ITRM20000693A1 - Procedimento per la determinazione quantitativa dello iodio in fluidibiologici, e apparato semiautomatico per la sua attuazione. - Google Patents

Description

Descrizione dell'invenzione industriale dal titolo: PROCEDIMENTO PER LA DETERMINAZIONE QUANTITATIVA DELLO IODIO IN FLUIDI BIOLOGICI, E APPARATO SEMIAUTOMATICO PER LA SUA ATTUAZIONE;

La presente invenzione riguarda il settore delle analisi biologiche e cliniche, ed in particolare un metodo e relativo apparato per effettuare le analisi della cosiddetta "Ioduria", cioè della quantità di iodio presente nell'organismo di un paziente, che sono particolarmente usate in medicina nucleare ed in endocrinologia .

La determinazione della quantità di iodio nei fluidi biologici, e in particolare nell'urina, è il mezzo principale per scoprire carenze o eccessi nutrizionali e/o patologici di iodio nell'organismo. La misurazione analitica dello ioduro nelle urine è di particolare importanza anche nella terapia dei tumori tiroidei, ove viene effettuata una distruzione dei tessuti tiroidei per irraggiamento selettivo con 13II (radioablazione).

Poiché, come vedremo meglio nel seguito, la presenza di quantità importanti di iodio nel paziente inibisce l'effetto radioablativo, è necessario eseguire un accurato "screening" analitico dello ioduro (ione I-) nelle urine non solo nei pazienti con carenze nell' "intake" di iodio, ma anche prima delle terapie con <131>I, per scoprire e correggere eventuali sovraccarichi patologici e/o accidentali.

Attualmente, la determinazione dello I<- >nelle urine viene di regola effettuata nei laboratori chimici secondo metodiche analitiche affidabili, ma che hanno bisogno di strumentazione analitica complessa di uso non frequente nei reparti ospedalieri .

E' utile ricordare che tutto lo iodio che passa nel sangue dopo ingestione con acqua o alimenti, sotto varie forme chimiche, è trasformato in ioduro captato dalla tiroide, ed è convertito successivamente negli ormoni tiroidei tirossina e triiodotironina .

Oltre il 90% dello iodio è eliminato dall'organismo sotto forma di ioduro con le urine.

In effetti, la terapia dei tumori tiroidei è innanzitutto di tipo chirurgico, ma l'operazione chirurgica non riesce ad eliminare tutto il tessuto tiroideo, e per tale ragione successivamente all'operazione viene effettuata una distruzione dei tessuti tiroidei per irraggiamento selettivo (radioablazione) a cui si è accennato precedentemente .

Dal punto di vista pratico, dopo l'operazione chirurgica, dosi terapeutiche di <131>I sotto forma di NaI (ioduro di sodio) vengono somministrate al paziente per via orale; lo iodio in parte viene eliminato con le urine, in parte si accumula nei tessuti tiroidei rimasti, irraggiandoli selettivamente (lo iodio è un beta emittente), fino a provocare la morte cellulare del tessuto tumorale residuo .

Lo stesso principio di radioablazione viene utilizzato nella distruzione di metastasi da tumore tiroideo .

Lo <131>I che viene captato dalla tiroide è però in competizione con lo ioduro presente nell'organismo, per cui prima del trattamento si consiglia al paziente una dieta a basso contenuto di iodio.

In molti casi si riscontra comunque una elevata quantità di iodio nell'organismo, con forte effetto di inibizione.

Spesso lo iodio in eccesso è dovuto all'uso di mezzi di contrasto iodati, utilizzati nelle TAC e nelle diagnostiche radiografiche in genere; in altri casi è dovuto all'uso di farmaci o disinfettanti contenenti iodio.

In tutti questi casi la terapia di radio ablazione è assolutamente inefficace, a causa della bassa captazione specifica dello <131>I, per tale motivo è importante effettuare un accurato "screening" analitico di I<- >nelle urine.

L'esigenza è sentita da tutti i Reparti di Medicina Nucleare che effettuano trattamenti con radioiodio, ma non hanno a disposizione un kit semplice ed affidabile per effettuare in tempo reale la determinazione analitica quantitativa.

