ITRM20070030A1 - Derivati fosfatati di polisaccaridi e usi di essi - Google Patents
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Description
DESCRIZIONE
A corredo di una domanda dì brevetto per invenzione industriale avente per titolo: “Derivati fosfatati di polisaccaridi e usi di essi”
CAMPO TECNICO DELL’INVENZIONE
La presente invenzione si riferisce a prodotti fosfatati a base polisaccarìdica, in particolare: acido ialuronico (HA), carbossimetilcellulosa (CMC) e acido alginico (AA) e al loro uso.
STATO DELLA TECNICA
Tra i composti più comunemente impiegati in campo biomedico ci sono i polisaccaridi di origine naturale, utilizzati sia tal quali che modificati chimicamente. La lista delle loro applicazioni è lunghissima, sono infatti largamente utilizzati come scaffold cellulari, ricoprimenti per dispositivi biomedici, rilascio controllato di farmaci, etc.
Queste macromolecole vengono utilizzate per la loro elevata biocompatibilità e per il loro ruolo nel mediare l’interazione materialecellula e il riconoscimento immunologico. In conseguenza di ciò, da molto tempo è in atto lo sviluppo di polielettroliti sintetici e/o semisintetici che mimino le caratteristiche biologiche dei polielettroliti naturali o che abbiano nuove proprietà chimiche, fisiche e soprattutto biologiche.
Tra i polielettroliti di orìgine biologica vi sono alcuni polisaccaridi, come ad esempio l’acido ialuronico, che svolgono un ruolo fondamentale nelle interazioni cellula-substrato.
L'acido ialuronico è ampiamente utilizzato in campo oftalmologico, in chirurgia, nell'ingegnerìa tissutale e nel trattamento deH’osteoartrite [1-3]. Il limite più grande associato alla sua applicazione come tale è relativo alla sua degradazione enzimatica da parte della ialuronidasi che, diminuendone il tempo di vita, diminuisce notevolmente la sua attività biologica e farmacologia [4]. La solfatazione dell’acido ialuronico [5] ha portato alla formazione di un prodotto solubile in soluzioni acquose, più difficilmente degradarle del polisaccaride nativo, i cui prodotti di degradazione, possono però essere tossici per le cellule.
I derivati fosfatati non dovrebbero invece presentare nessun effetto tossico in quanto i prodotti di degradazione dell'acido ialuronico, così come i gruppi fosfato non sono tossici per l’organismo.
Sono note alcune reazioni in cui, attraverso reagenti contenenti gruppi fosfato, si ottengono dei gel polimerici [6-13], o mono-, oligo- e polisaccaridi fosfatati [14], ma ad oggi non è stato possibile ottenere polisaccaridi fosfatati solubili in acqua e in soluzioni fisiologiche che presentino spiccate caratteristiche biologiche e farmacologiche e, nel caso specifico dell'acido ialuronico, un'aumentata resistenza alla degradazione da parte della ialuronidasi e quindi un'attività biologica e farmacologica più prolungata nel tempo.
Anche la carbossimetilcellulosa è utilizzata in molte applicazioni biomediche, in particolare nella formulazione di preparati per via orale e topici, data la sua capacità di aumentare la viscosità [15] e in campo oftalmico [16-19]. Di recente è stata utilizzata in formulazioni per via orale come sostituto di diuretici nell'edema epatico e cardiaco e in preparati in grado di evitare la formazione di aderenze postoperatorie [20] e di cicatrici epidurali [21]. Il sale sodico della carbossimetilcellulosa è largamente utilizzato come stabilizzante per compresse e emulsioni [22,23]. In oftalmologia viene utilizzato come sostanza viscoelastica durante interventi chirurgici e laser terapia. L'acido alginico infine è ampiamente utilizzato in campo farmaceutico e biomedico [24], ad esempio in gastroenterologia nel trattamento del riflusso esofageo [25-27], in dermatologia per il trattamento delle ferite [28], in farmacologia come sistema per il rilascio controllato di farmaci [29-32] e come agente capace di inglobare cellule e biomolecole [33,34].
Nella presente invenzione, la fosfatazione degli ossidrili alcolici, presenti nella catena polisaccarìdica, mediante l’impiego di un opportuno reagente fosfatante (schema 1), porta alla formazione di nuovi derivati con caratteristiche chimico-fisiche e biologiche ben definite e diverse da quelle dei polisaccaridi di partenza.
