ITRM20100524A1 - Composizione comprendente un larvicida fotoattivabile - Google Patents

Description

Composizione comprendente un larvicida fotoattivabile

DESCRIZIONE

Campo tecnico

La presente invenzione si riferisce al campo degli insetticidi e, più in particolare, a una composizione comprendente un larvicida fotoattivabile e un vettore idoneo, quest’ultimo consentendo al larvicida di essere ingerito dalle larve, e a un procedimento per il controllo delle larve di zanzara usando detto larvicida fotoattivabile come integratore alimentare da applicare nell’ambiente in cui le larve si sviluppano.

Arte antecedente

Il modello strategico per il controllo dei vettori di patologie trasmesse dalle zanzare, come ad es. malaria, dengue, virus del Nilo occidentale, febbre gialla, filariosi, Ã ̈ attualmente rappresentato dalla gestione integrata dei vettori, IVM (OMS, Global strategic framework for integrated vector management, 2004), un approccio che richiede una scelta di misure basata su prove ed economicamente vantaggiosa tra tutti i procedimenti di controllo dei possibili vettori delle patologie.

La strategia IVM include la possibilità di usare larvicidi chimici per controllare le zanzare vettori di patologie.

Gli insetticidi attualmente usati per l’uccisione delle larve di zanzara sono mostrati nella seguente tabella 1 (OMS, Pesticides and their application for the control of vectors and pests of public health importance, 2006).

Tabella 1

I composti e le formulazioni raccomandati dall’OMS per il controllo di larve di zanzara

<Dosaggio>Classificazione di Insetticida Tipo chimicodi ai (g/ha)Formulazione pericolo secondo l’OMS di ai<a>

Olio<- b>

combustibile Soluzione -B. thuringiensis

isbiopesticidacgranulo

israelensidrodisperdibile -diflubenzurone IGR 25–100 polvere bagnabile U

metoprene IGR 20–40<concentrato>

emulsionabileU

novaluron IGR 10–100<concentrato>

emulsionabileNA

piriprossifen IGR 5–10 Granuli U

clorpirifos organofosfato 11–25<concentrato>

emulsionabileII

concentrato

fention organofosfato 22–112 emulsionabile, II

granuli

pirimfos-metil organofosfato 50–500<concentrato>

emulsionabileIII

concentrato

temefos organofosfato 56–112 emulsionabile, U

granuli

In cui ai significa ingrediente attivo; IGR significa regolatore di crescita dell’insetto;

<a>ha i seguenti significati: classe II significa moderatamente pericoloso; classe III significa leggermente pericoloso; classe U significa che à ̈ improbabile che sia causa di pericolo acuto nell’uso normale; NA significa informazioni non disponibili;

<b>significa che il dosaggio dell’ingrediente attivo à ̈ 142–190 litro/ha o 19–47 litro/ha, se à ̈ addizionato un agente di distribuzione;

<c>significa che il dosaggio dell’ingrediente attivo à ̈ 125–750 g di prodotto formulato per ettaro (corpi idrici aperti), o 1–5 mg/l (contenitori artificiali).

Esempi di larvicidi chimici sono descritti nei brevetti europei N. 0005912 N.

0265087.

I vantaggi dei larvicidi chimici attualmente usati sono l’azione di uccisione rapida, l’attività residua relativamente lunga, e il vantaggio economico. Gli svantaggi dei larvicidi chimici attualmente usati sono: rischi di sicurezza per gli esseri umani e per l’ambiente, effetti avversi sui biota non bersaglio (target), rischio di indurre una resistenza nelle popolazioni di insetti bersaglio (target), consistente inquinamento di vari ambienti.

Negli ultimi anni, l’uso di insetticidi batterici come il Bacillus thuringiensis var. israelensis (Bti) e B. sphaericus (Bs), e di regolatori di crescita dell’insetto (IGR) ha acquisito rilievo rispetto ai composti organofosfati, in risposta alla richiesta di composti più sicuri e/o più specifici per l’animale nocivo. Bti e Bs producono una tossina peptidica che, in seguito ad ingestione, crea dei pori nella membrana delle cellule epiteliali che rivestono il tratto gastrointestinale della larva, portando a un danno irreversibile dei tessuti intestinali e alla morte delle larve.

Tali tossine batteriche sono considerevolmente selettive per le larve di zanzara, pertanto sono sicure per i vertebrati e gli artropodi non bersaglio (target), benché le formulazioni più comuni non siano molto persistenti e siano necessari frequenti trattamenti successivi.

Esempi di insetticidi batterici sono descritti nel brevetto europeo N.1367898.

I regolatori di crescita dell’insetto (IGR) come metoprene e piriprossifen sono analoghi dell’ormone giovanile (juvenoidi) che interferiscono con la metamorfosi delle larve in pupe e adulti, mentre i composti come triflumuron e novaluron sono inibitori della sintesi della chitina che bloccano la formazione della cuticola ad ogni muta.

Gli juvenoidi agiscono al termine dello sviluppo larvale (pupazione e trasformazione in adulto), quindi sono in generale meno efficaci contro le popolazioni larvali di tutti gli stadi che solitamente si riscontrano nei siti dei focolai di sviluppo naturali. D’altra parte, gli inibitori della sintesi della chitina, che agiscono ad ogni muta, sono ugualmente efficaci contro popolazioni larvali sincrone e asincrone. In generale, i regolatori di crescita dell’insetto (IGR) esibiscono una buona attività residua e hanno un elevato margine di sicurezza per i vertebrati, benché abbiano un effetto avverso su alcune specie di artropodi non bersaglio (target) che condividono i medesimi habitat delle larve di zanzara, e non dovrebbero essere usati nei focolai di sviluppo con abbondanza di specie di artropodi.

I processi fotosensibilizzati nei sistemi biologici sono noti da moltissimo tempo (Raab, Zeit. Biol.39: 524-546, 1900; Moan e Peng, Anticancer Res.23: 3591-3600, 2003). Tali processi sono normalmente di natura ossidativa, dal momento che coinvolgono una specie altamente reattiva di ossigeno, chiamata ossigeno singoletto (<1>O2), come intermedio biotossico. L’ossigeno singoletto à ̈ generato mediante un trasferimento dell’energia degli elettroni dal sensibilizzatore fotoeccitato (normalmente, il suo stato di tripletto a lunga stabilità). La sequenza di stadi fotofisici e fotochimici può essere presentata schematicamente come segue:

Sens hÎ1⁄2 →<1>Sens promozione di Sens al primo stato di singoletto eccitato

<1>Sens →<3>Sens intersistema che incrocia lo stato di tripletto

<3>Sens O2→ Sens<1>O2generazione di ossigeno singoletto tramite trasferimento di energia

<1>O2+ Sub → Sub-ox attacco ossidativo

In cui Sens significa un agente fotosensibilizzante che assorbe luce visibile.

In generale, i processi fotosensibilizzati sono caratterizzati da un’elevata selettività nel tempo e nello spazio: la breve durata (nell’intervallo dei microsecondi) e l’elevata reattività dell’ossigeno singoletto, che può attaccare un gran numero di costituenti cellulari, limitano il danno fotoossidativo e al microambiente del sito ove à ̈ generato. La via media dell’ossigeno singoletto in una cellula o un tessuto à ̈ stata calcolata come inferiore a circa 0,1 Î1⁄4m (Moan e Peng, 2003).

I processi fotosensibilizzati stanno trovando applicazioni molto interessanti in medicina: un tipico esempio à ̈ rappresentato dalla terapia fotodinamica (PDT), che à ̈ stata inizialmente sviluppata per il trattamento dei tumori solidi (Dougherty et al., J. Natl. Cancer Inst. 90: 889-905, 1998), ma che viene ora estesa con successo al trattamento di varie patologie non oncologiche, in particolare questa tecnica sembra essere promettente per il trattamento di un certo numero di patologie infettive di origine microbica (Jori et al., Lasers Surg. Med.38: 468-481, 2006).

