ITTO20120785A1 - Micro-interferometro per microscopia interferenziale in n-esima armonica. - Google Patents
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Description
DESCRIZIONE dell'invenzione industriale dal titolo: "Micro-interferometro per microscopia interferenziale in n-esima armonica"
DESCRIZIONE
La presente invenzione riguarda in generale le tecniche di microscopia quantitativa label-free per l’indagine di mezzi trasparenti, poco assorbenti o riflettenti con dispersione cromatica.
L’esame di tali mezzi mediante metodi ottici si basa sulla variazione della lunghezza di cammino ottico attraverso il campione dovuta alla variazione dell’indice di rifrazione e/o dello spessore del campione. Dall’introduzione della microscopia a contrasto di fase da parte di Zernicke nel 1932 si à ̈ resa possibile la visualizzazione di campioni trasparenti, molto utile in particolare in medicina e biologia. Tuttavia, la misurazione dell’effettiva lunghezza di cammino ottico nel campione à ̈ necessaria per acquisire informazioni quantitative sulla composizione del campione. Ad esempio, in sistemi biologici trasparenti quali tessuti biologici o colture cellulari, parti differenti del tessuto/ cellula presentano differente lunghezza di cammino ottico a seconda della loro composizione e densità . Di particolare interesse à ̈ l’imaging quantitativo del cammino ottico in campioni istologici, usato ad esempio per la diagnosi del cancro nei tessuti. Tipicamente, l’imaging di campioni istologici richiede la colorazione e l’uso della microscopia a fluorescenza. Per contro, un imaging quantitativo label-free più rapido e semplice può incrementare significativamente la velocità nella diagnosi, permettendo ad esempio un rapido screening preliminare dei campioni istologici.
Misurazioni quantitative della lunghezza di cammino ottico possono essere effettuate mediante interferenza fra un fascio ottico passante attraverso il campione ed un secondo fascio ottico non passante attraverso il campione ed agente da riferimento. Tali misurazioni sono basate su interferometri a due bracci che sono affetti da effetti spuri dannosi dovuti a variazioni indesiderate del cammino ottico fra i due bracci, dovuti ad esempio a vibrazioni e turbolenze dell’aria. Sono state sviluppate tecniche per mitigare tali effetti dannosi, basate sull’uso di interferometri a due colori nei quali due fasci con differente lunghezza d'onda si propagano attraverso l'interferometro. Mediante analisi del segnale di interferenza dei due fasci à ̈ possibile sopprimere gli effetti della turbolenza dell'aria e delle vibrazioni meccaniche, aumentando così in modo rilevante la sensibilità e la stabilità del sistema. Nel caso degli interferometri a due colori la dispersione cromatica del campione deve essere presa in considerazione per acquisire informazioni quantitative dalla misurazione.
Un modo semplice per implementare un'interierometria a due colori à ̈ quello di utilizzare un fascio fondamentale ed un fascio armonico. Lo spostamento di fase misurato à ̈
Acpq= 2nq/À fL[n(X) — n(À/q)] di = Απ/ÀOPD , ove L à ̈ la lunghezza fisica del campione, n (λ) à ̈ l'indice di rifrazione del campione dipendente dalla lunghezza d'onda, À à ̈ la lunghezza d'onda fondamentale del laser, q à ̈ l'ordine dell'armonica, ed OPD à ̈ la differenza della lunghezza di cammino ottico. Il processo di generazione dell'armonica ottica, in particolare della seconda armonica, à ̈ coerente, nel senso che vi à ̈ una relazione di fase definita fra il fascio fondamentale ed il fascio armonico; i fasci laser utilizzati nell’interferometro sono cioà ̈ agganciati in fase. In questo modo à ̈ necessaria una singola sorgente laser invece di due differenti sorgenti generanti i due fasci. Microscopi basati su un interferometro a due colori che impiega un fascio fondamentale ed un fascio di seconda armonica sono riportati in letteratura; si vedano ad esempio il brevetto US 6611339, C. Yang et al. “Interferometric phasedispersion microscopy†Optics Letters, 25, 2000, 1526; A. Aha et al. “Harmonic phase dispersion microscope with a Mach-Zender interferometer†Applied Optics, 44, 2005, 1188. Tali sistemi comprendono modulatori ottici o componenti ottici mobili per migliorare il rapporto segnale/rumore. L’uso della configurazione a due bracci e modulatori ottici e la necessità di movimentare componenti ottici richiedono tempi lunghi di acquisizione che rendono difficoltosa l’implementazione pratica di tali sistemi.