I polielettroliti che possono essere utilizzati come substrato per questa invenzione sono i polisaccaridi in generale ed in particolare i sali sodici dell'acido ialuronico, della carbossimetilcellulosa e dell'acido alginico. I biopolimeri ottenuti presentano caratteristiche di biocompatibilità cellulare, non hanno effetti tossici nei confronti delle cellule, e, nel caso dell’acido ialuronico, presentano un'aumentata resistenza alla degradazione enzimatica. Tali biopolimeri, possono essere utilizzati sia tal quali che in miscela con altri componenti per applicazioni biomediche nel settore farmaceutico, oftalmologico, chirurgico, dermatologico e cosmetico.
Avendo a disposizione questi biopolimeri è possibile sviluppare nuovi idrogeli da impiegare nel settore biomedico-sanitario e farmaceutico, con particolare riguardo al settore oftalmologico e a quello chirurgico. Essi potranno essere altresì impiegati nei processi di crescita cellulare, nei sistemi per rilascio controllato di farmaci, nelle antiadesioni, negli impianti biomedici permanenti, temporanei e bioriassorbibili.
i nuovi biopolimeri possono quindi essere disponibili in forma di gel, creme, microsfere, tessuti, e altre formulazioni, in funzione degli usi terapeutici cui sono destinati. Questi biopolimeri possono anche essere impiegati nei processi di coating, impartendo nuove caratteristiche biologiche alla superficie di materiali usati come supporto.
QuestPnuovi biopolimeri possono essere utilizzati in soluzione acquosa come molecole biologicamente attive per applicazioni in campo biologico e biochimico.
SOMMARIO DELL’INVENZIONE
Forma pertanto oggetto della presente invenzione un derivato fosfatato di un polisaccaride caratterizzato del fatto di essere resistente a degradazione enzimatica e/o di non essere tossico. Preferibilmente il derivato fosfatato ha un grado di fosfatazione tra il 1 % e il 34%. Più preferibilmente, il polisaccaride del derivato fosfatato è l'acido ialuronico. Preferibilmente l'acido ialuronico ha un peso molecolare compreso fra 10.000 e 50.000 Dalton. Più preferibilmente l’acido ialuronico ha un peso molecolare compreso fra 50.000 e 250.000 Dalton. Ancora preferibilmente l’acido ialuronico ha un peso molecolare compreso fra 250.000 e 750.000 Dalton. Ancora più preferibilmente l'acido ialuronico ha un peso molecolare compreso fra 750.000 e 1.250.000 Dalton,
In una forma di attuazione, il polisaccaride è la carbossimetilcellulosa. Preferibilmente la carbossimetilcellulosa ha un peso molecolare compreso fra 90.000 e 2.000.000 Dalton.
In un’altra forma di attuazione il polisaccaride è l’alginato di sodio . Preferibilmente l'alginato di sodio ha un peso molecolare compreso fra 50.000 e 250.000 Dalton.
Forma oggetto della presente invenzione il derivato fosfatato come descritto sopra per uso medico.
Un ulteriore oggetto dell’invenzione è l’uso del derivato fosfatato deII’inw?nzione per la preparazione di un medicamento. Preferibilmente il medicamento ha un'attività compresa nel gruppo: anticoagulante, antiaggregante, osteoinduttiva, osteorigenerativa, antinfiammatoria, stimolante della crescita cellulare, anti-adesione post chirurgiche e anti-cicatrice ipertrofiche.
Forma anche oggetto della presente invenzione l'uso del derivato fosfatato dell'Invenzione per il rivestimento di un oggetto biomedicale. Preferibilmente l'oggetto biomedicale è compreso nel gruppo: catetere, tubicino, sonda, protesi di tessuto molle, protesi di origine animale, tondino artificiale, protesi ossee, lenti a contatto, siringa, strumento chirurgico, sistemo di filtrazione, strumento da laboratorio, contenitore per colture cellulari o per la rigenerazione di cellule e tessuti, supporto per peptidi, proteine, anticorpi. Più preferibilmente l'oggetto biomedicale è utilizzato in oftalmologia, dermatologia, otorinolaringoiatria, odontologia, ginecologia, urologia, chirurgia. Ancora più preferibilmente la chirurgia comprende la chirurgia osteoarticolare, nervosa, anastomotica, viscoelastica, oftalmica, oncologica, plastica, estetica, otorinolaringologica, addomino-pelvica, uroginecologica, cardiovascolare.
Forma oggetto della presente invenzione una composizione farmaceutica comprendente una quantità farmaceuticamente efficace ed accettabile del derivato dell'invenzione. Preferibilmente la composizione farmaceutica è in forma di gel, crema, microsfera o membrana. Più preferibilmente la composizione farmaceutica ha un rilascio controllato.
