ITRM950149A1

ITRM950149A1 - Derivati poliossidrilati delle rifamicine ad attivita' antimicrobica e metodi per la loro preparazione.

Info

Publication number: ITRM950149A1
Application number: IT95RM000149A
Authority: IT
Inventors: Luciano Cellai
Original assignee: Consiglio Nazionale Ricerche
Priority date: 1995-03-10
Filing date: 1995-03-10
Publication date: 1996-09-10
Also published as: ITRM950149A0; IT1278050B1

Abstract

Nuovi derivati poliossidrilati delle rifamicine di formula generale (FORMULA I) in cui R1 rappresenta un atomo di ossigeno o un gruppo ossidrilico, le linee tratteggiate possono rappresentare o meno un secondo legame coerentemente con la valenza degli

Description

"Derivati poliossidrilati delle rifamicine ad attività antimicrobica e metodi per la loro preparazione"

La presente invenzione concerne nuovi derivati poliossidrilati delle rifamicine ad attività antimicrobica e i metodi per la loro preparazione. Più specificamente, l'invenzione riguarda derivati delle rifamicine S e SV aventi un gruppo poliossidrilato ciclico e/o lineare, come ad esempio un gruppo glicosidico, con gli ossidrili eventualmente protetti, collegato al nucleo aromatico in posizione 3 attraverso un gruppo bivalente che funge da braccio distanziatore.

Come è noto, le rifamicine sono una classe di antibiotici di origine naturale isolati nel 1957 da brodi di fermentazione del microorganismo Nocardia mediterranei, e successivamente anche da altri ceppi di Nocardia e di Streptomyces, caratterizzati, come in generale la più ampia classe delle ansamicine, dalla presenza di un nucleo aromatico cromoforico (naftochinonico o naftoidrochinonico per le rifamicine) abbracciato da un lungo ponte alifatico (l'ansa), che collega due punti non adiacenti del nucleo aromatico. Gli elementi più studiati della classe delle rifamicine sono rappresentabili con la formula generale:

in cui Ra rappresenta ossigeno 0 ossidrile, Rb rappresenta un gruppo - (rifamicina B), un radicale di 1 ,3-diossolan-4-one connesso in 2 direttamente sull'anello (rifamicina 0), un atomo di ossigeno (rifamicina S) o un gruppo ossidrilico (rifamicina SV) e le linee tratteggiate rappresentano eventuali legami addizionali, coerentemente con la valenza degli atomi di carbonio nelle posizioni 1-4.

Le rifamicine naturali si sono mostrate particolarmente attive contro i batteri gram-positivi ed i micobatteri e molto meno attive contro i batteri gram-negativi, ed hanno una farmacologia caratterizzata soprattutto da una considerevole eliminazione epatobiliare, con scarsa escrezione attraverso la via renale. È appunto per allargarne lo spettro d'azione, migliorarne le caratteristiche farmacologiche aumentandone la diffusione nei vari tessuti dell'organismo, oltre che per aumentarne l'emivita piasmatica, che nel corso degli anni sono stati studiati innumerevoli possibili derivati.

Le relazioni struttura-attività nelle rifamicine sono state definite in grande dettaglio e non sono mai state smentite o contraddette nell’ambito delle ricerche svolte negli ultimi trentanni; si è stabilito, tra l’altro, che esse esplicano la loro azione antibatterica inibendo in maniera altamente specifica e con grande affinità l'enzima batterico RNA polimerasi DNA-dipendente. L'interazione enzima-inibitore avviene tramite la formazione di legami non-covalenti tra i residui amminoacilici deH'enzima e le funzioni ossigenate legate ai carboni nelle posizioni 1, 8, 21 e 23 dell'antibiotico. Poiché è stato dimostrato che dette quattro funzioni ossigenate si protendono tutte dalla stessa parte della molecola, si sono quasi sempre sfruttate le posizioni 3 e/o 4 del nucleo cromoforico (che si trovano dalla parte opposta della molecola) per ottenere derivati, in modo che i sostituenti introdotti non interferiscano nell'interazione inibente con l'enzima.

Uno dei più diffusi derivati delle rifamicine, considerato a tutt'oggi il prodotto con le migliori caratteristiche terapeutiche, è la 3-{[4-metil-1-pìperazinil)immino]metil} rifamicina SV, nota con il nome di rifampicina (brevetto USA 3.342.810). Tale sostanza è particolarmente attiva contro i micobatteri, tanto da essere, in associazione con uno o due altri principi attivi, il farmaco d'elezione per la cura della tubercolosi, e si è rivelata, contrariamente alle rifamicine naturali, apprezzabilmente attiva anche contro i germi gram-negativi.

Composti strutturalmente simili alla rifampicina, che sono stati sviluppati successivamente sempre neil'ottica di realizzare prodotti con caratteristiche farmacologiche migliori, sono la rifapentina, in cui il metile terminale della catena in 3 della rifampicìna è sostituito da un ciclopentile (ad es., Cricchio, R. et al., Farm. Ed. Sci., 30, 605-619,’ 1975), varie 3-azinometifrifamicine, come ad esempio quelle descritte nei brevetti europei EP 119571 e EP 157444 e la 3-{N-piperidinometilazino)metilrifamicina SV (ad es., Della Bruna, C. et al., J. Antibiot., 38(6), 779-786, 1985).