Attualmente la determinazione dello I<- >nelle urine, che solitamente si effettua nei laboratori chimici, avviene secondo due metodiche analitiche: determinazione potenziometrica diretta dello ioduro mediante elettrodo selettivo per lo iodio, o la determinazione spettrofotometrica dello ioduro per reazione di Sandell-Kolthoff.

Nella determinazione potenziometrica diretta, la quantità di ioduro nelle urine viene determinata misurando il potenziale di un elettrodo selettivo rispetto a un elettrodo di riferimento, sia nel campione di urine che in una serie di campioni standard.

Questa metodica, pur garantendo una sufficiente riproducibilità, ha una ridotta sensibilità per i valori bassi di ioduro. Inoltre l'elettrodo selettivo è molto delicato, è particolarmente soggetto a sporcarsi e possiede un alto costo aggravato da una vita piuttosto breve (circa sei mesi).

La seconda delle metodologie comunemente usate, cioè la determinazione spettrofotometrica dello ioduro per reazione di Sandell-Kolthoff , si basa sul fatto che nella riduzione dello ione Ce<4+>->Ce<3+ >accoppiata all'ossidazione As<3+>→As<5+>, lo ioduro si comporta da catalizzatore. Lo ione Ce<4+ >è intensamente colorato in giallo, mentre lo ione Ce<3+ >è incolore. Una misura spettrofotometrica del Ce<4+ >rimasto permette di determinare la quantità di iodio.

In sostanza, ad una provetta che contiene le urine su cui determinare lo iodio viene aggiunto dell'acido arsenioso, e quindi del solfato cerico.

L'intensità della colorazione gialla viene letta alla lunghezza d'onda di 405 nm, e la diminuzione di intensità rispetto alla intensità iniziale è proporzionale alla quantità di I<- >(ioduro) presente in soluzione.

Il metodo è piuttosto preciso, accurato e sensibile .

Prima della determinazione è necessario eliminare alcuni interferenti della reazione di Sandell-Kolthoff, quali ad esempio il tiocianato (SCN-), che è tipicamente presente in quantità apprezzabile nelle urine dei fumatori.

Tale eliminazione viene ottenuta trattando a caldo le urine con acido clorico, preferibilmente con una miscela acido clorico/sodio cromato, o con persolfato di ammonio.

Uno svantaggio di tale metodologia nota, è dato dal fatto che per la determinazione quantitativa dello iodio è necessario disporre di un buon spettrofotometro, e inoltre la determinazione non si presta alle misure in campo.

La necessità di disporre di un metodo analitico per l'analisi dello iodio nelle urine sufficientemente rapido, economico e utilizzabile anche fuori dai laboratori analitici ha condotto la nota azienda MERCK<® >alla brevettazione e messa in commercio di un "kit", denominato "Merck Rapid Urinary Test".

In esso le urine vengono fatte passare attraverso una colonna di carbone attivo per l'eliminazione di alcuni interferenti, poi viene effettuata l'ossidazione della tetrametilbenzidina con acido peracetico, catalizzata dallo iodio.

Il colore ottenuto dopo la reazione può differenziare le urine in tre gruppi:

- < 10μς/dl, (giallo)

- 11-30 μg/dl (verde)

- > 30 μg/dl (blu)

Il metodo di analisi fornito da questo kit noto è semplice e affidabile, ma permette solo una distinzione semiquantitativa in tre gruppi.

Scopo principale della presente invenzione, è di superare i problemi e gli svantaggi suddetti fornendo un metodo analitico ed un apparato semplice ed economico, in grado di fornire risultati quantitativi sulla concentrazione di ioduro nelle urine ed in altri fluidi biologici anche in laboratori privi di strumenti analitici quali spettrofotometri e potenziometri di precisione.

Ciò è stato ottenuto, secondo il trovato, fornendo un metodo ed un apparato che, pur essendo basati essenzialmente sulla già menzionata reazione di Sandell-Kolthof f, sfruttano la proporzionalità inversa tra il tempo di viraggio della colorazione di una soluzione dei fluidi biologici da analizzare e la quantità di iodio presente in essi.

Una migliore comprensione dell'invenzione, si avrà con riferimento alle figure che illustrano schematicamente, a solo titolo esemplificativo e non già limitativo, una preferita forma realizzativa dell' apparato .

