JP6459268B2 - Biological component measuring method and measuring composition - Google Patents
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Description
本発明は、臨床診断において、生体成分を酸化還元反応を利用して測定する測定方法およびそれに用いる測定用組成物に関し、さらに詳しくは、生体成分中に共存する妨害物質の影響を回避することのできる上記方法および組成物に関する。 The present invention relates to a measurement method for measuring a biological component using a redox reaction in clinical diagnosis and a measurement composition used therefor, and more particularly, to avoid the influence of interfering substances coexisting in the biological component. To the above methods and compositions.
従来、臨床診断においては、酵素法による生体成分の測定が行われており、特に酸化酵素−ペルオキシダーゼ−酸化還元発色試薬（以下、発色剤とも表記する。）系による方法、すなわち検体中の測定対象物質を酵素反応させて過酸化水素を発生させ、これをペルオキシダーゼの存在下発色剤と反応させて比色定量する方法が広く行われている。この方法では、血清中に共存する妨害物質、例えばアスコルビン酸、ビリルビンなどの生体内還元物質の影響を受けやすい問題点が知られていたが、それぞれの妨害物質に応じて種々の対策が検討され、克服されてきた。 Conventionally, in clinical diagnosis, biological components are measured by an enzyme method, and in particular, a method using an oxidase-peroxidase-oxidation-reduction color reagent (hereinafter also referred to as color former) system, that is, a measurement target in a specimen. There has been widely used a method for colorimetric determination by reacting a substance with an enzyme to generate hydrogen peroxide and reacting it with a color former in the presence of peroxidase. This method has been known to be susceptible to the effects of interfering substances coexisting in serum, such as bioreductive substances such as ascorbic acid and bilirubin, but various countermeasures have been studied depending on the respective interfering substances. Have been overcome.
一方、妨害物質としてこれまでエタンシラートが見出されている（非特許文献１）。エタンシラートは止血剤として用いられる医薬品で、毛細血管抵抗性の減弱及び透過性の亢進によると考えられる出血傾向、例えば紫斑病などの患者に経口投与されるため、血清などの体液に混入して測定値に影響を与える可能性がある。非特許文献１によれば、エタンシラートがペルオキシダーゼに対し水素供与体として作用し、測定対象の濃度に応じて生成した過酸化水素を発色色素よりも先に消費してしまうため、真の値に対し負の影響を与えることとなる。 On the other hand, ethanesylate has been found as an interfering substance (Non-Patent Document 1). Etansylate is a pharmaceutical product used as a hemostatic agent, and is measured by mixing in body fluids such as serum because it is orally administered to patients with bleeding tendency, such as purpura, which is thought to result from decreased capillary resistance and increased permeability. May affect the value. According to Non-Patent Document 1, since ethanesylate acts as a hydrogen donor for peroxidase and consumes hydrogen peroxide generated according to the concentration to be measured prior to the coloring dye, It will have a negative impact.
本発明の目的は、エタンシラートの影響を回避するために、より簡便、安全かつ効果的な方法を創出することである。 The object of the present invention is to create a simpler, safer and more effective method to avoid the effects of ethanesylate.
本発明者らは、反応系への２，２，６，６−Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅ １−Ｏｘｙｌ Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃａｌ（別名ＴＥＭＰＯ Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃａｌ または ２，２，６，６−テトラメチルピペリジン１−オキシル フリーラジカル）（ＣＡＳ番号：２５６４−８３−２）（以下、ＴＥＭＰＯとも記載する。）の添加によりエタンシラートの影響を回避できることを見出した。さらに、ＴＥＭＰＯを測定用組成物に予め添加することにより、試料の前処理を行わずにエタンシラートの影響を受けない測定が出来ることを見出し、本発明を完成させた。
すなわち本発明は以下のような構成からなる。
The inventors have 2,2,6,6-tetramethylpiperidine 1-oxyl free radical (also known as TEMPO free radical or 2,2,6,6-tetramethylpiperidine 1-oxyl free radical) (CAS number) to the reaction system. : 2564-83-2) (hereinafter also referred to as TEMPO) was found to be able to avoid the influence of ethanesylate. Furthermore, by adding TEMPO to the measurement composition in advance, it was found that measurement without being affected by ethanesylate can be performed without pretreatment of the sample, and the present invention was completed.
That is, the present invention has the following configuration.
［項１］
酸化還元反応を利用した生体成分測定方法において、以下の（１）〜（３）の成分を共存させることを特徴とする、エタンシラートの影響を低減させる方法。
（１）ペルオキシダーゼ
（２）ペルオキシダーゼの存在下で過酸化水素と反応して呈色する酸化還元発色試薬
（３）２，２，６，６−Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅ １−Ｏｘｙｌ Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃａｌ（２，２，６，６−テトラメチルピペリジン１−オキシル フリーラジカル）
［項２］
以下の（１）〜（３）の成分を含むことを特徴とする、エタンシラートが含まれている可能性がある生体試料を測定するための試薬
（１）ペルオキシダーゼ
（２）ペルオキシダーゼの存在下で過酸化水素と反応して呈色する酸化還元発色試薬
（３）２，２，６，６−Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅ １−Ｏｘｙｌ Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃａｌ（２，２，６，６−テトラメチルピペリジン１−オキシル フリーラジカル）
[Claim 1]
A method for reducing the influence of ethanesylate, which comprises coexisting the following components (1) to (3) in a biological component measurement method using an oxidation-reduction reaction.
(1) Peroxidase (2) Redox coloring reagent that reacts with hydrogen peroxide in the presence of peroxidase to develop color (3) 2,2,6,6-Tetramethylpiperidine 1-Oxyl Free Radical (2,2,6, 6-tetramethylpiperidine 1-oxyl free radical)
[Section 2]
A reagent for measuring a biological sample that may contain ethanesylate, comprising the following components (1) to (3): (1) peroxidase (2) excess in the presence of peroxidase Redox coloring reagent that reacts with hydrogen oxide and develops color (3) 2,2,6,6-tetramethylpiperidine 1-oxyl free radical (2,2,6,6-tetramethylpiperidine 1-oxyl free radical)
本発明により、酸化酵素−ペルオキシダーゼ−発色剤系による酵素法での生体成分測定において、試料の前処理を行わずにエタンシラートの影響を受けない測定が可能となった。 According to the present invention, in the measurement of biological components by an enzyme method using an oxidase-peroxidase-color former system, measurement that is not affected by ethanesylate is possible without pretreatment of the sample.
（生体成分測定方法）
本発明が適用される生体成分測定方法は、酵素法による生体成分測定方法であって、特に酸化酵素−ペルオキシダーゼ−発色剤系による方法、すなわち検体中の測定対象物質を酵素反応させて過酸化水素を発生させ、これをペルオキシダーゼの存在下で発色剤と反応させて比色定量する方法を利用する方法である。
この原理を用いる生体成分測定方法は既に当該技術分野において確立されている。よって、その知見を本発明に適用して、各種試料中の生体成分の量または濃度を測定することができ、その態様は特に制限されない。
例えば、尿酸（ＵＡ）、クレアチニン（ＣＲＥ）、トリグリセライド（ＴＧ）、コレステロール（ＣＨＯ）などの生体成分等を測定するための方法が例示できる。
(Biological component measurement method)
The biological component measurement method to which the present invention is applied is a biological component measurement method based on an enzyme method, particularly a method using an oxidase-peroxidase-coloring agent system, that is, an enzyme reaction of a measurement target substance in a specimen to produce hydrogen peroxide. Is generated and reacted with a color former in the presence of peroxidase to perform colorimetric determination.
Biological component measurement methods using this principle have already been established in the art. Therefore, the knowledge can be applied to the present invention to measure the amount or concentration of biological components in various samples, and the mode is not particularly limited.
For example, a method for measuring biological components such as uric acid (UA), creatinine (CRE), triglyceride (TG), cholesterol (CHO) and the like can be exemplified.
例えば、ＵＡを測定する場合は、ＵＡを基質とするウリカーゼ（酸化酵素）の反応により生成した過酸化水素をペルオキシダーゼ−発色剤系により定量することができる。
他方、ＣＲＥを測定する場合は、ＣＲＥを基質とするクレアチニンアミジノヒドロラーゼの反応においては過酸化水素を直接生じないので、クレアチニンアミジノヒドロラーゼの反応で生じたクレアチンを予め試薬に添加したクレアチンアミドヒドロラーゼと反応させてサルコシンを生じさせ、さらに、サルコシンを予め試薬に添加したサルコシンオキシダーゼ（酸化酵素）を用いて過酸化水素を生じさせる、いわゆる共役反応を設計することにより、ペルオキシダーゼ−発色剤系によるＣＲＥ濃度の定量が可能になる。
ＴＧを測定する場合は、ＴＧを基質とするリポプロテインリパーゼ、および、共役酵素としてグリセロールキナーゼ、グリセロール３リン酸オキシダーゼ（酸化酵素）を用いて過酸化水素を生じさせることにより、ペルオキシダーゼ−発色剤系によるＴＧ濃度の定量が可能になる。
このように、測定対象を直接酸化して過酸化水素を発生させる反応を触媒する適当な酵素がなくても、過酸化水素を発生することができる酸化酵素の基質に測定対象を変化させうる反応を触媒する酵素（何段階かの酵素反応を繋げてもよい。）と、前記酸化酵素とを組み合わせた共役反応を適宜設計することにより、上記以外の生体成分の濃度又は量を測定することも可能である。
For example, when measuring UA, hydrogen peroxide generated by the reaction of uricase (oxidase) using UA as a substrate can be quantified by a peroxidase-color former system.
On the other hand, when measuring CRE, hydrogen peroxide is not directly generated in the reaction of creatinine amidinohydrolase using CRE as a substrate. Therefore, it reacts with creatine amide hydrolase in which creatine generated in the reaction of creatinine amidinohydrolase is added to the reagent in advance. By designing a so-called coupling reaction in which sarcosine is generated and hydrogen peroxide is generated using sarcosine oxidase (oxidase) in which sarcosine has been added to the reagent in advance, the CRE concentration of the peroxidase-chromogenic system can be increased. Quantification becomes possible.
In the case of measuring TG, a peroxidase-coloring agent system is produced by generating hydrogen peroxide using lipoprotein lipase using TG as a substrate and glycerol kinase and glycerol triphosphate oxidase (oxidase) as conjugate enzymes. Quantification of TG concentration is possible.
