ES2240388T3 - Metodo para la determinacion del contenido de yodo en fluidos biologicos y aparato semiautomatico para llevar a cabo el mismo. - Google Patents

Metodo para la determinacion del contenido de yodo en fluidos biologicos y aparato semiautomatico para llevar a cabo el mismo.

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ES2240388T3 ES01830729T ES01830729T ES2240388T3 ES 2240388 T3 ES2240388 T3 ES 2240388T3 ES 01830729 T ES01830729 T ES 01830729T ES 01830729 T ES01830729 T ES 01830729T ES 2240388 T3 ES2240388 T3 ES 2240388T3
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Abstract

Método para la determinación del contenido de yodo en fluidos biológicos, caracterizado por la medición del tiempo de la reacción completa de una solución de fluido biológico a analizar, en base a la conocida reacción SandellKolthoff, que se determina por el cambio de color de la misma solución, y por la determinación del contenido de yodo en la solución utilizando la proporción inversa entre el tiempo de cambio de color de la solución y el contenido de yodo en esta última, que actúa como catalizador, siendo llevada a cabo dicha determinación del contenido de yodo por diagramas de curvas estándar que representan el contenido de yodo con respecto a los tiempos de cambio de color.

Description

Método para la determinación del contenido de yodo en fluidos biológicos, y aparato semiautomático para llevar a cabo el mismo.
La presente invención se refiere a análisis biológicos y clínicos, y en particular a un método y correspondiente aparato para llevar a cabo los análisis del llamado "contenido de yoduro", es decir, el contenido de yodo en el organismo humano, que se utiliza especialmente en medicina nuclear y también en endocrinología.
La determinación del contenido de yodo en fluidos biológicos, y particularmente en la orina, es el método más importante para descubrir deficiencias alimentarias y/o patológicas o un exceso de yodo en el organismo. La medición analítica del contenido de yoduro en la orina es de particular importancia también en la terapia de tumores del tiroides, en los que se lleva a cabo la destrucción de tejidos del tiroides por radiación selectiva con ^{131}I (radioablación).
Dado que la presencia de un contenido importante de yodo en el paciente, tal como se mostrará más adelante, inhibe los efectos de la radioablación, es necesario llevar a cabo un rastreo analítico preciso del yoduro (ion I^{-}) en la orina no solamente de pacientes que tienen deficiencias en la absorción de yodo sino también antes de la terapia con ^{131}I para determinar y corregir cualquier sobrecarga patológica y/o accidental.
De acuerdo con el estado actual de la técnica, la determinación de I^{-} en la orina se lleva a cabo normalmente en laboratorios químicos de acuerdo con métodos analíticos fiables que, no obstante, requieren una instrumentación analítica compleja que no se utiliza frecuentemente a nivel hospitalario.
Se debe observar que la totalidad de yodo que pasa a la sangre después de su ingestión junto con el agua o alimentos con diferentes formas químicas, se transforma en yoduro captado por el tiroides y es convertido posteriormente en hormonas del tiroides, tiroxina y triyodotironina.
Más del 90% del yodo es eliminado del organismo por la orina en forma de yoduro.
En la actualidad, la terapia de los tumores de tiroides es, en primer lugar, quirúrgica, pero la operación quirúrgica no es satisfactoria para la eliminación de todos los tejidos del tiroides y por esta razón se lleva a cabo una destrucción de tejidos del tiroides después de la intervención por radiación selectiva (radioablación), tal como se ha mencionado anteriormente.
En la práctica, después de la operación quirúrgica, se administran oralmente al paciente dosis terapéuticas de ^{131}I en forma de NaI (yoduro sódico); el yodo es eliminado parcialmente por la orina y se acumula parcialmente en el resto de tejidos del tiroides que son sometidos a irradiación selectivamente (el yodo es emisor beta) hasta llevar a cabo la destrucción de las células de tejidos tumorales residuales.
El mismo principio de radioablación se utiliza en la destrucción de metástasis de tumores tiroidales.
No obstante, El ^{131}I que es captado en el tiroides establece competencia con el yoduro del organismo, de forma que es aconsejable proporcionar al paciente una dieta con bajo contenido de yodo antes del tratamiento.
