ITVR20080079A1 - Metodo per la produzione in vitro di tenociti a partire da cellule staminali mesenchimali, nonché rispettivi metodi per la caratterizzazione di detti tenociti e di dette cellule staminali mesenchimali - Google Patents

Metodo per la produzione in vitro di tenociti a partire da cellule staminali mesenchimali, nonché rispettivi metodi per la caratterizzazione di detti tenociti e di dette cellule staminali mesenchimali

Info

Publication number
ITVR20080079A1
ITVR20080079A1 IT000079A ITVR20080079A ITVR20080079A1 IT VR20080079 A1 ITVR20080079 A1 IT VR20080079A1 IT 000079 A IT000079 A IT 000079A IT VR20080079 A ITVR20080079 A IT VR20080079A IT VR20080079 A1 ITVR20080079 A1 IT VR20080079A1
Authority
IT
Italy
Prior art keywords
tenocytes
stem cells
seq
characterization
pcr
Prior art date
Application number
IT000079A
Other languages
English (en)
Inventor
Fausto Cremonesi
Paola Mariani
Sefania Violini
Original Assignee
Fond Parco Tecnologico Padano
Univ Degli Studi Milano
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Fond Parco Tecnologico Padano, Univ Degli Studi Milano filed Critical Fond Parco Tecnologico Padano
Priority to ITVR2008A000079A priority Critical patent/IT1394262B1/it
Priority to PCT/IB2009/052542 priority patent/WO2010007542A2/en
Priority to PCT/IB2009/052810 priority patent/WO2010007551A2/en
Publication of ITVR20080079A1 publication Critical patent/ITVR20080079A1/it
Application granted granted Critical
Publication of IT1394262B1 publication Critical patent/IT1394262B1/it

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70596—Molecules with a "CD"-designation not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/066—Tenocytes; Tendons, Ligaments
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0008—Oxidoreductases (1.) acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y102/00—Oxidoreductases acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2)
    • C12Y102/01—Oxidoreductases acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.2.1)
    • C12Y102/01012—Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (phosphorylating) (1.2.1.12)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/155—Bone morphogenic proteins [BMP]; Osteogenins; Osteogenic factor; Bone inducing factor

