ITMI982557A1

ITMI982557A1 - "nanosfere lipidiche solide atte ad una rapida internalizzazione dellecellule"

Info

Publication number: ITMI982557A1
Application number: IT1998MI002557A
Authority: IT
Inventors: Maria Rosa Gasco
Original assignee: Maria Rosa Gasco
Priority date: 1998-11-25
Filing date: 1998-11-25
Publication date: 2000-05-25
Also published as: CA2352149A1; US6685960B1; EP1133286B1; WO2000030620A1; ATE283039T1; CA2352149C; EP1133286A1; DE69922243T2; AU1654200A; DE69922243D1; ES2234322T3; IT1303787B1

Description

Descrizione dell’invenzione industriale dal titolo :

"Nanosfere lipidiche solide atte ad una rapida internalizzazione nelle cellule"

CAMPO DELL'INVENZIONE

La presente invenzione riguarda composizioni farmaceutiche in forma di nanosfere lipidiche solide in grado di penetrare rapidamente nelle cellule, il processo per la loro preparazione ed il loro impiego nel trattamento di patologie tumorali e dell'anemia mediterranea.

STATO DELLA TECNICA

E' noto dalla letteratura che gli acidi carbossilici a basso numero di atomi di carbonio, quali l'acido acetico, l'acido propionico, l'acido butirrico e l'acido succinico, e loro derivati, possono inibire la proliferazione delle cellule tumorali, in particolare nel caso di tumori al colon (H.P.Scheppach, F.Ritcher, Eur. J. Cancer Prevantion, 4, 373-378, 1995, e 31, 1077-1080, 1995).

Esistono in particolare prove sperimentali che dimostrano l'attività antiproliferativa dei sali di acido butirrico, ad esempio del sale sodico, nei confronti di una grande varietà di cellule neoplastiche (S.P.Landon et al., Cancer res., 48, 6161-6165, 1988 ; D.Coradini et al., Celi Proli†., 30, 149-159, 1997 ; H. Yamamoto et al., Ini. J. Cancer, 76, 897-902, 1998).

Studi recenti hanno mostrato che il butirrato di sodio è in grado di modulare l’espressione degli oncogeni e dei geni che regolano l'apoptosi in cellule provenienti da diversi istotipi (O.C.Velasquez et al., J. Parenteral Enteral Nutr., 20, 243-250, 1996 ; M. Mandai, R.Kumar, Celi Growth Diff 7, 311-318, 1996).

E' inoltre noto che gli stessi acidi carbossilici e/o taluni loro derivati possono favorire in modo significativo, nel caso dell'anemia mediterranea, la trasformazione della β-globtna in γ-globina, o globina fetale, che porta ad un miglioramento della malattia (S.P. Penne et al., New England J. Medicine , 328, 81-86, 1993, A.F. Collins et al., Blood, 85, 43-49, 1995).

Attualmente, l'utilizzo di tali composti è però fortemente limitato dalla difficoltà nel raggiungere concentrazioni piasmatiche efficaci, a causa del breve tempo di emivita, che rende troppo rapidi il metabolismo e l'escrezione di dette sostanze. Per ottenere risultati soddisfacenti si dovrebbero perciò somministrare quantità elevate di acido, con l'inconveniente di provocare dannosi effetti collaterali.

E' perciò sentita l'esigenza di disporre di un adeguato sistema di rilascio per queste sostanze, che consenta di ridurne le dosi, minimizzando così gli effetti collaterali.

SOMMARIO

Ora la Richiedente ha trovato nuove composizioni farmaceutiche che consentono di superare gli inconvenienti della tecnica nota, mostrando un'attività biologica sorprendentemente elevata.

Dette composizioni farmaceutiche sono preparate in forma di nanosfere lipidiche solide caratterizzate dal fatto di comprendere come sostanza attiva una sostanza lipidica costituita da un estere del α-tocoferolo o del δ-tocoferolo o del colesterolo con un acido carbossilico scelto nel gruppo costituito da acido acetico, acido propionico, acido butirrico ed acido succinico, ed eventualmente una o più ulteriori sostanze farmacologicamente attive.