Le procedure descritte possono essere applicate a sali diversi dei polisaccaridi, senza pregiudicare la reazione, che risulta indipendente dal controione del polisaccaride.
Questi metodi possono essere modificati in vari modi. Tali modifiche non sono da considerarsi come divergenze dallo spinto e dalle prospettive dell’invenzione e tutte quelle modifiche che apparirebbero evidenti ad un esperto del settore sono comprese nell’ambito della presente invenzione.
La presente invenzione verrà ora descritta in suoi esempi non limitativi, con particolare riferimento alle seguenti figure:
Figura 1: Spettri infra-rossi (IR) dei polisaccaridi HA, CMC e dei rispettivi derivati fosfatati. A) HA fosfatato [rapporto molare polisaccaride/ trisodio trimetafosfato (STMP, =1:10], B) HA nativo; C) CMC fosfatata [rapporto molare polisaccaride/STMP = 1:10] D) CMC nativa.
Figura 2: Spettri IR dei polisaccaridi AA e rispettivo derivato fosfatasi, A) AA fosfatato [rapporto molare polisaccaride/STMP = 1:10], B) AA nativo.
Figura 3: Curve di dispersione della velocità di rilassamento R-i, (ottenute dalla misura di 1/Ti dell'acqua) in funzione del campo magnetico applicato ( ωο)Λ : HA 1:10, ■ HA 1:5, ·ΗΑ1:1, ♦HA.
Figura 4: Risultato del test di citotossicità su fibroblasti di topo commerciali (ATCC NCTC L929) dei fosfatati dell'acido ialuronico, con vari gradi di fosfatazione. I valori sono il risultato della media ottenuta su 5 repliche dello stesso campione, osservando 5 zone differenti di ciascuni piastra di Petri per ciascun campione. I dati mostrano che i campioni di HA fosfatato, indipendentemente dal grado di fosfatazione, non hanno nessun effetto tossico sulle cellule. Infatti il numero di cellule presenti nei campioni di HA fosfatato è paragonabile al quelle rilevate nel controllo negativo, PS non citotossico e nettamente superiore a quello riscontrato nel controllo positivo, PVC citotossico. Figura 5: Valori di assorbanza misurati per i derivati fosfatati di HA A) ottenuti secondo l'esempio 1 e B) ottenuti secondo l'esempio 2) a tempi diversi (1, 3, 12 e 24 ore) di digestione con l’enzima ialuronidasi, in funzione delle loro percentuali di fosfatazione.
MATERIALI E METODI
Reagenti
I seguenti reagenti sono stati utilizzati: acido ialuronico (CAS n. 9067-32-7 ; MDL n. MFCD00875848 ; Merck 13, 4776), carbossimetilcellulosa (CAS n. 9004-32-4; MDL n. MFCD00081472), acido alginico (CAS n. 9005-38-3 ; MDL n.MFCD00081310; Merck 13,238)
li reattivo usato per la fosfatazione dei polisaccaridi è il trisodio trimetafosfato (STMP) (CAS n. 7785-84-4), un composto comunemente usato come addensante per sostanze alimentari [35-38].
Per tutti i polisaccaridi oggetto dell'invenzione la reazione avviene come indicato nel schema 1, ma su gruppi ossidrilici in posizione diversa, in funzione della struttura del polimero.
La reazione di fosfatazione è stata condotta sia in soluzione acquosa (protocollo a) che in una miscela di Dimetilsolfossido/acqua (DMSO/H20) (protocollo b). In entrambi i casi è stata realizzata una fosfatazione controllata variando i rapporti molari tra polisaccaridi e agente fosfatante.
Protocollo al
La reazione di fosfatazione viene eseguita aggiungendo, sotto agitazione, il reattivo fosfatante ad una soluzione acquosa, alcalina (pH=13) e termostata a 25°C, del sale sodico del polisaccaride. Il reattivo fosfatante è aggiunto in rapporto molare variabile a seconda del grado di fosfatazione voluto (Tabella 1 ).
Tabella 1. Rapporti molari polisaccaride/STMP utilizzati nella reazione di fosfatazione dei polisaccaridi.
La miscela di reazione viene mantenuta sotto agitazione ad un valore di pH pari a 13 mediante aggiunte successive di una soluzione di NaOH 1.0 M per 20 minuti. Al termine, il pH viene portato alla neutralità mediante piccole aggiunte successive di una soluzione di HCI 1.0 M. Il prodotto fosfatato viene precipitato in acetone. Il precipitato viene quindi filtrato e purificato mediante dialisi, quindi essiccato, o liofilizzato.
