ES2234322T3

ES2234322T3 - Nanoesferas solidas de lipidos apropiadas para su asimilacion rapida por las celulas.

Info

Publication number: ES2234322T3
Application number: ES99959320T
Authority: ES
Inventors: Maria Rosa Gasco
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1998-11-25
Filing date: 1999-11-24
Publication date: 2005-06-16
Anticipated expiration: 2019-11-24
Also published as: EP1133286A1; EP1133286B1; US6685960B1; DE69922243T2; CA2352149C; CA2352149A1; WO2000030620A1; DE69922243D1; IT1303787B1; ATE283039T1; ITMI982557A1; AU1654200A

Abstract

Composición farmacéutica en forma de nanoesferas lipídicas sólidas que presentan un diámetro medio inferior a 300 nm y un índice de polidispersión comprendido entre 0, 10 y 0, 50, comprendiendo dichas nanoesferas una sustancia lipídica que consta de colesteril butirato y, posiblemente, de otra o varias otras sustancias activas seleccionadas del grupo formado por taxol, idarubiceno y doxorubiceno, pudiéndose obtener dichas nanoesferas mediante un procedimiento que consta de las siguientes etapas: a) calentamiento de una mezcla, que comprende una sustancia lipídica que consiste en colesteril butirato e incluye posiblemente otra o varias otras sustancias activas seleccionadas del grupo formado por taxol, idarubiceno y doxorubiceno, y un o varios surfactivos, a la temperatura a la que se funde dicha mezcla; b) calentamiento de una mezcla de agua y un o varios cosurfactivos a la temperatura de la etapa a); c) mezcla con agitación moderada de la mezcla descrita en la etapa b) con la mezclade la etapa a), obteniéndose así una microemulsión; d) dispersión de la microemulsión obtenida en la etapa c) en agua preenfriada; e) lavado por diafiltración con agua destilada de la dispersión de la etapa d); f) esterilización o secado por congelación del producto obtenido en la etapa e).

Description

Nanoesferas sólidas de lípidos apropiadas para su asimilación rápida por las células.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a composiciones farmacéuticas en forma de nanoesferas lipídicas sólidas que son capaces de penetrar rápidamente en las células, en el procedimiento para su preparación, y en su uso para el tratamiento de patologías tumorales y de la talasemia \beta.

Técnica anterior

Un hecho bien conocido a partir de la literatura médica es que los ácidos carboxílicos, que presentan un número reducido de átomos de carbono, como el ácido acético, el ácido propiónico, el ácido butírico y el ácido succínico, así como sus derivados, pueden inhibir la proliferación de las células tumorales, en particular, en el caso del cáncer de colon (H.P. Scheppach, F. Richter, Eur. J. Cancer Prevention, 4, 373-378, 1995, y 31, 1077-1080, 1995).

Se han realizado, en particular, unas pruebas experimentales que demuestran la actividad antiproliferativa de las sales del ácido butírico como, por ejemplo, la sal sódica, con respecto a una gran variedad de células neoplásicas (S.P. Landon et al., Cancer Res., 48, 6161-6165, 1988; D. Coradini et al., Cell Prolif., 30, 149-159, 1977; H. Yamamoto et al., Int. J. Cancer, 76, 897-902, 1998). Unos estudios recientes han demostrado que el butirato sódico es capaz de modular la expresión de los oncogenes y de los genes que regulan la apóptosis en las células de distintos histotipos (O.C. Velásquez et al., J. Parenteral Enteral Nutr., 20, 243-250, 1996; M. Mandal, R. Kumar, Cell Growth Diff., 7, 311-318, 1996).

Otro hecho bien conocido es que los propios ácidos carboxílicos y/o algunos derivados de los mismos pueden constituir una ayuda significativa en el caso de la talasemia \beta, la transformación de \beta-globina en \gamma-globina o globina fetal, consiguiéndose una mejora en la enfermedad (S.P. Perine et al., New England J. Medicine, 328, 81-86, 1993; A.F. Collins et al., Blood, 85, 43-49, 1995).