Ulteriore oggetto della presente invenzione è il processo per la preparazione di dette nanosfere lipidiche, comprendente i seguenti stadi :

a) riscaldamento di una miscela comprendente una sostanza lipidica ed uno o più tensioattivi ad una temperatura tale da portare la miscela alla fusione ;

b) riscaldamento di una miscela costituita da acqua ed uno o più cotensioattivi ad una temperatura almeno uguale a quella dello stadio a) ;

c) mescolamento a caldo sotto leggera agitazione della miscela descritta allo stadio b) con la miscela dello stadio a), con ottenimento di una microemulsione ;

d) dispersione della microemulsione ottenuta allo stadio c) in acqua preraffreddata ;

e) lavaggio della dispersione dello stadio d) con acqua distillata mediante diafiltrazione ;

f) liofilizzazione del prodotto ottenuto allo stadio e) o sua sterilizzazione a caldo,

caratterizzato dal fatto che detta sostanza lipidica è costituita da un estere di α-tocoferolo o del δ-tocoferolo o del colesterolo con un acido carbossilico scelto nel gruppo costituito da acido acetico, acido propionico, acido butirrico ed acido succinico.

Le composizioni farmaceutiche in forma di nanosfere lipidiche solide oggetto della presente invenzione sono utili nel trattamento di tutte le condizioni patologiche per le quali è efficace la somministrazione dei suddetti acidi carbossilici, e sono in particolare adatte per il trattamento delle patologie tumorali e dell'anemia mediterranea.

Le caratteristiche ed i vantaggi delle nanosfere lipidiche solide come sistema di rilascio per gli acidi carbossilici secondo la presente invenzione e del relativo processo di preparazione saranno illustrati in dettaglio nella seguente descrizione.

DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL'INVENZIONE

La presente invenzione riguarda composizioni farmaceutiche in forma di nanosfere lipidiche solide ottenute da microemulsioni di una sostanza lipidica, stabilizzate da almeno un tensioattivo e da uno o più cotensioattivi.

Con il termine nanosfere lipidiche nella presente invenzione si intendono particelle con un diametro medio inferiore a 300 nm.

Per la preparazione di dette microemulsioni una sostanza lipidica in miscela con uno o più tensioattivi, ed eventualmente una o più ulteriori sostanze farmacologicamente attive, viene riscaldata fino a fusione ; separatamente una miscela costituita da acqua ed uno o più cotensioattivi viene riscaldata ad una temperatura almeno uguale a quella a cui fonde la miscela contenente la sostanza lipidica. La miscela acquosa viene quindi aggiunta a caldo sotto leggera agitazione alla miscela contenente la sostanza lipidica, ottenendo una microemulsione. La microemulsione così ottenuta è versata in acqua p re-raffreddata ad una temperatura compresa tra 2 e 10 °C sotto leggera agitazione, impiegando una quantità di acqua compresa fra 10 : 1 e 80 : 1 parti in volume rispetto al volume della microemulsione. La dispersione così ottenuta viene poi lavata più volte con acqua distillata mediante diafiltrazione in modo da eliminare le componenti solubili in acqua, utilizzando un apparecchio TCF2 (Amicon-Grace-Danvers, USA) munito di una membrana Diaflo YM 100 con cut-off di 100.000 Dalton, come descritto in R. Cavalli et al., S.T.P. Pharma Sciences, 2(6), 514-518, 1992.

Tale dispersione viene infine sterilizzata a caldo in autoclave a 121°C per 15 minuti a 2 atm, o liofilizzata.

Le nanosfere lipidiche così ottenute hanno un diametro medio compreso fra 40 e 300 nm, e preferibilmente fra 100 e 200 nm, ed un indice di polidispersione compreso fra 0,10 e 0,50.

La caratterizzazione delle microemulsioni è stata effettuata mediante spettroscopia di fotocorrelazione con uno strumento N 4 Coulter, secondo quanto descritto in R. Cavalli et al., int. J. Phanri., 148, 47-54, 1997.

La sostanza lipidica impiegata nella preparazione delle nanosfere lipidiche secondo la presente invenzione è scelta nel gruppo costituito da esteri del colesterolo o del α-tocoferolo o del δ-tocoferolo con acidi carbossilici a basso numero di atomi di carbonio, scelti nel gruppo costituito da acido acetico, acido propionico, acido butirrico ed acido succinico.