Description

“METODO PER LA PRODUZIONE IN VITRO DI TENOCITI A PARTIRE DA CELLULE STAMINALI MESENCHIMALI, NONCHÉ RISPETTIVI METODI PER LA CARATTERIZZAZIONE DI DETTI TENOCITI E DI DETTE CELLULE STAMINALI MESENCHIMALIâ€
* * * * *
Ambito tecnico
La presente invenzione riguarda un metodo per la produzione in vitro di tenociti a partire da cellule staminali mesenchimali ottenute da mammifero.
Essa concerne altresì un metodo per la caratterizzazione di tenociti, nonché un metodo per la caratterizzazione di cellule staminali mesenchimali ottenute da mammifero.
Sfondo tecnologico
La presente invenzione trova una sua generale collocazione nell'ambito del trattamento di mammiferi affetti da lesioni tendinee.
È noto che la lesione di un tendine, ad esempio una sua lacerazione parziale o completa, può compromettere seriamente ed in modo anche permanente la completa ed efficace mobilità di una articolazione.
Questo inconveniente à ̈ maggiormente frequente in persone od animali che per la loro stessa attività sono portati a sottoporre alcuni loro tendini a continui ed importanti sforzi, come à ̈ frequente nel caso di atleti o di animali da competizione, quali cani o cavalli da corsa. Peraltro, per conseguire elevate prestazioni agonistiche, questi soggetti non possono, in genere, prescindere da una piena efficienza della funzione tendinea, per cui, in caso di lesione, la loro carriera sportiva dipende dal totale recupero delle funzionalità compromesse.
Nel caso specifico dei cavalli da corsa, à ̈ noto che la lesione dei tendini degli arti (tra cui il tendine flessore digitale superficiale ed il tendine flessore profondo) à ̈ uno degli infortuni più frequenti e più gravi cui sono soggetti, e può avere come estrema conseguenza anche l'abbattimento dell'animale.
Le lesioni ai tendini infatti non sono facilmente recuperabili e, spesso, nemmeno il ricorso ad un intervento chirurgico garantisce un recupero totale delle funzionalità.
In termini del tutto generali, un tendine à ̈ formato in gran parte da tessuto connettivo fibroso a base di collagene (principalmente di tipo I, ma anche di tipo III e V), proteoglicani, elastina e fibronectina e, una volta lacerato, esso non si rigenera spontaneamente. Il materiale base del tessuto connettivo fibroso à ̈ prodotto dai tenociti, cellule altamente specializzate annegate nella matrice extracellulare che producono. Anche a causa del loro elevato grado di specializzazione, i tenociti presentano tuttavia un potenziale replicativo molto limitato, per cui i tentativi di ottenere una loro duratura ed efficace riproduzione in vitro si sono rivelati poco soddisfacenti.
La presenza di tenociti in una coltura cellulare viene tipicamente individuata mediante analisi citofluorimetriche, o colorazioni istochimiche, o saggi immunologici.
Negli ultimi anni, con l'approfondirsi delle conoscenze e delle applicazioni legate alle cellule staminali, sono stati condotti numerosi studi sulla possibilità di riparare una lesione tendinea utilizzando cellule staminali mesenchimali (di seguito, in breve, MSC).
Tali cellule hanno la particolarità di essere multipotenti, hanno cioà ̈ la capacità, in determinate condizioni, di differenziarsi in diversi tipi di tessuti come ad esempio il tessuto osseo, cartilagineo, muscolare, adiposo nonché tendineo. Le MSC possono essere ottenute per prelievo da fonti diverse, tra le quali citiamo il midollo osseo, il cordone ombelicale, il tessuto adiposo e tessuti fetali.
In particolare, in alcuni studi à ̈ prevista l'introduzione di MSC, opportunamente coltivate ed arricchite in vitro, direttamente in corrispondenza del tendine lesionato, in modo tale che almeno una parte delle stesse sia indotta alla differenziazione in tenociti da fattori prodotti da cellule presenti nel microambiente circostante e possa quindi rigenerare il materiale tendineo.
A differenza dei tenociti, infatti, le MSC sono facilmente coltivabili in vitro e mostrano un buon grado di proliferazione. Permane tuttavia nel settore l'esigenza di sviluppare nuovi metodi per la produzione di tenociti in vitro che consentano di sviluppare efficaci protocolli di riparazione di lesioni di tendini in mammiferi, in particolare nei cavalli da corsa. In questo ambito, vi à ̈ inoltre l'esigenza di stabilire efficaci protocolli di caratterizzazione di MSC e di tenociti.
Descrizione dell'invenzione
Il problema alla base della presente invenzione à ̈ quello di mettere a disposizione un metodo per la produzione in vitro di tenociti, concepito per rispondere all'esigenza sopra menzionata.
Nell'ambito di tale problema costituisce inoltre uno scopo del trovato mettere a punto un metodo per la caratterizzazione di cellule staminali mesenchimali ottenute da mammifero, nonché un metodo per la caratterizzazione di tenociti.
Questo problema à ̈ risolto e questi scopi sono conseguiti dal presente trovato mediante un metodo per la produzione in vitro di tenociti, e mediante rispettivi metodi per la caratterizzazione di cellule staminali mesenchimali e di tenociti, realizzati in accordo con le rivendicazioni accluse.
Breve descrizione dei disegni
Le caratteristiche ed i vantaggi dell'invenzione meglio risulteranno dalla descrizione dettagliata di un suo preferito esempio di realizzazione, illustrato a titolo indicativo e non limitativo con riferimento agli uniti disegni in cui:
− la figura 1 à ̈ una raccolta di riproduzioni fotografiche illustranti i risultati di una Reverse Transcriptase -Polymerase Chain Reaction – Trascrizione Inversa -Reazione a Catena della Polimerasi (di seguito, in breve, RT-PCR) condotta per individuare la presenza o la non presenza dell'espressione di determinati geni all'interno di una coltura cellulare di MSC;
