
【０１０４】トリグリセライド測定用第２試薬の調製 下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水
に溶解し、ｐＨ（２０℃）に調製した。 測定試薬成分 濃 度 グッド緩衝剤 ５０ｍＭ ４−アミノアンチピリン ０．７５ｍＭ ペルオキシダーゼ ６００単位／ＬPreparation of Second Reagent for Triglyceride Measurement The following reagent components were dissolved in pure water so as to have the concentrations described, respectively, and adjusted to pH (20 ° C.). Measurement reagent components Concentration Good buffer 50 mM 4-aminoantipyrine 0.75 mM peroxidase 600 units / L
【０１０５】（２）安定性検討のための試薬の保存 上記（１）で調製した、アジ化ナトリウム含有試薬、対
照及び本発明トリグリセライド測定用第１試薬、並びに
トリグリセライド測定用第２試薬を、図１のようにそれ
ぞれ試験管（容量１０ｍＬ、長さ１０５ｍｍ、内径１３
ｍｍ）に充填し、下記の組み合わせでビニール袋（１３
５ｍｍ×８５ｍｍ；チャック付き）に入れ、チャックを
閉めて密封し、１０℃及び２５℃にて１１日間保存し
た。 ａ）本発明・ＭＯＰＳ含有トリグリセライド測定用第１
試薬（ｐＨ７．５）、第２試薬並びにアジ化ナトリウム
含有試薬 ｂ）本発明・ＤＩＰＳＯ含有トリグリセライド測定用第
１試薬（ｐＨ７．５）、第２試薬並びにアジ化ナトリウ
ム含有試薬 ｃ）本発明・ＤＩＰＳＯ含有トリグリセライド測定用第
１試薬（ｐＨ８．０）、第２試薬並びにアジ化ナトリウ
ム含有試薬 ｄ）本発明・Ｂｉｃｉｎｅ含有トリグリセライド測定用
第１試薬（ｐＨ８．０）、第２試薬並びにアジ化ナトリ
ウム含有試薬 ｅ）本発明・Ｂｉｃｉｎｅ含有トリグリセライド測定用
第１試薬（ｐＨ８．５）、第２試薬並びにアジ化ナトリ
ウム含有試薬 ｆ）本発明・Ｂｉｃｉｎｅ含有トリグリセライド測定用
第１試薬（ｐＨ９．０）、第２試薬並びにアジ化ナトリ
ウム含有試薬 ｇ）対照・ＭＯＰＳ含有トリグリセライド測定用第１試
薬（ｐＨ６．５）、第２試薬並びにアジ化ナトリウム含
有試薬 ｈ）対照・ＭＯＰＳ含有トリグリセライド測定用第１試
薬（ｐＨ７．０）、第２試薬並びにアジ化ナトリウム含
有試薬 ｉ）対照・ＤＩＰＳＯ含有トリグリセライド測定用第１
試薬（ｐＨ７．０）、第２試薬並びにアジ化ナトリウム
含有試薬(2) Storage of Reagents for Stability Study The sodium azide-containing reagent, the control, the first reagent for measuring triglyceride of the present invention, and the second reagent for measuring triglyceride prepared in the above (1) are shown in FIG. Test tubes (capacity 10 mL, length 105 mm, inner diameter 13
mm) and the following combination of plastic bags (13
(5 mm × 85 mm; with a chuck), closed with the chuck closed, sealed, and stored at 10 ° C. and 25 ° C. for 11 days. a) The present invention, the first for measurement of triglyceride containing MOPS
Reagent (pH 7.5), Second Reagent and Sodium Azide-Containing Reagent b) The Present Invention-First Reagent (pH 7.5) for Measuring Triglyceride Containing DIPSO, Second Reagent and Sodium Azide-Containing Reagent c) Present Invention-DIPSO First reagent (pH 8.0), second reagent, and sodium azide-containing reagent for measuring triglyceride content d) The present invention—First reagent (pH 8.0), second reagent, and sodium azide-containing reagent for measuring bicine-containing triglyceride e) First reagent (pH 8.5), second reagent and sodium azide-containing reagent for measuring Bicine-containing triglyceride of the present invention f) First reagent (pH 9.0), second reagent for measuring Biglycine-containing triglyceride of the present invention And reagent containing sodium azide g) Control / MOPS containing triglyceride No. 1 Drug (pH 6.5), second reagent and reagent containing sodium azide h) Control / first reagent (pH 7.0) for measuring triglyceride containing MOPS, reagent containing second reagent and sodium azide i) Control / triglyceride containing DIPSO Measurement first
Reagent (pH 7.0), second reagent and sodium azide-containing reagent
【０１０６】（３）保存した試薬の安定性の判定 保存開始時及び、保存１日後、２日後、４日後、６日
後、７日後、８日後、並びに１１日後に、各々のトリグ
リセライド測定用第１試薬が発色しているか否かを目視
で判定した。(3) Determination of Stability of Stored Reagents At the start of storage and at 1, 2, 4, 6, 7, 8, and 11 days after storage, the first triglyceride measurement first was performed. It was visually determined whether or not the reagent had developed color.
