ITMI991503A1

ITMI991503A1 - Uso di metaboliti oligosaccaridici di proteoglicani come maker in fluidi biologici di diagnosi del biabete e delle complicanze patologiche c

Info

Publication number: ITMI991503A1
Application number: IT1999MI001503A
Authority: IT
Inventors: Ivo Volpato; Giovanni Scapagnini; Flavio Veneroni; Bernard Bizzini; Lorenzo Volpato; Maurizio Magara
Original assignee: Bidifarm S R L
Priority date: 1999-07-08
Filing date: 1999-07-08
Publication date: 2001-01-08
Also published as: AU6270600A; EP1198709A1; ITMI991503A0; WO2001004632A1

Description

Descrizione dell’invenzione industriale dal titolo :

"Uso di metaboliti oligosaccaridici di proteoglicani come marker in fluidi biologici di diagnosi del diabete e delle complicanze patologiche collegate, e metodi di rilevazione e titolazione degli stessi "

CAMPO DELL'INVENZIONE

La presente invenzione è relativa all'uso di metaboliti oligosaccaridici di proteoglicani come marker in fluidi biologici per la diagnosi del diabete e delle sue complicanze patologiche, e metodi per la loro rilevazione e titolazione .

STATO DELL’ARTE

Le patologie a decorso cronico sono in generale caratterizzate dalla comparsa e sviluppo di dismetaboliti fisiologici originati da alterazioni sia a livello cellulare che umorale.

L’entità della variazione dei parametri umorali può essere influenzata dallo stato generale del soggetto e pertanto non sempre riflette correttamente lo stato evolutivo della malattia e può fornire un indice erroneo dell’entità del danno prodotto e del conseguente rìschio di insorgenza di complicanze patologiche collegate.

Una corretta valutazione del danno cellulare sarebbe auspicabile in quanto in grado di fornire utili indicazioni sulla gravità del danno prodotto, sulla velocità di progressione della malattia, sulla sua regressione a seguito di trattamento farmacologico e sulla potenzialità di insorgenza delle patologie collegate.

A tutt'oggi però non è sempre stata possibile una corretta diagnosi del danno cellulare con metodologie che non implicassero interventi invasivi sul paziente. Di fatto questo tipo di indagine viene in genere condotta con metodi citometrici che comportano il prelievo di tessuto-campione. Il diabete è appunto una di queste malattie croniche per le quali il controllo dei parametri umorali e cellulari è di grande interesse al fine di comprendere le modalità di decorso della patologia, che presenta periodi di latenza più o meno lunghi, variabili individualmente. Contrariamente a quanto ipotizzato in un primo tempo, le alterazioni umorali del diabete possono essere espressione, oltre che di una disfunzione delle isole pancreatiche, anche di un contemporaneo disordine endocrino quale l’iperpituitarismo, l’iperadrenocorticismo, l’ipertiroidismo, ecc.

Lo scopo del trattamento del paziente diabetico è il mantenimento dei livelli ematici di glucosio il più vicini possibile alla norma, questo anche al fine di limitare l’insorgere ed il progredire di complicanze. I più frequenti rìschi di complicanze del diabete sono rappresentati da disordini microvascolari, retinopatie, nefropatie e neuropatie. Queste comunemente insorgono in media dopo 10-15 anni dall’inizio della malattia, ma solo le complicanze renali ed i disordini della retina sembrano direttamente correlati alla gravità dell'iperglicemia, mentre non lo sono i disordini aterogenici e neurologici. C'è da sottolineare che alcune complicanze non sembrano regredire significativamente anche riducendo i livelli di glucosio per 1-3 anni.

Il monitoraggio più comunemente usato è quello della determinazione del glucosio per evidenziare stati di iper- o ipoglicemia. Un importante test riguarda la misura delle proteine glicate, ma, a causa dell’emivita relativamente breve di tali proteine, questo tipo di test consente un controllo dello stato glicemico del paziente, e di conseguenza una valutazione del trattamento più efficace per mantenere il paziente nel desiderato stato normoglicemico e della progressione delle complicanze, solo nel breve periodo.

Da ciò si evince che le attuali metodologie di diagnosi di predizione ed insorgenza della patologia diabetica presentano, al momento, gravi lacune e limitazioni.

La genesi e cronicizzazione di molti disordini patologici implicano alterazioni della matrice extra-cellulare. La membrana basale contiene, tra i componenti specifici, il proteoglicano dell'eparansolfato (altrimenti detto proteoeparansolfato) e tracce di altre proteoglicani.

I proteoglicani sono strutture formate da un filamento centrale proteico al quale si connettono, tramite legami amidici, polisaccaridi detti glicosaminoglicani (da qui in poi GAGs) costituiti da unità disaccaridiche ripetitive contenenti un derivato di un aminozucchero, glucosamina o galattosamina. Almeno uno degli zuccheri del disaccaride possiede un gruppo carbossilato o solfato carico negativamente.

La presenza di proteoeparansolfato, con la sua forte carica negativa, può conferire alla membrana basale la capacità di bloccare il passaggio di proteine dal sangue alle urine, nonché è in grado di influenzare, attraverso i legami con altre strutture della membrana, i processi coinvolti nella patogenesi infiammatoria, aterosclerotica, trombogenica ecc..

E’ stato sottolineato come il decremento della concentrazione di proteoeparansolfato possa causare alterazioni della struttura della membrana basale tipiche della patologia diabetica (Rorbach D.H. et al., “Alterations of thè basement membrane in diabetes, in extracellular matrix", S.Hawkes e J.L.Wang ed., 1982, Academic Press, N.Y., pag.407-411). Nel lungo periodo infatti la membrana basale diabetica si presente più ispessita e porosa del normale, particolarmente in quei distretti attraverso i quali c'è un passaggio di grossi volumi di fluidi, come nei glomeruli renali e nei capillari sanguigni. Nello specifico l'ispessimento è stato ascritto ai livelli ridotti di proteoeparansolfato (Rorbach D.H. et al. supra). Nel diabete mellito si ha un Incremento dei valori di β-Ν-acetilglucosaminidasi (NAG) e di β-D-glucuronidasi, due enzimi che partecipano alla degradazione di mucopolisaccaridi e glicoproteine. (Whiting P.H, et al.. Clinica Chimica Acta, 1979, 92, 459-463; Reglero A. et al., Clinica Chimica Acta, 1980, 103, 156-158) descrive l’attività serica di questi due enzimi in rapporto alla gravità di complicanze diabetiche, quale la microangiopatia, ed un incremento delle attività in proporzione alla gravità del diabete stesso.