Protocollo bl
Il protocollo b) si differenzia dal protocollo a) solo nella fase iniziale, dove il polisaccaride viene dapprima disperso in un solvente organico (dimetilsolfossido) e successivamente alla miscela ottenuta viene aggiunta acqua bidistillata e una soluzione di NaOH 1.0 M per portare la miscela di reazione a pH=13. Da questo punto in poi si procede come nel protocollo a).
I due protocolli a) e b) portano a polisaccaridi tostatati in cui è possibile modulare il grado di fosfatazione del polisaccaride che, nel caso dell’acido ialuronico, si riflette anche in una minore o maggiore resistenza alla biodegradazione.
La reazione del polisaccaride in miscela di DMSO/acqua può portare sia alla formazione di un derivato fosfatato del polisaccaride, che ad una reticolazione del polisaccaride stesso con formazione di un idrogelo insolubile in funzione delle condizioni di aggiunta dei reattivi e della velocità di mescolamento.
La reazione di fosfatazione in tutti i casi comunque consente di fosfatare in modo specifico ed omogeneo la catena polisaccaridica. Le condizioni di pH alle quali avviene la reazione non portano all'idrolisi del polisaccaride nei tempi di reazione utilizzati, come dimostrato in letteratura [39] e verificato attraverso l'analisi rilassometrica NMR (vedi sezione “caratterizzazione chimica").
Di seguito sono riportati esempi non limitativi della presente invenzione:
ESEMPIO 1: Fosfatazione dello laluronato di sodio in fase omogenea
protocollo a)
1 .0 g del sale sodico dell'acido ialuronico è stato solubilizzato in 50.0 cm<3>di acqua bidistillata, la soluzione è stata miscelata sotto agitazione con una soluzione di NaOH ottenuta solubilizzando 40.0 g di base in 50.0 cm<3>di acqua bidistillata. Dopo 3 minuti di energica agitazione è stata aggiunta lentamente la soluzione dì STMP al 23 % m/v in acqua bidistillata fino al raggiungimento della quantità molare di agente fosfatante desiderata (tabella 1 ).
La reazione è stata lasciata a 25 °C sotto agitazione per 20 minuti, trascorsi i quali è stata aggiunta una soluzione di HCI 1.0 M fino alla neutralizzazione della miscela di reazione.
Il prodotto fosfatato è stato quindi precipitato in acetone, filtrato, purificato mediante dialisi (fino a completa eliminazione dei reattivi residui e dei prodotti interni della reazione) ed essiccato in stufa, o liofilizzato.
ESEMPIO 2: Fosfatazione dello ialuronato di sodio in fase eterogenea
Protocollo b)
1.0 g del sale sodico dell'acido ialuronico è stato sospeso in 25.0 cm<3>di dimetilsolfossido per 6 ore, quindi sono stati aggiunti 25.0 cm<3>di acqua bidistillata e la miscela è stata agitata vigorosamente per 1 ora; successivamente, sotto agitazione, è stata aggiunta una soluzione di NaOH, ottenuta solubilizzando 40.0 g di base in 50.0 cm<3>di acqua bidistillata. Dopo 3 minuti di energica agitazione è stata aggiunta lentamente la soluzione di STMP al 23 % m/v in acqua bidistillata fino ad ottenere la quantità molare di agente fosfatante desiderata (tabella 1). La reazione è stata lasciata a 25 °C sotto agitazione per 20 minuti, trascorsi i quali è stata aggiunta ancora la soluzione di HC1 1.0 M fino alla neutralizzazione della miscela di reazione.
Il prodotto fosfatato è stato quindi precipitato in acetone, filtrato, purificato mediante dialisi (fino a completa eliminazione dei reattivi residui e dei prodotti interni della reazione) ed essiccato in stufa, o liofilizzato.
ESEMPIO 3: Fosfatazione del sale sodico dalla carbossimetilcellulosa in fase omogenea
Protocollo a)
1.0 g del sale sodico della carbossimetilcellulosa è stato solubilizzato in 50.0 cm<3>di acqua bidistillata, la soluzione è stata miscelata sotto agitazione con una soluzione di NaOH ottenuta solubilizzando 40.0 g di base in 50.0 cm<3>di acqua bidistillata. Dopo 3 minuti di energica agitazione è stata aggiunta lentamente la soluzione di STMP al 23 % m/v in acqua bidistillata fino al raggiungimento della quantità molare di agente fosfatante desiderata (tabella 1). La reazione è stata lasciata a 25 °C sotto agitazione per 20 minuti, trascorsi i quali è stata aggiunta una soluzione di HCI 1.0 M fino alla neutralizzazione della miscela di reazione.