Nei disegni:

la figura 1 è un grafico che mostra la curva di taratura ottenuta a partire da quantità note di iodio, sullo stesso grafico sono riportati i valori ricavati analizzando le urine di due soggetti sani; e la figura 2 è uno schema che mostra un apparato per la realizzazione del metodo secondo il trovato.

E' noto che la reazione di riduzione del Ce da 4 a 3 è tanto più veloce guanto più iodio è presente nelle urine.

Pertanto, secondo l'invenzione, aggiungendo alle urine un eccesso di acido arsenioso, del solfato cerico e un indicatore di ossido riduzione, è possibile misurare il tempo che trascorre tra l'addizione dei reagenti nelle urine, e la completa riduzione del Ce<4+>.

Si trova sperimentalmente che tale tempo è inversamente proporzionale alla quantità dello ioduro presente, che catalizza la reazione.

Quindi, secondo il trovato, è sufficiente misurare i tempi di riduzione nel campione incognito e in alcuni standard, per determinare lo iodio presente nel campione di fluido corporeo analizzato.

A tale scopo, il metodo oggetto dell'invenzione comprende sostanzialmente le seguenti fasi:

1. eliminazione selettiva di alcune sostanze che possono interferire, quali ad esempio il tiocianato (SCN-), ossidandole mediante aggiunta ad una soluzione del fluido biologico da analizzare di un primo reagente A;

2. riscaldamento della soluzione contenente il fluido biologico ad una temperatura compresa tra 100 e 110°C per circa 60 min. e successivo raffreddamento;

3. aggiunta di un secondo reagente B atto a creare nella soluzione un ambiente fortemente riducente; 4. aggiunta di un terzo reagente C atto a indicare lo stato di ossido-riduzione presente in soluzione; 5. aggiunta in soluzione di un quarto reagente D avente la funzione di agente ossidante ed inizio del conteggio del tempo;

6.monitoraggio dei cambiamenti di colore della soluzione, fino all'apparizione della prima sfumatura rosa-arancio, nettamente visibile, in corrispondenza della quale viene rilevato tempo trascorso dall'aggiunta del quarto reagente D;

7. determinazione della quantità di iodio contenuta nella soluzione leggendo il grafico di figura 1 in funzione del tempo rilevato.

A titolo illustrativo, si riporta qui di seguito un esempio di determinazione secondo il metodo ora descritto, in cui il fluido biologico è urina in soluzione acquosa dal 10÷100%, preferibilmente 50%.

In una provetta di vetro vengono posti 250 μl di urina ai quali si aggiungono 250 μl di H20,e 500 μl di reagente A, preferibilmente costituito da acido clorico dal 5%÷35%, preferibilmente al 28%, detta soluzione viene poi scaldata a circa 100÷110°C per un tempo tra 5 muniti e 2 ore, preferibilmente per 60 minuti .

Il reagente A che agisce da ossidante ha lo scopo di distruggere selettivamente alcune sostanze, principalmente il tiocianato, che sono particolarmente presenti nelle urine dei fumatori, e interferiscono pesantemente con la reazione di Sandell-Kolthoff e quindi con la determinazione dello iodio .

In alternativa all'acido clorico, come ossidante si può anche usare il persolfato, il quale però "soffre" dì scarsa riproducibilità dei risultati.

Dopo aver fatto raffreddare la soluzione, ad essa vengono aggiunti:

- 500 μΐ dì reagente B riducente, costituito preferibilmente da una soluzione da 1÷50 mg/ml, preferibilmente 10 mg/ml di As203, e 10÷100 mg/ml, preferibilmente 25 mg/ml di NaCl sciolti in acido solforico 0,1N÷10N, preferibilmente IN,

- 20 μl di reagente C indicatore di ossidoriduzione, costituito preferibilmente da ortoferro fenantrolina 0,1÷10%, preferibilmente 6%, e - 20 μΐ di reagente D, che è l'agente ossidante della reazione, costituito preferibilmente da solfato cerico 0,01N÷3N, preferibilmente 0,2N in acido solforico 0,1N÷10N, preferibilmente 3,5N.