Altri derivati delle rifamicine ad attività antibiotica e/o antitubercolare sono invece sostituiti nelle posizioni 3 e 4 con una struttura eterociclica. Tra questi, i più noti sono la rifabutina, appartenente al gruppo delle spiropiperidilrifamicine (ad es., Marsili et al., J. Antibiot., 34(8), 1033-1038, 1981) e attualmente in fase di sperimentazione contro le infezioni da micobatteri opportunisti associate all'AIDS, e la rifaximina, (brevetto USA 4.341.785), una piridoimidazorifamicina usata soprattutto come disinfettante intestinale.

La domanda di brevetto PCT pubblicata con il numero WO 87/02361 descrive un'altra famiglia di derivati delle rifamicine sostituiti in posizione 3, in cui un gruppo piperazinico è collegato direttamente al carbonio in posizione 3 del cromoforo ed è a sua volta legato, dalla parte opposta, ad un gruppo benzilico variamente sostituito. I composti oggetto della domanda citata sono rivendicati come antitubercolari e antibatterici, ma maggiore sviluppo hanno avuto successivamente altri derivati ad essi strutturalmente molto simili, indicati per l'uso come antiiperlipemici e antiipercolesterolemici (pubblicazioni europee EP 308568, EP 314041, EP 314041, EP 395580). In questi derivati il gruppo legato in posizione 3 è praticamente lo stesso, ma alterazioni della struttura della rifamicina in altre zone della molecola la rendono del tutto inattiva come antibiotico.

La presente invenzione si inserisce nell'ambito della ricerca sulle rifamicine con l'obiettivo di fornire nuovi derivati capaci di avere una farmacocinetica diversa da quella delle rifamicine note, che, per la particolare combinazione delle caratteristiche di solubilità in acqua e di idrofiiicità, li porti a distribuirsi preferenzialmente in organi, quali i reni e i polmoni, che vengono raggiunti in quota limitata dai derivati noti. L'introduzione nella molecola della rifamicina di più sostituenti ossidrilati proposta a tale scopo, oltre a consentire un particolare tropismo di organo, ha anche l'effetto vantaggioso di facilitare l'impiego di forme di somministrazione in soluzione acquosa, anche già pronte per l'uso, come preparati iniettabili e soluzioni orali o per uso topico.

Formano pertanto oggetto specifico della presente invenzione derivati delle rifamicine di formula

in cui R1 rappresenta un atomo di ossigeno o un gruppo ossidrilico, le linee tratteggiate possono rappresentare o meno un secondo legame coerentemente con la valenza degli atomi di carbonio nelle posizioni 1-4, di modo tale che la struttura risultante è o un nucleo naftochinonico o un nucleo naftoidrochinonico, R2 rappresenta idrogeno o acetile, Z è un gruppo distanziatore bivalente avente la sola funzione di collegare il gruppo R alla rifamicina, e R è un gruppo poliossidrilato ciclico e/o lineare, avente da 2 a 6 gruppi ossidrilici liberi o protetti.

L'uso di funzioni ossidriliche per accrescere la solubilità e regolare l'idrofilicità della molecola della rifamicina è particolarmente conveniente perché il loro stato è indipendente dal pH del mezzo. È peraltro noto che la presenza di gruppi carbossilici liberi porta a rifamicine (come la B) prive di attività antibatterica.

Preferibilmente R contiene un gruppo poliossidrilato aliciclico o eterociclico con anello a 3-9 termini, in modo specifico un gruppo glicosidico con radicali ossidrilici liberi o protetti. Come gruppi protettori si usano di preferenza gruppi acilici, i quali sono più facilmente idrolizzabili, ad esempio, dei gruppi eterei, i composti secondo la formula (I) contenenti gruppi ossidrilici protetti possono agire come tali oppure essere idrolizzati in vivo.

Come risulta dal significato di R2, il gruppo acetilico in posizione 25, presente nella struttura delle rifamicine naturali, può anche essere idrolizzato ad OH nei composti della presente invenzione; se da una parte ciò può comportare una lieve perdita di attività, dall'altra può essere utile in particolari casi in cui si desideri aumentare al massimo l'idrofilicità della molecola.

Esempi di gruppi poliossidrilati R adatti per i composti dell’invenzione sono: β-D-glucopiranosile, 2,3,4,6-tetra-O-acetil- β-D-glucopiranosile, α-D-arabinopiranosile, 2,3,4-tri-O-acetil-a-D-arabinopiranosile, D-glucaril-1 ,4-lattone, N-acetilmuramiie, (3R,4S,5R)-3,4,5-triidrossi-1-cicloesencarbonile (o scichimile), l'ultimo dei quali non è un gruppo glicosidico.

Il gruppo spaziatore Z è presente nella molecola essenzialmente per offrire una maggiore versatilità e facilità nell'operazione di introduzione del sostituente poliossidrilato. Infatti, risulta praticamente impossibile collegare un tale gruppo, e in particolare un glicoside, direttamente al carbonio in posizione 3 della rifamicina, evidentemente a causa di problemi sterici. Al contrario, la natura chimica del gruppo Z ha scarsa rilevanza ai fini dell'attività della molecola, ed eventuali suoi contributi al comportamento dei derivati nei confronti delle proprietà di ripartizione tra fasi, e quindi del comportamento farmacocinetico, sono da ritenere assolutamente equivalenti agii effetti ottenibili con la derivatizzazione (protezione) dei gruppi ossidrilici delta funzione poliossidrilata.