Il prodotto fosfatato è stata quindi precipitato in acetone, filtrato, purificato mediante dialisi (fino a completa eliminazione dei reattivi residui e dei prodotti interni della reazione) ed essiccato in stufa, o liofilizzato.
ESEMPIO 4: Fosfatazione del sale sodico dalla carbossimetil cellulosa in fase eterogenea
Protocollo b)
1.0 g del sale sodico della carbossimetil cellulosa è stato sospeso in 25.0 cm<3>di dimetilsolfossido per 6 ore, quindi sono stati aggiunti 25.0 cm<3>di acqua bidistillata e la miscela è stata agitata vigorosamente per 1 ora; successivamente, sotto agitazione è stata aggiunta una soluzione di NaOH ottenuta solubilizzando 40.0 g di base in 50.0 cm<3>di acqua bidistiliata. Dopo 3 minuti di energica agitazione, è stata aggiunta lentamente la soluzione di STMP al 23 % m/v in acqua bidistiliata fino ad ottenere la quantità molare di agente fosfatante desiderata (tabella 1). La reazione è stata lasciata a 25 °C sotto agitazione per 20 minuti, trascorsi i quali è stata aggiunta ancora la soluzione di HCI 1.0 M fino alla neutralizzazione della miscela di reazione.
Il prodotto fosfatato è stato quindi precipitato in acetone, filtrato, purificato mediante dialisi (fino a completa eliminazione dei reattivi residui e dei prodotti interni della reazione) ed essiccato in stufa, o liofilizzato.
ESEMPIO 5: Fosfatazione del sale sodico dell'acido alginico in fase omogenea
Protocollo a)
1.0 g del sale sodico dell'acido alginico è stato solubilizzato in 50.0 cm<3>di acqua bidistiliata, la soluzione è stata miscelata sotto agitazione con una soluzione di NaOH ottenuta solubilizzando 40.0 g di base in 50.0 cm<3>di acqua bidistiliata. Dopo 3 minuti di energica agitazione è stata aggiunta lentamente la soluzione di STMP al 23 % m/v in acqua bidistiliata fino al raggiungimento della quantità molare di agente fosfatante desiderata (tabella 1). La reazione è stata lasciata a 25 °C sotto agitazione per 20 minuti, trascorsi i quali è stata aggiunta una soluzione di HCI 1.0 M fino alla neutralizzazione della miscela di reazione.
Il prodotto fosfatato è stato quindi precipitato in acetone, filtrato, purificato mediante dialisi (fino a completa eliminazione dei reattivi residui e dei prodotti interni della reazione) ed essiccato in stufa, o liofilizzato.
ESEMPIO 6: Fosfatazione del sale sodico dell'acido alginico in fase eterogenea
Protocollo b)
1.0 g del sale sodico dell'acido alginico è stato sospeso in 25.0 cm<3>di dimetilsolfossido per 6 ore, quindi sono stati aggiunti 25.0 cm<3>di acqua bidistillata e la miscela è stata agitata vigorosamente per 1 ora; successivamente, sotto agitazione è stata aggiunta una soluzione di NaOH ottenuta solubilizzando 40.0 g di base in 50.0 cm<3>di acqua bidistillata. Dopo 3 minuti di energica agitazione è stata aggiunta lentamente la soluzione di STMP al 23 % m/v in acqua bidistillata fino ad ottenere la quantità molare di agente fosfatante desiderata (tabella I ). La reazione è stata lasciata a 25 °C sotto agitazione per 20 minuti, trascorsi i quali è stata aggiunta ancora la soluzione di HCI 1.0 M fino alla neutralizzazione della miscela di reazione .
II prodotto fosfatato è stato quindi precipitato in acetone, filtrato, purificato mediante dialisi (fino a completa eliminazione dei reattivi residui e dei prodotti interni della reazione) ed essiccato in stufa, o liofilizzato.
Caratterizzazione chimica
Analisi Infrarossa
I composti purificati ed essiccati sono stati analizzati mediante spettroscopia infrarossa utilizzando un spettrometro FT-IR (modello Thermo Nicole† 5700) corredato di accessorio ATR (Attenuated Total Refiection) con un cristallo di germanio.
Le condizioni sperimentali sono state le seguenti:
numero di scansioni: 256;
risoluzione: 4.0 cm<‘1>;
energia del laser: 0.46 W;
apodizazione: Happ-Genzel;
correzione background: no.
Gli spettri infrarossi dei composti prima e dopo la modifica sono riportati in Figure 1, 2. 1 principali numeri d'onda osservati negli spettri sono riportati in tabella 2 insieme alle relative attribuzioni.