Al momento dell'aggiunta del reagente D, viene fatto partire un cronometro: per l'aggiunta del cerio il colore della soluzione vira immediatamente da arancio a verde.

Il reagente B crea nella soluzione un ambiente fortemente riducente, mentre il reagente C ha lo scopo di indicare lo stato dì ossido riduzione presente in soluzione: una colorazione arancio indica la presenza di Fe<2+ >nel complesso tra il Ferro e la orto-ferro fenantrolina, e quindi un ambiente riducente, una colorazione azzurra indica la presenza di Fe<3+ >nel complesso, e quindi un ambiente ossidante .

A causa dell'aggiunta dei reagenti B e C alle urine, l'ambiente diventa riducente e quindi la ortoferro fenantrolina si colora in arancio.

Dopo l'addizione del reagente D l'ambiente diventa ossidante, pertanto avviene rapidamente l'ossidazione del ferro del complesso orto-ferro fenantrolina, che diventa azzurra, e avviene lentamente la ossidazione dell'arsenito ad arseniato da parte del cerio tetravalente, catalizzata dallo ioduro presente.

Mentre la reazione di riduzione del Ce<4+ >da parte dell'As<3+ >ha luogo, la soluzione acquisisce un colore verde, risultante dal Ce<4+ >presente di colore giallo e dalla orto-ferro fenantrolina ossidata, di colore azzurro.

Mentre il Ce<4+ >viene ridotto a Ce<3+>, e quindi il colore giallo scompare, la soluzione si scolora lentamente, fino a diventare azzurro pallido quando tutto il Ce<4+ >è stato consumato. A quel punto l'arsenito in eccesso, che funge da riducente, riporta la orto-ferro fenantrolina al suo colore arancio originale.

Quindi, all'apparire della prima sfumatura rosa arancio, nettamente visibile, il cronometro viene fermato ed il tempo trascorso viene riportato in grafico e confrontato con una serie di tempi ricavati da standard a concentrazione via via crescente di ioduro.

In questo modo, secondo il trovato, la semplice misurazione del tempo di viraggio all'originario colore arancio consente di ricavare immediatamente, da un grafico come quello di figura 1, la quantità di iodio presente nelle urine esaminate.

Un esempio di determinazione su tre standard, ripetuta per tre volte, ha fornito i seguenti risultati :

Come si vede la riproducibilità di risposta è eccellente .

I valori di ioduria trovati e riportati nel grafico di figura 1 (23,7 ng e 16,5 ng), corrispondono rispettivamente a 9,5 μg/dl e a 6,6 μg/dl, e rientrano perfettamente nel range di normalità definito compreso nell'intervallo tra 5 μg/dl e 30 μg/dl.

Secondo la presente invenzione, al fine di facilitare l'attuazione del procedimento fin qui descritto cogliendo esattamente il punto di inizio e di fine del viraggio, è stato ideato l'apparato mostrato in figura 2.

L'apparato che · si descrive comprende sostanzialmente:

- una provetta 6 per la soluzione di fluido biologico da analizzare;

- tre siringhe o pipette (non mostrate) predisposte con la giusta quantità di reagenti A, B e C da aggiungere alla soluzione nella provetta;

- una siringa speciale 1 dotata di contatti elettrici 2 di fondo-corsa dello stantuffo 3, contenente il quarto reagente D da aggiungere alla soluzione nella provetta;

- un cronometro o timer 5 che viene avviato dalla chiusura dei suddetti contatti elettrici di fondocorsa e che viene fermato mediante un apposito pulsante di stop 4;

- un supporto 7 per la provetta 6, preferibilmente retroilluminato, atto a facilitare il rilevamento del viraggio del colore della soluzione nella provetta stessa.

In questo dispositivo, ciascuno dei primi tre reagenti A, B e C viene aggiunto alla soluzione di fluido biologico mediante una comune siringa o una pipetta, mentre il reagente D viene aggiunto mediante un'apposita siringa 1 dotata di contatti elettrici 2 di fondocorsa dello stantuffo 3 riportata in figura 2.

Appena effettuata l'aggiunta, i contatti elettrici 2 montati sulla siringa 1 fanno partire un cronometro 5 preferibilmente digitale.