Le porfirine sono in grado di assorbire sostanzialmente tutte le lunghezze d’onda dello spettro solare nell’intervallo dell’UV e del visibile. In particolare, le porfirine esibiscono una banda di assorbimento intensa (la banda Soret) nella regione spettrale del blu, che rappresenta il componente più intenso dell’emissione solare del mezzogiorno (Svaasand et al., Proc. SPIE 1203, pp. 2–21, 1990). D’altra parte, le bande di assorbimento del rosso delle porfirine sono utili all’alba e al tramonto, quando le lunghezze d’onda più lunghe di 600 nm rappresentano una componente importante della luce solare.

Varie porfirine danno stati di tripletto a lunga durata, con un’elevata resa quantica >0,7 e pertanto sono fotosensibilizzanti piuttosto efficaci. Di norma, lo stato di tripletto delle porfirine à ̈ efficacemente smorzato dall'ossigeno. Quindi le porfirine causano tipicamente l’inattivazione delle cellule attraverso la generazione di ossigeno singoletto, benché possano essere coinvolti anche processi di trasferimento di radicali (Reddi e Jori, Int. J. Biochem. 25: 1369–1375, 1993). Questa circostanza accresce la portata e il potenziale delle porfirine come fotosensibilizzanti, dal momento che esse presentano anche un'elevata fotoattività nei sistemi biologici anche quando tali sistemi sono caratterizzati da una bassa pressione di ossigeno.

La struttura chimica delle porfirine può essere modificata a vari livelli, inclusi (i) i sostituenti sporgenti dalle posizioni periferiche degli anelli pirrolici o degli atomi di carbonio meso, (ii) gli ioni metallici magari coordinati al centro del macrociclo tetrapirrolico, e (iii) i leganti assiali allo ione metallico. In questo modo, à ̈ possibile modulare le proprietà fisiche e chimiche delle molecole di porfirina e controllarne la ripartizione in scomparti subcellulari o subtissutali.

Le porfirine idrofobe sono situate a livello delle membrane cellulari che includono il plasma, le membrane mitocondriali e lisosomiali (Ricchelli e Jori, Photochem. Photobiol. 44: 151–158, 1986). Di conseguenza, il materiale genetico non à ̈ coinvolto nei fotoprocessi che portano alla morte cellulare. Tutte le prove disponibili indicano che la fotosensibilizzazione delle porfirine sulle cellule non promuove l'insorgenza di effetti mutagenici, in tal modo riducendo al minimo il rischio di scegliere cloni cellulari fotoresistenti.

L'estrazione e l'isolamento delle porfirine da prodotti naturali, e la loro preparazione per sintesi (spesso per modificazione delle porfirine naturali), sono procedure relativamente semplici (Moor et al., Mechanisms of fotodynamic therapy. In: Patrice (a cura di), Fotodynamic Therapy, The Royal Society of Chemistry, Cambridge, 2003, pp. 19–57). La captazione di nanomoli di porfirina à ̈ sufficiente a causare una rapida mortalità di vari tipi di mosche anche a intensità moderate di luce solare (Ben Amor et al., Photochem. Photobiol.71: 123–127, 2000).

Le porfirine subiscono spesso un rapido fotosbiancamento alla luce solare, quando esposte a fonti di luce artificiale visibile (Rotomskis et al., J. Photochem. Photobiol. B: Biol.39: 172–175, 1997).

Varie porfirine sono attualmente usate come agenti fototerapici; studi tossicologici (Dougherty et al., 1998) hanno dimostrato che questi coloranti in assenza di luce inducono un'importante danno agli essere umani solamente all'assunzione di 100 mg/kg di peso corporeo almeno, una quantità di gran lunga maggiore di quella necessaria per generare un'intensa tossicità per gli insetti.

Porfirine di formula generale (I):

in cui:

R1=R2=R3Ã ̈ -CH3

R4può essere scelto dal gruppo costituito da: -CH3(porfirina T4MPyP), -CH2(CH2)4CH3(porfirina C6); -CH2(CH2)8CH3(porfirina C10); -CH2(CH2)10CH3(porfirina C12); -CH2(CH2)12CH3(porfirina C14); -CH2(CH2)16CH3(porfirina C18) o -CH20(CH2)8CH3(porfirina C22)

sono note nell’arte.

I processi fotosensibilizzati sono stati rilevati appropriati anche per controllare la popolazione di insetti nocivi, incluse le mosche (Ben Amor e Jori, Insect Biochem. Mol. Physiol. 30: 915-925, 2000) e zanzare dei generi Culex (Dosdall et al., J. Am. Mosq. Control Assoc. 8(2):166-72 1992) e Aedes (Shao et al., J. Photochem. Photobiol., B: Biol., 98: 52-56, 2010; Chen et al. Agric. Sci. China 6(4): 458-465, 2007; Tian et al., J. Nat. Prod.69: 1241-1244, 2006).

È stato dimostrato che i derivati porfirinici esibiscono azione larvicida per le larve di zanzara su Culex sp. quando addizionati direttamente all'acqua di sviluppo delle larve in laboratorio (LD50 di clorofillina = 6,88 g/l dopo 3 h di esposizione a un’intensità luminosa 146,66 W/m<2>, Wohllebe et al., Parasitol. Res. 104: 593-600, 2009) e in condizioni di semicampo (mortalità del 100% dell’ematoporfirina a 10<-5>M dopo 3 giorni in luce solare naturale, Awad et al., J. Agri. Soc. Sci. 4(2): 85–8, 2008). Una mortalità completa à ̈ stata riportata per Aedes aegypti in esperimenti di laboratorio e semicampo da derivati ematoporfirinici dopo un’esposizione a 2,5 g/l per un periodo da 1 a 6 giorni (Karunaratne et al., Curr. Sci., 89, 170-173, 2005).

Le porfirine hanno varie caratteristiche vantaggiose, come: la proprietà di inattivare cellule sia eucaristiche sia procariotiche, come anche di favorire l'uccisione di batteri, funghi e protozoi parassiti sia nello stato di cisti che in quello vegetativo, e anche di insetti negli stadi sia larvale sia di adulto; un'efficiente attività fototossica contro ceppi microbici sia selvatici sia antibiotico-resistenti; mancanza di selezione delle cellule fotoresistenti come conseguenza della natura multi-bersaglio (target) dei processi fotosensibilizzati da porfirine; un basso potenziale mutagenico; e un’elevata selettività nell'uccisione di patogeni rispetto ai costituenti principali dei potenziali tessuti ospiti. Inoltre, le porfirine alle dosi fotochimicamente attive sono prive di qualsiasi citotossicità intrinseca in assenza di irradiazione.

L’uso delle porfirine come larvicidi à ̈ sicuro per i seguenti motivi: la loro attività à ̈ mediata dalla luce visibile, e non richiedono misure protettive per gli operatori; i prodotti della degradazione delle porfirine non inducono alcun effetto tossico o fototossico apprezzabile in una varietà di sistemi biologici, e la loro rapida scomparsa dall'ambiente riduce fortemente il rischio di una contaminazione diffusa o persistente.

L’uso di porfirine come larvicidi presenta i seguenti svantaggi: dal momento che le porfirine aderiscono molto probabilmente a un'ampia gamma di materiali presenti nei focolai di sviluppo naturali, l'applicazione della molecola nella sua forma pura sembra essere una procedura dispendiosa. In aggiunta, à ̈ probabile che la dispersione ambientale casuale aumenti il rischio di colpire organismi non bersaglio (target), come altri insetti, crostacei o protozoi.

La domanda di brevetto internazionale N. WO97/29637 descrive formulazioni con porfirine fotoinsetticide e attrattori.

La domanda di brevetto internazionale N. WO97/29636 descrive fotosensibilizzatori chimicamente legati a un veicolo che si rigonfia in acqua.

La domanda di brevetto US N. US200410245183 descrive ematoporfirine per la decontaminazione di acqua inquinata.

Il brevetto europeo N. EP 145711 descrive agenti insetticidi comprendenti porfirine idrosolubili.

La domanda di brevetto internazionale N. PCT/US02/20148 descrive porfirine antimicrobiche.

La domanda di brevetto US N. 2002/0103246 descrive l’uso di porfirine per rimuovere batteri e alghe da acquari.