Tabella 2. Principali numeri d'onda osservati negli spettri IR dei polisaccaridi nativi e fosfatati e la loro relativa attribuzione.
Per ogni polisaccaride è stato riportato il prodotto con il grado di fosfatazione più alto.
I numeri d'onda più significativi, che testimoniano l'avvenuta fosfatazione, sono quelli che cadono nella regione tra 1350-1250 cm<'1>, relativi allo stiramento del gruppo P=0 e nella regione 1100-990 cm<'1>relativi allo stiramento del gruppo C-O-P.
Come si può vedere, ie suddette bande sono presenti in tutti gli spettri dei derivati tostatati, anche se con intensità diverse a causa del diverso grado di fosfatazione.
Le bande più caratteristiche dei polisaccaridi nativi oggetto dell'invenzione (che si ritrovano ovviamente anche negli spettri dei polisaccaridi tostatati) sono quelle relative ai modi vibrazionali del gruppo ammidico (stretching del C=0 a 1648 cm<'1>e bending del N-H a 1546 cm<'1>) presente nello spettro dell'acido ialuronico e del gruppo carbossilato (stretching asimmetrico a 1610 cm<'1>e stretching simmetrico a 1403 cm<"1>) presente negli spettri di tutti e tre i polisaccaridi. Negli spettri dei polisaccaridi nativi e fosfatati è inoltre evidente una banda larga a 3500 cm<'1>, dovuta alle vibrazioni dei gruppi ossidrilici, che diminuisce in intensità nel caso di derivati con elevato grado di fosfatazione.
Determinazione del grado di fosfatazione
Per ogni polisaccaride fosfatato è stato determinato il grado di fosfatazione, espresso come la percentuale di unità disaccaridica fosfatata, considerando che ogni unità disaccaridica contenga un gruppo fosfato.
In schema 2 è riportata, come esempio, l'unità disaccaridica del sale sodico dell'acido ialuronico monofosfatato.
Schema 2 - Unità disaccaridica dell'acido ialuronico monofosfatato. La determinazione del grado di fosfatazione è stata eseguita nel seguente modo:
Una quantità nota di polisaccaride fosfatato è stata pesata esattamente e distrutta in acido nitrico concentrato a caldo per 10 minuti. Il prodotto derivante dalla distruzione è stato diluito in una quantità nota di acqua distillata e il contenuto di gruppi fosfato è stato determinato spettrofotometricamente con l'utilizzo di un kit commerciale (Test Aquaquant® Merck KgaA - Darmstadt - Germany ). I risultati per ogni campione analizzato sono riportati in tabella 3.
Tabella 3 - Valori della percentuale di fosfatazione dei polisaccaridi HA, CMC, AA fosfatati in funzione del rapporto molare polisaccaride/agente fosfatante (STMP)
Analisi rilassometrica NMR f<1>H field-cvclinal
L'analisi rilassometrica NMR (<1>H field-cycling) è stata effettuata su 3 campioni di acido ialuronico fosfatato con diversi gradi di fosfatazione(HA1:1; HA1:5 HA1:10). Confrontando i dati ottenuti con quelli relativi al polisaccaride non modificato (HA) è stato possibile ottenere informazioni sul peso molecolare e quindi sul grado di fosfatazione dei tre derivati fosfatati. Dai dati rilassometrìci è stata inoltre^ttenuta la dimostrazione che le condizioni sperimentali, se pur drastiche, non portano a deterioramento del polisaccaride né ad una frammentazione della sua catena. In Figura 3 è riportata la curva di dispersione della velocità di rilassamento Ri estrapolata dalla misura di 1/Ti dell'acqua in relazione al campo magnetico applicato. I campioni sono stati preparati sciogliendo il polisaccaride in acqua distillata per ottenere soluzioni la cui concentrazione polisaccaridica fosse di 15 mg/ml.
In un sistema polimerico non confinato il grado di rilassamento dovrebbe avere una frequenza di (1/Ti<κ>ar<1/3>) legata al peso molecolare del polimero stesso.
Come si può vedere in Figura 3, i valori di 1/Ti aumentano andando dal polimero nativo verso il polimero con un maggior grado di fosfatazione. Questo dato dimostra che vi è un aumento del peso molecolare, dovuto all'introduzione dei gruppi fosfato, e che le condizioni sperimentali non portano ad una distruzione della catena polimerica.
Caratterizzazione biologica
Test di Citotossicità
Cotture di fibroblasti.