Pitkanen E. et al, Diabetologica, 1980, 18(4), 275-278, Gosiewska A. et al., Pd. Tyg. Lek., 1992, 47(1-2), 28-30, e Maisant A. et al., Padiatr. Padiol., 1993, 28(3), 77-80 hanno postulato che i livelli urinari di NAG possano riflettere il danno renale del paziente diabetico e che i suoi tassi serici suggeriscano, in qualche modo, indicazioni sullo sviluppo e la prognosi delle microangiopatie. Oltre ad essere un parametro di correlazione tra diabete ed alcune sue complicanze, la determinazione della NAG sembrerebbe essere indipendente dai livelli ematici di glucosio, ciò indicando una probabile correlazione diretta con i danni tessutali alla base delle complicanze della malattia.

Queste osservazioni non hanno però sinora dato luogo ad alcun pratico sistema diagnostico in quanto gli enzimi in questione, e la NAG in particolare, non hanno provato di avere un’inequivocabile correlazione lineare con la patologia diabetica ed il suo decorso. Di fatto, trattandosi di una proteina, essa viene metabolizzata a livello renale, e quella parte che sopravvive a tale processo vede la sua concentrazione ulteriormente diminuita dal suo ruolo nel catabolismo dei glicosaminoglicani che, essendo presenti anche nelle urine, continuano a stimolarne l'intervento. Inoltre la determinazione di NAG sarebbe comunque relativa ad un parametro umorale, mentre è assai più auspicabile disporre di un metodo che possa rivelare un parametro cellulare al fine di meglio valutare il danno provocato a questi livelli dalla patologia.

SOMMARIO DELL’INVENZIONE

E’ stato ora sorprendentemente trovato che metaboliti oligosaccaridici dei proteoglicani originatisi dalla membrana cellulare possono essere rilevabili nei liquidi biologici in concentrazioni proporzionale alla possibile insorgenza del diabete o delle sue complicanze patologiche.

BREVE DESCRIZIONE DELLE FIGURE

La figura 1 illustra le bande elettroforetiche di metaboliti oligosaccaridici di proteoglicani estratti da urine di soggetti sani, prima e dopo trattamento con condroitinasi A/C a confronto con GAGs standard (Sigma).

La figura 2 illustra le bande elettroforetiche di metaboliti oligosaccaridici di proteoglicani estratti da urine di soggetti diabetici, prima e dopo trattamento con condroitinasi A/C a confronto con GAGs standard (Sigma). La figura 3 illustra il tracciato elettroforetico proveniente da urine di un soggetto diabetico.

La figura 4 illustra l'andamento della lettura di densità ottica nel test di affinità/specificità antigene/anticorpo.

Le figure 5 e 6 illustrano le rette di taratura del test di affinità per la lectina da Triticum vulgarìs.

DESCRIZIONE DELL’INVENZIONE

Pertanto la presente invenzione si riferisce all’uso di metaboliti oligosaccaridici dei proteoglicani come marker in fluidi biologici per la valutazione dello stato, gravità, rischio di insorgenza, possibilità di genesi di complicanze, monitoraggio del trattamento della malattia diabetica, ed ai metodi per la loro rivelazione e titolazione.

Come metaboliti oligosaccaridici dei proteoglicani si intendono i glicosaminoglicani, più specificamente eparansolfato, condroitinsolfati A e C, e dermatansolfato, ed i loro frammenti metabolici.

Particolarmente preferito ai fini della presente invenzione è l’uso dell’eparansolfato e dei suoi frammenti metabolici.

La quantità dei metaboliti dell’invenzione presente nei liquidi biologici è dipendente dall’entità dei danni cellulari indotti dal diabete ma indipendente dal controllo farmacologico della iperglicemia. Per tale motivo la loro determinazione quantitativa può essere utilizzata nel controllo del rischio di insorgenza delle complicanze associate al diabete, nel monitoraggio della gravità o della regressione della patologia, nella predizione di insorgenza della stessa in soggetti a rischio.

Essendo la concentrazione dei metaboliti dell'invenzione un valore indipendente dalle variazioni dei biochimismi umorali, vale a dire della concentrazione di glucosio nei fluidi biologici del soggetto, essa può essere considerata come parametro reale di riferimento dello stato, gravità, rischio di insorgenza, possibilità di genesi di complicanze, monitoraggio del trattamento della malattia diabetica.

I metaboliti secondo la presente invenzione possono venire rilevati nei liquidi biologici, preferibilmente nel siero e nelle urine, ed ancor più preferibilmente nelle urine.

Detti metaboliti oligosaccaridici vengono estratti dai liquidi biologici con metodologie specifiche, e caratterizzati sia per via elettroforetica che per reazione specifica in risposta ad un processo di nitrosazione.

I metodi messi a punto per la determinazione di questi metaboliti sono di tipo ponderale, immunoenzimatico, ad esempio, ELISA competitivo, immunoenzimatico-simile, immunocromatografico-colorimetrico e colorimetrico. Preferibilmente, i metaboliti oggetto della presente invenzione vengono rilevati con un metodo competitivo, ad esempio tramite il sistema biotina/ avidina; per determinazione colorimetrica dell’acido glucuronico e della glucosamina; oppure attraverso un metodo immunoenzimatico-simile tramite impiego di lectine, ad esempio, da Trìticum vulgaris.

L’uso delle lectine per la rivelazione dei metaboliti di glicosaminoglicani è di particolare rilevanza ai fini della presente invenzione. Le lectine sono da tempo usate in un metodo cromatografico per la purificazione degli zuccheri. E' stato ora sorprendentemente trovato che l’uso delle lectine può essere applicato anche al riconoscimento dei glicosaminoglicani in sistemi immunoenzimatico-simili.

