ITTO20010534A1 - Dispositivo e metodo per elettroporazione che riduce la contrazione muscolare e la sensazione di dolore. - Google Patents
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Description
D E S C R I Z I O N E
del brevetto per invenzione industriale
La presente invenzione si riferisce ad un dispositivo e ad un metodo per elettroporazione.
Come è noto, applicazioni biologiche, microbiologiche e farmacologiche recenti comportano l'introduzione di molecole in cellule, il che viene eseguito introducendo le molecole attraverso le membrane cellulari.
In alternativa, l'introduzione può venire eseguita esponendo le cellule ad un impulso elettrico, permettendo così il trasporto di molecole attraverso la membrana cellulare .
Le molecole possono essere sostanze inorganiche (per esempio farmaci) oppure molecole organiche (per esempio è noto che molecole di DNA possono venire introdotte in cellule).
Le molecole vengono introdotte usando vari metodi, comprendenti :
trasporto virale: associando la molecola con un virus che viene quindi introdotto nella cellula;
trasporto chimico; associando la molecola con una sostanza chimica per ridurre la resistenza della membrana cellulare, permettendo così l'introduzione della molecola nella cellula; e
metodi balistici; accelerando la molecola affinché colpisca e penetri la membrana cellulare.
I metodi noti presentano diversi inconvenienti, comprendenti :
rischio di reazione immunitaria al vettore; difficoltà di produzione e scarsa stabilità del vettore stesso (trasporto virale); inefficacia, tossicità e scarsa selettività (trasporto chimico). Per quanto riguarda i metodi balistici, questi si applicano solo a cellule superficiali.
Nuovi metodi, cosiddetti di elettroporazione, sono stati previsti recentemente, e sono basati sull'applicazione di impulsi elettrici alle cellule per produrre un campo elettrico che permeabilizza la struttura della cellula, permettendo alle sostanze di attraversare la membrana cellulare.
I metodi precedenti normalmente forniscono impulsi corti forniti ad una frequenza di ripetizione relativamente bassa (per esempio nel campo dell'elettrochemioterapia è nota l'applicazione di uno o più impulsi (per esempio 1, 2, 4, 6 oppure 8 impulsi) aventi una durata di 100 μs e una frequenza di ripetizione di 1 Hz) oppure forniscono impulsi più lunghi (per esempio è nota l'applicazione di impulsi aventi durate di alcuni millisecondi per trattare cellule con DNA).
Nei casi precedenti, i nervi ed i muscoli sottostanti del paziente (uomo o animale) che riceve gli impulsi vengono eccitati, ottenendo una eccitazione nervosa/contrazione muscolare e percezione di dolore. Il risultato è una sensazione sgradevole per il paziente che limita fortemente l'applicazione degli impulsi precedenti per un periodo di tempo più lungo nel caso di trattamento di volumi di tessuto elevati con, per esempio, una pluralità di elettrodi ad ago disposti in una serie.
Tuttavia, non solo i protocolli attuali usano diversi impulsi elettrici (ottenendo un numero equivalente di sensazioni sgradevoli da parte del paziente e un numero equivalente di contrazioni muscolari), ma studi in vitro ed in vivo hanno dimostrato che una migliore elettropermeabilizzazione delle cellule viene ottenuta quando vengono forniti diversi impulsi. Invece, per la stessa durata totale della distribuzione del campo elettrico, diversi impulsi corti (per esempio 10 impulsi di 100 microsecondi; durata totale = 1 millisecondo) portano ad una permeabilizzazione e assunzione del farmaco migliori rispetto ad un singolo impulso di 1 millisecondo.
Uno scopo della presente invenzione consiste nel fornire un dispositivo ed un metodo per elettroporazione progettati per eliminare gli inconvenienti dei dìspositivi e dei metodi per elettroporazione noti.