La citotossicità è stata valutata utilizzando fibroblasti di topo commerciali (ATCC NCTC L929) coltivati in fiasche di polistirene con MEM (Eagle's Minimal Essential Medium) addizionato con siero fetale bovino al 10% (v/v) (Sigma Chemicals Co., USA), 200mM L-glutammina (Sigma Chemicals Co., USA) e gentamicina 5 mg/ml di (SigméTChemicals Co., USA). I fibroblasti sono stati incubati a 37°C in atmosfera contenente il 5% di C02fino al raggiungimento della confluenza del monostrato cellulare. Le cellule sono state distaccate usando una soluzione allo 0.25% v/v di tripsina sterile in 0.05% EDTA (Sigma Chemicals Co. USA) e sospese in medium.
Esecuzione del test
In ogni pozzetto di una piastra per colture cellulari sono stati posti 0.1 mi di una sospensione contenente 8 x10<4>celluie/ml. La piastra è stata quindi incubata a 37 °C in atmosfera arricchita al 5% di C02.
Successivamente, ad ogni pozzetto, contenente un monostrato di cellule, sono stati addizionati 1.0 mi di MEM contenente 5.0 mg/ml del polisaccaride fosfatato. Ciascuna soluzione è stata sterilizzata per filtrazione (filtri Corning 0.22 micron). Le piastre sono state lasciate in incubatore per 24 ore. Al termine le cellule sono state fissate con glutaraideide e marcate con trypan blue per permetterne la conta attraverso un microscopio ottico. La superficie di polistirene (PS) delle piastre da coltura ha costituito il controllo negativo, mentre dischetti di poli-cloruro di vinile (PVC) stabilizzati con stagno sono stati utilizzati come controllo positivo, seguendo le norme ISO (ISO-10993-5). I risultati sono mostrati in Figura 4 e in Tabella 4. Per ogni campione sono state ripetute 5 repliche.
Tabella 4 - prove di citotossicità dei polisaccaridi tostatati su fibroblasti di topo commerciali (ATCC NCTC L929). I valori sono il risultato della media ottenuta su 5 repliche dello stesso campione, osservando 5 zone differenti di ciascuna piastra di Petri per ciascun campione.
I valori riportati nella Tabella 4 e nella Figura 4 mostrano chiaramente che i campioni di HA fosfatato, CMC fosfatato e AA fosfatato non hanno nessun effetto tossico sulle cellule. Infatti il numero di cellule presenti nei campioni suddetti è paragonabile al quelle rilevate nel controllo negativo, PS non citotossico e nettamente superiore a quello riscontrato nel controllo positivo, PVC citotossico.
Degradazione enzimatica
La degradazione enzimatica è stata effettuata basandosi sui metodo Ola M. Saad et al. [40] ed apportando a quest'ultimo minime variazioni. Brevemente, sono state preparate, in tampone di acetato di ammonio a pH fisiologico, soluzioni dei derivati fosfatati dell'acido ialuronico contenenti ciascuno 15.0 microgrammi di polimero in 1.0 mi di soluzione tampone. Le soluzioni sono state poste in un bagno termostatato a 37°C. Successivamente, ad ogni soluzione, è stata aggiunta una quantità nota di ialuronidasi (Sigma) per digerire l'acido ialuronico ed ottenere l’acido uranico. Il sale sodico dell'acido ialuronico è stato utilizzato come contrailo.
Per ogni campione è stato aggiunto un eccesso di enzima ialuronidasi e la quantità di acido uranico, prodotto in funzione del tempo di digestione, è stata determinata per via spettrofotometrica, attraverso l'esecuzione del saggio del carbazolo [41,42]. Brevemente, 100.0 microlitri della soluzione proveniente dalla degradazione sono stati aggiunti ad una soluzione contenente acido solforico concentrato e tetraborato di sodio decaidrato. La soluzione risultante è stata riscaldata a 100°C per 10 minuti. Successivamente è stata aggiunta una soluzione di carbazolo al 0.125% w/v in etanolo assoluto e la miscela è stata scaldata per ulteriori 15 minuti a 100°C. L'assorbanza finale cfella soluzione a 530 nm è stata determinata tramite uno spettrofotometro UV-visibile (Perkin-Elmer modello Lambda 25). Per ogni campione sono state effettuate 3 repliche.
Nelle Figure 5A e 5B sono stati riportati j valori di assorbanza dei saggio ai carbazolo in funzione della percentuale di fosfatazione del polisaccaride a tempi di digestione diversi (da 1 a 24 ore). I tostatati dello ialuronato di sodio sintetizzati secondo l'Esempio 1 e l'Esempio 2, riportati sopra, sono stati confrontati con lo ialuronato di sodio non fosfatato (controllo).