No obstante, en muchos casos, se encuentra un elevado contenido de yodo en el organismo, lo que tiene un fuerte efecto de inhibición.
El exceso de yodo es debido frecuentemente a la utilización de medios de contraste yodados utilizados en CAT y en general en diagnóstico radiográfico; en otros casos, este exceso es debido a la utilización de medicamentos o desinfectantes que contienen yodo.
En todos los casos, la terapia por radioablación es relativamente ineficaz a causa de la baja captación especifica de ^{131}I. Por esta razón, es importante llevar a cabo un rastreo analítico preciso de I^{-} en la orina.
Existe actualmente la necesidad en todas las Salas Hospitalarias de Medicina Nuclear que llevan a cabo tratamientos con yodo radioactivo, de disponer de un equipo simple y fiable para llevar a cabo la determinación en tiempo real del contenido de yodo de forma analitica-cuantitativa.
La determinación de I^{-} en la orina, que habitualmente se lleva a cabo en laboratorios químicos, se lleva a cabo en la actualidad principalmente de acuerdo con dos métodos analíticos distintos. El primero de ellos consiste en una determinación potenciométrica directa del contenido de yoduro por un electrodo selectivo de godo o espectrofotometría de yoduro por la reacción de Sandell-Kolthoff.
En la determinación potenciométrica directa, el contenido de yoduro de la orina es determinado por medición del potencial de un electrodo selectivo con respecto a un electrodo de referencia, tanto en la muestra de la orina como en varias muestras estándar.
Aunque dicha metodología garantiza suficiente reproductibilidad, tiene una sensibilidad reducida para bajos contenidos de yoduro. Además, el electrodo selectivo es muy delicado y está especialmente sujeto a suciedad y tiene un coste elevado, así como una vida bastante corta (unos 6 meses).
El segundo método habitualmente utilizado, es decir, la espectrofotometría de yoduro por la reacción de Sandell-Kolthoff, se basa en el hecho de que el yoduro actúa como catalizador en la reducción del ion Ce^{4+}\rightarrowCe^{3+} acoplado a la oxidación As^{3+}\rightarrowAs^{5+}. El ion Ce^{4+} tiene un color amarillo intenso, mientras que el ion Ce^{3+} es incoloro. La espectrofotometría del Ce^{4+} restante permite la determinación del contenido de yodo.
Como resumen, se añade ácido arsenioso y a continuación sulfato de cerio a un tubo de ensayo que contiene orina, cuyo contenido de yodo tiene que ser determinado. La intensidad de la coloración amarilla se lee a la longitud de onda de 405 nm y la disminución de la intensidad con respecto a la intensidad inicial es proporcional a la cantidad de I^{-} (yoduro) en la solución.
El método es bastante fiable, preciso y sensible.
Antes de la determinación, es necesario eliminar algunas moléculas que interfieren con la reacción de Sandell-Kolthoff, tales como tiocianato (SCN^{-}), que se encuentra típicamente presente en la orina de los fumadores en una cantidad notable.
Esta eliminación se obtiene por tratamiento térmico de la orina con ácido clórico, o con una mezcla de ácido clórico y cromato sódico, o con persulfato amónico.
Un inconveniente de los métodos conocidos es que se hace necesario tener un buen espectrofotómetro para la determinación cuantitativa del yodo. Además, esta determinación no se puede utilizar para mediciones directas en el hospital.
La necesidad de un método analítico para la determinación del yodo en la orina que sea rápido y económico, y que pueda también ser utilizado fuera de los laboratorios de análisis, condujo a la conocida empresa MERCK® a patentar y poner en el mercado un equipo llamado "Prueba Urinaria Rápida Merck", en la que la orina se hace pasar por una columna de carbón activado para eliminar una parte de las moléculas que interfieren, y a continuación se oxida tetrametilbencidina con ácido peracético, con yodo como catalizador.
La orina se puede dividir en tres grupos por el color obtenido después de la reacción:
-
< 10 \mug/dl (amarillo)
-
11-30 10 \mug/dl (verde)
-
> 30 \mug/dl (azul).