Dal punto di vista operativo, non appena il quarto reagente D è stato immesso nella provetta 6, quest' ultima viene rapidamente e brevemente agitata, e posta su un supporto 7 preferibilmente retroilluminato in modo che l'operatore, non appena vede comparire la caratteristica sfumatura rossa causata dalla riduzione della orto fenantrolina , ferma il cronometro 5 premendo l'apposito pulsante dì stop 4.

Il semplice apparato secondo l'invenzione, consente una eccellente riproducibilità nei tempi, abbinata a una notevole facilità d'uso.

Il metodo si presta anche ad analisi su altri liquidi biologici, quali ad esempio plasma, o idrolizzati di proteine.

L'apparato fin qui descritto, economico ed affidabile grazie alla semplicità dei suoi componenti, è di particolare interesse di tutti quei laboratori medici che hanno necessità di determinare il contenuto di ioduro nelle urine per la ricerca di carenze nutrizionali, ma anche in tutti i Reparti di Medicina Nucleare, che possono così effettuare in proprio, su tutti i pazienti candidati ad un intervento di radioablazione tiroidea, una veloce ed affidabile determinazione del carico di ioduro fisiologico, e delle variazioni della ioduria successive all'intervento terapeutico.

La presente invenzione è stata descritta ed illustrata in una sua preferita forma applicativa e realizzativa, ma è evidente che qualunque tecnico esperto del settore potrà apportarvi modifiche e/o sostituzioni funzionalmente equivalenti, senza peraltro esulare dall'ambito di tutela della presente privativa industriale.

Claims (20)