【０１０７】（４）安定性の判定結果 試薬の安定性について、１０℃における発色の判定結果
を表６に示した。(4) Results of Judgment of Stability Table 6 shows the results of judgment of color development at 10 ° C. with respect to the stability of the reagent.
【０１０８】[0108]
【表６】 [Table 6]
【０１０９】この表６より、対照試薬の「緩衝剤として
ＭＯＰＳを用いたトリグリセライド測定用第１試薬（ｐ
Ｈ６．５及びｐＨ７．０）」では、いずれも２日後にし
て、既に発色してしまっている。「緩衝剤としてＤＩＰ
ＳＯを用いたトリグリセライド測定用第１試薬（ｐＨ
７．０）」でも、保存６日後で、既に発色してしまって
いるのが分かる。これに対して、本発明試薬の「緩衝剤
としてＭＯＰＳを用いたトリグリセライド測定用第１試
薬（ｐＨ７．５）」では、保存４日後でも発色していな
いことが分かる。更に、「緩衝剤としてＤＩＰＳＯを用
いたトリグリセライド測定用第１試薬」では、ｐＨ７．
５の場合には、保存７日後でも発色しておらず、ｐＨ
８．０の場合には、保存１１日後でも発色していないこ
とが分かる。また、「緩衝剤としてＢｉｃｉｎｅを用い
たトリグリセライド測定用第１試薬」では、ｐＨ８．０
の場合には、保存８日後でも発色しておらず、ｐＨ８．
５及びｐＨ９．０の場合には、保存１１日後でも発色し
ていないことが分かる。From Table 6, it can be seen that the control reagent "first reagent for triglyceride measurement using MOPS as a buffer (p
H6.5 and pH 7.0), the color has already been developed after 2 days. "DIP as a buffer
First reagent for triglyceride measurement using SO (pH
7.0)), it can be seen that the color has already been developed 6 days after storage. On the other hand, in the reagent of the present invention, "the first reagent for measuring triglyceride (pH 7.5) using MOPS as a buffering agent" (pH 7.5), no color was developed even after 4 days of storage. Furthermore, in the “first reagent for measuring triglyceride using DIPSO as a buffering agent”, the pH7.
In the case of 5, the color was not developed even after 7 days of storage,
In the case of 8.0, it can be seen that no color was developed even after 11 days of storage. In the “first reagent for measuring triglyceride using Bicine as a buffer,” the pH is 8.0.
In the case of, color was not developed even after 8 days of storage, and the pH was 8.
In the case of pH 5 and pH 9.0, it can be seen that no color was formed even after 11 days of storage.
【０１１０】次に、２５℃における発色の判定結果を表
７に示した。Next, the results of determination of color development at 25 ° C. are shown in Table 7.