La presente invenzione riguarda in particolare un dispositivo per misurare otticamente un mezzo comprendente:
una sorgente luminosa che fornisce un fascio fondamentale con una prima lunghezza d’onda;
un primo generatore di armonica che genera dal fascio fondamentale un primo fascio di armonica con una seconda lunghezza d’onda armonicamente correlata con la prima lunghezza d’onda;
un sistema ottico che accoppia luce del fascio fondamentale e del primo fascio di armonica lungo un singolo, medesimo cammino luminoso estendentesi attraverso un’area di bersaglio destinata a ricevere un mezzo da misurare;
un secondo generatore di armonica disposto dopo l’area di bersaglio, il quale genera dal fascio fondamentale un secondo fascio di armonica con detta seconda lunghezza d’onda; ed
un rivelatore che rileva luce proveniente dal mezzo per misurare una variazione di fase della luce interagente con il mezzo.
Rispetto agli interferometri a due bracci un’architettura ad un braccio solo ha il vantaggio di presentare una struttura più semplice, il che à ̈ desiderabile per un uso pratico generalizzato.
In US 4184737 si descrive un microinterferometro con ottica non lineare a braccio singolo, e si afferma che la dispersione à ̈ usata per formare un’immagine di un campione mediante un obiettivo ed un oculare di microscopio. L’immagine à ̈ formata utilizzando una configurazione convenzionale di microscopio nella quale il condensatore del microscopio à ̈ disposto prima del primo convertitore di frequenza e l’obiettivo e l’oculare del microscopio sono disposti dopo il secondo convertitore di frequenza. US 4184737 tuttavia non riporta alcuna dimostrazione di principio o dati sperimentali; per contro, si ritiene che i processi basati sulla coerenza e coinvolti nella generazione dell’armonica ottica, e quindi nel meccanismo di formazione delle immagini descritto in US 4184737, impongano forti limiti all’applicazione di tale approccio, impedendone di fatto un’implementazione pratica.
Uno scopo dell’invenzione à ̈ pertanto quello di proporre un dispositivo che permetta di effettuare un imaging quantitativo di mezzi trasparenti, poco assorbenti o riflettenti con dispersione cromatica, superando gli inconvenienti degli interferometri a due bracci noti.
In vista di tale scopo, costituisce oggetto dell’invenzione un dispositivo per misurare otticamente un mezzo del tipo sopra definito, in cui detto sistema ottico comprende un sistema acromatico di focalizzazione ed un sistema acromatico di collimazione disposti rispettivamente prima e dopo l’area di bersaglio in modo da avere rispettivi punti focali per la prima e la seconda lunghezza d’onda sostanzialmente coincidenti in corrispondenza dell’area di bersaglio, in cui detti primo e secondo generatore di armonica sono rispettivamente disposti prima del sistema acromatico di focalizzazione e dopo il sistema acromatico di collimazione.
Rispetto alle apparecchiature per la misurazione della differenza di lunghezza di cammino ottico fra fasci fondamentali ed armonici basate su interferometri a due bracci, la presente invenzione, basata su un’architettura a braccio singolo e cammino luminoso comune, fornisce i seguenti vantaggi: 1) una struttura molto semplice, il che à ̈ di fondamentale importanza per un uso pratico generalizzato; 2) l’uso di una singola sorgente laser, rispetto a quegli interferometri a due bracci che sono basati su sorgenti luminose distinte per i due fasci; 3) permette di avere un’elevata sensibilità di fase, necessaria per formare immagini di campioni molto sottili o presentanti una dispersione cromatica di livello basso; 4) permette di avere ridotti tempi di acquisizione, necessari per un’implementazione realistica dell’imaging mediante scansione bidimensionale del campione nel piano focale.