Pertanto un ulteriore oggetto della presente invenzione è rappresentato da un kit per la rivelazione di glicosaminoglicani basato su lectina adesa a micropiastra o, in alternativa, legata ad un enzima di rivelazione, ad esempio perossidasi. Lectine particolarmente preferite ai fini della presente invenzione sono quelle derivanti da Trìticum vulgaris.

Preferibilmente il kit basato su lectine della presente invenzione opera secondo la cosiddetta tecnica a sandwich secondo la quale la lectina o un opportuno anticorpo viene ancorato ad un supporto solido, fatto reagire con la molecola da rivelare. Quest’ultima viene a sua volta con, rispettivamente, un opportuno anticorpo o con lectina, entrambi marcati con un enzima, che poi va ad interagire con un cromogeno in presenza di substrato per la rivelazione finale. Un tale tipo di tecnica risulta più semplice nella sua esecuzione e fornisce più rapidamente risultati.

L’estrazione, caratterizzazione, e rilevamento quantitativo dei metaboliti oligosaccaridici oggetto della presente invenzione verranno ora illustrati dai seguenti esempi.

Se non altrimenti specificato, nei successivi esempi il tampone PBS (tampone fosfato) è utilizzato 0,1 M e con pH 7,4.

ESEMPIO 1

Isolamento dei metaboliti oliaosaccaridici di proteoalicani da urine umane

a) Estrazione di glucosaminoglicani (GAGs) dalle urine

Urina (10 I) di soggetti umani volontari sani o affetti da patogenesi diabetica conclamata è stata addizionata con NaOH 0,1 M (40 g), posta sotto agitazione per 15 minuti e lasciata a sedimentare per 4 ore, poi filtrata ed il supematante limpido recuperato. Al supernatante si è aggiunto Triton X100 (300 mi) ed il pH è stato portato a 6 con HCI concentrato. Poi si è aggiunta DEAE-Sephadex A-25 (5 g) e il tutto è stato tenuto sotto agitazione per 20 minuti, quindi filtrato. La resina recuperata è stata caricata in colonna, lavata con NaCI 0,3M/Triton X100 al 3% (200 mi) ed eluita con NaOH 1M (20 mi), poi 0,1 M (80 mi). Al-(’eluato si sono aggiunti acido acetico (1,2 g) ed etanolo assoluto (400 mi), e la miscela è stata conservata per una notte a 20°C. Il precipitato formatosi è stato recuperato per centrifugazione a 1500xg per 10 minuti, lavato 3 volte con etanolo assoluto, quindi essiccato a 60°C. La successiva tabella 1 riporta i risultati ponderali del recupero di glicosaminogiicani da urine umane.

Tabella 1

Dalla questa tabella risulta chiaramente che il quantitativo di GAGs presente nelle urine di soggetti affetti da diabete conclamato è significativamente maggiore di quello dei volontari sani,

b) Trattamento con condroitinasi A/C

Questa fase è utile ad eliminare dalle urine i condroitini A/C e, quindi, verificare il comportamento di HS nella malattia.

Il prodotto ottenuto nella fase a) è stato sciolto in tampone Tris 0,1 M, pH=8, NaCI 0,1 M a dare una concentrazione di 20 mg/ml. Si è quindi aggiunto enzima SIGMA C-3667 così da avere 0,1pg/ml. Il tutto è stato lasciato a reagire per 24 ore sotto lenta agitazione al riparo dalla luce ed a temperatura ambiente, poi posto in tubo da dialisi con taglio 1000 contro acqua. Al dializzato si sono aggiunti Triton X100 (q.b. al 3%), HCI diluito a pH=6, DEAE-Sephadex 1-25 (50 mg/ml), e il tutto è stato tenuto sotto agitazione per 20 minuti. La resina è stata recuperata e trasferita in colonna, lavata con NaCI 0,3M/ Triton X100 al 3% (20 ml/g di resina) ed eluita con il minor volume possibile di NaOH 1M. L'eluato è stato portato a pH 5 con acido acetico, addizionato con etanolo assoluto e tenuto nel congelatore per un giorno. Il precipitato è stato recuperato per tramite centrifugazioni a 1500xg per 10 minuti, lavato 3 volte con etanolo assoluto ed essiccato a 60°C.

La successiva tabella 2 riporta i risultati ponderali del recupero da urine umane di glicosaminoglicani liberi da condroitini A/C.

Tabella 2

Dalla questa tabella risulta chiaramente che il quantitativo di GAGs privi di condroitini (prevalentemente HS) presente nelle urine di soggetti affetti da diabete conclamato è significativamente maggiore di quello dei volontari sani.

ESEMPIO 2

Caratterizzazione dei metaboliti oliaoeterosaccaridici di proteoeparansolfato

a) Metodo elettroforetico

La caratterizzazione elettroforetica è stata eseguita secondo gii insegnamenti di Cappelletti R. et al., Anal. Biochem., 1979, 93, 37, e Cappelletti R. et al., it. J. Biochem., 1982, 31(3), 229, utilizzando campioni, ottenuti secondo quanto descrìtto nell'esempio 1.

La figura 1 illustra le bande elettroforetiche di standard Sigma (a), metaboliti di soggetto sano prima del trattamento con condroitinasi A/C (b) e metaboliti di soggetto sano dopo trattamento con condroitinasi A/C (c).

La figura 2 illustra le bande elettroforetiche di standard Sigma (a), metaboliti di soggetto diabetico prima dei trattamento con condroitinasi A/C (b) e metaboliti di soggetto diabetico dopo trattamento con condrortinasi A/C (c).

b) Metodo di reazione di nitrosazione

La nitrosazione è una reazione caratteristica del HS per cui la macchia che lo identifica viene a scomparire dal tracciato eletroforetico. Questa reazione è stata condotta secondo il metodo descritto da Cappelletti R. et al. , Anal. Biochem., 1980, 105, 430.

La figura 3 illustra il tracciato elettroforetico di standard Sigma (a), metaboliti di soggetto diabetico prima del trattamento di nitrosazione (b) e metaboliti di soggetto diabetico dopo trattamento di nitrosazione (c).