In this way, even if there is no suitable enzyme that catalyzes the reaction that directly oxidizes the measurement target to generate hydrogen peroxide, the reaction can change the measurement target to a substrate of oxidase that can generate hydrogen peroxide. It is also possible to measure the concentration or amount of biological components other than those described above by appropriately designing a conjugation reaction in which an enzyme that catalyzes the reaction (may be linked to several stages of enzyme reaction) and the oxidase. Is possible.
上記の方法を実施するための手段としては、汎用の自動分析機（例えば、日立７１７０形自動分析機）に適用できるよう構成された液状試薬（またはキット）を用いる方法、凍結乾燥などの手段により製造された乾燥製剤と溶解液の組み合わせで構成された試薬（またはキット）を用いる方法、適当な担体に酵素などを担持させた形態のいわゆるドライシステム等と呼ばれるキットやセンサを用いる方法など種々の形態が例示できる。
好ましくは、試薬を２つに分包した液状試薬（以下、２試薬系の液状試薬とも記載する。）を用いて自動分析機で分析する方法である。この方法では、試料にまず１種類目の試薬（以下、第一試薬またはＲ１とも記載する。）を添加して一定時間反応させ、次いで２種類目の試薬（以下、第一試薬またはＲ１とも記載する。）をさらに添加して反応させ、この間の吸光度の変化を測定することにより目的成分を定量することが出来る。
Means for carrying out the above method include a method using a liquid reagent (or kit) configured to be applicable to a general-purpose automatic analyzer (for example, Hitachi 7170 type automatic analyzer), a means such as lyophilization. Various methods such as a method using a reagent (or kit) composed of a combination of the produced dry preparation and a solution, a method using a kit or a sensor called a so-called dry system in which an enzyme is supported on an appropriate carrier, etc. A form can be illustrated.
Preferably, the analysis is performed by an automatic analyzer using a liquid reagent in which the reagent is divided into two (hereinafter also referred to as a two-reagent liquid reagent). In this method, the first type of reagent (hereinafter also referred to as the first reagent or R1) is first added to the sample and allowed to react for a certain period of time, and then the second type of reagent (hereinafter also referred to as the first reagent or R1). The target component can be quantified by adding and reacting, and measuring the change in absorbance during this period.
本発明は、酸化還元反応を利用した生体成分測定方法において、エタンシラートの影響を低減させる方法である。本発明の方法は、エタンシラートが含まれている可能性がある生体試料を測定する場合に、試料の前処理を行わずにエタンシラートの影響を低減させることを可能にする。エタンシラートが含まれている可能性がある試料としては、例えば、エタンシラート投与患者の体液（たとえば、血清・血しょうなど血液に由来する試料）があるが、それに限定されない。 The present invention is a method for reducing the influence of ethanesylate in a biological component measurement method using a redox reaction. The method of the present invention makes it possible to reduce the influence of ethanesylate without pre-treatment of the sample when measuring a biological sample that may contain ethanesylate. Examples of the sample that may contain ethanesylate include, but are not limited to, body fluids of patients administered with ethanesylate (for example, samples derived from blood such as serum and plasma).
（生体成分測定試薬）
本発明のエタンシラートが含まれている可能性がある生体試料を測定するための試薬は、以下の（１）〜（３）の成分を含むものであれば特に限定されるものではない。上記のとおり種々の形態をとることができ、その試薬組成などの構成は当業者であれば本明細書の説明に基づいて適宜設定することができる。
（１）ペルオキシダーゼ
（２）ペルオキシダーゼの存在下で過酸化水素と反応して呈色する酸化還元発色試薬
（３）２，２，６，６−Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅ １−Ｏｘｙｌ Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃａｌ（２，２，６，６−テトラメチルピペリジン１−オキシル フリーラジカル）
(Biological component measurement reagent)
The reagent for measuring a biological sample that may contain the ethanesylate of the present invention is not particularly limited as long as it contains the following components (1) to (3). As described above, various forms can be adopted, and the composition of the reagent composition and the like can be appropriately set by those skilled in the art based on the description of the present specification.
(1) Peroxidase (2) Redox coloring reagent that reacts with hydrogen peroxide in the presence of peroxidase to develop color (3) 2,2,6,6-Tetramethylpiperidine 1-Oxyl Free Radical (2,2,6, 6-tetramethylpiperidine 1-oxyl free radical)
（ペルオキシダーゼ）
本発明に用いるペルオキシダーゼとしては、過酸化水素と酸化還元系発色試薬との反応を触媒する酵素であれば、いかなる種類の酵素を用いてもよく、例えば植物由来、細菌由来、担子菌由来のペルオキシダーゼが挙げられる。これらの中でも、純度、入手の容易性、価格等の理由から、西洋ワサビ、イネ、大豆由来のペルオキシダーゼが好ましく、西洋ワサビ由来のペルオキシダーゼがより好ましい。市販品としては、ＰＥＯ−１３１（東洋紡製）、ＰＥＯ−３０１（東洋紡製）、ＰＥＯ−３０２（東洋紡製）等が好適に用いられる。その使用量や添加の形態などについては特に限定されない。
(Peroxidase)
As the peroxidase used in the present invention, any kind of enzyme may be used as long as it catalyzes the reaction between hydrogen peroxide and a redox coloring reagent. For example, peroxidases derived from plants, bacteria, and basidiomycetes Is mentioned. Among these, horseradish, rice, soybean-derived peroxidase is preferable, and horseradish-derived peroxidase is more preferable because of purity, availability, and price. PEO-131 (made by Toyobo), PEO-301 (made by Toyobo), PEO-302 (made by Toyobo), etc. are used suitably as a commercial item. There are no particular restrictions on the amount used or the form of addition.
ペルオキシダーゼ活性は、以下の方法で定義する。
蒸留水１４ｍＬ、５％（Ｗ／Ｖ）ピロガロール水溶液２ｍＬ、０．１４７Ｍ 過酸化水素水１ｍＬ及び１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）２ｍＬを順次混合した後、２０℃にて５分間予備温調し、サンプル溶液１ｍＬを加え、酵素反応を開始する。２０秒間反応を行った後、２Ｎ硫酸水溶液１ｍＬを加えることにより反応を停止し、生成したプルプロガリンをエーテル１５ｍＬにて５回抽出する。抽出液を合わせた後、全量１００ｍＬとし、波長４２０ｎｍにおける吸光度を測定する（ΔＯＤｔｅｓｔ）。一方、盲検は蒸留水１４ｍＬ、５％ピロガロール水溶液２ｍＬ、０．１４７Ｍ 過酸化水素水１ｍＬ及び１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）２ｍＬを順次混合した後、２Ｎ 硫酸水溶液１ｍＬを加えて混和し、次いでサンプル溶液１ｍＬを加えて調製する。この液につき、上記と同様にエーテル抽出を行って吸光度を測定する（ΔＯＤｂｌａｎｋ）。ΔＯＤｔｅｓｔ及びΔＯＤｂｌａｎｋの吸光度の差より生成するプルプロガリン量を算出し、ペルオキシダーゼ活性を算出する。上記条件で２０秒間に１．０ｍｇのプルプロガリンを生成する酵素量を１プルプロガリン単位（Ｕ）とする。計算式は、以下に示す通りである。
Ｕ／ｍＬ
＝｛ΔＯＤ（ＯＤｔｅｓｔ−ＯＤｂｌａｎｋ）×希釈倍率}／｛０．１１７×１（ｍＬ））
＝ΔＯＤ×８．５４７×希釈倍率
Ｕ／ｍｇ＝｛Ｕ／ｍＬ｝×１／Ｃ
０．１１７ ： １ｍｇ％ プルプロガリンエーテル溶液の４２０ｎｍにおける吸光度
Ｃ ： 溶解時の酵素濃度（ｃ ｍｇ／ｍＬ）
（１プロプルガリン単位は１３．５国際単位（ｏ−ｄｉａｎｉｓｉｄｉｎｅを基質とし、２５℃の反応条件下）に相当する。）
なお、上記測定において、サンプル溶液は、予め氷冷した０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ６．０で溶解し、同緩衝液で３．０〜６．０プルプロガリン単位（Ｕ）／ｍＬになるよう希釈して測定に供することが好ましい。
Peroxidase activity is defined by the following method.
14 mL of distilled water, 2 mL of 5% (W / V) pyrogallol solution, 1 mL of 0.147M hydrogen peroxide solution and 2 mL of 100 mM phosphate buffer (pH 6.0) were sequentially mixed, and then pre-controlled at 20 ° C. for 5 minutes. Then, 1 mL of the sample solution is added to start the enzyme reaction. After reacting for 20 seconds, the reaction is stopped by adding 1 mL of 2N aqueous sulfuric acid solution, and the resulting purpurogallin is extracted 5 times with 15 mL of ether. After combining the extracts, the total volume is 100 mL, and the absorbance at a wavelength of 420 nm is measured (ΔOD test ). On the other hand, in the blind test, 14 mL of distilled water, 2 mL of 5% pyrogallol solution, 1 mL of 0.147 M hydrogen peroxide solution and 2 mL of 100 mM phosphate buffer (pH 6.0) were mixed in order, and then 1 mL of 2N sulfuric acid aqueous solution was added and mixed. Then, add 1 mL of the sample solution. About this liquid, ether extraction is performed in the same manner as described above, and the absorbance is measured (ΔOD blank ). The amount of purpurogallin produced is calculated from the difference in absorbance between ΔOD test and ΔOD blank , and the peroxidase activity is calculated. The amount of enzyme that produces 1.0 mg of purpurogallin in 20 seconds under the above conditions is defined as 1 purpurogallin unit (U). The calculation formula is as follows.
U / mL
= {ΔOD (OD test -OD blank ) × dilution ratio} / {0.117 × 1 (mL))
= ΔOD x 8.547 x dilution factor
U / mg = {U / mL} × 1 / C
0.117: Absorbance at 420 nm of 1 mg% purpurogallin ether solution C: Enzyme concentration at dissolution (c mg / mL)
(One propargalin unit corresponds to 13.5 international units (with o-dianisidine as a substrate and reaction conditions at 25 ° C.).)
In the above measurement, the sample solution was dissolved in 0.1 M phosphate buffer pH 6.0 that had been ice-cooled in advance, and diluted to 3.0 to 6.0 purpurogallin units (U) / mL with the same buffer solution. Then, it is preferable to use for the measurement.