En la actualidad, el uso de dichos componentes está, sin embargo, muy limitado por la dificultad en alcanzar concentraciones plasmáticas que sean efectivas, debiéndose esta dificultad al tiempo de vida media tan corto que implica metabolismos y excreciones de dichas sustancias demasiado rápidos. Para obtener resultados satisfactorios tendrían que suministrarse por tanto dichos ácidos en cantidades elevadas, con el inconveniente de que aparecerían efectos secundarios nocivos.

Existe por consiguiente la necesidad de disponer de un sistema de liberación adecuado para estas sustancias que permitiese disminuir las dosis y, por consiguiente, los efectos adversos.

El documento WO 94/20072 (Westesen K. et al.) describe partículas de agentes bioactivos, estando la matriz compuesta por los propios agentes bioactivos. Las sustancias especialmente apropiadas para la formulación de dichas partículas consisten en fármacos y otros materiales bioactivos que son poco solubles en agua. El documento presenta una larga lista de dichas sustancias, que abarca anestésicos hasta virostáticos, incluyendo el acetato de tocoferol y 3 succinato de tocoferol.

El documento no incluye, sin embargo, ninguna información sobre la asimilación de dichas partículas por las células.

Sumario

El autor de la presente invención ha encontrado unas nuevas composiciones farmacéuticas que no adolecen de los inconvenientes de la técnica anterior y que presentan una actividad biológica sorprendentemente elevada.

Dichas composiciones farmacéuticas se definen en la reivindicación 1.

Un objetivo adicional de la presente invención es presentar el procedimiento definido en la reivindicación 10.

Las composiciones farmacéuticas en forma de nanoesferas lipídicas sólidas que son objeto de la presente invención sirven para el tratamiento de patologías tumorales y de la talasemia \beta.

Las características y las ventajas que presentan las nanoesferas lipídicas sólidas como sistema de liberación de ácidos carboxílicos según la presente invención, así como las características y ventajas del correspondiente procedimiento de preparación se exponen detalladamente en la descripción siguiente.

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Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere a composiciones farmacéuticas en forma de nanoesferas lipídicas sólidas que se han obtenido a partir de microemulsiones de una sustancia lipídica que se ha estabilizado mediante por lo menos un surfactivo y mediante uno o varios cosurfactivos.

En la presente invención, se utiliza el término nanoesferas lipídica para hacer referencia a partículas que presentan un diámetro medio inferior a 300 nm.

Para la preparación de dichas microemulsiones, se calienta, hasta la fusión, una sustancia lipídica mezclada con uno o varios surfactivos y, en caso necesario, con otra o varias otras sustancias farmacológicamente activas, y se calienta, por separado, una mezcla de agua y uno o varios cosurfactivos a una temperatura que es por lo menos igual a la temperatura de fusión de la mezcla que contiene la sustancia lipídica. A continuación, se agrega en caliente y bajo agitación moderada la mezcla acuosa a la mezcla que contiene la sustancia lipídica, obteniéndose de este modo una microemulsión.

La microemulsión así obtenida se vierte en agua preenfriada a una temperatura comprendida entre 2 y 10ºC mientras se agita moderadamente la mezcla, utilizándose una cantidad de agua de 10:1 a 80:1 partes en volumen con respecto al volumen de la microemulsión. A continuación, se lava varias veces por diafiltración con agua destilada la dispersión así obtenida a fin de eliminar los componentes solubles en agua, utilizándose para ello un equipo TCF2 (Amicon-Grace-Danvers, USA) dotado de una membrana Diablo YM 100 con punto de corte en 100.000 Dalton, tal como se expone en el artículo de R. Cavalli et al., S.T.P. Pharma Sciences, 2(6), 514-518, 1992.

Dicha dispersión se esteriliza finalmente en caliente en un autoclave a 121ºC y 2 atm. durante 15 minutos, o se seca por congelación.

Las nanoesferas lipídicas así obtenidas presentan un diámetro medio comprendido entre 40 y 300 nm, y preferentemente entre 100 y 200 nm, y un índice de polidispersión comprendido entre 0,10 y 0,50.