La caratterizzazione immunologica è stata effettuata per produzione di anticorpi. A tale scopo si sono preparati due immunogeni di GAGs, uno con BSA (siero-albumina bovina) come immunogeno di lavoro, iniettato nell'animale (coniglio) per la produzione dell'anticorpo; il secondo con OVA (ovalbumina), come immunogeno di controllo per la verifica della specificità dell’anticorpo. La sintesi di questi immunogeni viene descritta di seguito.

ESEMPIO 3

Preparazione del coniugato GAGs-BSA

a) Idrazide del BSA

BSA (45 mg) è stata sciolta in fisiologica (20 mi), vi si è aggiunta una soluzione 0,5M di diidrazide dell’acido adipico (175 mg in 2 mi), a pH 5, ed il volume è stato potato a 24 mi con fisiologica. Si è aggiunta una soluzione acquosa di carbodiimide (192 mg in 10 mi, 01 ,M), e si è lasciato reagire per 6 ore a temperatura ambiente mantenendo il pH sotto il 5 per aggiunta di HCl. Il tutto è stato quindi dializzato contro tampone acetato 10mM, pH=9.

b) Ossidazione periodica del HS

GAGs (400 mg) sono stati sciolti in 4 mi di una soluzione fresca di metaperiodato di sodio 0.02M (4,28 g/l) in tampone acetato 0,1 M a pH=4. La miscela è stata posta sotto agitazione per 30 minuti a temperatura ambiente, quindi dializzata per una notte a temperatura ambiente contro tampone acetato 1mM, pH=4,4, dopo aggiunta di etilenglicole (0,4 mi).

c) Coniugazione

La soluzione ottenuta al punto b) è stata aggiunta a quella del punto a) ed il tutto posto sotto agitazione per 2 ore a temperatura ambiente. Vi si è aggiunto NaBH4 (100 mg) e la reazione è stata fatta proseguire per 4 ore a 4°C. La miscela di reazione è stata dializzata contro fisiologica, quindi concentrata da 25 a 5 mi per dialisi contro PEG 20, ed eluita da colonna di sefarosio. Si sono così ottenuti circa 560 mg di coniugato HS-BSA (resa: 90%).

ESEMPIO 4

Preparazione del coniugato GAGs-OVA

Procedendo analogamente a quanto descritto nel’esempio 3, si è ottenuto il coniugato in oggetto con resa sostanzialmente quantitativa.

ESEMPIO 5

Produzione degli anticorpi

Si sono utilizzati conigli del peso di circa 1 ,5 kg. Al tempo 0 (inizio del trattamento) gli animali sono stati trattati intradermicamente in 20 siti dell’addome, con 0,1 ml/sito di una sospensione di PBS (1 mi) contenente l’immunogeno GAGs-BSA (2 mg) ottenuto come descritto nell’esempio 3, ed adiuvante completo di Freund (1 mi, Sigma), al fine di avere la reazione di sensibilizzazione. Dopo 21 giorni, gli animali sono stati trattati per via intramuscolare con una 1 mi di una sospensione di PBS (1 mi) contenente limmunogeno GAGs-BSA ottenuto come descritto nell’esempio 3) ed adiuvante incompleto di Freund (1 mi, Sigma), al fine di avere la reazione scatenante. Dopo 8 giorni si è proceduto al prelievo di sangue dalla vena marginale dell'orecchio per la verifica con il metodo di affinità/specificità descritto nell’esempio 6. Successivamente, a 20 giorni di distanza, si è proceduto ad un ciclo ripetuto di richiami, iniettando intramuscolarmente la stessa sospensione della reazione scatenante, e prelievi fino all’accertamento dell’awenuta produzione di anticorpi specifici.

ESEMPIO 6

Test di affinità/specificità antigene/anticorpo

a) Preparazione della micropiastra

Si sono approntate soluzioni da 40 μg/l dei due immunogeni GAGs-BSA ed GAGs-OVA preparati come descritto, rispettivamente, negli esempi 3 e 4, in PBS. In micropiastra a 96 pozzetti per test ELISA si sono depositati, per ciascun pozzetto, 100 μΙ di una soluzione contenente GAGs-BSA. In parallelo, in una seconda micropiastra, si è eseguita la stessa operazione con una soluzione di GAGs-OVA. Le piastre sono state poste in termostato a 37°C per 3 ore per l'adesione deH'immunogeno. Successivamente a ciascun pozzetto si è aggiunto 150 μl di una soluzione di caseina al 2% (p/v) per la saturazione dei siti non reagiti. Le piastre sono state poste nuovamente in termostato a 37°C per 1 ora, poi i pozzetti sono stati lavati 3 volte con 300 ml di una soluzione di PBS contenente lo 0,2% di Tween 20 e perfettamente asciugati per scuotimento della piastra.

b) Preparazione del campione

Il sangue di coniglio è stato prelevato dalla vena marginale come descritto nell’esempio, e centrifugato a 3.000 rpm per 10 minuti. Il siero risultante è stato diluito con tampone PBS in diluizioni seriali (1/20, 1/40, 1/80, 1/160, 1/320, 1/640, 1/1280).

c) Preparazione del coniugato di rivelazione

La quantità di immunoglobuline (anticorpi) che si legano all’immunogeno adeso in piastra è stata rilevata mediante un anticorpo anti-lgG di coniglio (Sigma) coniugato all'enzima perossidasi (HRP) e diluito 1:1000 con PBS.

d) Esecuzione del test

Nei pozzetti della micropiastra precedentemente preparati si sono aggiunti 100 mi delle diverse diluizioni di campione (una per pozzetto). Nel primo pozzetto si sono aggiunti 100 μΙ di PBS come bianco. Le micropiastre sono state poste in termostato a 37°C per 1 ora. Si sono poi effettuati 3 lavaggi e conseguente asciugatura dei pozzetti con le stesse modalità della fase a). A ciascun pozzetto si sono aggiunti 100 μΙ di coniugato anti-IgG-HRP diluito, e le piastre sono state riportate in termostato a 37°C per 1 ora. Si sono poi effettuati altri 3 lavaggi e asciugatura sempre con la procedura della fase a), e ad ogni pozzetto si sono aggiunti 100 μΙ di substrato per l'enzima (OPD - Sigma), si è nuovamente incubato a 37°C e infine si sono aggiunti 50 μl di stopper (Sigma).