（酸化還元発色試薬）
本発明に用いる酸化還元系発色試薬としては、過酸化水素と反応して呈色するものであれば、いかなる種類の色素を用いてもよく、例えば水素供与体とカップラー、ロイコ体、テトラゾリウム塩等が挙げられる。その使用量や添加の形態などについては特に限定されない。これらはいずれも、市販品などを入手することができる。
(Redox coloring reagent)
As the redox coloring reagent used in the present invention, any kind of dye may be used as long as it reacts with hydrogen peroxide and develops color, for example, hydrogen donor and coupler, leuco body, tetrazolium salt, etc. Is mentioned. There are no particular restrictions on the amount used or the form of addition. All of these can be obtained as commercial products.
水素供与体とカップラーを用いた代表例は、水素供与体とカップラーとをペルオキシダーゼの存在下に過酸化水素によって酸化縮合させて色素を形成させるトリンダー（Ｔｒｉｎｄｅｒ）法である。
トリンダー法などに用いる水素供与体としては、フェノール、フェノール誘導体、アニリン誘導体、ナフトール、ナフトール誘導体、ナフチルアミン、ナフチルアミン誘導体等が知られている。
たとえば、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３−メトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３−メチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン、Ｎ−スルホプロピルアニリン、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−２，５−ジメチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−サクシニルエチレンジアミン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−アセチルエチレンジアミン等が挙げられる。また、これら水素供与体はカップラーと組合せて用いることができる。
また、カップラーとしては４−アミノアンチピリン（４ＡＡ）、アミノアンチピリン誘導体、バニリンジアミンスルホン酸、メチルベンズチアゾリノンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）、スルホン化メチルベンズチアゾリノンヒドラゾン（ＳＭＢＴＨ）等が知られている。
A typical example using a hydrogen donor and a coupler is a Trinder method in which a hydrogen donor and a coupler are oxidized and condensed with hydrogen peroxide in the presence of peroxidase to form a dye.
Known hydrogen donors used in the Trinder method include phenol, phenol derivatives, aniline derivatives, naphthol, naphthol derivatives, naphthylamine, naphthylamine derivatives, and the like.
For example, N-ethyl-N-sulfopropyl-3-methoxyaniline, N-ethyl-N-sulfopropylaniline, N-ethyl-N-sulfopropyl-3,5-dimethoxyaniline, N-sulfopropyl-3,5 -Dimethoxyaniline, N-ethyl-N-sulfopropyl-3,5-dimethylaniline, N-ethyl-N-sulfopropyl-3-methylaniline, N-ethyl-N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) -3-methoxyaniline, N-ethyl-N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) aniline, N-ethyl-N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) -3,5-dimethoxyaniline, N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) -3,5-dimethoxyaniline, N-ethyl-N- (2-hydroxy-3-sulfop Pill) -3,5-dimethylaniline, N-ethyl-N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) -3-methoxyaniline, N-sulfopropylaniline, N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) Examples include -2,5-dimethylaniline, N-ethyl-N- (3-methylphenyl) -N'-succinylethylenediamine, N-ethyl-N- (3-methylphenyl) -N'-acetylethylenediamine. These hydrogen donors can be used in combination with a coupler.
As couplers, 4-aminoantipyrine (4AA), aminoantipyrine derivatives, vanillindiamine sulfonic acid, methylbenzthiazolinone hydrazone (MBTH), sulfonated methylbenzthiazolinone hydrazone (SMBTH) and the like are known.
ロイコ体としては、トリフェニルメタン誘導体、フェノチアジン誘導体、ジフェニルアミン誘導体等が挙げられる。具体的には、４，４’−ベンジリデンビス（Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン）、４，４’−ビス［Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピルアミノ）−２，６−ジメチルフェニル］メタン、１−（エチルアミノチオカルボニル）−２−（３，５−ジメトキシ−４−ヒドロキシフェニル）−４，５−ビス（４−ジエチルアミノフェニル）イミダゾール、４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン塩（ＤＡ６４）、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン塩（ＤＡ６７）等が挙げられる。 Examples of leuco bodies include triphenylmethane derivatives, phenothiazine derivatives, diphenylamine derivatives, and the like. Specifically, 4,4′-benzylidenebis (N, N-dimethylaniline), 4,4′-bis [N-ethyl-N- (3-sulfopropylamino) -2,6-dimethylphenyl] methane 1- (ethylaminothiocarbonyl) -2- (3,5-dimethoxy-4-hydroxyphenyl) -4,5-bis (4-diethylaminophenyl) imidazole, 4,4′-bis (dimethylamino) diphenylamine, N- (carboxymethylaminocarbonyl) -4,4′-bis (dimethylamino) diphenylamine salt (DA64), 10- (carboxymethylaminocarbonyl) -3,7-bis (dimethylamino) phenothiazine salt (DA67), etc. Can be mentioned.
テトラゾリウム塩としては、２，３，５−トリフェニルテトラゾリウム塩、２，５−ジフェニル−３−（１−ナフチル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩、３，３’−［３，３’−ジメトキシ−（１，１’−ビフェニル）−４，４’−ジイル］−ビス［２−（４−ニトロフェニル）−５−フェニル−２Ｈ−テトラゾリウム］塩、３，３’−［３，３’−ジメトキシ−（１，１’−ビフェニル）−４，４’−ジイル］−ビス（２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウム）塩、２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩、３，３’−（１，１’−ビフェニル−４，４’−ジイル）−ビス（２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウム）塩、３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウム塩等が挙げられる。 Examples of the tetrazolium salt include 2,3,5-triphenyltetrazolium salt, 2,5-diphenyl-3- (1-naphthyl) -2H-tetrazolium salt, 3,3 ′-[3,3′-dimethoxy- (1 , 1′-biphenyl) -4,4′-diyl] -bis [2- (4-nitrophenyl) -5-phenyl-2H-tetrazolium] salt, 3,3 ′-[3,3′-dimethoxy- ( 1,1′-biphenyl) -4,4′-diyl] -bis (2,5-diphenyl-2H-tetrazolium) salt, 2- (4-iodophenyl) -3- (4-nitrophenyl) -5 (2,4-disulfophenyl) -2H-tetrazolium salt, 3,3 ′-(1,1′-biphenyl-4,4′-diyl) -bis (2,5-diphenyl-2H-tetrazolium) salt, 3- (4,5-dimethyl-2 Thiazolyl) -2,5-diphenyl -2H- tetrazolium salts.
（ＴＥＭＰＯ）
本発明に用いるＴＥＭＰＯは例えば東京化成工業製のものを入手可能である。
(TEMPO)
TEMPO used in the present invention is available from, for example, Tokyo Chemical Industry.
ＴＥＭＰＯの含有量は特に限定されないが、好ましい下限は０．１ｍｍｏｌ／Ｌ、さらに好ましい下限は０．５ｍｍｏｌ／Ｌ、である。一方、好ましい上限は１０ｍｍｏｌ／Ｌ、さらに好ましい上限は５．０ｍｍｏｌ／Ｌ、である。 The content of TEMPO is not particularly limited, but a preferred lower limit is 0.1 mmol / L, and a more preferred lower limit is 0.5 mmol / L. On the other hand, a preferable upper limit is 10 mmol / L, and a more preferable upper limit is 5.0 mmol / L.
本発明には、緩衝液成分を含有させることが好ましい。緩衝液としては、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液、ＧＯＯＤ緩衝液などが挙げられる。その使用量や設定ｐＨ、添加の形態などについては特に限定されない。これらはいずれも、市販品などを入手することができる。
ＧＯＯＤ緩衝液としては、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−２−アミノエタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）、２−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、ピペラジン−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノメタンスルホン酸（ＴＥＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−２−ヒドロキシ−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳＯ）、３−〔Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ〕−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＤＩＰＳＯ）、３−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕プロパンスルホン酸（ＥＰＰＳ）、２−ヒドロキシ−３−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕プロパンスルホン酸（ＨＥＰＰＳＯ）、３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、２−ヒドロキシ−３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、ピペラジン−１，４−ビス（２−ヒドロキシ−３−プロパンスルホン酸）（ＰＯＰＳＯ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ）、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノニ酢酸（ＡＤＡ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕グリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）、などが例示される。
The present invention preferably contains a buffer component. Examples of the buffer include Tris buffer, phosphate buffer, borate buffer, carbonate buffer, and GOOD buffer. There are no particular limitations on the amount used, the set pH, the form of addition, and the like. All of these can be obtained as commercial products.
GOOD buffers include N- (2-acetamido) -2-aminoethanesulfonic acid (ACES), N, N-bis (2-hydroxyethyl) -2-aminoethanesulfonic acid (BES), N-cyclohexyl- 2-aminoethanesulfonic acid (CHES), 2- [4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazinyl] ethanesulfonic acid (HEPES), 2-morpholinoethanesulfonic acid (MES), piperazine-1,4-bis (2-ethanesulfonic acid) (PIPES), N-tris (hydroxymethyl) methyl-2-aminomethanesulfonic acid (TES), N-cyclohexyl-3-aminopropanesulfonic acid (CAPS), N-cyclohexyl-2- Hydroxy-3-aminopropanesulfonic acid (CAPSO), 3- [N, N-bis (2-hydro Cyethyl) amino] -2-hydroxypropanesulfonic acid (DIPSO), 3- [4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazinyl] propanesulfonic acid (EPPS), 2-hydroxy-3- [4- (2- Hydroxyethyl) -1-piperazinyl] propanesulfonic acid (HEPPSO), 3-morpholinopropanesulfonic acid (MOPS), 2-hydroxy-3-morpholinopropanesulfonic acid (MOPSO), piperazine-1,4-bis (2-hydroxy) -3-propanesulfonic acid) (POPSO), N-tris (hydroxymethyl) methyl-3-aminopropanesulfonic acid (TAPSO), N- (2-acetamido) iminoniacetic acid (ADA), N, N-bis (2 -Hydroxyethyl) glycine (Bicine), N- [Tris (hydro Shimechiru) methyl] glycine (Tricine), etc. are exemplified.