La caracterización de las microemulsiones se ha realizado mediante espectroscopía de fotocorrelación utilizando un instrumento de Coulter N4, tal como se expone en el artículo de R. Cavalli et al., Int. J. Pharm., 148, 47-54, 1997.

El colesterilo butirato es la sustancia activa esencial de las nanoesferas lipídicas, pero en algunas formas de realización particulares de la presente invención puede incluir una o varias otras sustancias farmacológicamente activas seleccionadas del grupo formado por doxorubiceno, idarubiceno y taxol.

Como surfactivos suelen utilizarse generalmente fosfatidilcolina extraída de soja o yema de huevo, fosfolípidos y mezclas de los mismos.

Según una forma de realización preferida de la presente invención, el surfactivo utilizado es un producto comercial conocido por el nombre de Epikuron 200® (Lukas Meyer, Hamburgo, Alemania), que consiste en fosfatidilcolina en un 95%.

Los cosurfactivos se seleccionan de entre alcoholes, como el alcohol butílico, ácidos carboxílicos, como el ácido butírico y el ácido hexanoico, y sales de bilis, como el taurocolato sódico y el glicocolato sódico.

Según una forma de realización preferida de la presente invención, en la preparación de la microemulsión se utilizan varias sustancias en las siguientes proporciones, expresadas en tanto por ciento en peso con respecto al peso total de la microemulsión:

- sustancia lipídica:	5-18%
- surfactivos:	10-20%
- cosurfactivos:	12-18%
- agua:	44-70%

En la forma de realización preferida, las nanoesferas lipídicas obtenidas por diafiltración incluyen una dosis de sustancia lipídica comprendida entre el 25 y 42%, consistiendo el residuo en fosfatidilcolina y/o fosfolípidos y en trazas de otras sustancias que se utilizaron en el procedimiento de preparación.

Según una forma de realización especialmente preferida de la presente invención, la composición de las nanoesferas lipídicas sólidas, expresada en tanto por ciento en peso de varios componentes, es la siguiente:

- colesteril butirato	31,5%
- fosfatidilcolina	68,0%
- otros	0,5%

Debido a su composición y tamaño reducido, dichas nanoesferas presentan la característica inesperada de que son rápidamente asimiladas por las células, liberándose por tanto rápidamente la sustancia activa en las células.

En comparación con los sistemas de la técnica anterior, dichas nanoesferas lipídicas sólidas constituyen por tanto un sistema de liberación ideal para sustancias activas como los ácidos carboxílicos de bajo peso molecular que se encuentran en los ésteres de la presente invención. Permiten, en efecto, reducir drásticamente las dosis efectivas, disminuyendo por consiguiente los efectos secundarios.

Las composiciones farmacéuticas en forma de nanoesferas lipídicas sólidas de la presente invención pueden utilizarse satisfactoriamente en el tratamiento de cualquier patología en la que sea importante la característica de asimilación rápida de las sustancias activas.

Las composiciones farmacéuticas en forma de nanoesferas lípidicas según la presente invención son útiles en el tratamiento de cualquier patología que pueda tratarse eficazmente mediante la administración de ácido acético, ácido propiónico, ácido butírico y ácido succínico, y en particular en el tratamiento de patologías tumorales y de la talasemia \beta.

Las nanoesferas según la presente invención pueden utilizarse para dichos usos tanto solas como mezcladas con excipientes y/o diluyentes aceptables farmacológicamente, y/o con sustancias farmacológicamente activas. En algunas formas de realización particulares de las composiciones farmacéuticas según la presente invención, dichas sustancias activas consisten en agentes antineoplásticos.

Los ejemplos de preparación de composiciones farmacéuticas en forma de nanoesferas lipídicas sólidas que se describen a continuación son unos ejemplos que se presentan únicamente a título ilustrativo y no están destinados a limitar el alcance de la presente invención.