La densità ottica è stata letta a 492 nm entro 30 minuti azzerando contro il bianco. I risultati sono espressi dal grafico in Figura 4.

L’anticorpo formatosi nel coniglio è stato confermato essere diretto contro i GAGs in quanto si è avuta lettura sovrapponibile per i due immunogeni (HS-BSA e HS-OVA).

I seguenti esempi riguardano varie metodologie diagnostiche di rivelazione e dosaggio dei marker dell'invenzione.

ESEMPIO 7

Metodo immunoenzimatico competitivo su campione contenente condroitini

GAGs ed i loro frammenti metabolici competono con GAGs biotinilato aggiunti a concentrazioni standard nei confronti dell’anticorpo anti-GAGs adeso ad una fase solida (micropiastra). La concentrazione di GAGs biotinilato che si lega all'anticorpo è inversamente proporzionale alla concentrazione di GAGs e dei suoi frammenti metabolici contenuta nel campione.

La rivelazione avviene mediante titolazione del radicale biotina per reazione specifica con avidina-perossidasi.

a) Preparazione deH'immunoglobulina IgG anti-GAGs e metaboliti Dal siero anticorpale di coniglio (10 mi) ottenuto secondo quanto descrìtto nell'esempio 5, si sono precipitate le proteine per aggiunta di ammonio solfato al 50%, si è poi centrifugato a 3.000 rpm per 15 minuti ed il sovranatante è stato eliminato. Il precipitato è stato ripreso con tampone PBS (2 mi) e sottoposto a dialisi in tubo da 10 kD, per 48 ore a 2-8°C. La resa in proteine è di circa 7/100 mi.

Le IgG sono state purificate dal dializzato per cromatografia a bassa pressione su colonna Tryacril. Sulle IgG purificate è stato eseguito il titolo proteico utilizzando il micro-metodo Lowry (kit Sigma cod.

690.A). La resa in IgG è di 1 ,8-2 g/ml di siero.

Le IgG purificate sono state raccolte e portate alla concentrazione finale di 12,9 mg/ml per aggiunta di PBS, quindi diluite 1:100 con PBS per la successiva preparazione delle micropiastre,

b) Preparazione del coniugato HS-biotina (biotinizzazione di HS) o di GAGs-biotina

La coniugazione è stata eseguita su una miscela al 50% di HS e metaboliti estratti e purificati da soggetti normali (HSN) e da soggetti diabetici a diversi stadi della malattia e, più o meno, affetti da complicanze (HSP), al fine di avere la competizione col più ampio pannello possibile di metaboliti.

Si sono preparate due soluzioni iniziali di HSN e HSP (10 mg/ml in acqua). 230 μΙ di ognuna sono stati posti in bagno di ghiaccio. A parte si è preparata una soluzione di Nal04 0,1 M in tampone acetato 0,1 M, pH 5,5, e raffreddata anch'essa in bagno di ghiaccio. 3,52 mi di questa soluzione di Nal04 sono stati aggiunti alle soluzioni di HSN e HSP e la reazione è stata fatta procedere per 20 minuti in bagno di ghiaccio. Si sono poi aggiunti 150 μΙ di etilenglicol 1M, e si è lasciato a reagire per 30 minuti a temperatura ambiente. Il tutto è stato posto in Centricon 3.000 e centrifugato a 1.000 x g per 30 minuti (l’operazione è stata ripetuta per 5 volte). Il volume è stato riportato a 4 ml e si sono aggiunti 20,8 mg di biotin-idrazide. La reazione è stata fatta proseguire per 2 ore a temperatura ambiente, si è quindi ripetuta la centrifugazione su Centricon, e la miscela finale è stata portata ad un volume di 4,6 mi con PBS (concentrazione finale: 1 mg/ml).

c) Preparazione delle micropiastre

In micropiastre per ELISA da 96 pozzetti si sono posti 100 μl/pozzetto della soluzione IgG-anti-GAGs ottenuta al punto a) sopra. La le piastre sono state poste in termostato a 37°C per 3 ore, quindi i pozzetti sono stati svuotati, lavati per 3 volte con 300 μΙ di PBS e Tween 20 allo 0,2%, ed asciugati completamente per scuotimento. Dopodiché a ciascun pozzetto si sono aggiunti 150 μΙ di una soluzione di caseina al 2% (p/v) in tampone PBS, e si è posto ad incubare a 37° per 4 ore. Successivamente si è eseguita la procedura di svuotamento, lavaggio ed asciugatura dei pozzetti appena sopra descrìtta.

d) Curva di taratura del test

Si sono preparate soluzioni in tampone PBS contenenti, in rapporto volumetrico 1:1, una concentrazione fìssa di GAGs biotinilati pari a 100 μg/ml e concentrazioni scalari di GAGs standard partendo da una concentrazione massima di 100 pg/ml (1 punto) e diluendo in scala 1:2 per i punti successivi. In ciascun pozzetto sono stati posti 100 μΙ delle diverse soluzioni, escluso uno cui si è aggiunto il solo tampone (bianco). Le micropiastre sono state incubate a 37°C per 1 ora, poi si è effettuata la procedura di svuotamento, lavaggio ed asciugatura dei pozzetti sopra descritta. Si sono aggiunti per ogni pozzetto 100 μΙ di una diluizione 1:500 di avidìna perossidasi (Sigma, cod. A7419), e le micropiastre sono state riportate ad incubare in termostato a 37°C per 30 minuti, quindi si è effettuata la procedura di svuotamento, lavaggio ed asciugatura dei pozzetti sopra descritta. Si sono aggiunti 100 μΙ di substrato per l’enzima (OPD Sigma) preparato secondo le istruzioni del fornitore. Le piastre sono state nuovamente poste in termostato a 37° per 30 minuti e poi addizionate con 50 μΙ di stoppar (Sigma). La densità ottica è stata letta a 490 nm azzerando contro il bianco, e) Determinazione della concentrazione nel campione non trattato con condroitinasi dei metaboliti polisaccaridici urinali e serici.