本発明において、アスコルビン酸オキシダーゼ、防腐剤、塩類、酵素安定化剤、色原体安定化剤などを反応に影響を及ぼさない範囲で添加してもよい。その使用量や添加の形態などについては特に限定されない。これらはいずれも、市販品などを入手することができる。
防腐剤としては、アジ化物、キレート剤、抗生物質、抗菌剤などが挙げられる。
キレート剤としては、エチレンジアミン四酢酸およびその塩等が挙げられる。
抗生物質としては、ゲンタマイシン、カナマイシン、クロラムフェニコール等が挙げられる。
抗菌剤としては、メチルイソチアゾリノン、イミダゾリジニルウレア等が挙げられる。
塩類としては塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化アルミニウム等が挙げられる。
酵素安定化剤としては、シュークロース、トレハロース、シクロデキストリン、グルコン酸塩、アミノ酸類等が挙げられる。
色原体安定化剤としては、エチレンジアミン四酢酸およびその塩等のキレート剤、シクロデキストリン等が挙げられる。
In the present invention, ascorbate oxidase, preservatives, salts, enzyme stabilizers, chromogen stabilizers and the like may be added within a range that does not affect the reaction. There are no particular restrictions on the amount used or the form of addition. All of these can be obtained as commercial products.
Examples of antiseptics include azides, chelating agents, antibiotics, and antibacterial agents.
Examples of the chelating agent include ethylenediaminetetraacetic acid and its salt.
Antibiotics include gentamicin, kanamycin, chloramphenicol and the like.
Examples of antibacterial agents include methyl isothiazolinone and imidazolidinyl urea.
Examples of the salts include sodium chloride, potassium chloride, aluminum chloride and the like.
Enzyme stabilizers include sucrose, trehalose, cyclodextrin, gluconate, amino acids and the like.
Examples of chromogen stabilizers include chelating agents such as ethylenediaminetetraacetic acid and its salts, and cyclodextrins.
（酵素の安定化方法）
また、当初は予測できなかったことであるが、後述の実施例に記載したとおり、本発明の生体成分測定方法に用いるＴＥＭＰＯには、酵素の安定化効果があることがわかった。すなわち、本発明は、酵素の安定化方法としての一局面も有している。
(Enzyme stabilization method)
Moreover, although it was unpredictable at the beginning, it turned out that TEMPO used for the biological component measuring method of this invention has an enzyme stabilization effect as described in the below-mentioned Example. That is, the present invention also has one aspect as a method for stabilizing an enzyme.
ここで、安定化対象となる酵素は特に限定されない。たとえば上述の生体成分測定方法の説明において示した、ＵＡ、ＣＲＥ、ＴＧ、ＣＨＯなどの測定に用いられる各酵素、ペルオキシダーゼなどが挙げられる。 Here, the enzyme to be stabilized is not particularly limited. For example, each enzyme used for the measurement of UA, CRE, TG, CHO, etc., peroxidase, etc. shown in the above description of the biological component measurement method.
ところで、これらの方法では、血清などの試料中に共存する妨害物質、例えばアスコルビン酸、ビリルビンなどの生体内還元物質の影響を受けやすい問題点が知られていたが、それぞれの妨害物質に応じて、いわゆる消去系など種々の対策が検討され、克服されてきた。例えば、アスコルビン酸に対しては、試料にアスコルビン酸オキシダーゼを作用させることにより消去できる。また、ビリルビンに対しては、試料にビリルビンオキシダーゼを作用させることにより消去できる。このような方法を採用した試薬には、アスコルビン酸オキシダーゼおよび／またはビリルビンオキシダーゼが含まれる。これらの酵素もまた、安定化の対象となりうる。
さらに、数段階の共役反応を設計した場合は、反応中間体が試料に含まれることにより正誤差を発生するので、これらについても消去系が検討されている。代表的な方法は、測定対象物質に直接作用する酵素以外の酵素を試料に作用させて過酸化水素を生じさせ、反応中間体をカタラーゼで消去した後、測定対象物質に直接作用する酵素を反応系に追加して過酸化水素を発生させ、これをペルオキシダーゼの存在下で発色剤と反応させると同時に、カタラーゼの作用を事実上停止させて比色定量する方法である。たとえばＣＲＥ測定の場合は、クレアチニンアミジノヒドロラーゼ以外の酵素（クレアチンアミドヒドロラーゼおよびサルコシンオキシダーゼ）を試料に作用させて、反応中間体（クレアチンなど）に起因して発生した過酸化水素をカタラーゼで消去した後、クレアチニンアミジノヒドロラーゼを反応系に追加して、測定対象であるＣＲＥに起因して発生した過酸化水素をペルオキシダーゼの存在下で発色剤と反応させて比色定量する（このとき、同時に、カタラーゼの作用を実質的に停止させる。）。このような方法を採用した試薬には、カタラーゼが含まれる。この酵素もまた、安定化の対象となりうる。
By the way, in these methods, there are known problems that are easily affected by interfering substances coexisting in samples such as serum, for example, bioreductive substances such as ascorbic acid and bilirubin. Various countermeasures such as a so-called erasing system have been studied and overcome. For example, ascorbic acid can be eliminated by allowing ascorbate oxidase to act on the sample. Further, bilirubin can be eliminated by allowing bilirubin oxidase to act on the sample. Reagents employing such a method include ascorbate oxidase and / or bilirubin oxidase. These enzymes can also be subject to stabilization.
Furthermore, when several stages of conjugation reactions are designed, a positive error occurs due to the inclusion of the reaction intermediate in the sample. A typical method is to cause an enzyme other than the enzyme that directly acts on the measurement target substance to act on the sample to generate hydrogen peroxide, erase the reaction intermediate with catalase, and then react the enzyme that acts directly on the measurement target substance. In this method, hydrogen peroxide is generated in addition to the system, and this is reacted with a color former in the presence of peroxidase, and at the same time, the action of catalase is virtually stopped to perform colorimetric determination. For example, in the case of CRE measurement, an enzyme other than creatinine amidinohydrolase (creatine amide hydrolase and sarcosine oxidase) is allowed to act on the sample and hydrogen peroxide generated due to the reaction intermediate (creatine, etc.) is eliminated by catalase. , Creatinine amidinohydrolase was added to the reaction system, and hydrogen peroxide generated due to the CRE to be measured was reacted with a color former in the presence of peroxidase for colorimetric determination. The action is substantially stopped.) Reagents employing such a method include catalase. This enzyme can also be subject to stabilization.
具体的には、アスコルビン酸オキシダーゼ、ザルコシンオキシダーゼ、クレアチンアミジノヒドロラーゼ、カタラーゼが例示できる。中でもアスコルビン酸オキシダーゼ、カタラーゼが好ましい。 Specific examples include ascorbate oxidase, sarcosine oxidase, creatine amidinohydrolase, and catalase. Of these, ascorbate oxidase and catalase are preferable.
２試薬系の場合、酵素の安定化の観点からは、ＴＥＭＰＯはどちらの試薬に添加してもかまわない。エタンシラートの影響回避効果を得たいのであれば、第一試薬に添加することが好ましい。 In the case of a two-reagent system, TEMPO may be added to either reagent from the viewpoint of enzyme stabilization. If it is desired to obtain the effect of avoiding the influence of ethanesylate, it is preferably added to the first reagent.
以下に、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
（実施例１）
下記のクレアチニン測定試薬の第一試薬に、ＴＥＭＰＯを試薬中終濃度で０．１ｍｍｏｌ／Ｌ〜１０ｍｍｏｌ／Ｌになるように調製して測定試薬とした。
試料として、液状ネスコールＮ（アルフレサファーマ社）に試料中終濃度が２０μｇ／ｍＬとなるようにエタンシラートを加え、エタンシラートを加えていない液状ネスコールＮを対照として影響度を確認した。
比較例として、ＴＥＭＰＯを添加していないクレアチニン測定試薬で同様の検討を行なった。
EXAMPLES The present invention will be specifically described below with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
Example 1
TEMPO was prepared in the first reagent of the following creatinine measuring reagent so that the final concentration in the reagent would be 0.1 mmol / L to 10 mmol / L, and used as a measuring reagent.
As a sample, ethane sylate was added to liquid nescor N (Alfresa Pharma Co., Ltd.) so that the final concentration in the sample was 20 μg / mL, and the degree of influence was confirmed using liquid nescol N without ethane sylate as a control.
As a comparative example, the same study was performed using a creatinine measuring reagent not added with TEMPO.
（試薬の調製）
下記組成からなるクレアチニン測定試薬をそれぞれ調製した。
第一試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ ５０ｍＭ ｐＨ７．４
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） ３Ｕ／ｍＬ
ザルコシンオキシダーゼ（東洋紡社製ＳＡＯ−３５１） １０Ｕ／ｍＬ
クレアチンアミジノヒドロラーゼ（東洋紡社製ＣＲＨ−２２９） ４０Ｕ／ｍＬ
カタラーゼ（東洋紡社製ＣＡＯ−５０９） １３０Ｕ／ｍＬ
Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン ０．１４ｇ／Ｌ
第二試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ ５０ｍＭ ｐＨ７．４
クレアチニンアミドヒドロラーゼ（東洋紡社製ＣＮＨ−３１１） ４００Ｕ／ｍＬ
ペルオキシダーゼ（東洋紡社製ＰＥＯ−３０２） １０Ｕ／ｍＬ
４−アミノアンチピリン ０．６ｇ／Ｌ
(Preparation of reagents)
A creatinine measuring reagent having the following composition was prepared.
First reagent PIPES-NaOH 50 mM pH 7.4
Ascorbate oxidase (ASO-311 manufactured by Toyobo Co., Ltd.) 3 U / mL
Sarcosine oxidase (SAO-351, Toyobo Co., Ltd.) 10 U / mL
Creatine amidinohydrolase (Toyobo CRH-229) 40 U / mL
Catalase (Toyobo CAO-509) 130 U / mL
N-ethyl-N- (3-sulfopropyl) -3-methoxyaniline 0.14 g / L
Second reagent PIPES-NaOH 50 mM pH 7.4
Creatinine amide hydrolase (Toyobo CNH-311) 400 U / mL
Peroxidase (Toyobo PEO-302) 10 U / mL
4-Aminoantipyrine 0.6g / L
（測定法）
日立７１８０形自動分析機を用いた。試料２．７μＬに第一試薬 １２０μＬ添加し３７℃にて５分間インキュベーションし第一反応とした。その後第二試薬を４０μＬ添加し５分間インキュベーションし第二反応とした。第一反応および第二反応の吸光度を液量補正した各吸光度の差をとる２ポイントエンド法で５４６ｎｍにおける吸光度を測定した。
クレアチニン濃度未知試料のクレアチニン濃度の算出は、精製水および５ｍｇ／ｄＬクレアチニン水溶液の測定吸光度より算出して求めた。
(Measurement method)
A Hitachi 7180 automatic analyzer was used. 120 μL of the first reagent was added to 2.7 μL of the sample and incubated at 37 ° C. for 5 minutes to prepare the first reaction. Thereafter, 40 μL of the second reagent was added and incubated for 5 minutes to form a second reaction. Absorbance at 546 nm was measured by a two-point end method in which the absorbances of the first reaction and the second reaction were corrected for the liquid volume and the difference between the absorbances was taken.