Ejemplo 1

a) se agregan 15 mg de Epikuron 200® (95% de fosfatidilcolina) y 1 mg de fosfatidilinositol a 9 mg de colesteril butirato y se calienta la mezcla hasta alcanzar la fusión a aprox. 75ºC;

b) una mezcla de agua (62 mg), glicocolato sódico (3 mg) y alcohol butílico (10 mg) se calienta a la misma temperatura de la mezcla de la etapa a);

c) mientras se agita suavemente y se mantiene la temperatura de las etapas anteriores, se agrega la mezcla de la etapa b) a la mezcla de la etapa a), obteniéndose una microemulsión que resulta ser transparente;

d) la microemulsión obtenida en la etapa c) se dispersa en agua preenfriada a 5ºC en una cantidad igual a 20 partes en volumen de agua para cada parte de microemulsión, obteniéndose así una dispersión de nanoesferas;

e) la dispersión obtenida en la etapa d) se lava dos veces por diafiltración con agua destilada;

f) finalmente, se seca por congelación la dispersión lavada.

El diámetro medio de las nanoesferas se determinó por espectroscopia de fotocorrelación, obteniéndose como resultado un diámetro medio de 120 nm y un índice de polidispersión de 0,25.

Las nanoesferas así obtenidas consisten en un 35,5% de colesteril butirato y en un 64% de fosfatidilcolina.

Ejemplo 2

a) se agregan 16 mg de Epikuron 200® (95% de fosfatidilcolina) a 7 mg de colesteril butirato y se calienta la mezcla hasta alcanzar la fusión a aprox. 77ºC;

b) se calienta a la misma temperatura de la mezcla de la etapa a) una mezcla de agua (62 mg), taurocolato sódico (3 mg) y alcohol butílico (12 mg);

c) mientras se agita suavemente y se mantiene la temperatura de las etapas anteriores, se agrega la mezcla de la etapa b) a la mezcla de la etapa a), obteniéndose una microemulsión transparente;

d) la microemulsión obtenida en la etapa c) se dispersa en agua preenfriada a 2ºC en una cantidad igual a 40 partes en volumen de agua para cada parte de microemulsión, obteniéndose así una dispersión de nanoesferas;

e) la dispersión obtenida en la etapa d) se lava tres veces por diafiltración con agua destilada;

f) finalmente, la dispersión lavada se esteriliza según FU IX a 121ºC y a la presión de 2 atmósferas.

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El diámetro medio de las nanoesferas, que se determinó mediante espectroscopía de fotocorrelación, era de 150 nm, siendo el índice de polidispersión igual a 0,35.

Las nanoesferas así obtenidas consisten en un 30% de colesterol butirato y en un 69% de fosfatidilcolina.

Pruebas para verificar la inhibición en la proliferación de células

El experimento se realizó utilizando células de carcinoma de pulmón NIH-H460 (D.N. Camey et al., Cancer Res., 45, 2913-2923, 1985) cultivadas en el medio nutriente RPMI 1640 (Bio Whittaker, Verviers, Bélgica), al que se agregó suero fetal de ternera (SFT) en una cantidad volumétrica del 10% con respecto al volumen total, realizándose el cultivo en monocapas a la temperatura de 37ºC y en una atmósfera de CO_{2} humidificada al 5%.

Las células se dispusieron en 24 microplacas, utilizándose como medio nutriente RPMI 1640 con 10% de SFT, y se dejaron reposar durante 24 horas para la adhesión. A continuación, se extrajo el medio de inseminación, sustituyéndolo por el medio experimental que consistía en RPMI 1640 con 10% de SFT y distintas concentraciones cada vez mayores de butirato sódico o de colesteril butirato en forma de nanoesferas preparadas según el procedimiento descrito anteriormente en el ejemplo 1. Las células se mantuvieron durante 6 días en contacto con dicho medio experimental.

El efecto del butirato sódico y del colesteril butirato sobre el crecimiento de las células se evaluó contando las células mediante un contador de células.

Se observó de este modo que las nanoesferas que contenían colesteril butirato ocasionan una inhibición completa del crecimiento celular a una concentración de 0,21 mM de colesteril butirato, mientras que el butirato sódico ocasiona con la misma concentración una inhibición del crecimiento celular no superior al 50%.