Detta sostanza lipidica costituisce la sostanza attiva essenziale delle nanosfere lipidiche, che possono tuttavia comprendere, in forme di realizzazione particolari della presente invenzione, una o più altre sostanze farmacologicamente attive.

Tali ulteriori sostanze attive sono tipicamente scelte nel gruppo comprendente doxorubicina, idarubicina e taxolo.

Secondo una forma di realizzazione preferita della presente invenzione detta sostanza lipidica è colesteril butirrato.

Come tensioattivi sono tipicamente impiegati fosfatidilcolina ricavata da soia o da tuorlo d'uovo, fosfolipidi e loro miscele.

Secondo una forma di realizzazione preferita della presente invenzione il tensioattivo utilizzato è un prodotto commerciale noto con il nome Epikuron 200<® >(Lucas Meyer, Hamburg, Germany), costituito per il 95% da fosfatidilcolina.

I cotensioattivi sono scelti tra alcoli, quali alcol butilico, acidi carbossilici quali acido butirrico ed esanoico e sali biliari quali sodio taurocolato e sodio glicocolato.

Secondo una forma di realizzazione preferita della presente invenzione, nella preparazione della microemulsione le varie sostanze sono impiegate nelle seguenti proporzioni, espresse come percentuali in peso rispetto al peso totale della microemulsione :

- sostanza lipidica 5 - 18%

- tensioattivi : 10 - 20%

- cotensioattivi : 12 - 18%

- acqua : 44 - 70%.

Nella forma di realizzazione preferita le nanosfere lipidiche ottenute per diafiltrazione hanno un titolo in sostanza lipidica compreso tra 25 e 42%, il rimanente essendo costituito da fosfatidilcolina e/o da fosfolipidi e da tracce di altre sostanze impiegate nei processo di preparazione.

Secondo una forma di realizzazione particolarmente preferita della presente invenzione la composizione delle nanosfere lipidiche solide, espressa come percentuale in peso dei vari componenti, è la seguente :

- colesteril butirrato 31,5 %

- fosfatidilcolina 68,0%

- altro 0,5%

Per le loro piccole dimensioni e per la loro composizione, dette nanosfere hanno la caratteristica inaspettata di essere rapidamente interna lizzate nelle cellule, dove la sostanza attiva è rilasciata velocemente.

Rispetto ai sistemi della tecnica nota, dette nanosfere lipidiche solide costituiscono perciò il sistema di rilascio ideale per sostanze attive, quali gli acidi carbossilici a basso peso molecolare presenti negli esteri della presente invenzione. Infatti esse consentono una forte diminuzione delle dosi efficaci, con conseguente limitazione degli effetti collaterali.

Le composizioni farmaceutiche in forma di nanosfere lipidiche solide della presente invenzione possono pertanto essere impiegate con successo nel trattamento di tutte le patologie per le quali le suddette caratteristiche di intemalizzazione rapida della sostanza attiva sono

(X importanti.

Le composizioni farmaceutiche in forma di nanosfere lipidiche oggetto della presente invenzione sono utili nel trattamento di tutte le patologie per cui è efficace la somministrazione di acido acetico, acido propionico, acido butirrico ed acido succinico, ed in particolare nel trattamento di patologie tumorali e dell'anemia mediterranea.

Per detti impieghi le nanosfere secondo l'invenzione possono essere impiegate da sole, oppure in miscela con eccipienti e/o diluenti farmacologicamente accettabili, e/o sostanze farmacologicamente attive. In forme particolari di realizzazione delle composizioni farmaceutiche secondo la presente invenzione, dette sostanze attive sono agenti antineoplastici.

I seguenti esempi di preparazione di composizioni farmaceutiche in forma di nanosfere lipidiche solide sono riportati a scopo illustrativo, ma non limitativo della presente invenzione.