Secondo una specifica forma di realizzazione dell'invenzione, Z è un gruppo di formula

- (Π)

in cui:

Y è un eventuale gruppo di collegamento al nucleo aromatico, scelto

in cui:

m è compreso tra 0 e 6,

uno o più degli atomi di idrogeno delle catene alchilenìche possono essere sostituiti da atomi di alogeno, gruppi alchilici C1-4, gruppi fenilici, ossidrilici, alcossilici C1-2, alchil(Ci.2)amminid, aldeidici, dimetossimetilici.

Vantaggiosamente, come si vedrà nel seguito, Z è un gruppo come sopra definito in cui n è

scelto tra un legame ureidico , un legame tioureidico e un legame peptidico

Pertanto, composti preferiti secondo l'invenzione {le cui strutture sono mostrate più avanti negli esempi di sintesi) sono i seguenti:

3-[2'-N-(2",3,,,4,,,6"-tetra-0-acetiip-D-glucopiranosil)-tioureidil-etiltio] rifamicina SV;

3-[2,-N-(2",3",4",6"-tetra-0-acetil-3-D-glucopiranosil)-tioureidil-etiltio] rifamicina S;

3-[2'-N-(p-D-glucopiranosil)-tioureidil-etiltio]rifamicina S; 3-[2'-N-(P-D-glucopiranosil)-tioureidil-etiltio]-25-0-desacetil-nfamicina S;

3-[2’-N-(2",3”,4"-tri-0-acetil-a-D-arabinopiranosil)-tioureidil-etiltio] rifamicina SV;

3->[2'-N-(2",3",4"-tri-0-acetil-a-D-arabinopiranosil)-tioureidil-etiltio] rifamicina S;

3-[2'-N-(a-D-arabinopiranosil}-tioureidil-etiltio]rifamicina S;

3-[2'-N-{a-D-arabinopiranosi!)-tioureidil-etiltioJ-25-0-desacetil-rifamicina S;

a-p'-N-D-glucaro-ir.^'-lattoneJammidoletiitio-rifamicina SV.

La preparazione dei derivati di formula (I) può essere effettuata a partire da uno dei seguenti composti di partenza noti: rifamicina S, 3-clororifamicina S o SV, 3-bromorifamicina S o SV, 3-iodorifamicina S o SV, 3-formilrifamicina S o SV, 3-amminorifamicina S o SV, 3-carbossirifamicina S o SV, ai quali viene collegato il braccio distanziatore Z (o parte di esso) secondo tecniche di sintesi note e, successivamente, il gruppo poliossidrilato, con gli ossidrili eventualmente protetti, fornito di un adatto gruppo terminale di legame che andrà a costituire, dopo la sintesi, parte del braccio distanziatore Z.

Una via di sintesi preferita secondo l'invenzione utilizza come intermedio di partenza la 3-(2'-amminoetiltio)rifamicina SV di formula: (III)

Questo composto, originariamente sintetizzato neirambito delle prime ricerche su derivati attivi delle rifamicine naturali (Maggi, N. et al., Il Farmaco, 22(5), 307-315, 1967), è ottenuto secondo il metodo descritto in letteratura dalla reazione della rifamicina S con la βmercaptoetilammina. L'attacco dello zolfo avviene in modo selettivo sul carbonio in posizione 3, e si ottiene facilmente un prodotto univoco, con rese elevate; questo è poi isolato per semplice precipitazione. Tali caratteristiche, assieme al fatto di offrire un gruppo amminico primario disponibile per ogni tipo di reazione successiva, rendono la 3-(2’-amminoetiltio)rifamicina SV particolarmente utile come intermedio di sintesi per i prodotti dell'invenzione.

A partire dal composto di formula (IH) derivati secondo l'invenzione possono essere ottenuti secondo due diverse vie, a seconda della natura del gruppo terminale di collegamento portato dal gruppo poliossidrilato. Secondo un primo schema di sintesi, il composto di formula (III) viene fatto reagire con un composto di formula

(IV) in cui X rappresenta ossigeno (isocianato) o zolfo (isotiocianato) e R‘ è un gruppo R con i radicali ossidrilici protetti da gruppi acetilici. La reazione si fa avvenire in un solvente organico inerte, come ad esempio il tetraidrofurano, in presenza di un catalizzatore basico, come ad esempio la 4-dimetilamminopiridina, preferibilmente a temperatura ambiente, per un periodo di tempo che varia a seconda della natura dei reagenti, essendo di preferenza compreso, nel caso in cui il reagente di formula (IV) sia un isotiocianato, tra t ora e 72 ore. In modo specifico, con una quantità in eccesso di un reagente del tipo del glucopiranoside isocianato protetto con quattro gruppi acetilici la reazione può avvenire a temperatura ambiente in 1-3 ore, mentre con una quantità in eccesso di un reagente del tipo dell'arabinopiranoside isocianato protetto con tre gruppi acetilici fa reazione può avvenire, sempre a temperatura ambiente, in 48-72 ore.

Il composto di formula

così ottenuto è compreso nella classe di formula generale (I) e può essere il prodotto finale desiderato, oppure può essere sottoposto ad ulteriori trasformazioni per ottenerne altri prodotti di formula (I). Così, ad esempio, il composto di formula (V) può essere trattato con potassa alcolica, ad esempio in concentrazione 20mM, per liberare i gruppi ossidrilici del residuo R\ e il trattamento può essere protratto o realizzato in condizioni più drastiche per desacetilare anche il carbonio in posizione 25 della rifamicina.