La domanda di brevetto internazionale N. PCT/EG2008/000019 descrive una composizione comprendente un derivato porfirinico che à ̈ un estratto vegetale naturale e un lievito autolisato come attrattivo alimentare larvale per larve di zanzara che à ̈ addizionato ai focolai di sviluppo delle larve in soluzione acquosa. È stato dimostrato che il lievito autolisato à ̈ un attrattivo per una varietà di insetti (si vedano Ben Amor T. et al., Photochem. Photobiol. 67: 206-211, 1998; Ben Amor T. et al., Insect Biochem. Mol. Biol.30: 915-925, 2000).

PCT/EG2008/000019 presenta incongruenze e dati o dichiarazioni contraddittori.

Il derivato porfirinico à ̈ definito come estratto vegetale naturale, tuttavia non sono forniti ulteriori dettagli sulla sua composizione. Inoltre, il derivato porfirinico à ̈ definito dall’abbreviazione HP, che indica ematoporfirina, e dal valore del coefficiente di estinzione molare che corrisponde all’ematoporfirina (Ferro S. et al., Biomacromol.

10, 2592-2600, 2007)

Tuttavia, le porfirine, incluse le ematoporfirine, non sono presenti nelle piante verdi (Biosynthesis of Tetrapirroles. P.M. Jordan Ed., Elsevier, Amsterdam, Olanda,1991).

Inoltre, viene affermato che la composizione rivendicata esibisce una sicurezza per gli esseri umani e un’efficacia superiore a quelle tipiche del DDT; non viene tuttavia dato alcun risultato comparativo.

In aggiunta, nella misurazione dell’irradianza, la fonte di luce artificiale usata à ̈ descritta come simulatore solare di Oriel Corporation provvisto di lampada allo xeno da 1000 Watt. Detto simulatore solare contiene una lampada allo xeno ad alta pressione, quindi il suo spettro di emissione à ̈ sostanzialmente diverso dallo spettro di emissione del sole.

Le misurazioni quantitative dell’accumulo di porfirina nelle larve condotte mediante una procedura spettrofluorimetrica non sono chiare, perché non fanno menzione ad alcun grafico di taratura che chiarisca la relazione tra intensità della fluorescenza e concentrazione della porfirina.

Inoltre, la fluorescenza emessa à ̈ misurata in un ampio intervallo di lunghezze d’onda, in particolare 460-660 nm. Dal momento che le porfirine non emettono fluorescenza a lunghezze d’onda inferiori a 580 nm (Moan J. et al. In “Fotodynamic Therapy†B.W. Henderson e T.J. Dougherty, a cura di, Marcel Dekker Inc., pp. 19-36,1992), la raccolta dei dati in tale ampio intervallo di lunghezze d’onda (460-600 nm) rischia di misurare anche la fluorescenza emessa da altri composti biologici, come le flavine o i pigmenti biliari, rendendo imprecise le misurazioni.

In aggiunta, la rilevazione della porfirina nell'organismo delle larve mediante la tecnica spettrofluorimetrica à ̈ condotta usando 398 nm o 488 nm come lunghezze d’onda di eccitazione senza usare alcun controllo come confronto, ad es. ripetendo le procedure di estrazione e spettrofluorimetriche per le larve che non sono state alimentate con la porfirina al fine di accertare e quantificare il contributo dei cromofori non porfirinici che assorbono queste lunghezze d'onda (Ben Amor T. et al., Photochem. Photobiol.67: 206-211, 1998).

Inoltre, gli spettri di emissione di fluorescenza riportati (figure 9 e 10) sono costituiti da un certo numero di bande, il che suggerisce la presenza di una popolazione eterogenea di specie emettenti, in cui l'emissione intorno a 540 nm à ̈ originata da un fluoroforo non porfirinico. Solitamente, la presenza e il contributo relativo della porfirina all'emissione complessiva sono ottenuti misurando gli spettri di eccitazione di fluorescenza, che dimostrano la presenza esclusiva della porfirina nella misurazione spettrale osservata solamente se si sovrappongono con precisione allo spettro di assorbimento della porfirina (Reddi E. e Jori G., Rev. Chem. Interm. 10, 241-268, 1988)

Nella misurazione della durata di fluorescenza sono riportati due valori, vale a dire 1,5 ns per tempi di preincubazione brevi, e circa 15 ns per tempi di incubazione più lunghi. La misura della durata più breve non à ̈ coerente con la strumentazione usata, che ha una larghezza di gate minima di 3 ns. Inoltre, l’uso di un fitting (assegnazione) monoesponenziale dei grafici sperimentali non consente l'interpretazione dei valori della durata della fluorescenza in termini di rapporto tra specie porfiriniche monomeriche e aggregate, dal momento che quest'informazione può essere ottenuta necessariamente solamente usando un fitting (assegnazione) biesponenziale dei dati.

Inoltre, mancano dati riguardanti il decremento della sopravvivenza delle larve all'esposizione alla luce solare in presenza di 5 x 10<-5>M di porfirina.

In aggiunta, la figura 2 riporta una dose di porfirina dell'asse delle x in micromoli/ml, che à ̈ una concentrazione millimolare, mentre le concentrazioni usate negli esperimenti sono riportate come micromolari. Ancora, il recupero della porfirina nell’asse delle y à ̈ misurato in nanomoli di HP/larva, che à ̈ un modo piuttosto bizzarro per misurare tali acquisizioni, dal momento che larve diverse potrebbero avere dimensioni o pesi diversi, quindi l’acquisizione si riferisce generalmente a un valore più standard, ad es. il mg di proteina o parametri simili (si veda Ben Amor T. et al., Photochem. Photobiol. 67: 206-211, 1998; Ben Amor T. et al., Insect Biochem. Mol. Biol.30: 915-925, 2000).

Ie acquisizioni riportate nella figura 2 non mostrano alcun effetto sulla concentrazione della porfirina nell'intervallo da 1 a 5 x 10<-5>M sulla captazione della porfirina da parte delle larve, questi dati sembrano essere in contraddizione con l'effetto osservato della dose di porfirina sul decremento della sopravvivenza delle larve in presenza di diverse concentrazioni di porfirina, come mostrato nella figura 1, ove le larve trattate con lo stesso intervallo di dosi di porfirina esibiscono una sopravvivenza post-irradiazione dipendente dalla dose.

Inoltre, la figura 3 evidenzia che le larve esibiscono una sopravvivenza residua misurabile fino a 10-20 h post-irradiazione in presenza di porfirina 5 micromolare, le irradiazioni sono state eseguite usando velocità di fluence di 450 o 650 mW/cm<2>. Detta sopravvivenza residua à ̈ in contrasto con la mortalità del 100% riportata nella figura 1, che usa un'intensità luminosa minore, di 400 mW/cm<2>.

Da ultimo, nella figura 11 sono mostrati altri dati contraddittori, in cui la sopravvivenza residua del 20% delle larve osservata a 2 h post-irradiazione à ̈ inferiore a quella osservata a 10 h post-irradiazione, come mostrato nella figura 1.

Nella domanda di brevetto internazionale N. PCT/EG2008/000019 il lievito autolisato à ̈ addizionato separatamente rispetto alla porfirina. Il lievito autolisato à ̈ usato come attrattivo generico che attira in ugual modo insetti adulti, larve e altri organismi che sono presenti nello stesso ambiente. Di conseguenza, dal momento che la porfirina agisce in maniera non selettiva, diviene pericolosa per l'ambiente e per gli altri organismi che vi vivono.

È scopo della presente invenzione fornire un larvicida per il controllo di zanzare vettore che sia efficace contro tutti gli stadi larvali dell’organismo bersaglio (target), che abbia un'attività residua accettabile che consente una cadenza sostenibile delle applicazioni, preferibilmente quindicinale o mensile, che sia sicuro per esseri umani, che sia privo di tossicità per artropodi non bersaglio (target), che sia biodegradabile, che sia facile da manipolare e conservare.

È altresì auspicabile avere un larvicida a basso costo e con bassi requisiti di strumentazione per l'applicazione nonché di condizioni di trasporto.

Sussiste la necessità fortemente sentita di fornire una formulazione che sia altamente attrattiva come alimento per larve a una dose efficace, considerato il fatto che nei focolai di sviluppo naturali la materia organica di cui le larve solitamente si nutrono à ̈ disponibile in abbondanza, di modo che il larvicida formulato deve essere in grado di competere con questa risorsa alimentare naturale affinché sia assunto dalle larve.