ESEMPIO 1

a) 15 mg di Epikuron 200<® >(95% di fosfatidilcolina) e 1 mg di fosfatidii inositolo sono addizionati a 9 mg di colesteril butirrato, e tale miscela è riscaldata fino alla fusione a circa 75 °C ;

b) una miscela costituita da acqua (62 mg), glicocolato di sodio (3 mg) e alcol butilico (10 mg) è riscaldata alla stessa temperatura della miscela dello stadio a) ;

c) sotto leggera agitazione e alla stessa temperatura degli stadi precedenti, la miscela dello stadio b) viene aggiunta alla miscela dello stadio a), ottenendo una microemulsione, che risulta limpida.

d) La microemulsione ottenuta allo stadio c) viene dispersa in acqua preraffreddata a 5 °C in quantità pari a 20 parti in volume di acqua per ogni parte di microemulsione, ottenendo una dispersione di nanosfere ; e) la dispersione ottenuta allo stadio d) è lavata per 2 volte con acqua distillata mediante diafiltrazione ;

f) la dispersione lavata è infine liofilizzata.

Mediante spettroscopia di fotocorrelazione è stato determinato il diametro medio delle nanosfere, che è risultato essere 120 nm, con indice di polidispersione di 0,25.

Le nanosfere così ottenute sono costituite per il 35,5% da colesteril butirrato e per il 64% da fosfatidilcolina.

ESEMPIO 2

a) 16 mg di Epikuron 200<® >(95% di fosfatidilcolina) sono addizionati a 7 mg di colesteril butirrato e riscaldati fino a fusione della miscela a circa 77 °C ;

b) alla stessa temperatura dello stadio a) viene scaldata una miscela costituita da acqua (62 mg), taurocolato di sodio (3 mg) e alcol butilico (12 mg) ;

c) la miscela dello stadio b) è aggiunta, sotto leggera agitazione e sempre alla stessa temperatura degli stadi precedenti, alla miscela dello stadio a), ottenendo una microemulsione limpida ;

d) la microemulsione ottenuta allo stadio c) è dispersa in acqua preraffreddata a 2 °C in quantità pari a 40 parti in volume di acqua per ogni parte di microemulsione, ottenendo una dispersione di nanosfere; e) la dispersione ottenuta allo stadio d) è lavata per 3 volte con acqua distillata mediante diafiltrazione ;

f) la dispersione lavata è infine sterilizzata secondo FU IX a 121 °C e alla pressione di 2 atmosfere.

Il diametro medio delle nanoparticelle, determinato mediante spettrometria di fotocorrelazione, è risultato 150 nm, con indice di polidispersione di 0,35.

Le nanosfere così ottenute sono costituite dal 30% di colesterìl butirrato, e dal 69% di fosfatidilcolina.

Prove di inibizione della proliferazione cellulare

La sperimentazione è stata condotta su cellule di carcinoma del polmone NIH-H460 (D.N.Carney et al., Cancer Ras., 45, 2913-2923, 1985), fatte crescere in monostrato nel mezzo di nutrizione RPMI 1640 (Bio Whittaker, Verviers, Belgium) addizionato con il 10% in volume rispetto al volume totale del mezzo di FCS (Fetal Calf Serum), alla temperatura di 37 °C, in atmosfera umidificata al 5% di C02.

Le cellule sono state poste in piastre da 24 pozzetti, utilizzando come mezzo di nutrizione RPMI 1640 addizionato con il 10% di FCS, e lasciate aderire per 24 ore. Il mezzo di inseminazione è stato quindi rimosso e sostituito con il mezzo sperimentale costituito da RPMI 1640 con il 10% di FCS e concentrazioni crescenti di sodio butirrato, oppure di colesterìl butirrato in forma di nanosfere preparate secondo l'Esempio 1 sopra riportato. Le cellule sono state tenute per 6 giorni a contatto con tale mezzo sperimentale.

L'effetto del butirrato di sodio e del colesterìl butirrato sulla crescita cellulare è stato valutato contando le cellule mediante un Celi Counter.

Si è cosi osservato che le nanosfere contenenti colesteril butirrato hanno indotto una completa inibizione della crescita cellulare ad una concentrazione pari a 0,21 mM di colesteril butirrato, mentre il butirrato di sodio, alla stessa concentrazione, ha indotto una inibizione della crescita cellulare limitata al 50%.

Contemporaneamente è stata condotta una prova di confronto impiegando colesterolo come additivo del mezzo sperimentale costituito da RPMI 1640 con 10% di FCS, con la quale si è osservato che il colesterolo non influenza in alcun modo la proliferazione cellulare.