− la figura 2 à ̈ una raccolta di riproduzioni fotografiche illustranti i risultati di una RT-PCR condotta per individuare la presenza o la non presenza dell'espressione di determinati geni all'interno di una coltura cellulare di tenociti ottenuti per differenziazione di MSC.
Modo preferito di realizzazione dell'invenzione
In un suo primo aspetto, il metodo per la produzione in vitro di tenociti secondo la presente invenzione, comprende le fasi di ottenere una coltura cellulare di cellule staminali mesenchimali, prelevate da mammifero, e di porla a diretto contatto con una quantità efficace di proteina morfogenetica dell'osso 12, (di seguito, in breve, BMP12 - bone morphogenetic protein 12).
Le MSC possono essere ottenute da mammiferi adulti oppure da tessuti fetali, ed in particolare à ̈ preferito che esse siano prelevate da midollo osseo oppure da cordone ombelicale.
In entrambi i casi, le MSC devono essere in primo luogo opportunamente isolate dalle altre cellule che compongono i tessuti prelevati e quindi posti in un terreno di coltura adatto per la loro rapida proliferazione.
Le MSC sono identificate come tali mediante un metodo di caratterizzazione, che costituisce un secondo aspetto della presente invenzione, in cui à ̈ prevista una analisi mediante RT-PCR di un campione di cellule al fine di individuare in esse la presenza dei prodotti di espressione di specifici geni, in particolare di uno o più geni scelti tra SOX2, OCT-4 e NANOG. I prodotti dell'espressione dei geni di interesse saranno anche identificati nel testo che segue come “marcatori†.
I geni anzidetti esprimono rispettivi fattori di trascrizione ritenuti essenziali per il mantenimento di cellule indifferenziate e la presenza dei marcatori da essi espressi à ̈ considerato un chiaro indizio di staminalità. Si noti, tuttavia, che l'espressione dei geni OCT-4 e NANOG à ̈ tipicamente caratteristica di cellule staminali di tipo embrionale, ma che, sorprendentemente, essa si à ̈ dimostrata presente anche nelle MSC prelevate da esemplari adulti.
Preferibilmente, à ̈ inoltre previsto che l'analisi mediante RT-PCR sia condotta per individuare la presenza del prodotto di espressione del gene CD34. Contrariamente ai geni precedenti, CD34 esprime una glicoproteina tipicamente presente nel midollo osseo e nel cordone ombelicale ma non nelle MSC. L'analisi circa la presenza del prodotto di espressione di questo gene rappresenta quindi un controllo negativo, e l'assenza di CD34 nel campione di cellule analizzate serve per confermare che l'operazione di isolamento delle MSC dal midollo osseo o dal cordone ombelicale à ̈ stato condotto correttamente.
Come indicato in precedenza, l'analisi viene condotta mediante una RT-PCR, comprendente una prima fase di trasformazione in DNA complementare (di seguito, in breve, cDNA) di RNA messaggero (di seguito, in breve, mRNA) isolato dal campione cellulare da una successiva fase di amplificazione mediante Polymerase Chain Reaction - Reazione a Catena della Polimerasi (di seguito, in breve, PCR) del DNA complementare ottenuto dalla prima fase.
In questo modo, à ̈ possibile stabilire se i geni di interesse esprimano effettivamente la loro rispettiva proteina o se, al contrario, essi, ancorché presenti nel DNA cellulare, siano silenti.
Preferibilmente, secondo un ulteriore aspetto della presente invenzione, la fase di amplificazione mediante PCR Ã ̈ condotta utilizzando alcune delle coppie di inneschi specificate in tabella 1.
In particolare, per il gene SOX2 Ã ̈ stata utilizzata la coppia di inneschi, rispettivamente senso ed antisenso, definita dalle sequenze nucleotidiche SEQ ID NO:1 e SEQ ID NO:2; per il gene OCT-4 Ã ̈ stata utilizzata la coppia di inneschi, rispettivamente senso ed antisenso, definita dalle sequenze nucleotidiche SEQ ID NO:3 e SEQ ID NO:4; per il gene NANOG Ã ̈ stata utilizzata la coppia di inneschi, rispettivamente senso ed antisenso, definita dalle sequenze nucleotidiche SEQ ID NO:5 e SEQ ID NO:6; mentre, infine, per il gene CD34 Ã ̈ stata utilizzata la coppia di inneschi, rispettivamente senso ed antisenso, definita dalle sequenze nucleotidiche SEQ ID NO:7 e SEQ ID NO:8.
Una volta raggiunto il desiderato grado di proliferazione, le MSC sono poste a contatto diretto con una quantità efficace di BMP12. Questa proteina à ̈ una componente della famiglia delle proteine morfogenetiche dell'osso, le quali a loro volta rappresentano un sottogruppo della superfamiglia dei fattori di crescita trasformanti (TGF) e sono note per la loro abilità di promuovere la formazione ectopica di tessuto osseo e cartilagineo.
La quantità di BMP12 immessa nella coltura cellulare per indurre la differenziazione delle MSC in tenociti à ̈ compresa tra 30 e 70 ng/ml e, preferibilmente, à ̈ di 50 ng/ml.
L'esposizione diretta delle MSC alla BMP12 Ã ̈ mantenuta per un periodo di 14-21 giorni.
Secondo un ulteriore aspetto della presente invenzione, la presenza di tenociti all'interno delle MSC trattate con BMP12 Ã ̈ evidenziata mediante caratterizzazione genica, analizzando un campione delle cellule trattate mediante RT-PCR al fine di individuare la presenza dei prodotti di espressione di specifici geni.
In particolare, l'analisi mediante RT-PCR Ã ̈ condotta in modo tale da individuare la presenza dei prodotti di espressione di geni codificanti una proteina scelta tra tenomodulina e decorina. Queste proteine rivestono un ruolo importante nella formazione e nel mantenimento del tessuto connettivo del tendine, mentre sono del tutto assenti nelle cellule indifferenziate di origine.