The creatinine concentration of the sample with unknown creatinine concentration was calculated from the measured absorbance of purified water and a 5 mg / dL creatinine aqueous solution.
結果を表１に示す。すべての実施例（ＴＥＭＰＯの添加量が０．１ｍｍｏｌ／Ｌ以上１０ｍｍｏｌ／Ｌ以下）で比較例よりエタンシラートの影響が低減した。 The results are shown in Table 1. In all the examples (the amount of TEMPO added was 0.1 mmol / L or more and 10 mmol / L or less), the influence of ethanesylate was reduced as compared with the comparative example.
（実施例２）
実施例１に記載のクレアチニン測定試薬の第一試薬に、ＴＥＭＰＯを試薬中終濃度で０．３ｍｍｏｌ／Ｌとなるように調製して測定試薬とし、調製直後、３５℃・７日間保存後および３５℃・１４日間保存後の試薬について下記測定条件で測定した。
試料としては精製水およびクレアチニン５ｍｇ／ｄＬ水溶液を測定し、試薬ブランク（精製水測定吸光度）および感度（クレアチニン５ｍｇ／ｄＬ水溶液測定吸光度より精製水測定吸光度を差し引いた吸光度）を求めた。
また、実施例１と同様に試料として、液状ネスコールＮ（アルフレサファーマ社）に試料中終濃度が２０μｇ／ｍＬとなるようにエタンシラートを加え、エタンシラートを加えていない液状ネスコールＮを対照として影響度を確認した。
比較例として、ＴＥＭＰＯを添加していないクレアチニン測定試薬で同様の検討を行なった。
(Example 2)
As the first reagent of the creatinine measuring reagent described in Example 1, TEMPO was prepared to a final concentration of 0.3 mmol / L in the reagent to prepare a measuring reagent. Immediately after the preparation, after storage at 35 ° C. for 7 days and 35 The reagent after storage at 14 ° C. for 14 days was measured under the following measurement conditions.
As samples, purified water and creatinine 5 mg / dL aqueous solution were measured, and a reagent blank (purified water measurement absorbance) and sensitivity (absorbance obtained by subtracting purified water measurement absorbance from creatinine 5 mg / dL aqueous solution absorbance) were determined.
In addition, as in the case of Example 1, as a sample, ethane sylate was added to liquid nescor N (Alfresa Pharma) so that the final concentration in the sample was 20 μg / mL, and liquid nescol N without ethane sylate was used as a control. It was confirmed.
As a comparative example, the same study was performed using a creatinine measuring reagent not added with TEMPO.
（測定法）
日立７１８０形自動分析機を用いた。試料２．７μＬに第一試薬 １２０μＬ添加し３７℃にて５分間インキュベーションし第一反応とした。その後第二試薬を４０μＬ添加し５分間インキュベーションし第二反応とした。第一反応および第二反応の吸光度を液量補正した各吸光度の差をとる２ポイントエンド法で５４６ｎｍにおける吸光度を測定した。
クレアチニン濃度未知試料のクレアチニン濃度の算出は、精製水および５ｍｇ／ｄＬクレアチニン水溶液の測定吸光度より算出して求めた。
(Measurement method)
A Hitachi 7180 automatic analyzer was used. 120 μL of the first reagent was added to 2.7 μL of the sample and incubated at 37 ° C. for 5 minutes to prepare the first reaction. Thereafter, 40 μL of the second reagent was added and incubated for 5 minutes to form a second reaction. Absorbance at 546 nm was measured by a two-point end method in which the absorbances of the first reaction and the second reaction were corrected for the liquid volume and the difference between the absorbances was taken.
The creatinine concentration of the sample with unknown creatinine concentration was calculated from the measured absorbance of purified water and a 5 mg / dL creatinine aqueous solution.
結果を表２に示す。ＴＥＭＰＯを添加した場合、エタンシラートの影響については、３５℃、７日間および１４日間保存後も影響を回避できる結果であった。
実施例のブランク値および感度は、３５℃、７日間および１４日間保存後も良好であった。
The results are shown in Table 2. When TEMPO was added, the effect of ethanesylate was a result that could be avoided even after storage at 35 ° C. for 7 days and 14 days.
The blank values and sensitivity of the examples were good after storage at 35 ° C. for 7 days and 14 days.
（実施例３）
実施例２に用いた各試薬について、第一試薬中の各酵素の安定性について確認した。各酵素は下記測定法にて測定した。
調製直後試薬の測定値を１００％として３５℃・７日間、１４日間保存後の試薬中の成分活性または残量を確認した。
(Example 3)
For each reagent used in Example 2, the stability of each enzyme in the first reagent was confirmed. Each enzyme was measured by the following measurement method.
The component activity or remaining amount in the reagent after storage for 14 days at 35 ° C. for 7 days was confirmed with the measured value of the reagent immediately after preparation as 100%.
結果を表３に示す。ＴＥＭＰＯを添加した実施例の方が、無添加の比較例に比べ各酵素とも３５℃保存試薬中の酵素活性が高い結果となった。特にアスコルビン酸オキシダーゼ、カタラーゼについてはＴＥＭＰＯ添加により保存安定性が著しく向上する結果であった。 The results are shown in Table 3. In the example in which TEMPO was added, the enzyme activity in the 35 ° C. storage reagent was higher for each enzyme than in the comparative example without addition. In particular, ascorbate oxidase and catalase were significantly improved in storage stability when TEMPO was added.
（酵素活性測定法）
アスコルビン酸オキシダーゼ（ＡＳＯ）
下記条件下で1分間に1マイクロモルのアスコルビン酸を酸化する酵素量を1単位(Ｕ)とする。
試薬
（Ａ）１．０ｍＭアスコルビン酸溶液〔１０ｍＭのＬ−アスコルビン酸溶液を１．０ｍＭ ＥＤＴＡを含む０．２Ｍ ＫＨ２ＰＯ４溶液で１０倍希釈する〕（用時調製）
１０ｍＭのＬ−アスコルビン酸溶液は１７６ｍｇのＬ−アスコルビン酸（試薬特級，ＭＷ＝１７６．１３）を精秤し１．０ｍＭ ＥＤＴＡを含む１．０ｍＭ ＨＣｌ溶液１００ｍＬに溶解して調製する。
（Ｂ）１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４溶液
（Ｃ）０．２Ｎ ＨＣｌ溶液
被検酵素溶液：酵素を含む標品を予め氷冷した蒸留水で溶解（６０Ｕ／ｍＬ以上）し、分析直前に０．０５％ＢＳＡを含む１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４溶液（氷冷）で０．１５〜０．２５Ｕ／ｍＬに希釈する。
手順
（１）試験管に下記反応混液を調製し、３０℃で約５分間予備加温する。
０．５ｍＬ 基質溶液（Ａ）
０．５ｍＬ Ｎａ２ＨＰＯ４溶液（Ｂ）
（反応混液のｐＨは５．６）
（２）被検酵素溶液０．１ｍＬを加え、反応を開始する。
（３）３０℃で正確に５分間反応させた後、ＨＣｌ溶液（Ｃ）３．０ｍＬを加えて反応を停止させる。この液につき２４５ｎｍにおける吸光度を測定する（ＯＤｔｅｓｔ）。
（４）盲検は反応混液（１）を３０℃で５分間放置後、ＨＣｌ溶液（Ｃ）３．０ｍＬを加えて混和し，次いで酵素溶液０．１ｍＬを加えて調製する。以下同様に吸光度を測定する（ＯＤｂｌａｎｋ）。
計算式
Ｕ／ｍＬ＝（ΔＯＤ（ＯＤｂｌａｎｋ−ＯＤｔｅｓｔ）×４．１（ｍＬ）×希釈倍率）／（１０．０×１．０×５（分）×０．１（ｍＬ））＝ΔＯＤ×０．８２×希釈倍率
１０．０：アスコルビン酸の上記測定条件下（ｐＨ１．０）でのミリモル分子吸光係数（Ｆ／ｍｉｃｒｏｍｏｌｅ）
１．０：光路長（ｃｍ）
(Enzyme activity measurement method)
Ascorbate oxidase (ASO)
The amount of enzyme that oxidizes 1 micromole of ascorbic acid per minute under the following conditions is defined as 1 unit (U).
Reagent (A) 1.0 mM ascorbic acid solution [10 mM L-ascorbic acid solution is diluted 10-fold with 0.2 M KH 2 PO 4 solution containing 1.0 mM EDTA] (prepared when used)
A 10 mM L-ascorbic acid solution is prepared by accurately weighing 176 mg of L-ascorbic acid (reagent grade, MW = 176.13) and dissolving it in 100 mL of 1.0 mM HCl solution containing 1.0 mM EDTA.
(B) 10 mM Na 2 HPO 4 solution (C) 0.2 N HCl solution Test enzyme solution: A preparation containing the enzyme was dissolved in distilled water cooled in advance with ice (60 U / mL or more), and 0.05 immediately before the analysis. Dilute to 0.15-0.25 U / mL with 10 mM Na 2 HPO 4 solution (ice cooling) containing% BSA.
Procedure (1) Prepare the following reaction mixture in a test tube and preheat at 30 ° C. for about 5 minutes.
0.5 mL substrate solution (A)
0.5 mL Na 2 HPO 4 solution (B)
(The pH of the reaction mixture is 5.6)
(2) Add 0.1 mL of the test enzyme solution and start the reaction.
(3) After reacting at 30 ° C. for exactly 5 minutes, 3.0 mL of HCl solution (C) is added to stop the reaction. The absorbance at 245 nm is measured for this solution (OD test ).
(4) The blind test is prepared by allowing the reaction mixture (1) to stand at 30 ° C. for 5 minutes, adding 3.0 mL of HCl solution (C) and mixing, and then adding 0.1 mL of enzyme solution. Similarly, the absorbance is measured (OD blank ).