Forma inoltre oggetto dell’invenzione un procedimento per misurare otticamente un mezzo, comprendente i passi seguenti:
fornire un fascio fondamentale con una prima lunghezza d’onda;
generare dal fascio fondamentale un primo fascio di armonica con una seconda lunghezza d’onda armonicamente correlata con la prima lunghezza d’onda;
accoppiare luce del fascio fondamentale e del primo fascio di armonica lungo un singolo, medesimo cammino luminoso estendentesi attraverso un’area di bersaglio destinata a ricevere un mezzo da misurare;
generare dal fascio fondamentale proveniente dall’area di bersaglio un secondo fascio di armonica con detta seconda lunghezza d’onda; e
rilevare luce proveniente dal mezzo per misurare una variazione di fase della luce interagente con il mezzo;
in cui detto passo di accoppiamento comprende focalizzare acromaticamente il fascio fondamentale ed il primo fascio di armonica in corrispondenza dell’area di bersaglio e collimare acromaticamente il fascio fondamentale ed il primo fascio di armonica provenienti dall’area di bersaglio, detto passo di generazione del secondo fascio di armonica essendo dopo detto passo di collimazione.
Ulteriori caratteristiche e vantaggi del dispositivo secondo l’invenzione diverranno più chiari con la seguente descrizione dettagliata di una forma di realizzazione del trovato, fatta con riferimento ai disegni allegati, forniti a titolo puramente illustrativo e non limitativo, in cui:
- la figura 1 à ̈ una rappresentazione schematica del dispositivo secondo l’invenzione;
- la figura 2 Ã ̈ una rappresentazione schematica di un prototipo di microscopio interferometrico in seconda armonica usato per test di laboratorio;
- le figure 3a, 3b e 3c sono rispettivamente un’immagine fotografica di un campione di prova, un grafico che riporta il profilo del campione misurato con un profilometro a stilo, ed un grafico che riporta la misura dello spostamento di fase ∆φ ottenuto mediante scansione ottica lungo la direzione trasversale del campione, con il prototipo di figura 2.
L’invenzione propone un metodo semplice, ma accurato e sensibile, per misurare con una risoluzione spaziale elevata la differenza di lunghezza di cammino ottico fra radiazione fondamentale ed armonica in un campione trasparente o poco assorbente (od anche riflettente). L’implementazione del meto do à ̈ basata su un interferometro a due colori con cammino luminoso completamente condiviso, intrinsecamente insensibile ad effetti di vibrazione. In figura 1 à ̈ riportato uno schema dell’apparecchiatura.
L’apparecchiatura comprende una sorgente luminosa 1 che fornisce un fascio fondamentale FB, in particolare un fascio laser, con una prima lunghezza d’onda. Nella descrizione che segue, i termini “prima†e “dopo†sono intesi nella direzione di propagazione del fascio luminoso, indicata da una linea a tratto e punto in figura 1.
Il fascio laser fondamentale FB à ̈ convertito in frequenza in un primo generatore di armonica 3 comprendente un’unità ottica non lineare, ad esempio un cristallo duplicatore di frequenza. Il primo generatore di armonica 3 genera dal fascio fondamentale FB un primo fascio di armonica HB1 con una seconda lunghezza d’onda armonicamente correlata con la prima lunghezza d’onda. In figura 1, il primo fascio di armonica HB1 à ̈ rappresentato con una linea a tratti.
Il fascio fondamentale FB ed il primo fascio di armonica HB1, generato nel primo generatore 3, sono focalizzati in un’area di bersaglio 5 destinata a ricevere un mezzo S da misurare, mediante un sistema ottico acromatico di focalizzazione 7 disposto dopo il primo generatore 3. Il sistema ottico acromatico 7 deve essere acromatico su un intervallo di lunghezze d’onda, o su differenti intervalli, comprendente/i le lunghezze d’onda fondamentale ed armonica. L’area di bersaglio 5 ed il campione S sono disposti nel piano focale del sistema acromatico 7.
Dopo che fascio fondamentale e primo fascio di armonica sono stati fatti co-propagare attraverso il mezzo S, un sistema acromatico di collimazione 9 à ̈ utilizzato per collimare entrambi i fasci attraverso un secondo generatore di armonica 11, anch’esso comprendente un’unità ottica non lineare, ad esempio un cristallo duplicatore di frequenza. Il secondo generatore di armonica 11 genera dal fascio fondamentale FB un secondo fascio di armonica HB2 con la stessa lunghezza d’onda del primo fascio di armonica HB1 (seconda lunghezza d’onda), e quindi armonicamente correlata con la prima lunghezza d’onda. In figura 1, il secondo fascio di armonica HB2 à ̈ anch’esso rappresentato con una linea a tratti.