Preferibilmente, l'analisi mediante RT-PCR à ̈ condotta in modo da individuare la presenza di entrambe le proteine anzidette, e, inoltre, essa à ̈ condotta per verificare se nel campione cellulare esposto a BMP12 sia presente il prodotto di espressione del gene codificante la lipocalina P19. Questa proteina à ̈ presente in diversi tessuti di origine mesenchimale, come ad esempio nel tessuto uterino ed endometriale, ma non à ̈ presente nei tendini, per cui la sua assenza costituisce una conferma dell'alta selettività della differenziazione delle MSC ottenuta con il metodo della presente invenzione.
Preferibilmente, secondo un ulteriore aspetto della presente invenzione, la fase di amplificazione mediante PCR nella caratterizzazione dei tenociti à ̈ condotta utilizzando alcune delle coppie di inneschi specificate in tabella 1.
In particolare, per il gene codificante la tenomodulina à ̈ stata utilizzata la coppia di inneschi, rispettivamente senso ed antisenso, definita dalle sequenze nucleotidiche SEQ ID NO:9 e SEQ ID NO:10; per il gene codificante la decorina à ̈ stata utilizzata la coppia di inneschi, rispettivamente senso ed antisenso, definita dalle sequenze nucleotidiche SEQ ID NO:11 e SEQ ID NO:12 e per il gene codificante per la lipocalina P19 à ̈ stata utilizzata la coppia di inneschi, rispettivamente senso ed antisenso, definita dalle sequenze nucleotidiche SEQ ID NO:13 e SEQ ID NO:14.
Sia nella caratterizzazione delle MSC che nella caratterizzazione dei tenociti, la RT-PCR à ̈ stata altresì allestita per verificare la presenza del prodotto di espressione del gene codificante il GAPDH (gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi). Tale “marcatore†à ̈ certamente presente in entrambi i tipi di cellule esaminate, per cui la sua presenza costituisce un controllo positivo della correttezza della conduzione della RT-PCR. La coppia di inneschi, rispettivamente senso ed antisenso, impiegata per la fase di amplificazione mediante PCR del gene GAPDH à ̈ definita dalle sequenze SEQ ID NO:15 e SEQ ID NO:16.
Le sequenze oligonucleotidiche degli inneschi identificate nella presente descrizione con SEQ ID NO:1 fino a SEQ ID NO:16, sono riportate in tabella 1 in coda alla descrizione e, in lingua inglese, nel formato conforme allo standard internazionale definito dalla WIPO (Organizzazione Mondiale per la Proprietà Intellettuale).
Esempio
Raccolta ed isolamento di MSC
Campioni di midollo osseo sternale sono stati prelevati mediante aghi 11 gauge da una giumenta di otto anni, di razza Dutch Warmblood, raccolti in due siringhe da 20 ml contenenti 30000 unità di eparina di sodio, e mantenuti a bassa temperatura con ghiaccio.
30 ml del midollo osseo così raccolto sono stati deposti su Hystopaque® 1077 (Sigma Aldrich) e centrifugati per 20 minuti a 4°C ad una accelerazione di 400g. Lo strato formato da una popolazione cellulare ricca di MSC à ̈ stato aspirato e lavato in soluzione PBS priva di calcio e magnesio e sottoposta ad ulteriore centrifugazione a 260g per 5 minuti a 4°C.
I pellet cellulari sono stati quindi risospesi in 10 ml di DMEM (mezzo di coltura di Dulbecco modificato da Eagle) addizionato con 10% di FCS (siero fetale di vitello), 100 U/ml di penicillina, 100 mg/l di streptomicina (P/S) e 1% di amminoacidi non essenziali (NEAA), e quindi seminati in piastre a 24 pozzetti.
Le cellule sono state controllate per 3-4 giorni, dopo di che il terreno di coltura à ̈ stato sostituito con uno fresco, analogo al precedente ma ulteriormente addizionato di 50 ng/ml di EGF (fattore di crescita dell'epidermide). Nelle successive due settimane le cellule sono state quindi tripsinizzate, contate, seminate in fiasche di coltura da 25 cm<2>(4 x 10<5>cellule per fiasca) o in piastre da 24 pozzetti (2 x 10<5>cellule/ml) ed incubate a 37°C al 5% di CO2.
Caratterizzazione delle MSC
L'RNA totale di un campione di coltura cellulare à ̈ stato isolato mediante RNeasy Kit (Qiagen), risospeso in 30 l di acqua priva di ribonuclease e mantenuto ad una temperatura di –80°C.
0.5 mg di RNA sono stati quindi convertiti in cDNA mediante trascrittasi inversa (RevertAid H minusM-MLV RT da Fermentas Int., USA) e circa 2 l di cDNA ottenuto sono stati amplificati in soluzione 1X PCR, utilizzando 5U di polimerase Taq Gold (Applied Biosystem, USA) e 0.5 M di inneschi (senso ed antisenso) in grado di appaiarsi alle estremità dei segmenti genici di interesse.
In particolare, la reazione di PCR Ã ̈ allestita per amplificare il cDNA dei geni codificanti per SOX2, OCT-4, NANOG, CD34 e GAPDH. Le coppie di inneschi utilizzate a tal fine sono identificate rispettivamente dalle sequenze:
SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2;
SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4;
SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6;
SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8;
SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16.
Si noti che le coppie di inneschi per l'amplificazione dei geni SOX2, OCT4, NANOG e CD34 sono state specificamente disegnate ex novo, in quanto, per il cavallo, non risultano note le rispettive sequenze geniche.
Le sequenze oligonucleotidiche sono state ricavate da studi di allineamento con sequenze geniche note di altri mammiferi, tra cui l'uomo ed il topo.
La PCR Ã ̈ stata condotta come segue: dopo un primo riscaldamento a 95°C per 10 minuti sono stati eseguiti 35 cicli di lavoro, ciascuno di essi prevedendo 45 secondi a 95°C, 30 secondi a 58°C, 30 secondi a 72°C ed una fase finale di 5 minuti a 72°C. I prodotti ottenuti dalla PCR sono stati sottoposti ad elettroforesi in gel di agarosio al 2%, visualizzati con bromuro di etidio e fotografati sotto luce UV (Bio-Rad, USA). Le foto ottenute sono raccolte, per ciascun gene, in figura 1.
Si può notare come l'analisi indichi chiaramente come nel cDNA amplificato siano presenti i geni codificanti GAPDH, SOX2, OCT-4 e NANOG, il che implica che nell'RNA totale cellulare analizzato fosse presente mRNA codificato da tali geni, e di conseguenza il prodotto della loro espressione genica. Al contrario, il gene codificante CD34 risulta assente, il che comporta che tale gene sia silente.