In particolare, uno scopo della presente invenzione consiste nel fornire un dispositivo per elettroporazione che genera impulsi che limitano fortemente, fino ad una sola, le sensazioni avvertite dal paziente, cioè la sensazione e la contrazione prodotte dal primo impulso del treno di impulsi. A queste condizioni proposte, il trattamento può venire terminato prima che la sensazione venga avvertita dal paziente. Inoltre, la riduzione del numero di contrazioni provocate dal trattamento può potenzialmente diminuire l'alterazione della struttura del muscolo, oppure altri danni al muscolo oltre a quelli strettamente correlati alla permeabilizzazione cellulare.
Secondo la presente invenzione, si fornisce un dispositivo per elettroporazione secondo la rivendicazione 1.
La presente invenzione si riferisce anche ad un metodo per elettroporazione secondo la rivendicazione 7.
Una forma di realizzazione preferita, non limitativa, dell'invenzione verrà descritta a scopo di esempio con riferimento ai disegni allegati, in cui:
la Figura 1 mostra, schematicamente, un dispositivo per elettroporazione secondo gli insegnamenti della presente invenzione; e
le Figure 2a, 2b, 2c, 2d e 2e mostrano un segnale prodotto mediante il dispositivo della Figura 1.
Il numero 1 nella Figura 1 indica un dispositivo per elettroporazione nella sua totalità.
Il dispositivo 1 comprende un generatore di segnale, in particolare un generatore di impulsi 3 per produrre un treno di impulsi, avente una uscita collegata ad un ingresso di un amplificatore di potenza 5 avente la propria uscita in comunicazione con una coppia di elettrodi 7 e 8.
Il generatore di impulsi 3 è in grado di produrre un treno di impulsi P(t) la cui forma, ampiezza e ripetizione dipende da una pluralità di segnali di informazione ricevuti agli ingressi del generatore di impulsi 3.
In particolare, il generatore di impulsi 3 coopera con:
♦ un primo circuito 10 che è progettato per controllare la durata Wth (Figura 2a) di ciascun impulso P(t) generato, in particolare la durata può venir regolata in continuo fra circa 10 microsecondi e 10 millisecondi e, più particolarmente, fra circa 30 ps e 250 ps in forme di realizzazione preferite di treni di impulsi;
♦ un secondo circuito 12 che è progettato per controllare la frequenza di ripetizione Fr degli impulsi generati P(t) del treno, in particolare la frequenza di ripetizione Fr è variabile in continuo (o in fasi, incrementi) fra circa 1 KHz e 100 KHz e più praticamente fra circa 2 kHz e 25 kHz in una forma di realizzazione preferita del treno di impulsi. La frequenza di ripetizione Fr può aumentare con la diminuzione della durata Wth e diminuire con l'aumento della durata Wth anche se la frequenza di ripetizione e la durata non devono essere inversamente proporzionali (il ritardo fra due impulsi consecutivi e la durata dell'impulso può venire fissata indipendentemente).
Per esempio, per impulsi di 30 ps, la frequenza di ripetizione è convenientemente di 17 kHz e per impulsi di 100 ps, la frequenza di ripetizione è convenientemente 5 oppure 3,2 kHz; e
♦ un terzo circuito 14 che regola l'ampiezza di ciascun impulso applicato agli elettrodi 7, 8, tale ampiezza essendo regolabile fra 50 volt e 2000 volt, preferibilmente a meno di 1100 volt, a seconda degli scopi del trattamento (elettro-chemioterapia oppure elettro-geneterapia, cioè elettrotrasferimento di DNA per la terapia genica) del tessuto e della distanza fra gli elettrodi.
Convenientemente, gli impulsi sono impulsi rettangolari, anche se è evidente che possono venire usati impulsi aventi una forma differente (per esempio impulsi triangolari, trapezoidali, impulsi monopolari o bipolari, impulsi sinusoidali,...).
Il generatore di impulsi 3 ed i circuiti 10, 12 e 14 vengono controllati mediante una unità centrale di elaborazione (CPU) 18 che riceve comandi dall'esterno (per esempio comandi introdotti per mezzo di una tastiera 22) affinché possa venire generato un treno di impulsi P(t) avente una particolare durata, frequenza di ripetizione e ampiezza.