Formula U / mL = (ΔOD (OD blank −OD test ) × 4.1 (mL) × dilution rate) / (10.0 × 1.0 × 5 (min) × 0.1 (mL)) = ΔOD × 0.82 × dilution factor 10.0: millimolar molecular extinction coefficient (F / micromole) of ascorbic acid under the above measurement conditions (pH 1.0)
1.0: Optical path length (cm)
ザルコシンオキシダーゼ（ＳＡＯ）
下記条件下で１分間に１マイクロモルのＨ２Ｏ２を生成する酵素量を１単位（Ｕ）とする。
試薬
（Ａ）０．２Ｍサルコシン溶液〔１．７８ｇのサルコシン（ＭＷ＝８９．０９）を８０ｍＬの０．１２５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含む０．１２５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解後、１．０ＮのＮａＯＨあるいはＨＣｌでｐＨを８．０に調整（２５℃）し，蒸留水で１００ｍＬとする〕
（Ｂ）０．１％４−ＡＡ水溶液（１００ｍｇの４−アミノアンチピリンを１００ｍＬの蒸留水に溶解する）
（Ｃ）０．１％フェノール水溶液（１００ｍｇのフェノールを１００ｍＬの蒸留水に溶解する）
（Ｄ）ペルオキシダーゼ水溶液〔２５ｍｇのペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）（１１０プルプロガリン単位／ｍｇ）を蒸留水１００ｍＬに溶解する〕
（Ｅ）０．２５％ＳＤＳ水溶液〔１．２５ｇのｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌｓｕｌｆａｔｅ（ＳＤＳ）を５００ｍＬの蒸留水に溶解する〕
被検酵素溶液：酵素を含む標品を予め氷冷した２．０ｍＭ ＥＤＴＡを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で溶解し、分析直前に同緩衝液で０．０７−０．１７Ｕ／ｍＬに希釈する。
手順
（１）下記反応混液を調製する（褐色瓶にて氷冷保存）。
５０ｍＬ サルコシン溶液（Ａ）
１０ｍＬ ４−ＡＡ水溶液（Ｂ）
２０ｍＬ フェノール水溶液（Ｃ）
２０ｍＬ ペルオキシダーゼ水溶液（Ｄ）
（２）反応混液１．０ｍＬを試験管に採り，３７℃で約５分間予備加温する。
（３）被検酵素溶液０．０５ｍＬを加え，反応を開始する。
（４）３７℃で正確に１０分間反応させた後，ＳＤＳ水溶液（Ｅ）２．０ｍＬを加えて反応を停止させる。この液につき５００ｎｍにおける吸光度を測定する（ＯＤｔｅｓｔ）。
（５）盲検は酵素溶液の代わりに酵素希釈液（２．０ｍＭ ＥＤＴＡを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０））を用い、上記同様に操作を行って吸光度を測定する（ＯＤｂｌａｎｋ）。
計算式
Ｕ／ｍＬ＝（ΔＯＤ（ＯＤｔｅｓｔ−ＯＤｂｌａｎｋ）×３．０５（ｍＬ）×希釈倍率）／（１３．３×（１／２）×１．０×１０（分）×０．０５（ｍＬ））＝ΔＯＤ×０．９１７×希釈倍率
１３．３：Ｑｕｉｎｏｎｅｉｍｉｎｅ色素の上記測定条件下でのミリモル分子吸光係数（Ｆ／ｍｉｃｒｏｍｏｌｅ）
１／２：酵素反応で生成したＨ２Ｏ２の１分子から形成するＱｕｉｎｏｎｅｉｍｉｎｅ色素は１／２分子である事による係数
１．０：光路長（ｃｍ）
Sarcosine oxidase (SAO)
The amount of enzyme that produces 1 micromole of H 2 O 2 per minute under the following conditions is defined as 1 unit (U).
Reagent (A) 0.2 M sarcosine solution [1.78 g of sarcosine (MW = 89.09) dissolved in 80 mL of 0.125 M Tris-HCl buffer (pH 8.0) containing 0.125% Triton X-100 Then, adjust the pH to 8.0 (25 ° C) with 1.0 N NaOH or HCl, and make it 100 mL with distilled water.]
(B) 0.1% 4-AA aqueous solution (100 mg of 4-aminoantipyrine is dissolved in 100 mL of distilled water)
(C) 0.1% phenol aqueous solution (100 mg of phenol is dissolved in 100 mL of distilled water)
(D) Peroxidase aqueous solution [25 mg of peroxidase (POD) (110 purprogalin units / mg) is dissolved in 100 mL of distilled water]
(E) 0.25% SDS aqueous solution [1.25 g of sodium dodecylsulfate (SDS) is dissolved in 500 mL of distilled water]
Test enzyme solution: A preparation containing the enzyme was dissolved in a 20 mM Tris-HCl buffer solution (pH 8.0) containing 2.0 mM EDTA previously cooled in ice, and 0.07 to 0.17 U in the same buffer solution immediately before the analysis. Dilute to / mL.
Procedure (1) The following reaction mixture is prepared (ice-cooled in a brown bottle).
50 mL sarcosine solution (A)
10 mL 4-AA aqueous solution (B)
20mL phenol aqueous solution (C)
20 mL peroxidase aqueous solution (D)
(2) Take 1.0 mL of the reaction mixture in a test tube and preheat at 37 ° C. for about 5 minutes.
(3) Add 0.05 mL of the test enzyme solution and start the reaction.
(4) After reacting accurately at 37 ° C. for 10 minutes, 2.0 mL of an aqueous SDS solution (E) is added to stop the reaction. The absorbance at 500 nm is measured for this solution (OD test ).
(5) In the blind test, an enzyme dilution solution (20 mM Tris-HCl buffer solution (pH 8.0) containing 2.0 mM EDTA) is used instead of the enzyme solution, and the operation is performed in the same manner as described above to measure the absorbance (OD blank). ).
Formula U / mL = (ΔOD (OD test −OD blank ) × 3.05 (mL) × dilution rate) / (13.3 × (1/2) × 1.0 × 10 (min) × 0.05 (ML)) = ΔOD × 0.917 × dilution ratio 13.3: Quinoneimine dye molar absorption coefficient (F / micromole) under the above measurement conditions
1/2: Quinoneimine dye formed from one molecule of H 2 O 2 produced by the enzymatic reaction is a factor of 1/2 molecule 1.0: Optical path length (cm)
クレアチンアミジノヒドロラーゼ（ＣＲＨ）
下記条件下で１分間に１マイクロモルの黄色色素を生成する酵素量を１単位（Ｕ）とする。
試薬
（Ａ）０．１Ｍクレアチン溶液〔１．４９ｇのクレアチン（ナカライテスク製）を５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．５に溶解し、１００ｍＬとする〕
（Ｂ）ＤＡＢ溶液（２．０ｇのｐ−ジメチルアミノベンズアルデヒドを１００Ｐのジメチルスルホキシドに溶解させた後、濃塩酸１５ｍＬを加える）
被検酵素溶液：酵素を含む標品を予め氷冷した５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で溶解し、分析直前に同緩衝液で２．０〜３．０Ｕ／ｍＬに希釈する。
手順
（１）試験管に基質溶液（Ａ）１．０ｍＬを採り、３７℃で約５分間予備加温する。
（２）被検酵素溶液０．１ｍＬを加え、反応を開始する。
（３）３７℃で正確に１０分間反応させた後、ＤＡＢ溶液（Ｂ）２．０ｍＬを加えて反応を停止させる。
（４）２５℃で２０分間放置後、４３５ｎｍにおける吸光度を測定する（ＯＤｔｅｓｔ）。
（５）盲検は基質溶液（Ａ）１．０ｍＬを３７℃で１０分間放置後、ＤＡＢ溶液（Ｂ）２．０ｍＬを加えて混和し、次いで酵素溶液０．１ｍＬを加えて調製する。以下同様に２５℃で２０分間放置後吸光度を測定する（ＯＤｂｌａｎｋ）。
計算式
Ｕ／ｍＬ＝（ΔＯＤ（ＯＤｔｅｓｔ−ＯＤｂｌａｎｋ）×３．１（ｍＬ）×希釈倍率）／（０．３２１×１．０×１０（分）×０．１（ｍＬ））＝ΔＯＤ×９．６５×希釈倍率
０．３２１：黄色色素のミリモル分子吸光係数（Ｆ／ｍｉｃｒｏｍｏｌｅ）
１．０：光路長（ｃｍ）
Creatine amidinohydrolase (CRH)
The amount of enzyme that produces 1 micromole of yellow pigment per minute under the following conditions is defined as 1 unit (U).
Reagent (A) 0.1 M creatine solution [1.49 g creatine (manufactured by Nacalai Tesque) is dissolved in 50 mM phosphate buffer pH 7.5 to make 100 mL]
(B) DAB solution (2.0 g of p-dimethylaminobenzaldehyde is dissolved in 100 P of dimethyl sulfoxide, and then 15 mL of concentrated hydrochloric acid is added)
Test enzyme solution: A preparation containing the enzyme is dissolved in a 50 mM phosphate buffer (pH 7.5) previously cooled in ice, and diluted to 2.0 to 3.0 U / mL with the same buffer immediately before the analysis.
Procedure (1) Take 1.0 mL of the substrate solution (A) in a test tube and preheat at 37 ° C. for about 5 minutes.
(2) Add 0.1 mL of the test enzyme solution and start the reaction.
(3) After reacting accurately at 37 ° C. for 10 minutes, 2.0 mL of DAB solution (B) is added to stop the reaction.
(4) After standing at 25 ° C. for 20 minutes, the absorbance at 435 nm is measured (OD test ).
(5) In the blind test, 1.0 mL of the substrate solution (A) is allowed to stand at 37 ° C. for 10 minutes, then 2.0 mL of DAB solution (B) is added and mixed, and then 0.1 mL of the enzyme solution is added. Similarly, the absorbance is measured after standing at 25 ° C. for 20 minutes (OD blank ).