Come già descritto in precedenza, i prodotti dell'espressione dei geni codificanti SOX2, OCT-4 e NANOG rivela la presenza di MSC, mentre l'assenza del “marcatore†CD34 conferma la natura mesenchimale delle cellule di midollo osseo originarie.
Differenziazione in tenociti
Campioni di coltura cellulare di MSC al quinto passaggio, al 70% di confluenza, sono stati seminati in fiasche di coltura e mantenuti per 14-21 giorni in un terreno di crescita addizionato con 50 ng/ml di BMP12 (Tebu-Bio, Italia) e sostituito a giorni alterni.
Caratterizzazione dei tenociti
Al termine del periodo di esposizione, la coltura cellulare esposta a BMP12 Ã ̈ stata sottoposta ad una analisi mediante RT-PCR, per verificare l'avvenuta differenziazione delle MSC in tenociti.
Pertanto, come nel caso precedente, l'RNA totale di un campione di coltura cellulare à ̈ stato isolato mediante RNeasy Kit (Qiagen), risospeso in 30 l di acqua priva di ribonuclease e mantenuto ad una temperatura di –80°C.
0.5 mg di RNA sono stati quindi convertiti in cDNA mediante trascrittasi inversa (RevertAid H minusM-MLV RT da Fermentas Int., USA) e circa 2 l di cDNA ottenuto sono stati amplificati in soluzione 1X PCR, utilizzando 5U di polimerase Taq Gold (Applied Biosystem, USA) e 0.5 M di inneschi (senso ed antisenso) in grado di appaiarsi alle estremità dei segmenti genici di interesse.
In particolare, la fase di amplificazione mediante PCR Ã ̈ allestita per dimostrare la presenza nel cDNA ottenuto dalla fase di retro-trascrizione dell'mRNA dei geni codificanti tenomodulina, decorina, lipocalina P19 e GAPDH. Le coppie di inneschi utilizzati a tal fine sono identificate rispettivamente dalle sequenze:
SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10;
SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12;
SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14;
SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16.
La PCR à ̈ stata condotta come segue: un primo riscaldamento a 95°C per 10 minuti à ̈ stato seguito da 35 cicli di lavoro ciascuno formato da 45 secondi a 95°C, 30 secondi a 58°C, 30 secondi a 72°C ed una fase finale di 5 minuti a 72°C.
I prodotti ottenuti dalla PCR sono stati sottoposti ad elettroforesi in gel di agarosio al 2%, visualizzati con bromuro di etidio e fotografati sotto luce UV (Bio-Rad, USA). Le foto ottenute sono raccolte, per ciascun gene, in figura 2.
Si può notare come dall' amplificazione del cDNA risulti chiaramente la presenza dei prodotti di espressione dei geni codificanti GAPDH, tenomodulina e decorina, mentre il gene codificante la lipocalina P19 risulti non espresso .
Come già descritto in precedenza, la presenza nella coltura cellulare dei prodotti di espressione dei geni codificanti tenomodulina e decorina à ̈ indice della presenza di tenociti, mentre l'assenza dei prodotti di espressione del gene codificante la lipocalina P19 conferma che il processo di differenziazione indotto da BMP12 sulle MSC non ha dato luogo a cellule di tipo diverso dai tenociti, risultando pertanto molto specifico e selettivo.
Infatti una analisi al microscopio delle cellule ha confermato che la differenziazione indotta da BMP12 non ha dato luogo ad osteoblasti.
Tabella 1
ELENCO DELLE SEQUENZE
<110> Parco Tecnologico Padano
<120> Method for in vitro production of tenocytes
<130> BI003731
<160> 16
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Designed F-primer for PCR amplification of SOX2
<400> 1
tggttacctc ttcctcccac t 21
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Designed R-primer for PCR amplification of SOX2
<400> 2
gggcagtgtg ccgttaat 18
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Designed F-primer for PCR amplification of OCT-4
<400> 3
tcccaggaca tcaaagctgc aga 23
<210> 4
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Designed R-primer for PCR amplification of OCT-4
<400> 4
gtcaaactta cgtaccctct cgggtct 27
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Designed F-primer for PCR amplification of Nanog
<400> 5
tacctcagcc tccagcagat 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Designed R-primer for PCR amplification of Nanog
<400> 6
cattggtttt tctgccacct 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Designed F-primer for PCR amplification of CD34
<400> 7
attacacgga aaacggtgga 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Designed R-primer for PCR amplification of CD34
<400> 8
aattcggtat cagccaccac 20
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Designed F-primer for PCR amplification of Tenomodulin <400> 9
gatcttcact tccctaccaa cg 22
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Designed R-primer for PCR amplification of Tenomodulin <400> 10
ctcatccagc atggggtc 18
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Designed F-primer for PCR amplification of Decorin <400> 11
gaatgagatc accaagctgc 20
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Designed R-primer for PCR amplification of Decorin <400> 12
tgagatgcga atgtatgaga ga 22
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Designed F-primer for PCR amplification of P19 lipocalin <400> 13
ttcttcatcc acaagatcca g 21
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Designed R-primer for PCR amplification of P19 lipocalin <400> 14
agttgggaca cacatacctc tt 22
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Designed F-primer for PCR amplification of GAPDH
<400> 15
caacgaattt ggctacagca 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Designed R-primer for PCR amplification of GAPDH
<400> 16
ctgtgaggag gggagattca 20