Per quanto riguarda il siero, esso è stato ottenuto da sangue venoso prelevato in assenza di anticoagulante e centrifugato a 3.000 rpm per 15 minuti. Il volume di siero usato era di 100 μl. Per le urine si è usato 10 stesso volume, previa filtrazione, nel caso esse non risultassero perfettamente limpide.

Il volume indicato di campione è stato aggiunto in rapporto volumetrico di 1:1 alla soluzione di GAGs biotinilato (pari a 100 mg/ml). 100 μΙ di questa miscela sono stati posti in un pozzetto della micropiastra sensibilizzato con anticorpo anti-GAGs, quindi si lascia incubare per 1 ora a 37°C. La rivelazione è stata eseguita analogamente a quanto descritto per la taratura del punto d), leggendo a 490 nm contro il bianco. Il valore di densità ottica (D.O.) estrapolato sulla retta di taratura e moltiplicato per il fattore di diluizione fornisce la concentrazione di GAGs e dei suoi frammenti oligosaccaridici nel campione.

Nella successiva Tabella 3 sono riportati i valori ottenuti dalle urine di soggetti diabetici a confronto con quella di soggetti sani.

Tabella 3

La concentrazione di GAGs presente nelle urine di soggetti ma ati è drammaticamente superiore a quella presente nelle urine dei soggetti sani

ESEMPIO 8

Metodo immunoenzimatico competitivo su campione di urine trattato con condroitinasi A/C

Per quanto concerne la micropiastra, il coniugato, la metodologia operativa e la preparazione della curva di taratura, esse sono le stesse descritte nell’esempio 7.

a) Preparazione del campione

Ad 1 ml di urina si sono aggiunti 10<-3 >U di condroitinasi AC (Sigma C 3667) e la reazione è stata fatta procedere sotto agitazione a temperatura ambiente per 24 ore al riparo dalla luce. Al termine il tutto viene trasferito in un tubo di dialisi 1.000 D contro acqua e si è lasciato dia-I izza re per 24 ore sotto leggera agitazione. Il dializzato (100 μΙ) è stato miscelato con la soluzione di HS biotinilato in rapporto 1:1 v/v. 100 μΙ di questa miscela sono stati posti in un pozzetto della micropiastra sensibilizzato con anticorpo anti-GAGs. La rivelazione e lettura de! HS e dei suoi metaboliti contenuti nel campione sono state effettuate con la stessa metodica descritta nell’esempio 7. I risultati sono riportati nella seguente Tabella 4

Tabella 4

La concentrazione di HS e dei suoi metaboliti, a seguito di trattamento con condroitinasi A/C, presente nelle urine di soggetti malati è drammaticamente superiore a quella presente nelle urine dei soggetti sani.

L'aumento di concentrazione di GAGs urinari nei soggetti diabetici rispetto a quelli sani si riscontra sia prima che dopo trattamento con condroitinasi A/C, pertanto, a livello applicativo, entrambi i parametri sono altrettanto significativi.

ESEMPIO 9

Metodo di affinità per la lectina da Triticum vulaarìs

1. Metodo con l'anticorpo adeso alla piastra e rivelazione con lectina-HRP

a-1 ) Preparazione della micropiastra

A micropiastra da ELISA a 96 pozzetti sono state adese IgG anti-GAGs con la stessa tecnica descritta nell’esempio 7,c). b-1) Coniugato lectina-HRP

Si è usato Triticum vulgaris Lectine-Peroxidase Labeled (Sigma L.3892) diluito prima dell’uso 1 mg in 500 mi di tampone PBS. c-1 ) Principio del metodo

La lectina da Triticum vulgaris ha affinità per i residui N-acetil-β-D-glucosaminici e per gli oligomeri N-acetil-β-D-glucosamina. Questi ultimi sono costituenti del HS e dei suoi analoghi strutturali. L’HS, gli analoghi ed i loro frammenti metabolici contenuti nel campione di fluido biologico si legano all'anticorpo specifico adeso alla parete della micropiastra. La loro rivelazione avviene per aggiunta di coniugato lectina da Triticum vulgaris- perossidasi e successiva determinazione spettrofotometrica della reazione sviluppatasi tra enzima e substrato specifico (ortofenildiamina=OPD).

d-1) Esecuzione del test

In una micropiastra sensibilizzata con anticorpi IgG anti-GAGs si sono depositati 100 μΙ di diverse soluzioni secondo il seguente schema:

B C2

S1 C2

s2 C3

s3 C3

S4 C4

S5 C4

C1 ·

dove:

B = bianco (urina deprivata di GAGs)

S1, S2, S3, S4 e S5 = standard, costituiti da una miscela di GAGs o di HS da soggetti normali e diabetici in soluzione tampone PBS alle seguenti concentrazioni scalari in pg/ml (rispettivamente

200, 50, 12,5, 3,125, 0,781).

C1, C2, C3, e C4 = campioni (urine).

Le piastre vengono poste ad incubare in termostato a 37°C per 1 ora. Si sono quindi eseguiti 3 lavaggi consecutivi per aggiunta, a ciascun pozzetto, di 300 μΙ di tampone PBS contenente Tween 20 allo 0,2%, ed i pozzetti vengono poi asciugati perfettamente per scuotimento. A ciascun pozzetto si sono aggiunti 100 μΙ di coniugato lectina-HRP prediluito come descritto al punto b-1) sopra. La piastra è stata riportata in termostato a 37°c per 1 ora, e si sono eseguiti 3 lavaggi con le modalità già sopra indicate, dopodiché a ciascun pozzetto sono stati aggiunti 100 μΙ di croniogeno, ottenuto sciogliendo al momento dell’uso 1 compressa da 2 mg di OPD (Sigma) e in 5 mi di tampone PBS ed aggiungendo 10 μΙ di H2O2 al 15%. La piastra è stata riportata in termostato a 37°C per 30 minuti poi in ogni pozzetto si sono aggiunti 50 μΙ di H2S042N.