El método de análisis proporcionado por dicho equipo es simple y fiable, pero solamente permite una división semicuantitativa en tres grupos.
El objetivo principal de la presente invención consiste en superar los problemas y los inconvenientes mencionados anteriormente dando a conocer un método analítico así como un aparato simple y económico capaz de proporcionar resultados cuantitativos de la concentración de yoduro en la orina y otros fluidos biológicos, incluso en laboratorios sin instrumentos analíticos tales como espectrofotómetro y potenciómetro de precisión.
Este objetivo ha sido conseguido de acuerdo con la invención al dar a conocer un método y aparato que utiliza la proporción inversa entre el tiempo de cambio de color de una solución de fluidos biológicos a analizar y el contenido de yodo de esta última, aunque se base esencialmente en la ya mencionada reacción de Sandell-Kolthoff.
La mejor comprensión de la invención resultará de la referencia a los dibujos que muestran esquemáticamente una realización preferente del aparato solamente a titulo de ejemplo no limitativo.
En los dibujos:
la figura 1 es un diagrama que muestra la curva de calibración obtenida a partir de cantidades conocidas de yodo; el mismo diagrama muestra los valores obtenidos analizando la orina de dos individuos sanos; y
la figura 2 es un diagrama esquemático que muestra un aparato para llevar a cabo el método según la invención.
Es sabido que la reducción de Ce de +4 a +3 es más rápida cuanto mayor es el contenido de yodo en la orina.
Por lo tanto, de acuerdo con la invención, el tiempo entre la añadidura de reactivos a la orina y la reducción completa de Ce^{4+} se puede medir añadiendo un exceso de ácido arsenioso, sulfato de cerio y un indicador de óxido-reducción.
Se descubrió experimentalmente que dicho tiempo es inversamente proporcional al contenido de yoduro que es el catalizador de la reacción.
Por lo tanto, de acuerdo con la invención, es suficiente medir los tiempos de reducción de la muestra no conocida y algunas muestras estándar para determinar el contenido de yodo en la muestra del fluido humano analizado.
Con este objetivo, el método de la invención comprende esencialmente las siguientes etapas:
1. eliminar selectivamente una parte de la sustancias que interfieren tales como tiocianato (SCN^{-}) por su oxidación con la adición de un primer reactivo A a la solución del fluido biológico a analizar;
2. calentar la solución que contiene el fluido biológico a una temperatura comprendida entre 100 y 110ºC durante unos 60 minutos enfriando a continuación;
3. añadir un segundo reactivo B capaz de crear un ambiente fuertemente reductor en la solución;
4. añadir un tercer reactivo C capaz de indicar el estado de óxido-reducción en la solución;
5. añadir un cuarto reactivo D que tiene la función de agente oxidante con respecto a la solución, y empezar el contaje del tiempo;
6. controlar el cambio de color de la solución hasta la aparición de la primera tonalidad claramente visible rosa-naranja, en cuyo momento se detecta y se registra el tiempo desde la adición del cuarto reactivo D;
7. determinar el contenido de yodo en la solución leyendo el diagrama de la figura 1 con respecto al tiempo detectado.
A titulo ilustrativo, un ejemplo de la determinación de acuerdo con el método descrito anteriormente se da a conocer a continuación siendo el fluido biológico una solución de orina en agua 10\div100%, preferentemente 50%.
250 \mul de H_{2}O y 500 \mul del reactivo A, consistiendo preferentemente en 5-35%, preferentemente 28%, de ácido clórico, se pone en un tubo de pruebas de cristal; dicha solución es calentada a continuación aproximadamente a 100-110ºC durante un tiempo comprendido entre 5 minutos y 2 horas, preferentemente 60 minutos.
El reactivo A que actúa como oxidante tiene el objetivo de destruir selectivamente algunas sustancias, especialmente el tiocianato, que se encuentran presentes particularmente en la orina de fumadores y que interfieren fuertemente con la reacción de Sandell-Kolthoff y también con la determinación de yodo.
Como alternativa al ácido clórico como oxidante, se puede utilizar también persulfato que "adolece" de baja reproductibilidad de los resultados.