Quindi, la radiazione fondamentale FB viene rimossa mediante un sistema di filtraggio ottico 13.
Un sistema rivelatore 15, posto dopo il sistema di filtraggio ottico 13, rileva luce proveniente dal mezzo S per misurare una variazione di fase della luce interagente con il mezzo S. In particolare, nel sistema rivelatore 15 la differenza in lunghezza di cammino ottico fra il fascio fondamentale FB ed il primo fascio di armonica HB1 viene misurata mediante interferenza fra il primo ed il secondo fascio di armonica HB1, HB2. Prevedendo un sistema di movimentazione (non illustrato) per movimentare il campione S o l’apparecchiatura l’uno rispetto all’altro, à ̈ possibile effettuare una scansione mono- o bidimensionale del campione nel piano focale, e quindi ottenere un mappa dettagliata della differenza di cammino ottico, ovvero un’immagine quantitativa.
Cruciale per il funzionamento corretto del microscopio à ̈ la disposizione dei sistemi ottici acromatici di focalizzazione 7 e collimazione 9 fra i due generatori di armonica 3 ed 11, con rispettivi punti focali per la prima e la seconda lunghezza d’onda sostanzialmente coincidenti in corrispondenza dell’area di bersaglio 5. Ciò garantisce che fascio fondamentale e fascio armonico siano focalizzati nello stesso piano focale.
Lo stesso principio sopra descritto per la misurazione in trasmissione può essere facilmente applicato a campioni riflettenti od in modalità riflessione. In questo caso il fascio fondamentale FB ed il primo fascio di armonica HB1 sono riflessi dalla superficie del campione, o da un’ottica riflettente disposta dopo il campione trasparente. La radiazione fondamentale viene nuovamente convertita in frequenza nello stesso generatore di armonica (in questo caso primo e secondo generatore coincidono), oppure in un secondo generatore, nel caso in cui si utilizzi una configurazione di riflessione con un angolo di incidenza dei fasci sul campione diverso da zero.
Esempio sperimentale
Per test di laboratorio à ̈ stato realizzato un prototipo di microscopio interferometrico in seconda armonica; uno schema di tale prototipo à ̈ rappresentato in figura 2.
Un fascio laser fondamentale ad onda continua a 1064 nm, accoppiato in fibra ottica, viene duplicato in frequenza in un primo generatore di seconda armonica 3 costituito da un cristallo non lineare di borato di bismuto tagliato per una generazione di seconda armonica di tipo I. Fascio fondamentale e fascio di seconda armonica generato nel generatore 3 sono focalizzati sul campione S per mezzo di un doppietto acromatico 7 disposto fra il primo generatore 3 ed il campione S. Fascio fondamentale e primo fascio di seconda armonica hanno polarizzazione ortogonale. Fascio fondamentale e primo fascio di seconda armonica passano attraverso un compensatore di fase, in questo caso una finestra ottica inclinata C che presenta differente lunghezza di cammino ottico per i due fasci a seconda dell’angolo di incidenza di essi, e che quindi può compensare differenze di lunghezza di cammino ottico spurie indesiderate all’interno dell’apparecchiatura ottica, scegliendo l’angolo di inclinazione adatto.
Dopo che i due fasci sono co-propagati attraverso il campione, un secondo doppietto acromatico 9 à ̈ utilizzato per collimare i due fasci in una lamina di ritardo duale DWP, onda intera per il fascio fondamentale e semionda per il fascio di seconda armonica, con l’asse ottico disposto in modo tale da ruotare di 90 gradi la polarizzazione del fascio di seconda armonica e lasciare effettivamente inalterata la polarizzazione del fascio fondamentale.
Il fascio fondamentale ed il fascio di seconda armonica passano attraverso un altro generatore di seconda armonica 11, ove si genera il secondo fascio di seconda armonica, con polarizzazione ortogonale rispetto al fascio fondamentale ed al primo fascio di seconda armonica. La radiazione fondamentale viene quindi rimossa per mezzo del sistema di filtraggio ottico 13, in questo caso una combinazione di un filtro di vetro colorato ed un filtro interferenziale.