L'efficacia e la selettività di ingestione del larvicida da parte delle larve di zanzara dipende dalla dimensione complessiva del larvicida; la dimensione complessiva non dovrebbe essere superiore a quella delle particelle alimentari tipicamente ingerite da tali larve a diversi stadi del loro sviluppo, vale a dire minore di 100 micrometri, preferibilmente 5-20 micrometri.

Inoltre, dal momento che il pH nell'intestino anteriore di dette larve à ̈ alcalino (pH > 8), il veicolo dovrebbe essere stabile a pH neutri e acidi per evitare il rilascio della porfirina, e dovrebbe dispiegarsi, rilasciando la porfirina a un pH alcalino. Di conseguenza, una volta ingerito dalle larve, la porfirina si dissocia dal veicolo e si situa in vari segmenti del canale alimentare delle larve, inducendo un marcato grado di fotosensibilità e la successiva morte delle larve a causa di un danno esteso all'apparato gastrointestinale.

Oggetto dell’invenzione

Oggetto della presente invenzione à ̈ una composizione comprendente almeno una porfirina e almeno un veicolo che vengono associati stabilmente covalentemente o non covalentemente, preferibilmente non covalentemente, per mezzo di interazioni elettrostatiche e idrofobe, e in cui il veicolo à ̈ selettivamente appetibile per larve di zanzara, a condizione che il veicolo non sia lievito autolisato.

È altresì un oggetto della presente invenzione una composizione comprendente almeno una porfirina e almeno un veicolo che sono associati stabilmente covalentemente o non covalentemente, preferibilmente non covalentemente, per mezzo di interazioni elettrostatiche e idrofobe e in cui il veicolo à ̈ selettivamente appetibile per larve di zanzara, a condizione che il veicolo non sia lievito autolisato, in cui la porfirina e il veicolo sono sotto forma di un complesso.

È un oggetto della presente invenzione una composizione comprendente almeno una porfirina e almeno un veicolo che sono stabilmente associati covalentemente o non covalentemente, preferibilmente non covalentemente, per mezzo di interazioni elettrostatiche e idrofobe, facoltativamente sotto forma di un complesso, in cui il veicolo à ̈ selettivamente appetibile per larve di zanzara, detto veicolo non essendo lievito autolisato, in cui il veicolo à ̈ stabilmente associato alla porfirina a temperature inferiori a 50 °C, e a valori di pH che variano da 5,0 a 8,0

È un oggetto della presente invenzione una composizione comprendente almeno una porfirina e almeno un veicolo che sono stabilmente associati covalentemente o non covalentemente, preferibilmente non covalentemente, per mezzo di interazioni elettrostatiche e idrofobe, facoltativamente sotto forma di un complesso, in cui il veicolo à ̈ selettivamente appetibile per larve di zanzara, detto veicolo non essendo lievito autolisato, in cui il veicolo à ̈ stabilmente associato alla porfirina in condizioni aride, a una temperatura inferiore a 50 °C e umidità relativa fino all’80%.

È un oggetto della presente invenzione una composizione comprendente almeno una porfirina e almeno un veicolo che sono stabilmente associati covalentemente o non covalentemente, preferibilmente non covalentemente, per mezzo di interazioni elettrostatiche e idrofobe, facoltativamente sotto forma di un complesso, in cui il veicolo à ̈ selettivamente appetibile per larve di zanzara, detto veicolo non essendo lievito autolisato, in cui il veicolo à ̈ stabilmente associato alla porfirina per almeno 6 mesi in condizioni di stoccaggio.

È un oggetto della presente invenzione una composizione comprendente almeno una porfirina e almeno un veicolo che sono stabilmente associati covalentemente o non covalentemente, preferibilmente non covalentemente, per mezzo di interazioni elettrostatiche e idrofobe, facoltativamente sotto forma di un complesso, in cui il veicolo à ̈ selettivamente appetibile per larve di zanzara, detto veicolo non essendo lievito autolisato, in cui il veicolo à ̈ stabilmente associato alla porfirina per almeno 2 settimane in acqua.

In un ulteriore oggetto della presente invenzione, nella composizione il veicolo ha una dimensione tra 5 Î1⁄4m e 50 Î1⁄4m.

Nella composizione oggetto della presente invenzione, il veicolo può essere sintetico o naturale.

Nella composizione oggetto della presente invenzione, il veicolo sintetico può essere scelto dal gruppo costituito da Eudragit, derivati di metacrilato, polivinilpirrolidone, derivati di PEG; liposomi, polipeptidi, oligo- o polisaccaridi, amido, amilopectina, Ca++/alginato, poli(acido lattico) (PLA) facoltativamente coniugato a polietilenglicole (PEG) o loro copolimeri, poli(acido lattico-co-glicolico) (PLGA) facoltativamente coniugato a polietilenglicole o loro copolimeri, polietilenglicoli funzionalizzati, polisaccaridi, derivati di cellulosa, destrani, copolimeri di destrani, poli(acido acrilico) (PAA), copolimeri di poli(acido acrilico) (PAA), poli(alcol vinilico) (PVA), copolimeri di poli(alcol vinilico) (PVA), poli(ossido di etilene), copolimeri di poli(ossido di etilene), polossameri, copolimeri di polossameri, polietilenimmina (PEI), copolimeri di polietilenimmina (PEI).

Nella composizione oggetto della presente invenzione, il veicolo naturale può essere scelto dal gruppo costituito da alimento in pellet (palline) per animali carnivori, alimento in pellet (palline) per animali erbivori, carbone vegetale, polline, farine vegetali, semi.

In un ulteriore oggetto della presente invenzione, il veicolo à ̈ Eudragit.

In un ulteriore oggetto della presente invenzione la porfirina à ̈ anionica o cationica.

In ancora un altro oggetto della presente invenzione, la porfirina à ̈ di formula (I) :

in cui:

R1=R2=R3Ã ̈ -CH3

R4Ã ̈ una catena idrocarburica C1-C22lineare o ramificata,

tutti i possibili stereoisomeri, isomeri Z e E, isomeri ottici e loro miscele,

In un altro scopo ancora della presente invenzione, R4Ã ̈ una catena alchilica C1-C22satura o insatura, lineare o ramificata.

In un altro scopo ancora della presente invenzione, R4Ã ̈ scelto dal gruppo costituito da: -CH3, -CH2(CH2)4CH3; -CH2(CH2)8CH3; -CH2(CH2)10CH3; -CH2(CH2)12CH3; -CH2(CH2)16CH3o -CH20(CH2)8CH3.

In un altro scopo ancora della presente invenzione, R4 Ã ̈ -CH2(CH2)10CH3o -CH2(CH2)12CH3.

È un ulteriore oggetto della presente invenzione una composizione comprendente meso-tri(N-metilpiridil), mono(N-dodecilpiridil)porfina e Eudragit, facoltativamente sotto forma di un complesso.

È ancora un ulteriore oggetto della presente invenzione una composizione comprendente meso-tri(N-metilpiridil), mono(N-tetradecil-piridil)porfina e Eudragit, facoltativamente sotto forma di un complesso.

È altresì un oggetto della presente invenzione l’uso della composizione come larvicida, preferibilmente contro zanzare del genere Aedes o Anopheles e più preferibilmente contro Aedes aegypti, Anopheles gambiae, Anopheles arabiensis, Anopheles stephensi.

Un ulteriore oggetto della presente invenzione à ̈ una formulazione alimentare per larve comprendente detta composizione.

È altresì un oggetto della presente invenzione un procedimento per controllare lo sviluppo larvale comprendente l’alimentare le larve con detta formulazione alimentare per larve.

È altresì un oggetto della presente invenzione un procedimento per controllare lo sviluppo larvale comprendente l’applicazione all’ambiente della composizione e del relativo kit, che comprende mezzi idonei per applicare detta composizione nell’ambiente.

Diversamente dai composti che agiscono per contatto diretto con il bersaglio (target), la composizione oggetto della presente invenzione à ̈ selettiva e specifica per le larve, dal momento che esercita la sua azione larvicida per ingestione, e per tale motivo à ̈ meno suscettibile di colpire organismi non bersaglio (target).