1. RIVENDICAZIONI 1. Metodo per la determinazione quantitativa dello iodio in fluidi biologici, caratterizzato dal fatto che, basandosi sulla nota reazione di Sandell-Kolthoff, prevede di misurare il tempo di reazione completa di una soluzione di fluido biologico da analizzare, segnalata dal viraggio della colorazione della soluzione stessa, e di determinare la quantità di iodio contenuta nella soluzione stessa sfruttando la proporzionalità inversa tra il tempo di viraggio della soluzione e la quantità di iodio in essa contenuta che funge da catalizzatore; la determinazione della quantità di iodio venendo effettuata mediante delle curve standard che riportano la quantità di iodio contenuto in funzione dei tempi di viraggio.
2. 2. Procedimento secondo la rivendicazione precedente, caratterizzato dal fatto che comprende sostanzialmente le seguenti fasi: a) eliminazione selettiva dì alcune sostanze che possono interferire, quali ad esempio il tiocianato (SCN-), ossidandole mediante ,aggiunta ad una soluzione del fluido biologico da analizzare di un primo reagente (A); b) riscaldamento della soluzione contenente il fluido biologico ad una temperatura compresa tra 100 e 110°C per un tempo compreso tra 15 minuti e 2 ore e successivo raffreddamento; c} aggiunta di un secondo reagente (B) atto a creare nella soluzione un ambiente fortemente riducente; d) aggiunta di un terzo reagente (C) atto a indicare lo stato di ossido-riduzione presente in soluzione; e) aggiunta in soluzione di un quarto reagente (D) avente la funzione di agente ossidante ed inizio del conteggio del tempo; f) monitoraggio dei cambiamenti di colore della soluzione, fino all'apparizione della prima sfumatura rosa-arancio, nettamente visibile, in corrispondenza della quale viene rilevato tempo trascorso dall'aggiunta del quarto reagente (D); g) determinazione della quantità di iodio contenuta nella soluzione leggendo un grafico che riporta una curva che mostra le quantità di iodio in funzione del tempo rilevato.
3. 3. Procedimento secondo la rivendicazione 1 o 2, caratterizzato dal fatto che detta soluzione di fluidi biologici è una soluzione acquosa di urina dal 10% al 100% in volume.
4. 4. Procedimento secondo la rivendicazione 2, caratterizzato dal fatto che il primo reagente (A) è costituito da acido clorico dal 5% al 35%.
5. 5. Procedimento secondo la rivendicazione 2, caratterizzato dal fatto che il secondo reagente (B) riducente è costituito da una soluzione di 1÷50 mg/mi di AS203 e di 10÷100 mg/mi di NaCl sciolti in acido solforico 0,1N÷10N.
6. 6. Procedimento secondo la rivendicazione 2, caratterizzato dal fatto che il terzo reagente (C) indicatore di ossido-riduzione è costituito da ortoferro fenantrolina 0,1%÷10%.
7. 7. Procedimento secondo la rivendicazione 2, caratterizzato dal fatto che il quarto reagente (D), ossidante della reazione, è costituito da solfato cerìco 0,01N÷3N in acido solforico 0,1N÷10N.
8. 8. Procedimento secondo le rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che in una provetta di vetro vengono posti: 250 μl di urina, 250 μl di H20, 500 μΐ del primo reagente (A) e si scalda detta soluzione per 60 minuti a circa 100÷110°C, dopo aver raffreddato, si aggiungono 500 μl del secondo reagente (B) riducente, 20 μl del terzo reagente (C) indicatore di ossido-riduzione, .e 20 μl del quarto reagente (D) , che è l'agente ossidante della reazione e si agita brevemente, al momento dell'aggiunta dell'ultimo reagente (D), viene fatto partire un cronometro che viene fermato solo quando nella colorazione azzurro pallido appare la prima sfumatura rosa arancio.
9. 9. Procedimento secondo la rivendicazione 2, caratterizzato dal fatto che il riscaldamento di acuì alla fase b)ha una durata di 60 minuti.
10. 10. Procedimento secondo la rivendicazione 3, caratterizzato dal fatto che la soluzione acquosa di urina è al 50% in volume.
11. 11. Procedimento secondo la rivendicazione 4, caratterizzato dal fatto che il primo reagente (A) è acido clorico al 28%.
12. 12. Procedimento secondo la rivendicazione 5, caratterizzato dal fatto che il secondo reagente (B) è costituito da una soluzione è composta da 10mg/ml di As2O3 e da 25mg/ml di NaCl, sciolti in acido solforico IN.
13. 13. Procedimento secondo la rivendicazione 6, caratterizzato dal fatto che il terzo reagente (C) è costituito da orto-ferro fenantrolina 6%
14. 14. Procedimento secondo la rivendicazione 7, caratterizzato dal fatto che il quarto reagente (D) è costituito da solfato cerico 0,2N in acido solforico 3 ,5N.
15. 15. Apparato per la determinazione quantitativa dello iodio in fluidi biologici, caratterizzato dal fatto di comprendere: - una provetta (6) per una soluzione di fluido biologico da analizzare; - tre siringhe o pipette (non mostrate) predisposte con la giusta quantità di primi tre reagenti (A, B e C) da aggiungere alla soluzione nella provetta; - una siringa speciale (1) dotata di contatti elettrici (2) dì fondo-corsa dello stantuffo (3), contenente un quarto reagente (D) da aggiungere alla soluzione nella provetta; - un cronometro o timer (5) che viene avviato dalla chiusura dei suddetti contatti elettrici (2) dì fondo-corsa e che viene fermato mediante un apposito pulsante di stop (4) quando la soluzione vira di colore tornando al colore originario prima dell'aggiunta del quarto reagente; - un supporto (7) per la provetta (6), preferibilmente retroilluminato, atto a facilitare il rilevamento del viraggio del colore della soluzione nella provetta stessa.
16. 16. Apparato secondo la rivendicazione 15, caratterizzato dal fatto che, i contatti elettrici (2) montati sulla siringa (1) sono posizionati in modo tale che non appena terminata l'aggiunta del quarto reagente (D), fanno partire un cronometro (5).
17. 17. Apparato secondo la rivendicazione 15 o 16, caratterizzato dal fatto che il fluido biologico è costituito da urina, plasma, o idrolizzati di proteine .
18. 18. Procedimento secondo una delle rivendicazioni da 1 a 14, caratterizzato dal fatto che il fluido biologico è costituito da urina, plasma, o idrolizzati di proteine.
19. 19. Apparato per la determinazione quantitativa dello iodio in fluidi biologici, come sostanzialmente descritto ed illustrato nella presente descrizione e nelle figure allegate.
20. 20. Procedimento per la determinazione quantitativa dello iodio in fluidi biologici, come sostanzialmente descritto nella presente descrizione con riferimento alle figure allegate.