La densità ottica dei singoli pozzetti è stata letta a 492 nm entro 30 secondi, azzerando contro il bianco.

e-1) Retta di taratura e determinazione del campione

Riportando su scala logaritmica le concentrazioni dei punti standard e le relative densità ottiche (D.O.), si ottiene la retta di taratura del test (illustrata dalla Figura 5), ottenuta su campioni standard con o senza trattamento con condroitinasi.

Le densità ottiche lette per i campioni preparati secondo le metodologie già descritte, vengono riportate sulla retta della taratura, consentendo l'estrapolazione del contenuto in derivati metabolici del campione espresso in μg/ml.

Nella successiva Tabella 5 sono riportati i valori di GAGs totali ed HS e relativi frammenti metabolici provenienti dagli stessi campioni di soggetti normali e patologici. ottenuto con il metodo sandwich e rivelazione con lectina da Triticum vulgaris coniugata con perossidasi (HRP). Per la titolazione di HS e suoi frammenti, i campioni biologici sono state previamente trattati con condroitinasi.

Tabella 5

2. Metodo con lectina da Triticum vulgaris adesa alla micropiastra e rivelazione con anticorpo coniugato a perossidasi.

L’HS, i GAGs ed i loro metaboliti contenuti nel campione si legano per affinità alia lectina da Triticum vulgaris adesa alla fase solida (micropiastra). La loro rivelazione avviene per aggiunta del coniugato tra l’anticorpo IgG specifico diretto contro essi, e l’enzima perossidasi, e successiva determinazione spettrofotometrica della colorazione sviluppata dalla reazione tra enzima bloccato e substrato specifico. a-2) Preparazione della micropiastra

Una soluzione di lectina da Triticum vulgaris (Sigma) in tampone C03<2 >HC03<- >0,1M, pH 9,5 è stata depositata nei pozzetti di una micropiastra in ragione di 100 μΙ/pozzetto, e la piastra è stata incubata a 37°C per 2 ore. Dopo la procedura di lavaggio già sopra descritta, a ciascun pozzetto sono stati aggiunto 150 μl di una soluzione di caseina al 2% in tampone PBS. La micropiastra è stata lasciata per una notte a 4°C, poi si sono effettuati i 3 lavaggi con le modalità già sopra descritte.

b-2) Coniugato anticorpo-enzima (Ab-HRP)

La coniugazione è stata effettuata tra igG ottenute per purificazione dell’antisiero anti-GAGs e l’enzima HRP. La purificazione delle IgG dell’antisiero è stata eseguita come descritto nell’esempio 7, a), mentre per preparare il coniugato si è operato come segue. Una soluzione di enzima HRP (5,1 mg) in NalO4 (1,275 mi) 0,1 M in tampone acetato 0,1 M, pH 5,5, è stato fatto reagire per 20 minuti sotto agitazione a temperatura ambiente al riparo dalla luce. Si è poi aggiunto etilenglicole 1M (76,5 μΙ) e la reazione è stata fatta proseguire per altri 5 minuti. La soluzione di enzima risultante è stata cromatografata su colonna Sephadex (eluente: tampone C03<2->/HC03<- >0,1 M, pH 9,5). Le frazioni contenenti HRP attivata sono state addizionate con IgG (10,2 mg) e lasciate a reagire per 2 ore sotto agitazione a temperatura ambiente ed al riparo dalla luce. Si sono aggiunti 510 μΐ di NaBH4 (4 mg/ml di acqua) e la reazione è stata fatta proseguire per altre 2 ore a temperatura ambiente, sotto agitazione al riparo dalla luce. La miscela è stata dializzata in tubo da 100kD contro tampone PBS. Per l'esecuzione del test, la soluzione risultante è stata diluita in PBS 0,1 M, pH 7,4 in ragione di 1:900.

c-2) Esecuzione del test

Effettuato analogamente a quanto descritto al punto d-1 ) sopra, ma usando come coniugato di rivelazione IgG-HRP al posto di lectina-HRP, ed essendo in questo caso la lectina adesa alla microp iastra.

d-2) Retta di taratura e determinazione del campione

Nella figura 6 è riportato un esempio di retta di taratura applicando lo stesso sistema del punto e-1 ) di cui sopra.

Nella tabella 6 vengono riportati i valori dei contenuti nei liquidi biologici ottenuti operando sugli stessi campioni e con le stesse modalità.

Tabella 6

ESEMPIO 10

Determinazione tramite metodo cromatoarafico-colorimetrico su microcolonna

Si bloccano i metaboliti GAGs e loro frammenti su colonna cromatografica che può essere costituita da una matrice quale, ad esempio IgG anti-GAGs o anti-HS adeso a supporto inerte, o lectina da Trìticum vulgarìs immobilizzata su Sepharose 6MB (Sigma L.6257). L’eluente può essere HCI 0,1 N o N-acetil-p-D-glucosamina 0,5-1 ,5M. La concentrazione di GAGs o HS e loro frammenti metabolici viene determinata mediante rivelazione del contenuto di acidi uranici (glucuronico) o di glucosamina eseguita con metodologia spettrofotometrica.

1. Immobilizzazione degli anticorpi anti-GAGs su palline di vetro

IgG anti-GAGs (200 mg) sono state legate a palline Sigma G4643 (1 g pari a 7,7- 10<-5 >moli di NH2).

2. Determinazione dell’acido uranico

Tre provette contenenti sodio tetraborato 0,0125M (1,2 mi) in H2S04 al 96%, e 0,2 ml di campione, o 0,2 mi di standard o 0,2 mi di bianco (PBS) sono state poste in bagno di ghiaccio e sottoposte ad cauta agitazione, poi per 5 minuti a bagnomaria a 100°C e quindi raffreddate. Vi si è aggiunto m-idrassi-difenil 0,15% in NaOH allo 0,5% (40 μΙ) e dopo 5 minuti si è effettuata la lettura di densità ottica a 520 nm azzerando con il bianco.