Claims (3)

  1. RIVENDICAZIONI 1. Metodo per la produzione in vitro di tenociti, comprendente la fase di porre a diretto contatto una coltura cellulare di cellule staminali mesenchimali, ottenute da mammifero, con una quantità efficace di proteina BMP12 (bone morphogenetic protein 12 - proteina morfogenetica dell'osso 12), caratterizzato dal fatto che detta proteina BMP12 à ̈ introdotta in detta coltura cellulare di cellule staminali mesenchimali ad una concentrazione compresa tra 30 e 70 ng/ml.
  2. 2. Metodo secondo la rivendicazione 1, in cui detta BMP12 Ã ̈ introdotta in detta coltura cellulare di cellule staminali mesenchimali ad una concentrazione di 50 ng/ml per un periodo di 14-21 giorni.
  3. 3. Metodo secondo una delle rivendicazioni precedenti, in cui dette cellule staminali mesenchimali sono ottenute da cavallo.
ITVR2008A000079A 2008-07-17 2008-07-17 Metodo per la produzione in vitro di tenociti a partire da cellule staminali mesenchimali, nonché rispettivi metodi per la caratterizzazione di detti tenociti e di dette cellule staminali mesenchimali IT1394262B1 (it)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
ITVR2008A000079A IT1394262B1 (it) 2008-07-17 2008-07-17 Metodo per la produzione in vitro di tenociti a partire da cellule staminali mesenchimali, nonché rispettivi metodi per la caratterizzazione di detti tenociti e di dette cellule staminali mesenchimali
PCT/IB2009/052542 WO2010007542A2 (en) 2008-07-17 2009-06-15 Method for the in vitro production of tenocytes
PCT/IB2009/052810 WO2010007551A2 (en) 2008-07-17 2009-06-29 Method for the production of tenocytes in vitro from mesenchymal stem cells