Infine, nel sistema rivelatore si misura la differenza in lunghezza di cammino ottico fra la radiazione fondamentale e la radiazione di seconda armonica dovuta al passaggio attraverso il campione, mediante interferenza dei due fasci di seconda armonica. In questo caso, si effettua una misurazione di fase diretta miscelando i due fasci di seconda armonica in un beam splitter polarizzatore PBS disposto con asse ottico a 45 gradi rispetto ai due fasci di seconda armonica. I fasci trasmesso e riflesso dal beam splitter sono rilevati da due rivelatori, nel caso presente due fotodiodi accoppiati in fibra ottica.
I segnali dei due fotodiodi sono
V± = a+I<2>+ β2± 2(/?I/?2)<1/2>sin(A<p <p0)],
ove β±Î™<ζ>à ̈ l'intensità della seconda armonica, a±Ã ̈ la responsività del rivelatore, φο=ηπ+Δφ0, Δφ0à ̈ lo spostamento di fase non compensato, e Αφ = 4Tr/A/J(n(A)-n(A/2))]dZ à ̈ la fase da misurare.
Il segnale registrato à ̈ R= ( V+-V-) / ( V++V_) = [ a± Vsin ( Δφ+Δφο ) ] / [ liaVsin {Δφ+Δφ0) ] , ove
a= ( a+- ot-) / ( a++ ot-) , e V=2 ( βιβ2) V ( βι β2) ≤1 à ̈ la visibilità .
Per CK≤1% (rivelatori bilanciati), e Δφο<1 mRad (regolando il compensatore), si ha
R^a+Vsin {Δφ+ Δφο) al primo ordine in a, ed VA 3⁄45+costante per Δφ«1.
L' interferometro proposto si autocalibra effettuando una scansione del setting del compensatore (ad es., l'angolo di inclinazione di una finestra ottica) su una frangia interferometrica per valutare la visibilità , V, e l'eventuale off-set (dovuto ad esempio a rivelatori non perfettamente bilanciati) .
Le prestazioni dell'apparecchiatura sono state testate misurando scanalature di profondità micrometrica e sub-micrometrica su campioni piani trasparenti di polimero/vetro effettuando una scansio ne lineare, come riportato in figura 3. Nello specifico, il campione à ̈ stato preparato depositando mediante spinning un film di polimetilmetacrilato (PMMA) dello spessore di 650 nm su un vetrino sottile, e successivamente rimuovendo una parte selezionata del film mediante laser etching diretto. In figura 3a à ̈ rappresentata l’immagine fotografica della parte trattata con laser, insieme con la parte adiacente di film non trattata. In figura 3b à ̈ riportato il profilo del film polimerico sul vetro, misurato con un profilometro a stilo. In figura 3c à ̈ mostrato lo spostamento di fase R≈α+Vsin(∆φ+ ∆φ0) misurato, ottenuto effettuando una scansione ottica del campione lungo la direzione trasversale, perpendicolare alla scanalatura ottenuta con il laser.
La sensibilità nella variazione di spostamento di fase misurata à ̈ di 7 mRad su una variazione di spostamento di fase di 0,114 Rad. La variazione di spostamento di fase misurata si traduce direttamente in un valore misurato per la dispersione del film polimerico, dando un ∆nexp=1,49(9)x10<-2>, in ottimo accordo con l’indice di rifrazione di PMMA riportato in letteratura, ∆n~1,4x10<-2>, con una certa variabilità legata all’effettiva composizione e qualità del polimero. Il tempo di acquisizione per pixel durante la scansione à ̈ di 0,3 ms. Per apprezzare la rilevanza del presente approccio, si confrontino i risultati suddetti con le misurazioni allo stato dell’arte riportate in A. Aha et al, “Harmonic phase dispersion microscope with a Mach-Zender interferometer†Applied Optics, 44, 2005, 1188, dove la sensibilità riportata à ̈ di 71 mRad con un tempo di acquisizione per pixel di 50 ms. Quindi, con il prototipo sopra descritto si sono ottenute una risoluzione migliore di un ordine di grandezza ed una velocità di acquisizione maggiore di più di due ordini di grandezza. Inoltre, in A. Aha et al, “Harmonic phase dispersion microscope with a Mach-Zender interferometer†Applied Optics, 44, 2005, 1188 à ̈ utilizzato un interferometro Mach-Zender a due bracci in combinazione con due modulatori acusto-ottici. Quindi, l’approccio qui presentato à ̈ non solo più sensibile e veloce, ma anche molto più compatto e versatile, e semplice da implementare, anche in apparecchiature preesistenti. La risoluzione spaziale di 60 micron ottenuta con il prototipo di microscopio interferometrico in seconda armonica à ̈ comparabile con la dimensione dello spot stimato del laser sul campione. La risoluzione spaziale del microscopio interferometrico in seconda armonica può essere aumentata fino al limite di diffrazione, quindi a livelli submicrometrici, adottando obiettivi acromatici adeguati.