Nella composizione della presente invenzione, la porfirina e il veicolo interagiscono per mezzo di interazioni elettrostatiche e idrofobe.

Per i precedenti motivi, la combinazione della presente invenzione, in cui porfirina e veicolo interagiscono, Ã ̈ specificatamente ingerita dalle larve.

Le porfirine cationiche che interagiscono con i gruppi carbossilati carichi negativamente che sono presenti sulla superficie esterna delle membrane cellulari delle larve di zanzara mediante un legame ionico sono più efficaci come larvicida, dal momento che consentono un'associazione data elettrostaticamente in tempo reale tra l’agente fotosensibilizzante e l'organismo delle larve.

Le porfirine di formula (I) interagiscono efficacemente con i gruppi carbossilati carichi negativamente che sono presenti sulla superficie esterna delle membrane cellulari endoteliali delle larve di zanzara tramite un’interazione elettrostatica e la coda idrocarburica posta sul perimetro della molecola di porfirina favorisce l'ancoraggio della porfirina stessa ai domini lipidici delle membrane cellulari nell'intestino dell'organismo bersaglio (target), aumentando la stabilità del complesso tra l’agente fotosensibilizzante e l’organismo bersaglio (target) sono molto più efficaci come larvicida.

Nella composizione della presente invenzione, il veicolo à ̈ progettato in termini di proprietà fisiche (ad es. granulometria, capacità di galleggiamento) e caratteristiche chimiche (ad es. attrattiva come alimento) al fine di adattarsi alle caratteristiche comportamentali e alle necessità fisiologiche delle larve di zanzara oggetto del trattamento, che variano a seconda della specie di zanzara (Merritt et al., Annu. Rev. Entomol.37: 349-376, 1992).

Inoltre, nella composizione della presente invenzione, il veicolo protegge la porfirina dalla degradazione idrolitica e fotoindotta, consentendo il galleggiamento sulla superficie dell’acqua, e ne favorisce la solubilizzazione in mezzi a pH >8.

In aggiunta, nella composizione della presente invenzione il veicolo à ̈ attrattivo per le larve, à ̈ lavorabile per produrre microparticelle di granulometria controllata, ed à ̈ biologicamente inerte.

La presente invenzione à ̈ sicura per gli esseri umani, facile da manipolare e conservare, e ha un basso costo e bassi requisiti in termini di strumentazione di applicazione nonché di condizioni di trasporto.

La presente invenzione à ̈ biologicamente efficace contro l’organismo bersaglio (target), includendo attività residua, mancanza di tossicità su organismi non bersaglio (target), ed à ̈ capace di controllare le popolazioni larvali sincrone e asincrone composte da larve.

La presente invenzione fornisce anche un larvicida economico con bassi requisiti in termini di strumentazione di applicazione nonché di condizioni di trasporto, appropriato per una produzione e applicazione in paesi a basso reddito afflitti dalle patologie veicolate dalle zanzare.

Ulteriori caratteristiche e tratti distintivi della presente invenzione risulteranno evidenti dalla seguente descrizione dettagliata e dagli esempi.

Descrizione dettagliata dell’invenzione

Nell’ambito della portata della presente invenzione:

porfirina significa derivati porfirinici a base libera, derivati porfirinici sostituiti da metallo, e analoghi di tetrapirrolo di porfirine, tutti recanti da 0 a 8 sostituenti periferici sugli anelli pirrolici e da 0 a 4 sostituenti nelle posizioni meso,

analoghi di tetrapirrolo di porfirine significa clorine, porficeni, ftalocianine e naftalocianine

Porfirina C12significa meso-tri(N-metilpiridil), mono(N-dodecilpiridil)porfina Porfirina C14significa meso-tri(N-metilpiridil), mono(N-tetradecil-piridil)porfina Por-Eud indica la composizione che include polimero Eudragit e porfirina.

Veicolo sintetico significa un veicolo preparato per sintesi chimica;

veicolo naturale significa un veicolo di origine naturale ottenuto mediante processi di estrazione e/o purificazione;

Eudragit<®>S 100 (Evonik Industries AG, Essen, Germania) indica un copolimero anionico, a base di acido metacrilico e metilmetacrilato. Eudragit<®>S 100 à ̈ usato in farmacia come veicolo farmacologico per trattamenti orali (Na e Bae: pH–sensitive polymers for drug delivery. In: Polymeric drug delivery systems. G.S. Kwon a cura di Taylor & Francis, Boca Raton, USA, Vol.148, pagg.135-139 (2005);

palatabilità indica la capacità di essere attrattivo per le larve di zanzara bersaglio (target), essere in grado di rispondere alle caratteristiche comportamentali e alle esigenze fisiologiche delle larve di zanzara bersaglio (target), essere in grado di competere con la materia organica presente in natura di cui solitamente si nutrono le larve in modo da essere ingerito selettivamente da larve di zanzara bersaglio (target);

condizioni di conservazione indica la conservazione in fiale a chiusura ermetica in condizioni anidre, con protezione dalla luce mediante materiale scurito o non trasparente all'interno o intorno alle pareti del contenitore, a temperatura costante, preferibilmente a 20 °C.

Gli stessi inventori hanno dimostrato nel presente documento che la composizione della presente invenzione à ̈ efficace come larvicida di larve di zanzara contro varie specie di zanzara appartenenti a due specie diverse di due generi diversi, vale a dire Aedes aegypti, Anopheles gambiae (forme cromosomiche sia S sia M), An. arabiensis e An. stephensi. Le composizioni testate agiscono su larve di zanzara allevate in laboratorio come anche su larve prelevate da focolai di sviluppo naturali (tabelle 2 e 3). La composizione della presente invenzione agisce sulle larve in seguito a ingestione attraverso l’esposizione alla luce delle larve nutrite con porfirina (tabella 4). La composizione della presente invenzione à ̈ prontamente assunta da tutti gli stadi larvali (tabella 5), mentre le sole porfirine, se disciolte in acqua come tali, in assenza di un veicolo, esibiscono effetti fototossici su organismi non bersaglio (target) di habitat acquatici (tabella 6).

La porfirina può essere scelta dal gruppo costituito da derivati porfirinici a base libera, derivati porfirinici sostituiti da metallo, e analoghi di tetrapirrolo di porfirine, tutti recanti da 0 a 8 sostituenti periferici sugli anelli pirrolici e da 0 a 4 sostituenti nelle posizioni meso.

Gli analoghi di tetrapirrolo di porfirine possono essere scelti dal gruppo costituito da clorine, porficeni, ftalocianine e naftalocianine

In una prima forma di realizzazione preferita, la porfirina à ̈ anionica.

In una seconda forma di realizzazione preferita, la porfirina à ̈ cationica.

In un’ulteriore forma di realizzazione preferita della presente invenzione, la porfirina ha la seguente formula (I) :

in cui:

R1=R2=R3Ã ̈ -CH3

R4Ã ̈ una catena idrocarburica C1-C22lineare o ramificata.

Preferibilmente, R4Ã ̈ una catena alchilica C1-C22satura o insatura, lineare o ramificata.

Più preferibilmente R4à ̈ scelto dal gruppo costituito da: -CH3(porfirina T4MPyP), -CH2(CH2)4CH3(porfirina C6); -CH2(CH2)8CH3(porfirina C10); -CH2(CH2)10CH3(porfirina C12); -CH2(CH2)12CH3(porfirina C14); -CH2(CH2)16CH3(porfirina C18) o -CH20(CH2)8CH3(porfirina C22).

In maniera maggiormente preferitaR4Ã ̈ -CH2(CH2)10CH3o -CH2(CH2)12CH3 .

L’invenzione include nel suo scopo tutti i possibili stereoisomeri, isomeri Z e E, isomeri ottici e loro miscele di composti di formula (I).

Le porfirine preferite di formula (I) sono:

meso-tri(N-metilpiridil), mono(N-dodecilpiridil)porfina;

e, meso-tri(N-metilpiridil), mono(N-tetradecilpiridil)porfina.