In modo specifico, la desacetilazione parziale di un prodotto contenente il gruppo glucopiranosidico protetto viene realizzata alla temperatura di un bagno di ghiaccio in 45 minuti circa, e la desacetilazione del C(25) richiede un ulteriore trattamento, alle stesse condizioni, per altri 45 minuti circa, mentre la desacetilazione parziale di un prodotto contenente il gruppo arabinopiranosidico protetto reazione può avvenire a temperatura ambiente in circa 3 ore, e la sua desacetilazione totale richiede altre 24 ore circa.

In qualunque fase della via di sintesi sopra descritta i derivati possono essere ossidati alla corrispondente forma chinonica con ferricianuro di potassio, ad esempio utilizzando soluzioni di ferricianuro di potassio al 33%, a dare i corrispondenti derivati della rifamicina S. È anche possibile riportare i composti ossidati nella forma idrochinonica con acido ascorbico.

Il secondo schema di sintesi preferito comporta la reazione deH'intenmedio di partenza di formula (III) con un composto di formula R - COOH (VI) in cui R è un residuo poliossidrilato come definito nella formula (I), in un solvente organico inerte, come ad esempio il tetraidrofurano. Il gruppo carbossilico del composto di formula (Vi) viene preventivamente attivato, ad esempio con dicicloesilcarbodiimmide, e la reazione ha luogo in presenza di un catalizzatore basico, ad esempio la 4-dimetilamminopiridina.

Anche in questo caso i derivati ottenuti, di formula

possono essere ossidati alla forma chinonica corrispondente con ferricianuro di potassio.

I composti dell'invenzione sono recuperati dall'ambiente di reazione mediante tecniche note. Tali tecniche comprendono l'estrazione con un adatto solvente organico, quale ad esempio acetato di etile, cloroformio, cloruro di metilene e analoghi, o loro miscele, seguita da evaporazione a secchezza dell'estratto organico e dal riprendere il residuo ottenuto con un opportuno solvente, dal quale si separa il prodotto finale. Alternativamente, la miscela di reazione può essere direttamente evaporata a secchezza, e il residuo ottenuto ripreso a sua volta con un adatto solvente, dal quale si separa il prodotto finale.

La purificazione può essere effettuata sia per vìa cromatografica, su piastre preparative o su colonne di gel di silice, che per cristallizzazione da solventi. Solventi di cristallizzazione che possono essere vantaggiosamente impiegati sono scelti fra acqua, metanolo, etanolo, n-propanolo, isopropanolo, n-esano, acetato d'etile, cloroformio, cloruro di metilene, glicole etilenico monometiletere o loro miscele.

Come sarà più ampiamente mostrato nel seguito, i composti secondo l'invenzione sono farmacologicamente attivi come antibatterici, e pertanto l'invenzione concerne anche l'uso di tali composti come principi ativi in preparazioni farmaceutiche, specificamente ad azione antimicrobica, e le formulazioni farmaceutiche contenenti come ingredienti attivi uno o più dei composti dell'invenzione. L'invenzione comprende inoltre l'uso dei composti di formula (I) per la preparazione di composizioni farmaceutiche.

I composti dell'invenzione possono essere somministrati in modi diversi, ad esempio per via orale, topica o intramuscolare. Per tali somministrazioni le sostanze vengono incorporate in formulazioni farmaceutiche convenzionali, che contengono, insieme al principio attivo, additivi usuali quali, ad esempio, agenti dolcificanti, aromatizzanti, coloranti, ricoprenti e conservanti, diluenti inerti come carbonato di calcio, carbonato di sodio, lattosio e talco, agenti leganti come amido, gelatina e polivinilpirrolidone, agenti sospendenti come metìlcellutosa o idrossietilcellulosa e agenti inibenti quali lecitina, poliossietilenstearato e poliossimetilensorbitan-monoleato, agenti riducenti come acido ascorbico e suoi sali. Le formulazioni per uso topico e intramuscolari possono anche contenere il principio attivodisciolto o sospeso in acqua distillata, in unione con i comuni eccipienti farmaceuticamente accettabili.

La presente invenzione viene descritta nel seguito, a titolo esemplificativo e non limitativo, con riferimento ad alcune sue forme di specifiche di realizzazione.

Negli esempi di sintesi che seguono, gli spettri U.V sono stati eseguiti su soluzioni acquose usando un apparecchio Varian DMS-90; si riportano i valori dei massimi di assorbenza e dei corrispondenti coefficienti di estinzione molare. Gli spettri 1H-NMR e 13C-NMR monodimensionali e bidimensionali, omo- ed eterocorrelati sono stati effettuati con apparecchio Bruker a 600 MHz, in solventi deuterati. I valori delle risonanze sono riportati in ppm relativamente al tetrameri silano preso uguale a zero. I picchi non assegnati sono indicati con n.a.. Infine, gli spettri di massa sono stati determinati col metodo di iniezione di electron-spray. I dati riportati sono in accordo con le strutture proposte.

ESEMPIO 1

A 2,5g (6,4mmoli) di 2,3,4,6-tetra-0-acetil-p-D-glucopiranoside isotiocianato, sciolti in 20mi di tetraidrofurano anidro, vengono aggiunti 0,5g (0,65 mmoli) di S-fé'-amminoetiltioJrifamicina SV, ottenuta come descritto nella letteratura già citata (Maggi, N. et al., Il Farmaco, 22(5), 307-315, 1967), sciolti in 60ml di tetraidrofurano anidro. Si aggiungono inoltre 100 mg di 4-dimetilamminopiridina. La reazione è condotta sotto agitazione, a temperatura ambiente, ed è completa dopo due ore. Si evapora il solvente sotto vuoto ottenendo un residuo solido che viene disciolto, e viene cromatografato su colonna di gel di silice 0,06-0,20 eluendo con una miscela di cloroformio-metanolo 8:2 - 7:3. Si isolano 0,7 g di prodotto con una resa del 93%.