Claims (4)
- RIVENDICAZIONI 1. Dispositivo per misurare otticamente un mezzo, comprendente: una sorgente luminosa (1) che fornisce un fascio fondamentale (FB) con una prima lunghezza d’onda; un primo generatore di armonica (3) che genera dal fascio fondamentale (FB) un primo fascio di armonica (HB1) con una seconda lunghezza d’onda armonicamente correlata con la prima lunghezza d’onda; un sistema ottico (7, 9) che accoppia luce del fascio fondamentale (FB) e del primo fascio di armonica (HB1) lungo un singolo, medesimo cammino luminoso estendentesi attraverso un’area di bersaglio (5) destinata a ricevere un mezzo (S) da misurare; un secondo generatore di armonica (11) disposto dopo l’area di bersaglio (5), il quale genera dal fascio fondamentale (FB) un secondo fascio di armonica (HB2) con detta seconda lunghezza d’onda; ed un rivelatore (15) che rileva luce proveniente dal mezzo per misurare una variazione di fase della luce interagente con il mezzo; caratterizzato dal fatto che detto sistema ottico comprende un sistema acromatico di focalizzazione (7) ed un sistema acromatico di collimazione (9) disposti rispettivamente prima e dopo l’area di bersaglio (5) in modo da avere rispettivi punti focali per la prima e la seconda lunghezza d’onda sostanzialmente coincidenti in corrispondenza dell’area di bersaglio (5), in cui detti primo e secondo generatore di armonica sono rispettivamente disposti prima del sistema acromatico di focalizzazione (7) e dopo il sistema acromatico di collimazione (9).
- 2. Dispositivo secondo la rivendicazione 1, comprendente inoltre un sistema di filtraggio ottico (13) disposto dopo il secondo generatore di armonica e prima del rivelatore (13) per rimuovere il fascio fondamentale (FB).
- 3. Procedimento per misurare otticamente un mezzo, comprendente i passi seguenti: fornire un fascio fondamentale (FB) con una prima lunghezza d’onda; generare dal fascio fondamentale (FB) un primo fascio di armonica (HB1) con una seconda lunghezza d’onda armonicamente correlata con la prima lunghezza d’onda; accoppiare luce del fascio fondamentale (FB) e del primo fascio di armonica (HB1) lungo un singolo, medesimo cammino luminoso estendentesi attraverso un’area di bersaglio (5) destinata a ricevere un mezzo (S) da misurare; generare dal fascio fondamentale (FB) proveniente dell’area di bersaglio (5) un secondo fascio di armonica (HB2) con detta seconda lunghezza d’onda; e rilevare luce proveniente dal mezzo per misurare una variazione di fase della luce interagente con il mezzo; caratterizzato dal fatto che detto passo di accoppiamento comprende focalizzare acromaticamente il fascio fondamentale (FB) ed il primo fascio di armonica (HB1) in corrispondenza dell’area di bersaglio (5) e collimare acromaticamente il fascio fondamentale (FB) ed il primo fascio di armonica (HB1) provenienti dall’area di bersaglio (5), detto passo di generazione del secondo fascio di armonica essendo dopo detto passo di collimazione.
- 4. Procedimento secondo la rivendicazione 3, comprendente inoltre rimuovere il fascio fondamentale (FB) mediante filtraggio ottico (13) dopo detto passo di generazione del secondo fascio di armonica e prima di detto passo di rilevamento.
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