Le porfirine di formula (I) sono caratterizzate dalla presenza di quattro gruppi funzionali carichi positivamente scelti dal gruppo costituito da anelli piridinici inseriti nelle quattro posizioni meso del macrociclo tetrapirrolico, l’atomo di azoto di ciascun anello piridilico essendo quaternizzato e reso cationico mediante il legame di tre gruppi metilici e una catena idrocarburica. Detti gruppi funzionali interagiscono con i gruppi carbossilati carichi negativamente che sono presenti sulla superficie esterna delle membrane cellulari delle larve di zanzara attraverso un’interazione elettrostatica. Inoltre, la coda idrocarburica posta sul perimetro della molecola di porfirina promuove l’ancoraggio della stessa porfirina ai domini lipidici delle membrane cellulari nell’organismo bersaglio (target), aumentando la stabilità del complesso tra l’agente fotosensibilizzante e l’organismo bersaglio (target).

In un’ulteriore forma di realizzazione preferita sono state usate Porfirina C12e Porfirina C14(Frontier Scientific, USA).

Nella composizione della presente invenzione, un veicolo idoneo, indipendentemente dal fatto che sia un veicolo sintetico o naturale, dovrebbe avere le seguenti caratteristiche:

Proprietà chimiche: capacità di stabilire un’associazione covalente o non covalente stabile con le porfirine per mezzo della presenza di cariche negative o positive, garantendo l’interazione elettrostatica con i gruppi carichi positivamente o, rispettivamente, negativamente, nella molecola di porfirina. Inoltre, grazie alla presenza del macrociclo aromatico idrofobo, le porfirine possono associarsi al nucleo della catena polimerica mediante interazioni idrofobe.

Proprietà fisiche: capacità di rimanere associato stabilmente con le porfirine in acqua in un’ampia gamma di condizioni fisiche e chimiche, come temperatura inferiore a 50 °C e pH da 5,0 a 8,0, che rispecchiano le condizioni dei focolai di sviluppo naturali, come anche in condizioni aride, come temperatura inferiore a 50 °C, umidità relativa fino all’80%, che rispecchiano le possibile condizioni di conservazione estreme. Capacità di rimanere stabilmente associato con le porfirine per almeno 6 mesi in condizioni di conservazione, e per almeno 2 settimane in acqua.

Proprietà biologiche: capacità di produrre, una volta caricato con porfirine, un’attività larvicida residua fino a 2 settimane; palatabilità per le larve di zanzara e competitività con la materia organica presente in natura di cui le larve solitamente si nutrono; dimensione tra 5 Î1⁄4m e 50 Î1⁄4m; capacità di raggiungere una distribuzione omogenea in zone definite della colonna d'acqua, nello specifico in relazione al comportamento di alimentazione delle larve delle varie specie di zanzara, ad es. in galleggiamento sulla superficie, in distribuzione uniforme sulla colonna d’acqua, o come deposito sul fondo; mancanza di tossicità per specie di vertebrati e invertebrati non bersaglio (target) alle tipiche dosi di applicazione sul campo; mancanza di tossicità per contatto, ingestione e inalazione per gli esseri umani durante la produzione, la manipolazione, lo stoccaggio, il trasporto e l'applicazione.

I veicoli sintetici possono essere scelti dal gruppo costituito da Eudragit®, derivati di metacrilato, polivinilpirrolidone, derivati di PEG; liposomi, polipeptidi, oligo- o polisaccaridi, amido, amilopectina, Ca++/alginato, poli(acido lattico) (PLA) facoltativamente coniugato a polietilenglicole (PEG) o loro copolimeri, poli(acido lattico-co-glicolico) (PLGA) facoltativamente coniugato a polietilenglicole o loro copolimeri, polietilenglicoli funzionalizzati, polisaccaridi, derivati di cellulosa, destrani, copolimeri di destrani, poli(acido acrilico) (PAA), copolimeri di poli(acido acrilico) (PAA), poli(alcol vinilico) (PVA), copolimeri di poli(alcol vinilico) (PVA), poli(ossido di etilene), copolimeri di poli(ossido di etilene), polossameri, copolimeri di polossameri, polietilenimmina (PEI), copolimeri di polietilenimmina (PEI).

Esempi di veicoli naturali sono gli alimenti in pellet (palline) per animali carnivori o erbivori, carbone vegetale, polline, farine vegetali, semi.

In una forma di realizzazione della presente invenzione, il veicolo sintetico à ̈ Eudragit®.

In un’altra forma di realizzazione della presente invenzione, il veicolo naturale à ̈ costituito da alimento in pellet (palline) per topi o gatti.

L’efficacia e la selettività dell’ingestione della composizione rivendicata da parte di larve di Anopheles e Aedes sono ottenute assicurandosi che la dimensione del formulato non sia maggiore di quella delle particelle alimentari tipicamente ingerite da tali larve nei diversi stadi del loro sviluppo, che à ̈ inferiore a 100 micrometri, preferibilmente 5-20 micrometri, inoltre traendo vantaggio dal fatto che il pH nell'intestino anteriore di tali larve à ̈ naturalmente alcalino (pH > 8), corrispondendo alle caratteristiche chimiche del polimero di Eudragit che in tali condizioni di pH alcalino si dispiega, rilasciando la porfirina: di conseguenza, una volta ingerito da larve di Anopheles, la porfirina si dissocia dal veicolo e si posiziona in vari segmenti del canale alimentare delle larve, inducendo un marcato grado di fotosensibilità e la successiva morte delle larve a causa di un esteso danno all'apparato gastrointestinale. Inoltre, Eudragit à ̈ stabile a pH neutri e acidi, quindi la porfirina non verrà rilasciata nell'ambiente acquoso dei tipici focolai di sviluppo naturali e, in aggiunta, non verrà rilasciata né agirà in altri piccoli organismi, caratterizzati da un pH intestinale neutro o acido.

Prove sperimentali sono fornite usando composizioni comprendenti porfirina C12o porfirina C14e Eudragit<®>o alimento in pellet (palline) per topi o gatti.

Esempi

Esempio 1 – Efficacia come larvicida di larve di zanzara

Sono stati usati ceppi di laboratorio di Anopheles stephensi, M e S (Kisumu), forme cromosomiche di An. gambiae, An. arabiensis e Aedes aegypti, come anche larve di Anopheles spp. e Aedes spp. raccolte sul campo. Le zanzare di laboratorio sono state tenute a 28-30 °C, > 90% di RH e un fotoperiodo di 12 h. L’intensità luminosa variava tra 0,5 mW/cm<2>(lampadina a fluorescenza) e 185 mW/cm<2>(luce solare).

Soluzioni di porfirina C12o C14a concentrazioni di 5 – 100 Î1⁄4M sono state preincubate a temperatura ambiente al buio con 15-60 mg di veicolo (Eudragit oppure alimento macinato per topi o alimento macinato per gatti) per 4-12 ore in leggera agitazione. Dopo l’incubazione, le soluzioni sono state filtrate, e il veicolo caricato à ̈ stato essiccato a temperatura ambiente o in forno (45 °C).

L'efficacia di legame della porfirina a Eudragit à ̈ del 95% circa, rispetto alla quantità iniziale di porfirina disciolta nella soluzione di incubazione. Per esempio, l’incubazione di 25 mg di Eudragit in 10 ml di porfirina 50 µM (C12) dà un formulato di Por-Eud contenente 18,6 µg di porfirina per mg di Eudragit. Le composizioni usate sono rimaste stabili per almeno un mese al buio dopo la loro preparazione.

Sono stati preparati vassoi in plastica trasparente della capacità di un litro contenenti pozzetti ciascuno avente 500 ml di acqua e 6 – 60 mg della composizione della presente invenzione. Lotti di 60 – 100 larve L2, L3 o L4 sono stati introdotti nei vassoi dopo il tramonto (o lo spegnimento della luce artificiale). La mortalità delle larve à ̈ stata valutata il giorno successivo a partire dalle 8.00, ed à ̈ stato registrato il tempo necessario a raggiungere una mortalità almeno del 90%. Le larve immobili o che non esibivano una risposta di fuga all’ispezione sono state definite morte o morenti, e contate insieme alle altre (Tabelle 2 e 3). Le pupe che si sono occasionalmente formate durante tutto il periodo di irradiazione sono state scartate ed escluse dalla valutazione. Un numero uguale di lotti di larve preparate nello stesso modo à ̈ stato tenuto continuamente in condizioni di buio, e la relativa mortalità à ̈ stata valutata in modo analogo, per valutare la tossicità al buio.