Spettro U.V.: 445 (4.02), 317 (4.25), 273 (4.43).

Spettro di massa: picco molecolare 1162.

ESEMPIO 2

Si sciolgono 0,5g di

glucopiranosil)-tioureidil-etiltio] rifamicina SV in acetato di etile e si sottopongono ad ossidazione per dibattimento con una soluzione acquosa di ferricianuro di potassio al 33%. La fase organica viene separata, seccata su solfato di sodio anidro, filtrata ed evaporata. Il residuo viene cromatografato su colonna di gel di silice 0,04-0,06 eluendo con una miscela di cloroformio-metanolo 9:1. Si isolano 0,45g di prodotto con una resa del 90%.

Spetro U.V.: 425 (3,58), 316 (4,08), 243 (4,30).

Spettro di massa: picco molecolare 1160.

A 0,4g (0,35nmoli) di 3-[2,-N-(2",3H,4,,,6”-tetra-0-acetil-5-pglucopiranosil)-tioureidii-etiltio]rifamicina S si aggiungono 60 mi di KOH metanolica 20mM, alla temperatura di un bagno di ghiaccio. Si lascia sotto agitazione per 45 minuti, sempre mantenendo la temperatura attorno a 0°C. Si neutralizza con una soluzione acquosa di acido citrico e si evaporano i solventi sotto vuoto. Si ridiscioglie il residuo in cloroformio e si lava la soluzione cloroformica con soluzione acquosa satura di cloruro di sodio. Si secca la fase cloroformica con solfato di sodio anidro, la si filtra e si evapora il solvente sotto vuoto. Il residuo viene cromatografato su colonna di gel di silice 0,06-0,20 eluendo con un gradiente di una miscela di cloroformio-metanolo da 85: 15 a 8020. Si ottengono 0,2 g di prodotto puro pari ad una resa del 58%.

Spettro U.V.: 523 (3,54), 450 (3,60) 371 (3,58), 325 (4,42), 245 (4,53).

Spettro di massa: picco molecolare 992.

glucopiranosil)-tioureidil-etiltio] rifamicina S, sciolti in 15 mi di etanolo assoluto, vengono aggiunti 50 mi di KOH etanolica al 20%, alla temperatura di un bagno a ghiaccio. Si fascia sotto agitazione per 45 minuti, sempre mantenendo la temperatura attorno a 0°C, poi si neutralizza con una soluzione acquosa di acido citrico e si estrae con cloroformio. Gli estratti cloroformici riuniti vengono lavati con una soluzione acquosa satura di cloruro di sodio, seccati su solfato di sodio anidro, filtrati ed evaporati sotto vuoto. Si ottiene un residuo solido che viene cromatografato su colonna di gel di silice 0,06-0,20 eluendo con una miscela di cloroformio-metanolo 8:2. Si isolano 0,1 5g di prodotto puro con una resa pari al 37%.

Spettro U.V.: 534 (3,56), 380 (3,55), 330 (4,40), 250 (4,60).

Ad 1,0g (1 ,3 mmoli) di 3-(2-aminoetiltio)rifamicina SV, sciolti in 20 mi di tetraidrofurano anidro, si aggiungono 1,0g (3, Immoli) di 2,3,4-tri-O-acetil-a-D-arabinopiranosil isotiocianato, sciolti in 2ml di tetraidrofurano anidro, e 20 mg di 4-dimetilamminopiridina. La reazione è condotta sotto agitazione, a temperatura ambiente, per 72 ore. Si evapora il solvente sotto vuoto, ottenendo un residuo solido che viene disciolto e cromatografato su colonna di gel di silice 0,04 - 0,06 eluendo con una miscela di cloroformio-metanolo 8:2. Si isolano 0,3g di prodotto con una resa del 22%.

Spettro U.V.: 450 (3,97), 318 (4,08).

Spettro di massa: picco molecolare 1088.

ESEMPIO 6

3-f2'-N-(2".3n.4,,-tri-0-acetil-a-D-arabinopiranosih-tioùreidil-etiltiol rtfamicina S

piranosil)-tioureidil-etiltio]rifamicina S V in acetato di etile e si sottopongono ad ossidazione per dibattimento con una soluzione acquosa di ferricianuro di potassio al 33%. La fase organica viene separata, seccata su solfato di sodio anidro, filtrata ed evaporata. (I residuo viene cromatografato su colonna di gel di silice 0,06 - 0,20 eluendo con una miscela di cloroformio-metanolo 9:1. Si isolano 0,45g di prodotto con una resa del 90%.

Spettro U.V.: 443 (3,74) 318 (4,08).

Scetro di massa: picco molecolare 1086.

ESEMPIO 7

A 0,4g (0,37 nmoli) di 3-[2,-N-(2,,I3"14,,-tri-0-acetil-a-D-arabinopiranosil)-tioureidil-etiltio]rifamicina SV si aggiungono 30 mi di KOH metanolica 20mM, a temperatura ambiente. Si lascia sotto agitazione per 3 ore e poi si neutralizza con un leggero eccesso di acido citrico. Si dibatte con acetato di etile, che viene poi separato e dibattuto con una soluzione acquosa di ferricianuro di potassio al 33%. La fase organica viene separata, seccata su solfato di sodio anidro, filtrata ed evaporata. Si ridiscioglie it residuo e lo si cromatografa su colonna di gel di silice 0,04 - 0,06 eluendo con una miscela di cloroformio-metanolo 8 2. Si isolano 0, 1g dr prodotto con una resa del 30%.