Formula U / mL = (ΔOD (OD test −OD blank ) × 3.1 (mL) × dilution rate) / (0.321 × 1.0 × 10 (min) × 0.1 (mL)) = ΔOD X 9.65 x dilution factor 0.321: millimolar molecular extinction coefficient of yellow pigment (F / micromole)
1.0: Optical path length (cm)
カタラーゼ（ＣＡＯ）
下記条件下で１分間に１マイクロモルのＨ２Ｏ２を加水分解する酵素量を１単位（Ｕ）とする。
試薬
（Ａ）１０ｍＭリン酸緩衝液 ｐＨ７．０（２５℃における）
（Ｂ）Ｈ２Ｏ２溶液 １６ｍＭ（０．１８２ｍｌの３０％（Ｗ／Ｖ）を１００ｍＬの（Ａ）で溶解する。））
（Ｃ）チタン試薬 １．０ｇのＴｉＯ２と１０ｇのＫ２ＳＯ４とを１５０ｍＬの濃硫酸とともに、マントルヒーター上で１８０−２２０℃で２−３時間混ぜる。混合液を冷却して、溶液部分を水で１．５Ｌに希釈する。
（Ｄ）酵素希釈液 （Ａ）を用いる。
手順
（１）試験管に基質溶液（Ｂ）０．２５ｍＬを採り、２５℃で約５分間予備加温する。
（２）被検酵素溶液０．２５ｍＬを加えて混ぜる。
（３）２５℃で正確に５分間反応させた後、チタン試薬（Ｃ）２．５ｍＬを加えて反応を停止させる。
（４）４１０ｎｍにおける吸光度を測定する（ＯＤｔｅｓｔ）。
（５）盲検は基質溶液（Ｂ）０．２５ｍＬを２５℃で５分間放置後、チタン試薬（Ｃ）２．５ｍＬを加えて混和し、次いで酵素溶液０．２５ｍＬを加えて調製する。（ＯＤｂｌａｎｋ）。
計算式
Ｕ／ｍＬ＝（ΔＯＤ（ＯＤｔｅｓｔ−ＯＤｂｌａｎｋ）×３．０（ｍＬ）×希釈倍率）／（Ｆ×１．０×５（分）×０．２５（ｍＬ））＝ΔＯＤ×２．４×（１／Ｆ）×希釈倍率
Ｆ：１．０ｍＭのＨ２Ｏ２の存在により生じるＴｉｔａｎｉｕ ｃｏｌｏｒ ｐｒｏｄｕｃｔの吸光係数（普通は約７．０であるが、既知濃度のＨ２Ｏ２の濃度を用いて、各々のロットにおいて決める。）
１．０：光路長（ｃｍ）
Catalase (CAO)
The amount of enzyme that hydrolyzes 1 micromole of H 2 O 2 per minute under the following conditions is defined as 1 unit (U).
Reagent (A) 10 mM phosphate buffer pH 7.0 (at 25 ° C.)
(B) H 2 O 2 solution 16 mM (0.182 ml of 30% (W / V) is dissolved in 100 mL of (A).))
(C) Titanium reagent 1.0 g of TiO 2 and 10 g of K 2 SO 4 are mixed together with 150 mL of concentrated sulfuric acid at 180-220 ° C. for 2-3 hours on a mantle heater. Cool the mixture and dilute the solution portion to 1.5 L with water.
(D) Enzyme diluent (A) is used.
Procedure (1) 0.25 mL of the substrate solution (B) is put in a test tube and pre-warmed at 25 ° C. for about 5 minutes.
(2) Add and mix 0.25 mL of the test enzyme solution.
(3) After reacting accurately at 25 ° C. for 5 minutes, 2.5 mL of titanium reagent (C) is added to stop the reaction.
(4) The absorbance at 410 nm is measured (OD test ).
(5) The blind test is prepared by adding 0.25 mL of the substrate solution (B) at 25 ° C. for 5 minutes, adding 2.5 mL of the titanium reagent (C), mixing, and then adding 0.25 mL of the enzyme solution. (OD blank ).
Formula U / mL = (ΔOD (OD test −OD blank ) × 3.0 (mL) × dilution rate) / (F × 1.0 × 5 (min) × 0.25 (mL)) = ΔOD × 2 4 × (1 / F) × dilution factor F: extinction coefficient of Titaniu color product produced by the presence of 1.0 mM H 2 O 2 (usually about 7.0, but with known concentrations of H 2 O 2 Use concentration to determine for each lot.)
1.0: Optical path length (cm)
（実施例４）
下記の尿酸測定試薬（ＵＡ）、中性脂肪測定試薬（ＴＧ）、総コレステロール測定試薬（ＴＣ）、ＨＤＬ−Ｃ測定試薬（ＨＤＬ）、ＬＤＬ−Ｃ測定試薬（ＬＤＬ）の各々の第一試薬に、ＴＥＭＰＯを試薬中終濃度で０．３ｍｍｏｌ／Ｌになるように調製して測定試薬とした。
試料として、液状ネスコールＮ（アルフレサファーマ社）に試料中終濃度が２００μｇ／ｍＬとなるようにエタンシラートを加え、エタンシラートを加えていない液状ネスコールＮを対照として影響度を確認した。
比較例として、ＴＥＭＰＯを添加していない各測定試薬で同様の検討を行なった。
(Example 4)
For each first reagent of the following uric acid measurement reagent (UA), neutral fat measurement reagent (TG), total cholesterol measurement reagent (TC), HDL-C measurement reagent (HDL), and LDL-C measurement reagent (LDL) TEMPO was prepared to a final concentration of 0.3 mmol / L in the reagent, and used as a measurement reagent.
As a sample, ethane sylate was added to liquid nescor N (Alfresa Pharma Co., Ltd.) so that the final concentration in the sample was 200 μg / mL, and the degree of influence was confirmed using liquid nescol N without ethane sylate as a control.
As a comparative example, the same examination was performed with each measurement reagent to which TEMPO was not added.
（試薬の調製）
尿酸測定試薬（ＵＡ）
第一試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ ５０ｍＭ ｐＨ７．０
ペルオキシダーゼ（東洋紡社製ＰＥＯ−３０１） ２Ｕ／ｍＬ
第二試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ ５０ｍＭ ｐＨ７．０
Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン（同仁化学社製） ０．４ｇ／Ｌ
ウリカーゼ（東洋紡社製ＵＡＯ−２１１） ０．８Ｕ／ｍＬ
中性脂肪測定試薬（ＴＧ）
第一試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ １００ｍＭ ｐＨ６．６
ＭｇＣｌ２ １ｍｍｏｌ／Ｌ
アデノシン３リン酸２Ｎａ塩 １ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン ０．４ｍｍｏｌ／Ｌ
フラビンアデニンジヌクレオチド２Ｎａ塩 ８μｍｏｌ／Ｌ
グリセロールキナーゼ（東洋紡社製ＧＹＫ−３１１） ３Ｕ／ｍＬ
カタラーゼ（東洋紡社製） ２００Ｕ／ｍＬ
グリセロリン酸オキシダーゼ（東洋紡社製Ｇ３Ｏ−３２１） ３Ｕ／ｍＬ
ＡＳＯ（東洋紡績製ＡＳＯ−３１１） １Ｕ／ｍＬ
第二試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ ５０ｍＭ ｐＨ７．４
クレアチニンアミドヒドロラーゼ（東洋紡社製ＣＮＨ−３１１） ４００Ｕ／ｍＬ
ペルオキシダーゼ（東洋紡社製ＰＥＯ−３０２） １０／ｍＬ
４−アミノアンチピリン ０．６ｇ/Ｌ
総コレステロール測定試薬（ＴＣ）
第一試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ ５０ｍＭ ｐＨ７．０
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） ３Ｕ／ｍＬ
コレステロールエステラーゼ（東洋紡社製ＣＯＥ−３１１） ２Ｕ／ｍＬ
コール酸ナトリウム ５ｇ／Ｌ
Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン ０．１４ｇ／Ｌ
第二試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ ５０ｍＭ ｐＨ７．０
コレステロールオキシダーゼ（東洋紡社製ＣＯＯ−３２１） ２Ｕ／ｍＬ
ペルオキシダーゼ（東洋紡社製ＰＥＯ−３０２） １０／ｍＬ
４−アミノアンチピリン ０．６ｇ/Ｌ
ＨＤＬ−Ｃ測定試薬（ＨＤＬ）
第一試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ ５０ｍＭ ｐＨ６．５
エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩 ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化マグネシウム ５ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カルシウム ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）デオキシコラミド（同仁化学社製） ０．１％
ジギトニン（同仁化学社製） ０．０１％
コレステロールエステラーゼ（東洋紡社製ＣＯＥ−３０１） ２Ｕ／ｍＬ
コレステロールオキシダーゼ（東洋紡社製ＣＯＯ−３２１） ３Ｕ／ｍＬ
カタラーゼ（東洋紡社製ＣＡＯ−５０９） １００Ｕ／ｍＬ
Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３−メトキシアニリン（同仁化学社製） ０．１ｇ／Ｌ
第二試薬
ＭＯＰＳ−ＮａＯＨ １００ｍＭ ｐＨ７．５
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩 ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カルシウム ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
エマルゲン１２０（花王社製） ０．３％
化学修飾コレステロールエステラーゼ（東洋紡社製ＣＯＥ−３１３） １Ｕ／ｍＬ
ペルオキシダーゼ（東洋紡社製ＰＥＯ−３０１） ８Ｕ／ｍＬ
４−アミノアンチピリン ０．４ｇ／Ｌ
ＬＤＬ−Ｃ測定試薬（ＬＤＬ）
第一試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ ５０ｍＭ ｐＨ７．５
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩 ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化マグネシウム １０ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カルシウム ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）デオキシコラミド（同仁化学社製） ０．２％
化学修飾コレステロールエステラーゼ（東洋紡社製ＣＯＥ−３１３） ０．５Ｕ／ｍＬ
未修飾コレステロールオキシダーゼ（東洋紡社製ＣＯＯ−３２１） ３Ｕ／ｍＬ
カタラーゼ（東洋紡社製ＣＡＯ−５０９） １００Ｕ／ｍＬ
４−アミノアンチピリン ０．１ｇ／Ｌ
第二試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ ５０ｍＭ ｐＨ７．５
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩 ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化マグネシウム １０ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カルシウム ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシプロピレン（２）ポリオキシエチレンデシルエーテル（エマレックスＤＡＰＥ０２０７：日本エマルジョン社製） ０．３％
ペルオキシダーゼ（東洋紡社製ＰＥＯ−３０１） ８Ｕ／ｍＬ
Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３−メトキシアニリン（同仁化学社製） ０．４ｇ／Ｌ
(Preparation of reagents)
Uric acid measurement reagent (UA)
First reagent PIPES-NaOH 50 mM pH 7.0
Peroxidase (Toyobo PEO-301) 2U / mL
Second reagent PIPES-NaOH 50 mM pH 7.0
N-ethyl-N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) -3-methylaniline (manufactured by Dojin Chemical) 0.4 g / L
Uricase (UAO-211 manufactured by Toyobo Co., Ltd.) 0.8 U / mL
Neutral fat measurement reagent (TG)
First reagent PIPES-NaOH 100 mM pH 6.6
MgCl 2 1 mmol / L
Adenosine triphosphate 2Na salt 1mmol / L
4-aminoantipyrine 0.4 mmol / L
Flavin adenine dinucleotide 2Na salt 8 μmol / L
Glycerol kinase (Toyobo GYK-311) 3 U / mL
Catalase (Toyobo) 200U / mL
Glycerophosphate oxidase (G3O-321 manufactured by Toyobo Co., Ltd.) 3 U / mL