La Tabella 2 mostra l’efficacia come larvicida per larve di zanzara di C12e C14della composizione comprendente porfirina e il veicolo, che à ̈ Eudragit o alimento in pellet (palline) per topi o gatti in test condotti su scala di laboratorio, in cui vi sono 60-100 larve/500 ml per vassoio; alle larve à ̈ stato concesso di alimentarsi con le formulazioni durante la notte; ciascun risultato deriva da un esperimento rappresentativo indipendente. Intervallo di intensità luminosa: 0,5 – 185 mW/cm<2>.

Tabella 2

Tempo Specie di quantit per zanzare compost concentrazion ottener allevate in veicolo à (mg)

e di carica fonte di luce e una laboratoriooper (µM) mortalit , ceppi vassoio à ≥ 90%

(ore) Anopheles 60 50 sole 0,5 gambiae 30 50 sole 0,5 ceppo C12<Eudragi>15 50 sole 0,5t

Kisumu 30 25 sole 0,5 (S) 15 25 sole 0,5 An. 30 50 sole 0,5<C12>Eudragi

arabiensis<t>15 5 sole 3 An. le

<Eudragi>so

gambiae C12 15 25 0,5 (M)t

An. 60 100 sole 0,5 gambiae Cibo 30 100 sole 0,5 ceppo C12 per 30 50 sole 0,5 Kisumu gatti<sole>

(S) 30 25 8

An. Cibo sole

arabiensis<C12>per 30 50 3

gatti

An. Cibo sole

gambiae C12 per 30 50 3 (M) gatti

lampadina

Aedes

<C14>Cibo

<70 5>a 3 aegypti per topi fluorescenz

a

lampadina

An. a

<C12>Cibo

<6 0.64>6 stephensi per topi fluorescenz

a

lampadina

An.

<C14>Cibo

<6 0.5>a

stephensi per topi fluorescenz 1

a

La Tabella 3 mostra l’efficacia su zanzare raccolte sul campo in cui vi sono 60-100

larve/500 ml per vassoio; alle larve à ̈ stato concesso di alimentarsi con i formulati

C12 durante la notte; non à ̈ stata osservata alcuna tossicità al buio. Ciascun

risultato deriva da un esperimento rappresentativo indipendente. Fonte di luce: luce

solare in tutti i casi, intervallo di intensità: 4 – 185 mW/cm<2>

Tabella 3

Tempo per Campione quantità concentrazione di ottenere catturato sul veicolo (mg) per una campo vassoio carica (µM) mortalità ≥90% (ore) Anopheles spp

Aedes sppEudragit 30 50 0,5 Anopheles spp Eudragit 30 25 0,5 Anopheles spp Eudragit 15 15 3 Anopheles spp<Cibo per>

gatti<30 50 3>

I risultati delle tabelle 2 e 3 mostrano che il caricamento di un veicolo sintetico o naturale, appetibile per larve di zanzara, con derivati porfirinici dà come risultato una formulazione larvicida efficace che porta a una mortalità larvale del 100% in breve tempo (tipicamente da 0,5 a 3 ore). Ceppi di laboratorio dei generi Anopheles e Aedes, come anche larve raccolte sul campo appartenenti agli stessi generi esibiscono una sensibilità simile. Le dosi applicate, quando espresse in g/ha di principio attivo, sembrano essere nello stesso intervallo dei dosaggi sul campo per i larvicidi attualmente raccomandati dall’OMS. Ad esempio, 500 ml di acqua trattata con 15 mg di C12Por-Eud che à ̈ stato caricato con C12 a 50 Î1⁄4M corrispondono approssimativamente a un dosaggio di 400 g/ha di C12 (si veda la Tabella 1). L'incubazione di Eudragit in una soluzione 10 volte meno concentrata di C12, e l’uso di 15 mg di questo Por-Eud ha dato come risultato un’uccisione più lenta delle larve, che ha tuttavia superato il 90% in appena 3 ore.

Esempio 2 – Ingestione di Por-Eud da parte di larve ed effetto fotosensibilizzante del formulato ingerito

L’effetto fotosensibilizzante di Por-Eud ingerito su larve di zanzara à ̈ stato dimostrato in esperimenti condotti in laboratorio usando Anopheles gambiae ceppo Kisumu, in tutti gli stadi larvali, e i risultati sono mostrati nella tabella 4. Le larve sono state nutrite durante la notte con Eudragit non trattato (Eud di controllo) o con Eudragit caricato con porfirina, e quindi esposte alla luce solare. Le larve trattate sono state esposte alla luce nello stesso vassoio ove era stata somministrata l'alimentazione durante la notte (Por-Eud), oppure dopo essere state trasferite in vassoi contenenti acqua pura (cambio di vassoio Por-Eud). In aggiunta, un lotto di larve à ̈ stato posto in acqua filtrata dai vassoi che erano stati incubati durante la notte con Por-Eud (acqua Por-Eud).

La Tabella 4 mostra la mortalità di larve alimentate con Por-Eud durante la notte ed esposte a luce solare in vassoi di acqua trattata con Por-Eud o in vassoi contenenti acqua pura.

Tabella 4

Mortalità larvale in Mortalità larvale in Trattamenti seguito a seguito a incubazione durante esposizione di 30 la notte, min a luce solare (70 eseguita al buio mW/cm<2>)

Eud di controllo 0 % 0 %

Por-Eud 0 % 100 %

cambio di vassoio Por-Eud 0 % 100 %

Acqua Por-Eud 0 % 5 %

I dati mostrano che Por-Eud non provoca mortalità larvale quando i vassoi sono tenuti al buio, mentre le larve incubate durante la notte con Por-Eud e trasferite in acqua pura per l’esposizione alla luce sono morte dopo 30 min di esposizione alla luce, sottolineando la circostanza che l’azione di Por-Eud à ̈ legata all’ingestione del formulato. È stata osservata una mortalità solamente bassa quando le larve sono state incubate in acqua con Por-Eud filtrata, che à ̈ stata dovuta probabilmente al fatto che piccole particelle di Por-Eud sono passate attraverso il filtro.

Esempio 3 – Assunzione da parte degli stadi larvali di porfirina caricata su un veicolo

Osservazioni dirette di larve di An. stephensi e Ae. aegypti alimentate con porfirina caricata su pellet (palline) per animali o Eudragit sono state effettuate allo stereomicroscopio.

A larve di Anopheles stephensi e Aedes aegypti a tutti gli stadi dello sviluppo larvale à ̈ stata offerta porfirina caricata su pellet (palline) per animali o Eudragit, entrambi costituiti da particelle di dimensioni diverse (1-300 µm). Le larve di An. stephensi ingeriscono di preferenza le particelle di alimento che galleggiano sulla superficie dell’acqua, mentre le larve di Aedes si alimentano sul fondo dei contenitori. Le larve assumono preferibilmente particelle nell'intervallo di 20-50 µm. L'esame degli intestini delle larve al microscopio ha rilevato che la maggior parte delle particelle visibili nel lume dell'intestino misura tra 6 e 20 Î1⁄4m. La differenza di intervallo granulometrico osservata all’assunzione e all'interno dell'intestino potrebbe essere spiegata da una scissione o digestione dell'alimento assunto.

Esempio 4 – Attrattiva della porfirina caricata su un veicolo organico rispetto a veicolo non trattato come risorsa alimentare

Al fine di valutare l’attrattiva di particelle di alimenti rivestite con porfirina tenendo in considerazione il fatto che negli ambienti naturali un larvicida porfirinico deve competere con le particelle alimentari naturali, alimento in pellet (palline) per animali trattato con porfirina (Por-AFP) à ̈ stato offerto alle larve miscelandolo con diverse quantità di AFP non trattato.

Sono state testate le seguenti miscele: Por-AFP : AFP = 1:0 , 0:1 , 1:1, 1:5, 1:15 , 1:45.