Come si evidenzia nelle figure 5A e 5B tutti i derivati fosfatati dello ialuronato presentano una notevole resistenza all'idrolisi, in termini di produzione di acido uranico, da parte della ialuronidasi. Il controllo, ovvero l’acido ialuronico non modificato, risulta notevolmente degradato dopo 3 ore di digestione e, anche prolungando il tempo di digestione fino a 24 ore, non si nota un aumento rilevante di acido uranico in soluzione. Questo lascia presupporre che nelle prime ore la digestione sia pressoché completa, come confermato dalla letteratura e dalle specifiche tecniche fornite dalla casa produttrice dell'enzima. Per quanto riguarda i fosfatati, nessuno di loro raggiunge nelle prime 24 ore un livello di degradazione equivalente al controllo, inoltre risulta evidente che, aumentando il grado di fosfatazione, aumenta la resistenza alla degradazione tanto che il polisaccaride più fosfatato dopo 24 di digestione risulta degradato meno della metà del controllo.
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Claims (1)
- RIVENDICAZIONI 1- Derivato fosfatato di un polisaccaride caratterizzato del fatto di essere resistente a degradazione enzimatica e/o di non essere tossico. 2- Derivato fosfatato secondo la rivendicazione 1 avente un grado di fosfatazione tra il 1% e il 34%. 3- Derivato fosfatato secondo la rivendicazione 1 o 2 in cui il polisaccaride è l'acido ialuronico. 4- Derivato fosfatato secondo la rivendicazione 3 in cui l'acido ialuronico ha un peso molecolare compreso fra 10.000 e 50.000 Dalton. 5- Derivato fosfatato secondo la rivendicazione 3 in cui l’acido ialuronico ha un peso molecolare compreso fra 50.000 e 250.000 Dalton. 6- Derivato fosfatato secondo la rivendicazione 3 in cui l'acido ialuronico ha un peso molecolare compreso fra 250.000 e 750.000 Daiton. 7- Derivato fosfatato secondo la rivendicazione 3 in cui l'acido ialuronico ha un peso molecolare compreso fra 750.000 e 1.250.000 Dalton. 8- Derivato fosfatato secondo la rivendicazione 1 o 2 in cui il polisaccaride è la carbossimetilcellulosa. 9- Derivato fosfatato secondo la rivendicazione 8 in cui la carbossimetilcellulosa ha un peso molecolare compreso fra 90.000 e 2.000.000 Dalton. 10-Derivato fosfatato secondo la rivendicazione 1 o 2 in cui il polisaccaride è l’alginato di sodio . 11 -Derivato fosfatato secondo la rivendicazione 10 in cui l'alginato di sodio ha un peso molecolare compreso fra 50.000 e 250.000 Daiton. 12- Derivato fosfatato secondo una delle rivendicazioni precedenti per uso medico. 13-Uso dei derivato fosfatato secondo una delle rivendicazioni precedenti per la preparazione di un medicamento. 14-Uso secondo la rivendicazione 13 in cui il medicamento ha un'attività compresa nel gruppo: anticoagulante, antiaggregante, osteoinduttiva, osteorigenerativa, antinfiammatoria, stimolante della crescita cellulare, anti-adesione post chirurgiche e anti-cicatrice ipertrofiche. 15-Uso del derivato fosfatato secondo le rivendicazioni 1-12 per il rivestimento di un oggetto biomedicale. 16- Uso secondo la rivendicazione 15 in cui l’oggetto biomedicale è compreso nel gruppo: catetere, tubicino, sonda, protesi di tessuto molle, protesi di origine animale, tondino artificiale, protesi ossee, lenti a contatto, siringa, strumento chirurgico, sistemo di filtrazione, strumento da laboratorio, contenitore per colture cellulari o per la rigenerazione di cellule e tessuti, supporto per peptidi, proteine, anticbrpi. 17-Uso secondo la rivendicazione 16 in cui l'oggetto biomedicale è utilizzato in oftalmologia, dermatologia, otorinolaringoiatria, odontologia, ginecologia, urologia, chirurgia. 18- Uso secondo la rivendicazione 17 in cui la chirurgia comprende la chirurgia osteoarticolare, nervosa, anastomotica, viscoelastica, oftalmica, oncologica, plastica, estetica, otorinolaringologica, addomino-pelvica, uroginecologica, cardiovascolare. 19-Composizione farmaceutica comprendente una quantità farmaceuticamente efficace ed accettabile del derivato secondo le rivendicazioni 1-12 . 20-Composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 19 essendo in forma di gel, crema, microsfera o membrana. 21 -Composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 19-20 avente un rilascio controllato.
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