ASO (Toyobo ASO-311) 1U / mL
Second reagent PIPES-NaOH 50 mM pH 7.4
Creatinine amide hydrolase (Toyobo CNH-311) 400 U / mL
Peroxidase (Toyobo PEO-302) 10 / mL
4-Aminoantipyrine 0.6g / L
Total cholesterol measuring reagent (TC)
First reagent PIPES-NaOH 50 mM pH 7.0
Ascorbate oxidase (ASO-311 manufactured by Toyobo Co., Ltd.) 3 U / mL
Cholesterol esterase (Toyobo COE-311) 2 U / mL
Sodium cholate 5g / L
N-ethyl-N- (3-sulfopropyl) -3-methoxyaniline 0.14 g / L
Second reagent PIPES-NaOH 50 mM pH 7.0
Cholesterol oxidase (Toyobo COO-321) 2 U / mL
Peroxidase (Toyobo PEO-302) 10 / mL
4-Aminoantipyrine 0.6g / L
HDL-C measurement reagent (HDL)
First reagent PIPES-NaOH 50 mM pH 6.5
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt 0.2mmol / L
Magnesium chloride 5mmol / L
Calcium chloride 0.1mmol / L
N, N-bis (3-D-gluconamidopropyl) deoxycollamide (manufactured by Dojindo) 0.1%
Digitonin (Dojin Chemical Co., Ltd.) 0.01%
Cholesterol esterase (Toyobo COE-301) 2 U / mL
Cholesterol oxidase (Toyobo COO-321) 3 U / mL
Catalase (Toyobo CAO-509) 100 U / mL
N-ethyl-N-sulfopropyl-3-methoxyaniline (manufactured by Dojin Chemical) 0.1 g / L
Second reagent MOPS-NaOH 100 mM pH 7.5
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt 0.2 mmol / L
Calcium chloride 0.1mmol / L
Emulgen 120 (Kao Corporation) 0.3%
Chemically modified cholesterol esterase (Toyobo COE-313) 1 U / mL
Peroxidase (Toyobo PEO-301) 8U / mL
4-aminoantipyrine 0.4 g / L
LDL-C measurement reagent (LDL)
First reagent PIPES-NaOH 50 mM pH 7.5
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt 0.2 mmol / L
Magnesium chloride 10mmol / L
Calcium chloride 0.1mmol / L
N, N-bis (3-D-gluconamidopropyl) deoxycholamide (manufactured by Dojindo) 0.2%
Chemically modified cholesterol esterase (Toyobo COE-313) 0.5 U / mL
Unmodified cholesterol oxidase (Toyobo COO-321) 3 U / mL
Catalase (Toyobo CAO-509) 100 U / mL
4-Aminoantipyrine 0.1g / L
Second reagent PIPES-NaOH 50 mM pH 7.5
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt 0.2 mmol / L
Magnesium chloride 10mmol / L
Calcium chloride 0.1mmol / L
Polyoxypropylene (2) polyoxyethylene decyl ether (Emalex DAPE0207: manufactured by Nippon Emulsion Co., Ltd.) 0.3%
Peroxidase (Toyobo PEO-301) 8U / mL
N-ethyl-N-sulfopropyl-3-methoxyaniline (manufactured by Dojin Chemical) 0.4 g / L
（測定法）
日立７１８０形自動分析機を用いた。試料に第一試薬を添加し３７℃にて５分間インキュベーションし第一反応とした。その後第二試薬を添加し５分間インキュベーションし第二反応とした。第一反応および第二反応の吸光度を液量補正した各吸光度の差をとる２ポイントエンド法で所定の波長における吸光度を測定した。
各々以下のサンプル（Ｓ）、試薬量（Ｒ１、Ｒ２）、測定波長を用いた。（Ｓ／Ｒ１、Ｒ２／測定波長）
ＵＡ ２．７μＬ ／１２０μＬ、６０μＬ／ ６００ｎｍ
ＴＣ １．５μＬ ／１２０μＬ、６０μＬ／ ６００ｎｍ
ＴＧ １．５μＬ ／１２０μＬ、６０μＬ／ ６００ｎｍ
ＨＤＬ １．６μＬ ／１５０μＬ、５０μＬ／ ６００ｎｍ
ＬＤＬ １．６μＬ ／１５０μＬ、５０μＬ／ ６００ｎｍ
濃度の算出は、精製水および各項目の標準液の測定吸光度より算出して求めた。
各項目の標準液濃度は以下を用いた。
ＵＡ ６．９ｍｇ／ｄＬ
ＴＣ ２２１ｍｇ／ｄＬ
ＴＧ １２４ｍｇ／ｄＬ
ＨＤＬ ８９ｍｇ／ｄＬ
ＬＤＬ ９１ｍｇ／ｄＬ
(Measurement method)
A Hitachi 7180 automatic analyzer was used. The first reagent was added to the sample and incubated at 37 ° C. for 5 minutes to form the first reaction. Then, the second reagent was added and incubated for 5 minutes to form a second reaction. Absorbance at a predetermined wavelength was measured by a two-point end method in which the absorbances of the first reaction and the second reaction were corrected for liquid amounts and the difference between the absorbances was taken.
The following samples (S), reagent amounts (R1, R2), and measurement wavelengths were used. (S / R1, R2 / measured wavelength)
UA 2.7 μL / 120 μL, 60 μL / 600 nm
TC 1.5μL / 120μL, 60μL / 600nm
TG 1.5μL / 120μL, 60μL / 600nm
HDL 1.6μL / 150μL, 50μL / 600nm
LDL 1.6μL / 150μL, 50μL / 600nm
The concentration was calculated from the measured absorbance of purified water and standard solutions for each item.
The following standard solution concentrations were used.
UA 6.9mg / dL
TC 221mg / dL
TG 124mg / dL
HDL 89mg / dL
LDL 91mg / dL
結果 表４に示す。比較例と比較し、いずれの試薬もＴＥＭＰＯを添加した実施例では、エタンシラートの影響を低減できる結果であった。 Results are shown in Table 4. Compared with the comparative example, in each of the examples in which TEMPO was added to each reagent, the effect of ethanesylate was reduced.
（実施例５）
実施例３と同様の実験を、ＴＥＭＰＯの濃度を０．１〜１ｍｍｏｌ／Ｌの範囲で表５に記載のように変え、調製直後試薬の測定値を１００％として３５℃・１４日間保存後の試薬中の成分活性または残量を確認した。
(Example 5)
The same experiment as in Example 3 was carried out by changing the concentration of TEMPO in the range of 0.1 to 1 mmol / L as shown in Table 5, and setting the measured value of the reagent immediately after preparation as 100% at 35 ° C. for 14 days after storage. The component activity or remaining amount in the reagent was confirmed.
結果を表５に示す。すべての実施例（ＴＥＭＰＯの添加量が０．１ｍｍｏｌ／Ｌ以上１ｍｍｏｌ／Ｌ以下）で、ＴＥＭＰＯ無添加の比較例に比べ各酵素とも３５℃保存試薬中の酵素活性が高い結果となった。特にアスコルビン酸オキシダーゼ、カタラーゼについてはＴＥＭＰＯ添加により保存安定性が著しく向上する結果であった。 The results are shown in Table 5. In all the examples (the amount of TEMPO added was 0.1 mmol / L or more and 1 mmol / L or less), each enzyme had a higher enzyme activity in the 35 ° C. storage reagent than the comparative example without TEMPO addition. In particular, ascorbate oxidase and catalase were significantly improved in storage stability when TEMPO was added.
生体成分を酸化還元反応を利用して測定する測定方法、および、該方法に用いる試薬や組成物に適用できる。 The present invention can be applied to a measurement method for measuring a biological component using an oxidation-reduction reaction, and a reagent or composition used in the method.
Claims (10)
（１）ペルオキシダーゼ
（２）ペルオキシダーゼの存在下で過酸化水素と反応して呈色する酸化還元発色試薬
（３）２，２，６，６−Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅ １−Ｏｘｙｌ Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃａｌ（２，２，６，６−テトラメチルピペリジン１−オキシル フリーラジカル）
を共存させ、且つ（３）２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル フリーラジカルの試薬中終濃度が５．０ｍｍｏｌ／Ｌ以下であることを特徴とする、エタンシラートの影響を低減させる方法。 In the biological component measurement method using an oxidation-reduction reaction, the following components (1) to (3) :
(1) Peroxidase (2) Redox coloring reagent that reacts with hydrogen peroxide in the presence of peroxidase to develop color (3) 2,2,6,6-Tetramethylpiperidine 1-Oxyl Free Radical (2,2,6, 6-tetramethylpiperidine 1-oxyl free radical)
And (3) 2,2,6,6-tetramethylpiperidine-1-oxyl free radical has a final concentration in the reagent of 5.0 mmol / L or less, reducing the effect of ethanesylate How to make.
（１）ペルオキシダーゼ
（２）ペルオキシダーゼの存在下で過酸化水素と反応して呈色する酸化還元発色試薬
（３）２，２，６，６−Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅ １−Ｏｘｙｌ Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃａｌ（２，２，６，６−テトラメチルピペリジン１−オキシル フリーラジカル）
を含み、且つ（３）２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル フリーラジカルの試薬中終濃度が５．０ｍｍｏｌ／Ｌ以下であることを特徴とする、エタンシラートが含まれている可能性がある生体試料を測定するための試薬。 The following components (1) to (3) :
(1) Peroxidase (2) Redox coloring reagent that reacts with hydrogen peroxide in the presence of peroxidase to develop color (3) 2,2,6,6-Tetramethylpiperidine 1-Oxyl Free Radical (2,2,6, 6-tetramethylpiperidine 1-oxyl free radical)
And (3) 2,2,6,6-tetramethylpiperidine-1-oxyl containing ethane sylate having a free radical final concentration of 5.0 mmol / L or less A reagent for measuring potential biological samples.
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