【０１１１】[0111]
【表７】 [Table 7]
【０１１２】この表７より、対照試薬の「緩衝剤として
ＭＯＰＳを用いたトリグリセライド測定用第１試薬（ｐ
Ｈ６．５及びｐＨ７．０）」では、いずれも２日後にし
て、既に発色してしまっている。「緩衝剤としてＤＩＰ
ＳＯを用いたトリグリセライド測定用第１試薬（ｐＨ
７．０）」でも、保存４日後で、既に発色してしまって
いるのが分かる。これに対して、本発明試薬の「緩衝剤
としてＭＯＰＳを用いたトリグリセライド測定用第１試
薬（ｐＨ７．５）」では、保存２日後でも発色していな
いことが分かる。更に、「緩衝剤としてＤＩＰＳＯを用
いたトリグリセライド測定用第１試薬」では、ｐＨ７．
５の場合には、保存４日後でも発色しておらず、ｐＨ
８．０の場合には、保存６日後でも発色していないこと
が分かる。また、「緩衝剤としてＢｉｃｉｎｅを用いた
トリグリセライド測定用第１試薬」では、ｐＨ８．０の
場合には、保存４日後でも発色しておらず、ｐＨ８．５
の場合には、保存８日後でも発色していないことが分か
る。更にｐＨ９．０の場合には、保存１１日後でも発色
していないことが分かる。As shown in Table 7, the control reagent “the first reagent for measuring triglyceride using MOPS as a buffer (p
H6.5 and pH 7.0), the color has already been developed after 2 days. "DIP as a buffer
First reagent for triglyceride measurement using SO (pH
7.0) ”, it can be seen that the color has already developed four days after storage. In contrast, it can be seen that the reagent of the present invention, "the first reagent for measuring triglyceride using MOPS as a buffer (pH 7.5)", did not develop color even after 2 days of storage. Furthermore, in the “first reagent for measuring triglyceride using DIPSO as a buffering agent”, the pH7.
In the case of 5, no color was developed even after 4 days of storage,
In the case of 8.0, it can be seen that no color was developed even after 6 days of storage. In addition, in the “first reagent for measuring triglyceride using Bicine as a buffer”, in the case of pH 8.0, no color was formed even after 4 days of storage, and the pH was 8.5.
In the case of, it can be seen that no color was developed even after 8 days of storage. Further, in the case of pH 9.0, it can be seen that no color was formed even after 11 days of storage.
【０１１３】これらのことにより、本発明・トリグリセ
ライド測定用第１試薬及びトリグリセライド測定用第２
試薬では、近傍の試薬に含まれるアジ化ナトリウムが気
化し、これがトリグリセライド測定用試薬に溶け込むこ
とにより起こる発色を抑制し、試薬の劣化や、機能の低
下を防ぐことが出来ることが確かめられた。また、本結
果より第１試薬のｐＨが高いほど、アジ化ナトリウムに
よる試薬の劣化、機能の低下を防ぐことができることも
分かる。同一のｐＨにおいても、緩衝剤がＤＩＰＳＯの
場合には、アジ化ナトリウムの影響を更に抑制すること
ができることが明らかとなった。Thus, according to the present invention, the first reagent for measuring triglyceride and the second reagent for measuring triglyceride can be used.
In the case of the reagent, it was confirmed that sodium azide contained in the nearby reagent was vaporized, which suppressed color development caused by dissolution into the reagent for measuring triglyceride, and prevented deterioration of the reagent and deterioration of the function. The results also show that the higher the pH of the first reagent, the more the deterioration of the reagent and the deterioration of the function due to sodium azide can be prevented. It has been clarified that, even at the same pH, when the buffer is DIPSO, the effect of sodium azide can be further suppressed.
【発明の効果】本発明の試料中の被検物質の測定試薬及
び測定方法は、色原体を含有する第１の試薬のｐＨが
７．５以上であり、且つ第２の試薬のｐＨが第１の試薬
のｐＨ未満になるように測定試薬を構成することによ
り、アジ化物等の近傍の試薬に含まれる成分が気化し、
これが試薬に溶け込むことにより起こる発色を抑制し、
試薬の劣化や、機能の低下を防止することができる。即
ち、測定試薬を開封状態においても長期間安定に使用す
ることができるものである。また、本発明の試料中の被
検物質の測定試薬及び測定方法によれば、アジ化物等の
試薬に含まれる成分が自動分析装置等の試薬プローブ
（試薬採取口）に付着することにより、この試薬プロー
ブが次の試薬を採取した際に、試薬プローブに付着した
アジ化物等がその試薬に混入することにより起こる発色
を抑制し、試薬の劣化や、機能の低下を防止することが
できる。即ち、プローブ方式の自動分析装置においても
長期間安定に使用することができるものである。更に、
本発明の試料中の被検物質の測定試薬及び測定方法によ
れば、ビリルビンによる負誤差の影響を回避できるの
で、正確な測定値が得られるものである。そして、本発
明の試料中の被検物質の測定試薬及び測定方法は、上記
の測定試薬の劣化や機能低下を防止することと、最終反
応液のｐＨを測定反応の至適ｐＨ域に設定することの両
立が可能なものである。According to the reagent and method for measuring a test substance in a sample of the present invention, the pH of the first reagent containing a chromogen is 7.5 or more, and the pH of the second reagent is By configuring the measurement reagent so as to be lower than the pH of the first reagent, components contained in the nearby reagent such as azide are vaporized,
This suppresses the color development caused by dissolving in the reagent,