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
ITVR2008A000079A IT1394262B1 (it) 2008-07-17 2008-07-17 Metodo per la produzione in vitro di tenociti a partire da cellule staminali mesenchimali, nonché rispettivi metodi per la caratterizzazione di detti tenociti e di dette cellule staminali mesenchimali

Publications (2)

Publication Number Publication Date
ITVR20080079A1 true ITVR20080079A1 (it) 2010-01-18
IT1394262B1 IT1394262B1 (it) 2012-06-01

Family

ID=40750928

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ITVR2008A000079A IT1394262B1 (it) 2008-07-17 2008-07-17 Metodo per la produzione in vitro di tenociti a partire da cellule staminali mesenchimali, nonché rispettivi metodi per la caratterizzazione di detti tenociti e di dette cellule staminali mesenchimali

Country Status (2)

Country Link
IT (1) IT1394262B1 (it)
WO (2) WO2010007542A2 (it)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10801014B2 (en) 2013-12-06 2020-10-13 Global Stem Cell Technology Method and composition for inducing chondrogenesis or tenogenesis in mesenchymal stem cells

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1872789A1 (en) * 2002-09-07 2008-01-02 Medcell Bioscience Ltd. Pharmaceuticals kits comprising mesenchymals stem cells

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1872789A1 (en) * 2002-09-07 2008-01-02 Medcell Bioscience Ltd. Pharmaceuticals kits comprising mesenchymals stem cells