Después de enfriar la solución, se añade de forma secuencial:
- 500 \mul de reactivo reductor B, que consiste preferentemente en una solución de 1\div50 mg/ml, preferentemente 10 mg/ml, As_{2}O_{3}, y 10\div100 mg/ml, preferentemente 25 mg/ml, de NaCl disuelto en ácido sulfúrico 0,1N\div10N, preferentemente 1N;
- 20 \mul de reactivo C, que es el indicador de óxido-reducción, que consiste preferentemente en 0,1\div10%, preferentemente 6%, de ortoferro-fenantrolina, y
- 20 \mul del reactivo D, que es el agente oxidante de la reacción, que consiste preferentemente en sulfato de cerio 0,01N\div3N, preferentemente 0,2N, en ácido sulfúrico 0,1N\div10N, preferentemente 3,5N.
Después de añadir el reactivo D, se pone en marcha un cronómetro. Después de la añadidura del cerio, el color de la solución cambia inmediatamente de naranja a verde pálido.
El reactivo B crea un ambiente fuertemente reductor en la solución, mientras que el reactivo C proporciona la indicación del estado de óxido-reducción en la solución. Un color naranja indica la presencia de Fe^{2+} en el complejo de hierro y orto-ferro-fenantrolina, es decir, un medio reductor, mientras que un azul pálido indica la presencia de Fe^{3+} en el complejo, es decir, un medio oxidante.
Se crea un medio reductor por añadidura de los reactivos B y C a la orina de manera que la orto-ferro-fenantrolina adopta color naranja.
Se crea un medio oxidante por la adición del reactivo D de forma que la oxidación del hierro en el complejo de orto-ferro-fenantrolina que tiene color pálido tiene lugar con rapidez, mientras que la oxidación de la arsenita pasando a arsenate por cerio tetravalente, que es catalizado por yoduro, tiene lugar lentamente.
Al tener lugar la reacción de reducción de Ce^{4+} por As^{3+}, la solución adopta un color verde pálido resultado de la presencia de Ce^{4+} que tiene color amarillo y orto-ferro-fenantrolina oxidada que tiene un color azul pálido.
Mientras el Ce^{4+} se reduce a Ce^{3+}, es decir, que se parece al color amarillo, la solución se decolora lentamente hasta que aparece un color azul pálido después de consumirse la totalidad de Ce^{4+}. En aquel momento, el exceso de arsenita que actúa como agente reductor provoca que la orto-ferro-fenantrolina vuelva a su color naranja original.
Por lo tanto, al aparecer la primera tonalidad claramente visible rosa-naranja, se para el cronómetro y el tiempo transcurrido se traslada a un diagrama y se compara con varios tiempos estándar con concentraciones gradualmente crecientes de yoduro.
Por lo tanto, de acuerdo con la invención, la simple medición del tiempo del cambio de color con respecto al color naranja original permite trazar inmediatamente un diagrama tal como se ha mostrado en la figura 1, a efectos de proporcionar el contenido de yoduro en la orina analizada.
Un ejemplo de determinación repetida tres veces con respecto a tres estándares proporcionó los siguientes resultados:
yoduro tiempos de cambio de color
0 ng 167 \pm 1,1 segundos
5 ng 146 \pm 1,1 segundos
10 ng 113 \pm 1,0 segundos
15 ng 108 \pm 0,7 segundos
Tal como se puede apreciar, la reproductibilidad de la respuesta es excelente.
El contenido de yoduro hallado y representado en el diagrama de la figura 1 (23,7 ng y 16,5 ng) corresponde a 9,5 \mug/dl y 6,6 \mug/dl, y se encuentra exactamente en la gama típica definida entre 5,5 \mug/dl y 30 \mug/dl.
De acuerdo con la presente invención, a efectos de facilitar la ejecución del método que se ha dado a conocer por detección de los tiempos de inicio y final de cambio de color, se ha ideado el aparato mostrado en la figura 2.