Nell'uso reale, elettrodi 7, 8 vengono applicati ad una porzione di tessuto 25 (mostrata schematicamente nella Figura 1) contenente cellule vive. La porzione di tessuto può essere preferibilmente una che fa parte di un essere vivente (uomo o animale).
Alla porzione di tessuto 25 viene anche applicata una sostanza (organica o inorganica o biopolimerica) 30 da introdurre nelle cellule. La sostanza 30 può venire applicata in numerosi modi differenti, alcuni dei quali sono elencati in seguito a scopo di esempi non limitati vi:
• applicazione diretta della sostanza alla porzione di tessuto, per esempio applicando alla porzione di tessuto un fluido contenente la sostanza;
• applicazione indiretta della sostanza, per esempio introducendo la sostanza nel sistema circolatorio della porzione di tessuto; e
• iniezione della sostanza, per esempio usando elettrodi 7, 8 simili ad aghi, ciascuno avente un condotto interno contenente la sostanza da iniettare nella porzione di tessuto. La sostanza può anche venire iniettata usando aghi separati dagli elettrodi.
La sostanza 30 introdotta può essere inorganica oppure organica o biopolimerica, per esempio
• un acido nucleico;
• una molecola di DNA contenente sequenze di regolazione e sequenze che codificano geni terapeutici o geni di interesse per scopi biomedici o biotecnologici;
· un oligonucleotide, naturale (fosfodiesteri) o modificato (entro lo scheletro dell ' oligonucleotide, come fosfosolfati, oppure alle estremità, mediante addizione di gruppi per proteggere gli oligonucleotidi dalla digestione di nucleasi; la descrizione delle modifiche dell'oligonucleotide essendo non limitativa);
• una proteina o un peptide, naturale oppure modificato geneticamente o chimicamente, estratto da fonti naturali oppure ottenuto mediante sintesi, oppure una molecola che simula la struttura di una proteina o di un peptide, indipendentemente dalla sua struttura;
• un agente citotossico, in particolare l'antibiotico bleomicina o cisplatina;
• una penicillina; e
• un agente farmacologico diverso da un acido nucleico.
Il dispositivo 1 viene attivato per generare un treno di impulsi che sono distanziati fra di loro di un intervallo di tempo Tsp che è minore rispetto al periodo refrattario dei nervi e/oppure dei muscoli presenti nella porzione di tessuto 35.
Più precisamente, il periodo refrattario è diviso in due parti: periodo refrattario assoluto (durante il quale la membrana del nervo/muscolo non può venire depolarizzata, cioè non può venire generato un secondo potenzìale di azione) e un periodo refrattario relativo (durante il quale può venire generato un nuovo potenziale di azione, la membrana viene depolarizzata, ma solo con un impulso elettrico più forte).
I valori numerici del periodo refrattario per la porzione di tessuto 25 variano leggermente in base al tipo di nervo e muscolo contenuto nella porzione di tessuto 25.
In generale, le fibre nervose mielinizzate hanno periodi refrattari più corti rispetto a quelle demielinizzate, e fibre nervose con diametri maggiori hanno periodi refrattari più corti rispetto alle fibre nervose più sottili.
Alcuni esempi del periodo refrattario sono i seguenti :
♦ Esempio 1: periodo refrattario assoluto (ARD) = 0,4 ms, periodo refrattario relativo (RRP) = 0,1 fino a 0,2 ms, quindi il periodo refrattario (che è la somma di entrambi) è uguale a 0,5 fino a 0,6 ms. Questi valori vengono forniti per fibre nervose mielinizzate grandi negli uomini e sono quindi i più brevi.
♦ Esempio 2: ARD = 0,5 fino a 1 ms, RRD = 0,5 fino a 2 ms, quindi il periodo refrattario totale, che è la somma di entrambi, è da 1 fino a 2,5 ms.
♦ Esempio 3: ARD = 1 ms, RRD = 10 fino a 15 ms.
Anche la tabella seguente fornisce esempi di periodi refrattari per nervi aventi diametri differenti (minimo/massimo) e composizione differente (demielinizzate/mielinizzate) .