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AWAD H A ET AL: "Autologous mesenchymal stem cell-mediated repair of tendon", TISSUE ENGINEERING, LARCHMONT, NY, US, vol. 5, no. 3, 1 June 1999 (1999-06-01), pages 267 - 277, XP009022533, ISSN: 1076-3279 *
FU SAI CHUEN ET AL: "The roles of bone morphogenetic protein (BMP) 12 in stimulating the proliferation and matrix production of human patellar tendon fibroblasts.", LIFE SCIENCES, vol. 72, no. 26, 16 May 2003 (2003-05-16), pages 2965 - 2974, XP002533206, ISSN: 0024-3205 *
MAJEWSKI M ET AL: "Ex vivo adenoviral transfer of bone morphogenetic protein 12 (BMP-12) cDNA improves Achilles tendon healing in a rat model", GENE THERAPY, vol. 15, no. 16, August 2008 (2008-08-01), pages 1139 - 1146, XP002533207, ISSN: 0969-7128 *
VIOLINI STEFANIA ET AL: "Horse bone marrow mesenchymal stem cells express embryo stem cell markers and show the ability for tenogenic differentiation by in vitro exposure to BMP-12.", BMC CELL BIOLOGY 2009, vol. 10, 2009, pages 29, XP002533208, ISSN: 1471-2121 *
WANG ET AL: "Mesenchymal stem cells differentiate into tenocytes by bone morphogenetic protein (BMP) 12 gene transfer", JOURNAL OF BIOSCIENCE AND BIOENGINEERING, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 100, no. 4, 1 October 2005 (2005-10-01), pages 418 - 422, XP005667216, ISSN: 1389-1723 *

Also Published As

Publication number Publication date
WO2010007551A2 (en) 2010-01-21
WO2010007551A3 (en) 2010-04-29
WO2010007542A2 (en) 2010-01-21
IT1394262B1 (it) 2012-06-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Lange‐Consiglio et al. Characterization and potential applications of progenitor‐like cells isolated from horse amniotic membrane
Tazaki et al. Salamander spinal cord regeneration: The ultimate positive control in vertebrate spinal cord regeneration
Nery et al. Human mesenchymal stem cells: from immunophenotyping by flow cytometry to clinical applications
Chen et al. Study of in vivo differentiation of rat bone marrow stromal cells into schwann cell‐like cells
Berg et al. Chondrogenic potential of mesenchymal stromal cells derived from equine bone marrow and umbilical cord blood
JP5057629B2 (ja) ペプチド足場での組織細胞のカプセル化およびその使用
Lui Markers for the identification of tendon-derived stem cells in vitro and tendon stem cells in situ–update and future development
Meyer et al. Restorative approaches in Parkinson's Disease: which cell type wins the race?
Erickson et al. Cartilage matrix formation by bovine mesenchymal stem cells in three-dimensional culture is age-dependent
AU2017278931B2 (en) Improved methods for detecting and modulating the embryonic-fetal transition in mammalian species
JP2007514434A5 (it)
Mokry et al. Telomere attrition occurs during ex vivo expansion of human dental pulp stem cells
Fayazi et al. In-vitro construction of endometrial-like epithelium using CD146+ mesenchymal cells derived from human endometrium
JP2017500860A (ja) 哺乳類筋肉由来の幹細胞
US20200093961A1 (en) A method for regenerating the interverterbral disc with notochordal cells
Ogura et al. Methods of high integrity RNA extraction from cell/agarose construct
ITVR20080079A1 (it) Metodo per la produzione in vitro di tenociti a partire da cellule staminali mesenchimali, nonché rispettivi metodi per la caratterizzazione di detti tenociti e di dette cellule staminali mesenchimali
Ouyang et al. Generation of insulin-producing cells from rat mesenchymal stem cells using an aminopyrrole derivative XW4. 4
KR101389851B1 (ko) 신경능선줄기세포의 배양방법 및 그 용도
JP2013510577A5 (it)
JPWO2019013279A1 (ja) 三次元メカノシグナル細胞培養系を用いて作製した腱／靱帯様人工組織
ATE392469T1 (de) Verfahren zur ex vivo bildung von säugetier- knochen und dessen verwendungen
Nakano et al. Evaluation of mRNA expression levels and electrophysiological function of neuron-like cells derived from canine bone marrow stromal cells
Ferrari et al. Adult stem cells: perspectives for therapeutic applications
Nemoto et al. Tenascin-C expression in equine tendon-derived cells during proliferation and migration