3. Preparazione del kit ed esecuzione del test

Colonnine cromatografiche (0 0,6x10 cm) sono state caricate con palline di vetro con l’anticorpo anti-GAGs immobilizzato, risospese in tampone PBS. Il letto cromatografico è stato lavato con lo stesso tampone, eluito con 30 mi di urine campione e nuovamente lavato con lo stesso tampone. Si è poi eluito con una soluzione di N-acetil-β-D-glucosamina 0,1 M (5 mi), e l’eluato è stato sottoposto alla determinazione spettrofotometrica delle concentrazioni di acidi uranici contenuti nei GAGs urinari e loro metaboliti. Dal rapporto del titolo determinato in riferimento a quello dei relativi standard si sono definite le concentrazioni dei campioni.

Nella successiva tabella 7 vengono riportati i valori dei GAGs urinari e dei loro frammenti isolati dal campione.

Tabella 7

L'entità dei valori Δ% è un chiaro indizio di come la concentrazione dei GAGs nelle urine sia proporzionale alla gravità della patologia diabetica ed all'insorgenza di complicanze.

ESEMPIO 11

Metodo immunocromatoarafico su membrana di nylon

I frammenti di GAGs solfati presenti nel campione vengono legato all'anticorpo specifico adeso alia membrana. La loro rivelazione avviene per aggiunta di lectine da Triticum vulgarìs legata a HRP. L'intensità della colorazione in confronto a standard predosati indica in maniera qualiquantitativa la concentrazione di analiti nel campione.

1. Preparazione della membrana

Una soluzione di IgG anti-HS (30 mg/ml in PBS) è stata deposta su una membrana in ragione di 3 μl. La membrana è stata fatta asciugare e poi immersa in caseina al 3% in PBS. Dopo 15 minuti è stata scolata su carta e messa in termostato a 37°C per 30 minuti, infine montata sull’apposito supporto.

2. Preparazione del coniugato

li coniugato lectina-HRP da Triticum vulgarìs marcato (Sigma L.3882) (1000 μΙ) è stato diluito con 10 mi di PBS/caseina 3%, e la miscela è stata posta sotto agitazione al riparo dalla luce.

3. Esecuzione del test

Ciascun pozzetto è stato addizionato con PBS/caseina 3% (bianco), le urine da analizzare, fresche (C,) e gli standard (S1, S2, S3), secondo il seguente schema:

B, S1 S2, S3,C1C1

dove B, S e C sono come sopra definiti. I pozzetti sono stati sottoposti ad un ciclo di 3 lavaggi con 300 μΙ di tampone PBS contenente Tween 20 allo 0,2%, poi addizionati con 5 μl di lectina-HRP da Triticum vulgaris marcato (Sigma L.3882) diluito in PBS. Dopo 10 minuti i pozzetti sono stati nuovamente lavati come sopra e poi addizionati con 10 μΙ di tetrametilbenzilina (TMB) in soluzione tampone (substrato cromogeno). I risultati sono stati valutati visivamente confrontando l’intensità della colorazione dei pozzetti contenenti il campione rispetto a quelli di controllo positivo.

Claims

RIVENDICAZIONI 1. Uso di metaboliti oligosaccaridici di proteoglicani come marker in fluidi biologici per valutare lo stato, la gravità, il rischio di insorgenza, la possibilità di genesi di complicanze, e il monitoraggio del trattamento della malattia diabetica.
2. Uso di metaboliti secondo la rivendicazione 1 sono scelti dal gruppo comprendente eparansolfato, condroitinsolfato A e C, e dermatansolfato e loro frammenti metabolici.
3. Uso secondo la rivendicazione 1 in cui il metabolita è eparansolfato e i suoi frammenti metabolici.
4. Uso secondo la rivendicazione 1 in cui i metaboliti sono rivelati da siero e urine.
5. Metodo diagnostico per la determinazione di metaboliti oligosaccaridici di proteoglicani da fluidi, biologici che sfrutta una tecnica immunoenzimatica (ELISA) competitiva.
6. Metodo diagnostico secondo la rivendicazione 5 in cui la tecnica competitiva è basata sul sistema di rivelazione biotina/avidina.
7. Uso del metodo secondo la rivendicazione 5 per valutare lo stato, la gravità, il rischio di insorgenza, la possibilità di genesi di complicanze, e il monitoraggio del trattamento della malattia diabetica.
8. Kit diagnostico basato sul metodo secondo la rivendicazione 5.
9. Metodo diagnostico per la determinazione di metaboliti oligosaccaridici di proteoglicani da fluidi biologici che consiste nella determinazione colorimetrica dell'acido glucuronico e della glucosamina.
10. Uso del metodo secondo la rivendicazione 9 per valutare lo stato, la gravità, il rìschio di insorgenza, la possibilità di genesi di complicanze, e il monitoraggio del trattamento della malattia diabetica
11. Kit diagnostico basato sul metodo secondo la rivendicazione 9.
12. Metodo diagnostico per la determinazione di metaboliti oligosaccaridici di proteoglicani da fluidi biologici che sfrutta una metodica immunoenzimatico-simile di tipo a sandwich tramite rivelazione per via cromatografica/colorimetrica con lectine o di loro coniugati.
13. Metodo secondo la rivendicazione 12 in cui le lectine provengono da Trìticum vulgarìs.
14. Metodo secondo la rivendicazione 12 in cui le lectine sono coniugate con perossidasi.
15. Uso del metodo secondo la rivendicazione 12 per valutare lo stato, la gravità, il rischio di insorgenza, la possibilità di genesi di complicanze, e il monitoraggio del trattamento della malattia diabetica
16. Metodo secondo la rivendicazione 12 applicato ad urine.
17. Kit diagnostico basato sul metodo secondo la rivendicazione 12.
18. Uso di lectine per la rivelazione per via cromatografica/colorimetrica di metaboliti oligosaccaridici di proteoglicani da fluidi biologici.
19. Uso di lectine secondo la rivendicazione 18 per rivelare metaboliti oligosaccaridici di proteoglicani da urine.
20. Uso di lectine secondo la rivendicazione 18 per valutare lo stato, la gravità, il rischio di insorgenza, la possibilità di genesi di complicanze, e il monitoraggio del trattamento della malattia diabetica.
21. Uso secondo la rivendicazione 18 di lectine da Trìticum vulgarìs.
22. Uso di lectine secondo la rivendicazione 19 in forma di coniugato.
23. Uso di ledine secondo la rivendicazione 23 in forma di coniugato con perossidasi.