Secondo la presente invenzione, l'utilizzatore avverte solo il primo impulso del treno e non avverte più (oppure solo ad una estensione considerevolmente minore) gli impulsi successivi poiché il nervo e/oppure il muscolo, quando attivato per la prima volta, non ha più il tempo di reagire agli impulsi successivi e viene automaticamente portato in una condizione in cui gli impulsi successivi non vengono avvertiti.
In altre parole, il dispositivo della presente invenzione genera un treno di impulsi aventi una frequenza Fr (1 kHz - 100 kHz) che è in ogni caso maggiore rispetto alla frequenza massima del potenziale di azione del tessuto nervoso e/oppure muscolare presente nella porzione di tessuto 25. In effetti, la frequenza del potenziale di azione dei nervi e/oppure dei muscoli scheletrici si estende da 400 Hz a 2,5 kHz e quindi la frequenza di ripetizione degli impulsi generati è maggiore della frequenza del potenziale di azione dei nervi e/oppure dei muscoli. Come conseguenza, i nervi e/oppure i muscoli non vengono attivati con ciascun impulso consecutivo e il paziente non avverte un dolore addizionale e/oppure eccessivo e/oppure non ha sensazione sgradevoli, tranne la prima.
Come indicato in precedenza, il paziente avverte solo l'applicazione del primo impulso e non avverte nessuno degli impulsi successivi del treno; per minimizzare il disturbo imposto ad un paziente, secondo una forma di realizzazione dell'invenzione, il primo impulso Pf (Figura 2b) del treno ha una ampiezza Al che è minore dell'ampiezza A2 degli impulsi successivi Ps del treno, per cui il primo impulso che attiva i muscoli (e che viene potenzialmente avvertito) sostanzialmente non induce dolore a causa dell'ampiezza trascurabile e gli impulsi seguenti (che non vengono avvertiti per effetto della loro distanza) hanno una ampiezza maggiore per ottenere una buona permeabilizzazione nel substrato.
Secondo una forma di realizzazione alternativa mostrata nella Figura 2c, il primo impulso Pf ha un fronte di salita in forma di rampa lineare nel campo da 0 volt fino all'ampiezza A2 e gli impulsi successivi Ps sono rettangolari e hanno ampiezza fissa A2.
Secondo la forma di realizzazione mostrata nella Figura 2d, il fronte di salita del primo impulso Pf viene gradualmente aumentato da una funzione diversa da una lineare, per esempio secondo una funzione esponenziale. Ulteriori impulsi Ps sono impulsi rettangolari aventi ampiezza fissa A2.
Secondo la forma di realizzazione mostrata nella Figura 2e, tutti gli impulsi Pf, Ps del treno hanno un fronte di salita che aumenta gradualmente in modo lineare oppure esponenziale da 0 fino all'ampiezza A2.
Le conoscenza acquisite dal Richiedente indicano che l'applicazione di impulsi con il campo di durata precedente e la frequenza di ripetizione precedente, permette una eccellente elettroporazione delle cellule e contemporaneamente non induce un potenziale di azione nei nervi e/oppure nei muscoli con ciascun impulso consecutivo di elettroporazione, per cui il paziente non avverte dolore addizionale e/oppure eccessivo e/oppure non avverte sensazioni sgradevoli, tranne la prima.
Ovviamente, al dispositivo descritto in precedenza si possono apportare cambiamenti senza, tuttavia, distaccarsi dal campo della presente invenzione.
Claims (16)
- R I V E N D I C A Z I O N I 1. Dispositivo per elettroporazione comprendente un mezzo (3) di generazione di impulsi collegabile (5) ad elettrodi (7, 8) applicabili ad un substrato (25) di un essere vivente comprendente cellule; detti elettrodi (7, 8) producendo, in detto substrato (35), un campo elettrico che induce permeabilizzazione delle membrane di dette cellule per facilitare l'introduzione di sostanze (30) nelle cellule, caratterizzato dal fatto che comprende un mezzo (12) di regolazione della frequenza progettato per pròdurre un treno di impulsi che sono distanziati fra di loro di un intervallo di tempo Tsp che è minore del periodo refrattario dei nervi e/oppure dei muscoli presenti nel substrato (25).