L'esperimento sopra descritto è stato ripetuto su cellule di carcinoma mammario, identificate con la sigla MCF7, impiegando come mezzo di inseminazione DMEM/F12 (Dulbecco’s modified Eagle's medium, Sigma Chemical Co., St Louis, MO) con 2% di FCS.

Dette cellule sono state poste in piastre da 12 pozzetti, dove sono state lasciate ad aderire per 24 ore nel mezzo di nutrizione sopra descritto. (I mezzo di nutrizione è stato poi rimosso e sostituito con il mezzo sperimentale costituito da DMEM/F12 con 10% di FCS addizionato con concentrazioni crescenti di sodio butirrato, oppure di colesteril butirrato sotto forma di nanosfere preparate operando secondo l'Esempio 2 riportato sopra. Le cellule sono state tenute per 6 giorni a contatto con tale mezzo sperimentale.

L'effetto antiproliferativo delle nanosfere di colesteril butirrato sulla crescita delle cellule è stato valutato contando le cellule con un Celi Counter. Da tali misure è risultato che le nanosfere contenenti colesteril butirrato hanno indotto una completa inibizione della crescita cellulare ad una concentrazione pari a 0,2 mM di colesterìl butirrato, mentre il sodio butirrato ha indotto, alla stessa concentrazione, una inibizione della crescita cellulare limitata al 40%.

Prove sulla internalizzazione nelle cellule

L'internalizzazione delle nanosfere contenenti colesterìl butirrato in cellule di carcinoma del polmone, identificate con la sigla NIH-H460, è stata studiata mediante osservazione al microscopio a fluorescenza.

Operando secondo l'Esempio 1 sopra riportato sono state preparate nanosfere contenenti coiesteril butirrato, che sono state rese fluorescenti mediante aggiunta di cu marina 6.

Cellule NIH-H460, addizionate con 50 μΙ di nanosfere marcate, sono state incubate a 37 °C, e campioni sono stati prelevati in tempi diversi per essere esaminati.

Detti campioni sono stati lavati con una soluzione salina tamponata con tampone fosfato, centrifugati ed addizionati con una soluzione contenente 5pg/ml di ioduro di propidio.

Le cellule cosi trattate sono state osservate e fotografate mediante microscopio a fluorescenza in parallelo con il controllo costituito dalle stesse cellule addizionate di solo ioduro di propidio.

Si è osservato che, al contrario del controllo, le cellule trattate con le nanosfere rese fluorescenti mediante cumarina 6 contenenti colesterìl butirrato apparivano già dopo 5 minuti dal trattamento quasi completamente fluorescenti, a dimostrazione di una quasi completa internalizzazione delle nanosfere nelle cellule in tempi molto brevi.