El aparato que se da a conocer incluye esencialmente:
- un tubo de ensayo 6 para la solución del fluido biológico a analizar;
- tres jeringas o pipetas (no mostradas) que contienen la cantidad apropiada de reactivo A, B y C a añadir a la solución del tubo de ensayo;
- una jeringa especial (1) dotada de contactos eléctricos (2) para el final de carrera del pistón (3) y conteniendo el cuarto reactivo D a añadir a la solución del tubo de pruebas;
- un cronómetro o temporizador (5) que se pone en marcha por el cierre de dichos contactos de fin de carrera y se detiene por un botón de paro adecuado (4);
- un soporte (7) para el tubo de ensayo (6) que está preferentemente iluminado en la parte posterior y que es capaz de facilitar la detección del cambio de color de la solución del tubo de ensayo.
En este aparato, cada uno de los tres primeros reactivos A, B y C es añadido a la solución de fluido biológico por una jeringa común o una pipeta, mientras el reactivo D es añadido por una jeringa adecuada (1) dotada de contactos eléctricos (2) de final de carrera del pistón (3), tal como se ha mostrado en la figura 2.
Después de esta adición, los contactos eléctricos (2) de la jeringa (1) ponen en marcha un cronómetro preferentemente digital (5).
En funcionamiento, tan pronto como el cuarto reactivo D es colocado en el tubo de ensayo (6), este último es agitado con rapidez en un tiempo reducido, y se pone sobre un soporte (7) que está preferentemente iluminado por la parte posterior de manera que el operador para el cronómetro (5) presionando el motor de paro adecuado (4), tan pronto como aparece la tonalidad roja característica provocada por la reducción de la orto-fenantrolina.
El simple aparato de acuerdo con la invención permite una excelente reproductibilidad a lo largo del tiempo asociada con una notable facilidad de utilización.
Además, también se pueden analizar otros líquidos biológicos tales como plasma o hidrolizados de proteínas mediante el método indicado.
El aparato que se ha dado a conocer es económico y fiable debido a sus componentes simples y puede ser de especial interés no solamente para todos los laboratorios médicos que necesitan determinar el contenido de yoduro en la orina a efectos de investigación de deficiencias alimentarias, sino también para todas las Instalaciones Hospitalarias de Medicina Nuclear que pueden llevar a cabo de esta manera su propia determinación rápida y fiable del contenido de yoduro fisiológico y de la variación de dicho contenido de yoduro después del tratamiento terapéutico de los pacientes destinados a un tratamiento de radioablación de tiroides.
La presente invención ha sido descrita y mostrada de acuerdo con una realización preferente de la misma, no obstante, es evidente que cualquier técnico en la materia puede hacer modificaciones equivalentes y/o sustituciones sin salir del ámbito de la presente invención industrial.

Claims (18)

1. Método para la determinación del contenido de yodo en fluidos biológicos, caracterizado por la medición del tiempo de la reacción completa de una solución de fluido biológico a analizar, en base a la conocida reacción Sandell-Kolthoff, que se determina por el cambio de color de la misma solución, y por la determinación del contenido de yodo en la solución utilizando la proporción inversa entre el tiempo de cambio de color de la solución y el contenido de yodo en esta última, que actúa como catalizador, siendo llevada a cabo dicha determinación del contenido de yodo por diagramas de curvas estándar que representan el contenido de yodo con respecto a los tiempos de cambio de
color.
2. Método, según la reivindicación 1, caracterizado porque comprende esencialmente las siguientes etapas:
a) eliminar selectivamente una parte de las sustancias que interfieren tales como tiocianato (SCN^{-}) por su oxidación con la adición de un primer reactivo (A) a una solución del fluido biológico a analizar;
b) calentar la solución que contiene el fluido biológico a una temperatura entre 100 y 110ºC durante un tiempo comprendido entre 15 minutos y 2 horas con enfriamiento a continuación;
c) añadir un segundo reactivo (B) capaz de crear un medio fuertemente reductor en la solución;
d) añadir un tercer reactivo (C) capaz de indicar el estado de óxido-reducción de la solución;
e) añadir un cuarto reactivo (D) que tiene la función de agente oxidante de la solución, y empezar el contaje del tiempo;
f) controlar los cambios de color de la solución hasta la aparición de la primera tonalidad claramente visible rosa-naranja, en cuya aparición se detecta el tiempo desde la adición del cuarto reactivo (D);
g) determinar el contenido de yodo en la solución por lectura del diagrama de curvas del contenido de yodo con respecto al tiempo detectado.