Spettro U.V.: 440 (3,45), 368 (3,58), 320 (4,04).

Spettro di massa: picco molecolare 960 (M-2).

Spettro NMR in D-,Q-DMSO-DR:9:1: C(13) 1,56; C(14) n.a.; C(17) 6,32; C(18) 6,51; C(19) 6,06; C(20) 2,25; C(21) 3,65; C(22) 1,32; C(23)

ESEMPIO 8

3-r2,-N-fa-D-arabinoDiranosilVtioureidil-etiltiol-25-Q-desacetil rifamicina S.

arabinopiranosil)-tioureidii-etiltio]rifamicina SV si aggiungono 30 mi di KOH metanolica 20mM, a temperatura ambiente. Si lascia sotto agitazione per 24 ore e poi si neutralizza con un leggero eccesso di acido citrico. Sì dibatte con acetato di etile, che viene poi separato e dibattuto con una soluzione acquosa di fenricianuro di potassio al 33%. La fase organica viene separata, seccata su solfato di sodio anidro, filtrata ed evaporata. Si ridiscioglie il residuo e lo si cromatografa su colonna di gel di silice 0,04 - 0,06 eluendo con una miscela di cloroformio-metanolo 8:2. Si isolano 0,1g di prodotto con una resa del

Ad 1g (5,2 mmoli) di acido D-glucarico-1 ,4-lattone monoidrato, sciolto in 30 mi di tetraidrofurano anidro, vengono aggiunti sotto agitazione, alla temperatura di 0 °C, 2g (10 mmoli) di dicicloesilcarbodiimmide, sciolti in 20 mi di tetraidrofurano anidro. Dopo 30 minuti si aggiungono 1g di 3-(2'-aminoetiltio) rifamicina SV, sciolto in 20 mi di tetraidrofurano anidro, e 30 mg di 4-dimetilamminopiridina.

Dopo 12 ore si filtra e si elimina il solvente sotto vuoto. Il residuo solido viene sciolto in acetato di etile. La soluzione è lavata con una soluzione satura di cloruro di sodio, seccata su solfato di sodio anidro, filtrata ed evaporata, e il residuo solido viene ridisciolto e cromatoqrafato su colonna di qel di silice 0,06 - 0,20 eluendo con una miscela di cloroformio-metanolo 8:2. Si ottengono 0,6g di prodotto, con una resa del 49%.

Spettro U.V.: 450 (3.58) 320 (3.95).

Spettro di massa: picco molecolare 947 (M+1 ).

Caratterizzazione dei composti deali esempi 1-9

In composti di cui agli esempi precedenti, denominati nel

seguito con il numero dell'esempio che ne descrive la sintesi, sono stati

sottoposti ad una serie di determinazioni sperimentali per saggiarne

l'applicabilità come sostanze ad azione terapeutica.

La solubilità in acqua, riportata nella seguente tabella 1 in

confronto con quella della rifampicina, è stata determinata su soluzioni

sature acquose, in base a misure spettrofotometriche U.V.

TABELLA 1

Solubilità in acqua

Composto g/l moli/l

1 2,06 1 ,78 10'3

2 n.d. n.d.

3 4,87 4,91 IO-3

4 10,90 1 ,15 10‘2

5 6,17 5,67 10-3

6 1,72 1,58 10^

7 4,86 5,06 10o

8 4,12 4,48 10-3

9 6,72 7,10 10-3

rifampicina 1,16 1,41 10"3

n.d.: non determinata

I dati che precedono mostrano come i composti dell'invenzione

siano significativamente più solubili della rifampicina, soprattutto se si considerano i valori in termini di moli/l, che sono quelli rilevanti dal

punto di vista dell'attività. La migliorata solubilità in acqua dei prodotti dell’invenzione consente, in primo luogo, una maggiore versatilità nella

scelta della via di somministrazione, rendendo utilizzabili o più convenienti forme farmaceutiche in soluzione acquosa, come preparati

iniettabili e soluzioni pronte per uso orale o topico.

Al fine di ottenere un indice della idrofilicità relativa dei nuovi

composti, sia tra di loro che nei confronti della rifampicina, se ne è va¬

lutato il coefficiente di ripartizione tra fasi, attraverso una misura del

parametro RM secondo il metodo di Biagi lievemente modificato (Biagi,

G.L. et al., J. Chromatogr., 41, 371, 1969). In pratica, si è effettuata

una cromatografia su strato sottile di gel di silice modificata dei tipo C-18, eluendo con una miscela al 50% di acetonitrile e tampone fosfato

100mM, pH 7,0. Si sono quindi ricavati i valori di RM secondo la formula

RM = log(1/Rf - 1) 1 valori cosi ricavati sono riportati nella seguente

tabella 2.

TABELLA 2

Misure di idrofilicità

Composto_ RM

1 0,466

2 1,273

3 0,237

4 -0,088

5 0,322

6 1,273

7 0,373

8 0,01 1

9 -0,100

rifampicina 0,546

Dal momento che è sperimentalmente dimostrato che la rifampicina è bene assorbita a livello cellulare, e l'assorbimento delle sostanze in questione nelle cellule batteriche avviene per valori di idrofilicità compresi entro campi delimitati, si ritiene che per esplicare la massima attività i composti in studio dovranno avere idrofilicità quanto più possibile simile a quella della rifampicina, mentre valori troppo bassi di tale parametro (ad esempio, negativi), corrispondenti ad un' idrofilicità eccessiva, portano a derivati meno attivi.