Gli esperimenti sono stati condotti con larve a diversi stadi dello sviluppo, usando Anopheles stephensi e Aedes aegypti. Le larve sono state alimentate con le miscele per 30 minuti, quindi l’intestino à ̈ stato osservato al microscopio a fluorescenza. La densità delle particelle di porfirina nell'intestino delle larve che si erano nutrite delle miscele di Por-AFP : AFP = 1:15 e 1:45 à ̈ stata trovata corrispondente alla proporzione delle particelle di porfirina nella miscela alimentare, indicando che le larve non hanno alcuna preferenza in senso positivo o negativo per le particelle rivestite con porfirina. Nelle larve che si erano nutrite di Por-AFP : AFP = 1:1 e 1:5 à ̈ stata osservata una fluorescenza rossa di intensità relativamente più elevata di quanto atteso, probabilmente dovuta a della porfirina entrata in soluzione, che ha colorato tutto il bolo alimentare.

Esempio 5 - Effetti su organismi non bersaglio (target) di habitat acquosi

L’effetto della porfirina libera disciolta in acqua sulla fotosensibilità di potenziali organismi acquosi non bersaglio (target) à ̈ stata valutata su Colpoda inflata, Artemia franciscana e Daphnia magna, un protozoo e due specie di crostacei che si trovano di frequente negli ambienti acquosi. I dati sulla mortalità sono stati registrati dopo 1 h di irradiazione con luce visibile emessa da una lampadina a fluorescenza. I risultati sono mostrati nella tabella 5.

Tabella 5

Organismo non Esempio Dose di Mortalità (%)LD-50 (Î1⁄4M)target specifico porfirina (Î1⁄4M)

Protozoo Colpoda inflata 0,6 40 1,0

(trophozoites)

Colpoda inflata 1,0 20 > 1,0 (cisti)

Crostaceo Artemia 6,0 20 > 10,0

franciscana

Daphnia magna 0,3 50 0,3 I precedenti risultati mostrano che detti invertebrati possono essere colpiti dall’azione fotocida della porfirina libera disciolta in acqua.

Claims (29)

1. RIVENDICAZIONI 1. Una composizione comprendente almeno una porfirina e almeno un veicolo, caratterizzata dal fatto che il veicolo instaura un’associazione covalente o non covalente stabile con la porfirina per mezzo di interazioni elettrostatiche e idrofobe e il veicolo à ̈ selettivamente appetibile per larve di zanzara, a condizione che il veicolo non sia lievito autolisato.
2. 2. La composizione secondo la rivendicazione 1, in cui la porfirina e il veicolo sono sotto forma di un complesso.
3. 3. La composizione secondo la rivendicazione 1 o 2, in cui l’associazione à ̈ non covalente.
4. 4. La composizione secondo la rivendicazione 1 o 2, in cui il veicolo à ̈ stabilmente associato alla porfirina a temperature inferiori a 50 °C e pH che varia da 5,0 a 8,0.
5. 5. La composizione secondo la rivendicazione 1 o 2, in cui il veicolo à ̈ stabilmente associato alla porfirina in condizioni di aridità, a temperature inferiori a 50 °C e umidità relativa fino all’80%.
6. 6. La composizione secondo la rivendicazione 1 o 2, in cui il veicolo à ̈ stabilmente associato alla porfirina per almeno 6 mesi in condizioni di conservazione.
7. 7. La composizione secondo la rivendicazione 1 o 2, in cui il veicolo à ̈ stabilmente associato alla porfirina per almeno 2 settimane in acqua.
8. 8. La composizione secondo la rivendicazione 1 o 2, in cui il veicolo ha una dimensione tra 5 Î1⁄4m e 50 Î1⁄4m.
9. 9. La composizione secondo la rivendicazione 1 o 2, in cui il veicolo à ̈ sintetico o naturale.
10. 10. La composizione secondo la rivendicazione 1 o 2, in cui il veicolo sintetico à ̈ scelto dal gruppo costituito da Eudragit, derivati di metacrilato, polivinilpirrolidone, derivati di PEG (polietilenglicole); liposomi, polipeptidi, oligo- o polisaccaridi, amido, amilopectina, Ca++/alginato, poli(acido lattico) (PLA) facoltativamente coniugato a PEG o loro copolimeri, poli(acido lattico-co-glicolico) (PLGA) facoltativamente coniugato a polietilenglicole o loro copolimeri, derivati di cellulosa, destrani, copolimeri di destrani, poli(acido acrilico) (PAA), copolimeri di poli(acido acrilico) (PAA), poli(alcol vinilico) (PVA), copolimeri di poli(alcol vinilico) (PVA), poli(ossido di etilene), copolimeri di poli(ossido di etilene), polossameri, copolimeri di polossameri, polietilenimmina (PEI), copolimeri di polietilenimmina (PEI).
11. 11. La composizione secondo la rivendicazione 1 o 2, in cui il veicolo naturale à ̈ scelto dal gruppo costituito da alimento in pellet per animali carnivori, alimento in pellet per animali erbivori, carbone vegetale, polline, farine vegetali, semi.
12. 12. La composizione secondo la rivendicazione 1 o 2, in cui il veicolo à ̈ Eudragit.
13. 13. La composizione secondo la rivendicazione 1 o 2, in cui la porfirina à ̈ anionica.
14. 14. La composizione secondo la rivendicazione 1 o 2, in cui la porfirina à ̈ cationica.
15. 15. La composizione secondo la rivendicazione 1 o 2, in cui la porfirina à ̈ di formula (I): in cui: R1=R2=R3à ̈ -CH3 R4à ̈ una catena idrocarburica C1-C22lineare o ramificata, tutti i possibili stereoisomeri, isomeri Z e E, isomeri ottici e loro miscele,
16. 16. La composizione secondo la rivendicazione 15, in cui R4Ã ̈ una catena alchilica C1-C22satura o insatura, lineare o ramificata.
17. 17. La composizione secondo la rivendicazione 15, in cui R4Ã ̈ scelto dal gruppo costituito da: -CH3, -CH2(CH2)4CH3; -CH2(CH2)8CH3; -CH2(CH2)10CH3; -CH2(CH2)12CH3; -CH2(CH2)16CH3o -CH20(CH2)8CH3.
18. 18. La composizione secondo la rivendicazione 15, in cui R4Ã ̈ scelto dal gruppo costituito da: -CH2(CH2)10CH3o -CH2(CH2)12CH3.
19. 19. Composizione comprendente meso-tri(N-metilpiridil), mono(N-dodecilpiridil)porfina e Eudragit.
20. 20. Composizione secondo la rivendicazione 19, in cui meso-tri(N-metilpiridil), mono(N-dodecilpiridil)porfina e Eudragit sono sotto forma di un complesso.
21. 21. Composizione comprendente meso-tri(N-metilpiridil), mono(N-tetradecilpiridil)porfina e Eudragit.
22. 22. Composizione secondo la rivendicazione 21, in cui meso-tri(N-metilpiridil), mono(N-tetradecilpiridil)porfina e Eudragit sono sotto forma di un complesso.
23. 23. Uso della composizione di una qualsiasi delle rivendicazioni 1-22 come larvicida.
24. 24. Uso della composizione di una qualsiasi delle rivendicazioni 1-22 e come larvicida contro zanzare del genere Aedes o Anopheles.
25. 25. Uso della composizione di una qualsiasi delle rivendicazioni 1-22 e come larvicida contro Aedes aegypti, Anopheles gambiae, Anopheles arabiensis, Anopheles stephensi.
26. 26. Formulazione alimentare per larve comprendente la composizione di una qualsiasi delle rivendicazioni 1-22.
27. 27. Procedimento per controllare lo sviluppo larvale comprendente l’alimentazione delle larve con la formulazione alimentare per larve secondo la rivendicazione 26.
28. 28. Procedimento per controllare lo sviluppo larvale comprendente l’applicazione all’ambiente della composizione di una qualsiasi delle rivendicazioni 1-22.
29. 29. Kit per il controllo dello sviluppo larvale comprendente la composizione di una qualsiasi delle rivendicazioni 1-22 e mezzi idonei per applicare detta composizione all’ambiente.