3. Método, según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque dicha solución de fluidos biológicos es una solución de la orina en agua de 10% a 100% en volumen.
4. Método, según la reivindicación 2, caracterizado porque el primer reactivo (A) es ácido clórico en un contenido de 5% a 35%.
5. Método, según la reivindicación 2, caracterizado porque el segundo agente reductor (B) es una solución de 1\div50 mg/ml As_{2}O_{3} y 10\div100 mg/ml NaCl disuelto en 0,1N\div10N de ácido sulfúrico.
6. Método, según la reivindicación 2, caracterizado porque el tercer reactivo (C), un indicador de óxido-reducción, es 0,1%\div10% de orto-ferro-fenantrolina.
7. Método, según la reivindicación 2, caracterizado porque el cuarto reactivo (D), un oxidante de la reacción, es sulfato de cerio 0,01N\div3N en ácido sulfúrico 0,1N\div10N.
8. Método, según las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque se colocan en un tubo de ensayo 250 \mul de orina, 250 \mul de H_{2}O y 500 ml del primer agente (A), a continuación dicha solución es calentada durante 60 minutos a una temperatura aproximada de 100\div110ºC, después de enfriamiento se añaden 500 \mul del segundo agente reductor (B), 20 \mul del tercer reactivo (C), indicador de óxido-reducción, y 20 \mul del cuarto reactivo (D) que es el agente oxidante de la reacción y se agita durante un tiempo reducido, de manera que cuando se añade el último reactivo (D) se pone en marcha un cronómetro que se para solamente cuando aparece la primera tonalidad rosa-naranja en el color azul pálido.
9. Método, según la reivindicación 2, caracterizado porque el calentamiento de la etapa b) dura 60 minutos.
10. Método, según la reivindicación 3, caracterizado porque la solución de orina en agua es una solución al 50% por volumen.
11. Método, según la reivindicación 4, caracterizado porque el primer reactivo (A) es ácido clórico al 28%.
12. Método, según la reivindicación 5, caracterizado porque el segundo reactivo (B) es una solución que consiste en 10 mg/ml de As_{2}O_{3} y 35 mg/ml de NaCl disueltos en ácido sulfúrico 1N.
13. Método, según la reivindicación 6, caracterizado porque el tercer reactivo (C) es orto-ferro-fenantrolina al 6%.
14. Método, según la reivindicación 7, caracterizado porque el cuarto reactivo (D) es sulfato de cerio 0,2N en ácido sulfúrico 3,5N.
15. Aparato para determinar el contenido de yodo en fluidos biológicos, caracterizado porque comprende:
- un tubo de ensayo (6) para la solución del fluido biológico a analizar;
- tres jeringas o pipetas (no mostradas) que contienen la cantidad adecuada de los tres primeros reactivos (A, B y C) a añadir a la solución del tubo de ensayo;
- una jeringa especial (1), u otro aparato similar para el suministro de cantidades precisas de liquido, dotada de contactos eléctricos (2) para el fin de carrera del pistón (3) y conteniendo el cuarto reactivo (D) a añadir a la solución del tubo de ensayo;
- un cronómetro o temporizador (5) que es puesto en marcha por el cierre de dichos contactos eléctricos (2) de fin de carrera y que es parado por un botón de paro adecuado (4) cuando la solución cambia de color y vuelve al color original antes de añadir el cuarto reactivo;
- un soporte (7) para el tubo de ensayo (6) que está preferentemente iluminado en la parte posterior y que es capaz de facilitar la detección del cambio de color de la solución del tubo de ensayo.
16. Aparato, según la reivindicación 15, caracterizado porque los contactos eléctricos (2) de la jeringa (1), u otro aparato similar para el suministro de cantidades precisas de liquido, están dispuestos de manera tal que ponen en marcha un cronómetro (5) tan pronto como se ha terminado la adición del cuarto reactivo (D).
17. Aparato, según la reivindicación 15 ó 16, caracterizado porque el fluido biológico es orina, plasma o hidrolizados de proteínas.
18. Método, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, caracterizado porque el fluido biológico es orina, plasma o hidrolizados de proteínas.
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