Deterioration of the reagent and deterioration of the function can be prevented. That is, the measurement reagent can be stably used for a long period of time even in the opened state. Further, according to the reagent and method for measuring a test substance in a sample of the present invention, components contained in a reagent such as azide adhere to a reagent probe (reagent sampling port) of an automatic analyzer or the like. When a reagent probe collects the next reagent, color development caused by azide or the like adhering to the reagent probe being mixed into the reagent can be suppressed, and deterioration of the reagent and deterioration of the function can be prevented. That is, the probe-type automatic analyzer can be used stably for a long period of time. Furthermore,
According to the reagent and method for measuring a test substance in a sample of the present invention, the influence of a negative error due to bilirubin can be avoided, so that accurate measurement values can be obtained. And the measuring reagent and measuring method of the test substance in the sample of the present invention prevent deterioration and function deterioration of the measuring reagent and set the pH of the final reaction solution to the optimum pH range of the measuring reaction. It is possible to achieve both.
【図１】安定性検討のための試薬の保存方法を示した図
面。FIG. 1 is a drawing showing a method of storing reagents for studying stability.
【図２】本発明及び対照尿酸測定用試薬の相関を示す図
面。FIG. 2 is a drawing showing the correlation between the present invention and a control uric acid measurement reagent.
【図３】本発明及び対照総コレステロール測定用試薬の
相関を示す図面。FIG. 3 is a drawing showing the correlation between the present invention and a control total cholesterol measuring reagent.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｑ 1/60 Ｃ１２Ｑ 1/60 1/62 1/62 ──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. 7 Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) C12Q 1/60 C12Q 1/60 1/62 1/62
Claims (6)
反応系を使用し、色原体として電子供与基を有するアニ
リン誘導体を用いる、試料中の被検物質の測定試薬にお
いて、（イ）前記色原体を含有する第１の試薬のｐＨが
７．５以上であり、（ロ）もう一方の試薬である第２の
試薬のｐＨが第１の試薬のｐＨ未満である、ことを特徴
とする、２試薬系の試料中の被検物質の測定試薬。1. A reagent for measuring a test substance in a sample, which comprises using a reaction system for detecting hydrogen peroxide generated by an oxidase and using an aniline derivative having an electron donating group as a chromogen. Wherein the pH of the first reagent containing the chromogen is 7.5 or higher, and (b) the pH of the second reagent, which is the other reagent, is lower than the pH of the first reagent. A reagent for measuring a test substance in a two-reagent system sample.
７．８以上である、請求項１に記載の測定試薬。2. The measurement reagent according to claim 1, wherein the pH of the first reagent containing the chromogen is 7.8 or more.
８．０以上である、請求項１に記載の測定試薬。3. The measurement reagent according to claim 1, wherein the pH of the first reagent containing the chromogen is 8.0 or more.
反応系を使用し、色原体として電子供与基を有するアニ
リン誘導体を用いる、試料中の被検物質の測定方法にお
いて、（イ）前記色原体を含有する第１の試薬のｐＨが
７．５以上であり、（ロ）もう一方の試薬である第２の
試薬のｐＨが第１の試薬のｐＨ未満である、２試薬系の
測定試薬を用いることを特徴とする、試料中の被検物質
の測定方法。4. A method for measuring a test substance in a sample using a reaction system for detecting hydrogen peroxide generated by an oxidase and using an aniline derivative having an electron donating group as a chromogen, the method comprising: The pH of the first reagent containing the chromogen is 7.5 or more, and (b) the pH of the second reagent, which is the other reagent, is lower than the pH of the first reagent. A method for measuring a test substance in a sample, comprising using a measurement reagent.
７．８以上である、請求項４に記載の測定方法。5. The method according to claim 4, wherein the pH of the first reagent containing the chromogen is 7.8 or more.
８．０以上である、請求項４に記載の測定方法。 【０００１】6. The method according to claim 4, wherein the pH of the first reagent containing the chromogen is 8.0 or more. [0001]
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