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Claims

RIVENDICAZIONI 1. Composizione farmaceutica nella forma di nanosfere lipidiche solide, caratterizzata dal fatto che dette nanosfere comprendono come sostanza attiva una sostanza lipidica costituita da un estere del atocoferolo o del δ-tocoferolo o del colesterolo con un acido carbossilico scelto nel gruppo costituito da acido acetico, acido propionico, acido butirrico ed acido succinico.
2. Composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 1, caratterizzata dal fatto che detta sostanza lipidica è colesteril butirrato.
3. Composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 1 , caratterizzata dal fatto che dette nanosfere hanno un diametro medio inferiore a 300 nm ed un indice di polidispersione compreso tra 0,10 e 0,50.
4. Composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 3, caratterizzata dal fatto che il diametro medio delle nanosfere è compreso tra 100 e 200 nm.
5. Composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 1 , caratterizzata dal fatto che la quantità di sostanza lipidica attiva nelle nanosfere è compresa tra 25 e 42% in peso, il rimanente essendo costituito da fosfatidilcolina e/o da fosfolipidi.
6. Composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 1, caratterizzata dal fatto di comprendere una o più ulteriori sostanze attive scelte nel gruppo costituito da taxolo, idarubicina e doxorubicina.
7. Processo per la preparazione di nanosfere lipidiche solide, comprendente i seguenti stadi : a) riscaldamento di una miscela comprendente una sostanza lipidica ed uno o più tensioattivi ad una temperatura tale da portare la miscela alla fusione ; b) riscaldamento di una miscela comprendente acqua ed uno o più cotensioattivi ad una temperatura uguale a quella dello stadio a) ; c) mescolamento sotto leggera agitazione della miscela descritta allo stadio b) con la miscela dello stadio a), con ottenimento di una microemulsione ; d) dispersione della microemulsione ottenuta allo stadio c) in acqua preraffreddata ; e) lavaggio della dispersione dello stadio d) con acqua distillata mediante diafiltrazione ; f) liofilizzazione del prodotto ottenuto allo stadio e), o sua sterilizzazione a caldo, caratterizzato dal fatto che detta sostanza lipidica è costituita da un estere del α-tocoferolo o del δ-tocoferolo o del colesterolo con un acido carbossilico scelto nel gruppo consistente di acido acetico, acido propionico, acido butirrico ed acido succinico.
8. Processo secondo la rivendicazione 7, caratterizzato dal fatto che detta sostanza lipidica è colesteril butirrato.
9. Processo secondo la rivendicazione 7, caratterizzato dal fatto che detto tensioattivo dello stadio a) è scelto nel gruppo consistente di fosfatidilcolina di soia, fosfatidilcolina d'uovo, fosfolipidi e loro miscele.
10. Processo secondo la rivendicazione 7, caratterizzato dal fatto che la miscela allo stadio a) comprende ulteriormente una o più sostanze attive scelte tra taxolo, idarubicina e doxorubicina.
11. Processo secondo la rivendicazione 7, caratterizzato dal fatto che detto cotensioattivo alio stadio b) è scelto nel gruppo consistente di butanolo, acido butirrico, acido esanoico, sodio taurocolato e sodio glicocolato.
12. Processo secondo la rivendicazione 7, caratterizzato dal fatto che detta sostanza lipidica è presente in detta microemulsione dello stadio c) in quantità compresa tra 5 e 18% in peso rispetto al peso totale.
13. Processo secondo la rivendicazione 7, caratterizzato dal fatto che la quantità di acqua nella miscela dello stadio b) è compresa tra 44 e 70% in peso rispetto al peso totale della microemulsione.
14. Processo secondo la rivendicazione 7, caratterizzato dal fatto che la quantità di tensioattivi presenti nella miscela allo stadio a) è compresa tra 10 e 20% in peso rispetto al peso totale della microemulsione.
15. Processo secondo la rivendicazione 7, caratterizzato dal fatto che la quantità di cotensioattivi presenti nella miscela acquosa allo stadio b) è compresa tra 12 e 18% in peso rispetto al peso totale della microemulsione.
16. Processo secondo la rivendicazione 7, caratterizzato dal fatto che detta dispersione allo stadio d) è effettuata con acqua raffreddata a 2 -10 °C in quantità compresa tra 10 : 1 e 80 : 1 parti in volume rispetto al volume di miscela dello stadio c).
17. Processo secondo la rivendicazione 7, caratterizzato dal fatto che allo stadio f) si ottengono nanosfere lipidiche solide con un diametro medio inferiore a 300 nm e indice di polidispersione compreso tra 0,10 e
18. Uso di una sostanza lipidica costituita da un estere del α-tocoferolo o del δ-tocofero!o o del colesterolo con un acido carbossilico scelto nel gruppo costituito da acido acetico, acido propionico, acido butirrico ed acido succinico, come sostanza attiva per la preparazione di una composizione farmaceutica nella forma di nanosfere lipidiche solide.
19. Uso secondo la rivendicazione 18, caratterizzato dal fatto che detta sostanza lipidica è colesteril butirrato.
20. Uso secondo la rivendicazione 18, caratterizzato dal fatto che detta composizione farmaceutica è utile nei trattamenti basati sulla somministrazione di acido acetico, acido propionico, acido butirrico ed acido succinico.
21. Uso secondo la rivendicazione 18, caratterizzato dal fatto che detta composizione farmaceutica è utile nel trattamento delle patologie tumorali e dell'anemia mediterranea.
22. Uso secondo la rivendicazione 18, caratterizzato dal fatto che dette nanosfere possono essere somministrate da sole, oppure in miscela con eccipienti e/o diluenti farmacologicamente accettabili, e/o con sostanze farmacologicamente attive.
23. Uso secondo la rivendicazione 22, caratterizzato dal fatto che dette sostanze farmacologicamente attive sono agenti antineoplastici. (BRA/pd) Q