L'attività antimicrobica dei composti dell'invenzione è stata determinata in vitro secondo metodi standard, sui ceppi batterici comunemente usati per fa caratterizzazione degli antibiotici e utilizzando, secondo la prassi, la rifampicina quale miglior composto noto di confronto. Come già notato, quest'ultimo prodotto si distingue dalle precedenti rifamicine per essere attivo non solo sui batteri grampositivi e sui micobatteri, ma anche sui gram-negativi. Come ulteriori composti di riferimento sono stati usati la penicillina G, attiva solo su alcune specie di batteri gram-positivi ma non su altre, né sui gramnegativi, e la rifabutina, che è, come già notato, il farmaco d'eiezione contro il Mvcobacterium tuberculosis. I risultati di alcune di tali sperimentazioni sono riportati nel seguito.

I dati riportati nella seguente tabella 3 sono stati ottenuti con il metodo della diffusione in agar. L'inoculo era costituito da 0,1 mi di una coltura di microorganismo sviluppata per 18 ore e diluita 1:10. I campioni in esame sono stati sciolti in brodo (BHI) ad una concentrazione 5 volte superiore a quella massima da valutare e quindi diluiti con lo stesso mezzo per ottenere le varie concentrazioni inferiori. I brodi inoculati sono stati incubati a 30 °C per 24 ore e poi esaminati per valutare la crescita del microorganismo. I valori riportati rappresentano la concentrazione minima inibente la crescita del microorganismo (MIC), in pg di sostanza per mi di terreno di coltura.

I microorganismi considerati nella tabella sono due grampositivi, il Bacillus cereus (ceppo NCIMB 50014) e il Micrococcus luteus (ceppo ATCC 9341), e un gram-positivo, l'Escherichia coli (ceppo NCIMB 50034).

TABELLA 3

Attività in vitro - Saggio di diffusione su agar Composto MIC, pg/ml

Bacillus cereus Micrococcus Escherichia coli luteus

1 5-10 1-5 > 80

2 5-10 1-5 > 80

3 10-20 5-10 > 80

4 80 20-40 > 80

5 40-80 5-10 > 80

6 10-20 1-5 > 80

7 40-80 5-10 > 80

8 80 20-40 > 80

9 20-40 20-40 > 80 rifampicina 1 -5 1-5 20 peniceli ina G > 80 5-10 > 80

I dati riportati nella tabella che segue sono stati invece ottenuti saggiando il potere inibente dei derivati rifamicinici su brodocolture di stipiti batterici da collezione, sistematicamente portate a concentrazioni di 105 cellule/ml. Quantità variabili dei composti in esame sono state sciolte in 1 mi di dimetilsolfossido e successivamente diluite in acqua distillata, in modo tale da portare i diversi composti alla stessa serie di

concentrazioni. Le colture batteriche sono state incubate in presenza

dei composti per 18 ore a 37 °C, e sono state quindi effettuate le

valutazioni delle MIC.

I microorganismi considerati nella tabella 4, entrambi gram-

positivi, sono lo Staphylococcus aureus (ceppo ATCC 25293) e lo

Staphylococcus epidermidis (ceppo ATCC 12228).

TABELLA 4

Attività in vitro - Saggio con brodocolture

Composto MIC, pg/ml

Staphylococcus Staphylococcus aureus

1 2 0,125

3 1 0,062

4 4 0,250

5 4 0,250

7 1 0,031

9 8 0,500 rifampicina 0,031 0,031

Dall'esame dei dati riportati nelle tabelle 3 e 4 si può osservare

come in alcuni casi i derivati presentino lo stesso livello di attività della

rifampicina. È anche interessante osservare come vi sia un certo

parallelismo nei livelli di attività mostrati dai nuovi derivati nei confronti

dei diversi tipi di microorganismi, anche se ciascun microorganismo

presenta una propria sensibilità a questi composti.

Allo scopo di verificare l’attività dei composti nei confronti dei

micobatteri sono state effettuate colture di Mvcobatterium tuberculosis e Mvcobatterium avium in mezzo liquido (Dubos) e da queste sono

state preparate sospensioni contenenti i microorganismi in

concentrazioni di 1 mg/mi. Le sospensioni sono state diluite 10 volte

con acqua distillata sterile e aliquote di 0,05 mi della sospensione risultante sono state inoculate in brodo di coltura (BHI), a cui erano

aggiunte concentrazioni variabili dei composti in esame. Le colture erano incubate a 30 °C per 24 ore. La tabella 5 che segue mostra

alcuni dati ottenuti.

TABELLA 5

Attività su micobatteri

Composto_ MIC, pg/ml

Mvcobatterium Mvcobatterium avium _ tuberculosis _

2 > 10 > 10 3 > 10 > 10 4 > 10 > 10 rifampicina 1-10 1-10 rifabutina 1 1

I dati che precedono mostrano un altro aspetto vantaggioso dei composti dell’invenzione, consistente nella pressoché totale inattività nei confronti dei micobatteri. È infatti noto che l'uso delle rifamicine come antibiotici può selezionare numerosi ceppi resistenti: nel caso dei prodotti dell'invenzione si può con ritenere che il loro uso nella terapia di infezioni da batteri gram-positivi non comporta il rischio di insorgenza di ceppi di micobatteri resistenti.