- 2. Dispositivo per elettroporazione secondo la rivendicazione 1, in cui il mezzo (12) di regolazione della frequenza controlla la frequenza di ripetizione Fr degli impulsi generati, per variare tale frequenza di ripetizione fra circa 1 KHz e 100 KHz.
- 3. Dispositivo per elettroporazione secondo la rivendicazione 1 oppure 2, in cui il mezzo (12) di regolazione della frequenza controlla la frequenza di ripetizione Fr degli impulsi generati, per variare tale frequenza di ripetizione fra circa 2 KHz e 25 KHz.
- 4. Dispositivo per elettroporazione secondo qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui il dispositivo comprende un mezzo (10) di regolazione dell'ampiezza di tempo progettato per controllare la durata Wth di ciascun impulso generato P(t); detta durata Wth essendo regolata fra circa 10 ps e 10 ms.
- 5. Dispositivo per elettroporazione secondo qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui il dispositivo comprende un mezzo (10) di regolazione dell'ampiezza di tempo progettato per controllare la durata Wth di ciascun impulso generato P(t); detta durata Wth essendo regolata fra circa 30 ps e 250 ps.
- 6. Dispositivo per elettroporazione secondo qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui il primo impulso Pf del treno ha una ampiezza A1 che è minore dell'ampiezza A2 degli impulsi successivi Ps .
- 7. Dispositivo per elettroporazione secondo qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui il primo impulso Pf del treno ha un fronte di salita che aumenta monotonicamente da 0 volt fino ad una ampiezza A2.
- 8. Metodo per elettroporazione comprendente le fasi di: - generare (3) un treno di impulsi elettrici; e - applicare (5) detto treno di detti impulsi elettrici ad un substrato di un essere vivente (25) comprendente cellule, per produrre, in detto substrato (25), un campo elettrico che induce permeabilizzazione delle membrane di dette cellule, per facilitare l'introduzione di una sostanza (30) nelle cellule; caratterizzato dal fatto che gli impulsi sono distanziati fra di loro di un intervallo di tempo Tsp che è minore del periodo refrattario dei nervi e/oppure dei muscoli presenti nel substrato (25).
- 9. Metodo per elettroporazione secondo la rivendicazione 8, in cui viene fornita la fase di controllare la frequenza di ripetizione Fr degli impulsi generati, per variare la frequenza di ripetizione fra circa 1 KHz e 100 KHz.
- 10. Metodo per elettroporazione secondo la rivendicazione 8 oppure 9, in cui viene fornita la fase di controllare la frequenza di ripetizione Fr degli impulsi generati, per variare la frequenza di ripetizione fra circa 2 KHz e 25 KHz.
- 11. Metodo per elettroporazione secondo la rivendicazione 8, in cui viene eseguita la fase di controllo della durata Wth di ciascun impulso generato P(t); detta durata essendo regolata fra circa 10 ps e 10 ras.
- 12. Metodo per elettroporazione secondo la rivendicazione 8, in cui viene eseguita la fase di controllo della durata Wth di ciascun impulso generato P(t); detta durata essendo regolata fra circa 30 ps e 250 ps.
- 13. Metodo per elettroporazione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 8 a 12, in cui il primo impulso Pf del treno ha una ampiezza Al che è minore dell'ampiezza A2 degli impulsi successivi Ps.
- 14. Metodo per elettroporazione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 8 a 13, in cui il primo impulso Pf del treno ha un fronte di salita che aumenta monofonicamente da 0 volt fino all'ampiezza A2.
- 15. Metodo per elettroporazione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 8 a 14, in cui detta sostanza comprende un composto organico scelto dalla serie comprendente: • un acido nucleico; • una molecola di DNA; • un oligonucleotide; • un agente citotossico; • una penicillina.
- 16. Dispositivo e metodo di elettroporazione sostanzialmente come descritto e illustrato con riferimento ai disegni allegati.
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