La presente invenzione è stata descritta con riferimento particolare ad alcune sue forme di realizzazione specifiche, ma è da intendersi che variazioni e modifiche potranno essere ad essa apportate dagli esperti nel ramo senza per questo uscire dal relativo ambito di protezione.

Claims

RIVENDICAZIONI 1. Derivati delle rifamicine di formula (D in cui R1 rappresenta un atomo di ossigeno o un gruppo ossidrilico, le linee tratteggiate possono rappresentare o meno un secondo legame, coerentemente con la valenza degli atomi di carbonio nelle posizioni 1 -4, R2 rappresenta idrogeno o acetile, Z è un gruppo distanziatore bivalente, e R è un gruppo poliossidrilato ciclico e/o lineare, avente da 2 a 6 gruppi ossidritici liberi o protetti.
2. Composti secondo la rivendicazione 1 , in cui R contiene un gruppo poliossidrilato aliciclico o eterociclico con anello a 3-9 termini, avente da 2 a 6 gruppi ossidritici liberi o protetti ed eventualmente altri sostituenti.
3. Composti secondo la rivendicazione 2 in cui R è un gruppo glicosidico con gruppi ossidritici liberi o protetti.
4. Composti secondo la rivendicazione 2 in cui R è scelto tra i seguenti gruppi: β-D-glucopiranosile, 2,3,4,6-tetra-0-acetil-p-D-glucopiranosile, α-D-arabinopiranosile, 2,3,4-tri-O-acetil-a-D-arabinopiranosile, D-glucaril-1 ,4-lattone, N-acetilmuramile, (3R,4S,5R)-3,4,5-triidrossi-1-cicloesencarbonile (o scichimile).
5. Composti secondo ognuna delle rivendicazioni 1-4 in cui Z è un gruppo di formula (Π) in cui: Y è un eventuale gruppo di collegamento al nucleo aromatico, scelto n è 0 o 1, in cui: m è compreso tra 0 e 6, uno o più degli atomi di idrogeno delle catene alchileniche pos¬ sono essere sostituiti da atomi di alogeno, gruppi alchilici gruppi fenilici, ossidrilici, alcossilici aldeidìci, dimetossimetilici.
6. Composti secondo la rivendicazione 5 in cui n é 0 e Z è 6. Composti secondo la rivendicazione 1, corrispondenti ai nomi: -g!ucopiranosil)-tioureidii-etiltio] rifamicina SV; -O-acetil-p-D-glucopiranosiO-tioureidil-etiltio] rifamicina S; 9. Processo per la preparazione di composti secondo la rivendicazione 6, comprendente le fasi di: a) far reagire la 3-(2'-amminoetìltio)rifamicina SV di formula: (III) con un composto di formula (IV) in cui X rappresenta ossigeno o zolfo e R' è un gruppo R come precentemente definito con i radicali ossidrilici protetti da gruppi acetifici, in un solvente organico inerte e in presenza di un catalizzatore basico a dare un composto di formula (V) b) opzionalmente trattare il composto di formula (V) ottenuto dalla fase precedente con potassa alcolica per desacetilario parzialmente a dare il corrispondente composto di formula in cui R" è un gruppo R come precentemente definito con i radicali ossidrilici liberi; c) opzionalmente trattare il composto di formula (Vili) ottenuto dalla fase precedente con potassa alcolica per desacetilario totalmente a dare il corrispondente composto di formula in cui R" è un gruppo come sopra definito. 10. Processo secondo la rivendicazione 9 comprendente inoltre la fase di: d) ossidare il composto di formula (V), (Vili) o (IX) risultante rispettivamente dalla fase a), b), o c) alla corrispondente forma chinonica, mediante trattamento con ferricianuro di potassio, a dare i corrispondenti derivati della rifamicina S. 11. Processo per la preparazione di composti secondo la rivendicazione 7, comprendente la fase di: a')far reagire la 3-(2'-amminoeti[tio)rifamicina SV di formula: (III) con un composto di formula (VI) in cui R è un residuo poliossidrilato come definito nella formula (I), il cui gruppo carbossilico è stato preventivamente attivato, in un solvente organico inerte e in presenza di un catalizzatore basico, a dare un composto di formula (νπ) 13 12. Processo secondo la rivendicazione 11 comprendente inoltre la fase di: b'jossidare il composto di formula (VII) risultante dalla fase a'), alla corrispondente forma chinonica, mediante trattamento con ferricianuro di potassio, a dare il corrispondente derivato della rifamicina S. 14. Formulazioni farmaceutiche contenenti come ingredienti attivi uno o più dei composti secondo le rivendicazioni 1-8, in unione con uno o più veicoli farmaceuticamente accettabili. 15. Composti secondo le rivendicazioni 1-8 per l’uso come sostanze farmaceutiche. 16. Composti secondo le rivendicazioni 1-8 per l'uso come sostanze ad azione antimicrobica. 17. Uso dei composti secondo le rivendicazioni 1-8 per la preparazione di composizioni farmaceutiche. 18. Uso dei composti secondo le rivendicazioni 1-8 per la preparazione di composizioni farmaceutiche ad azione antimicrobica. 19. Derivati poliossidrilati delle rifamicine, metodi per la loro preparazione, composizioni che li c ontengono e loro uso secondo le rivendicazioni 1-18, sostanzialmente come in precedenza illustrato e descritto.