Se realizó simultáneamente una prueba en la que se utilizó colesterol como componente adicional del medio experimental formado por RPMI 1640 y 10% de SFT, observándose con esta prueba que el colesterol no incide de ningún modo sobre la proliferación de las células.

Se repitió el experimento descrito anteriormente con células del mastocarcinoma, identificado con la abreviatura MCF7, utilizando como medio de inseminación DMEM/F12 (medio de Eagle modificado por Dulbecco, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) con 2% de SFT.

Dichas células se dispusieron en 12 microplacas, donde se dejaron reposar para la adhesión durante 24 horas en el medio nutritivo descrito anteriormente.

A continuación, se extrajo el medio nutritivo sustituyéndolo por el medio experimental que consistía en DMEM/F12 con 10% de SFT y al que se agregaron concentraciones cada vez mayores de butirato sódico o de colesteril butirato en forma de nanoesferas preparadas según el procedimiento descrito anteriormente en el ejemplo 2. Las células se mantuvieron durante 6 días en contacto con dicho medio experimental.

El efecto antiproliferativo de las nanoesferas de colesteril butirato sobre el crecimiento de las células se evaluó contando las células mediante un contador de células. Dichas medidas demostraron que las nanoesferas que contenían colesteril butirato ocasionaban una inhibición completa del crecimiento celular a una concentración de 0,2 mM de colesteril butirato, mientras que el butirato sódico ocasionaba con la misma concentración una inhibición del crecimiento celular no superior al 40%.

Pruebas para evaluar la asimilación por las células

La asimilación de las nanoesferas que contienen colesteril butirato en las células de carcinoma pulmonar, identificadas con la abreviatura NIH-H460, se estudió mediante observación visual con un microscopio de fluorescencia.

Las nanoesferas con colesteril butirato, preparadas según el procedimiento descrito anteriormente en el ejemplo 1, se hicieron fluorescentes agregando cumarin 6.

Las células NIH-H460, a las que se agregaron 50 \mul de estas nanoesferas marcadas, se incubaron a 37ºC, tomándose subsiguientemente, en distintos tiempos, muestras para la evaluación.

Dichas muestras se lavaron con una solución salina estabilizada con un amortiguador de fosfato, se centrifugaron, y se les agregó a continuación una solución que contenía 5 \mug/ml de yoduro de propidio.

Las células así tratadas se observaron y fotografiaron mediante un microscopio de fluorescencia utilizando paralelamente células de control a las que se había agregado únicamente yoduro de propidio.

Al contrario de lo observado con las células de control, se observó que las células tratadas con las nanoesferas, que se hicieron fluorescentes con cumarin 6 y contenían colesteril butirato, eran casi completamente fluorescentes al cabo de sólo 5 minutos de iniciarse el tratamiento, demostrándose así una asimilación casi completa de las nanoesferas en las células en un período de tiempo muy corto.

Claims

1. Composición farmacéutica en forma de nanoesferas lipídicas sólidas que presentan un diámetro medio inferior a 300 nm y un índice de polidispersión comprendido entre 0,10 y 0,50, comprendiendo dichas nanoesferas una sustancia lipídica que consta de colesteril butirato y, posiblemente, de otra o varias otras sustancias activas seleccionadas del grupo formado por taxol, idarubiceno y doxorubiceno, pudiéndose obtener dichas nanoesferas mediante un procedimiento que consta de las siguientes etapas:

a) calentamiento de una mezcla, que comprende una sustancia lipídica que consiste en colesteril butirato e incluye posiblemente otra o varias otras sustancias activas seleccionadas del grupo formado por taxol, idarubiceno y doxorubiceno, y un o varios surfactivos, a la temperatura a la que se funde dicha mezcla;

b) calentamiento de una mezcla de agua y un o varios cosurfactivos a la temperatura de la etapa a);

c) mezcla con agitación moderada de la mezcla descrita en la etapa b) con la mezcla de la etapa a), obteniéndose así una microemulsión;

d) dispersión de la microemulsión obtenida en la etapa c) en agua preenfriada;

e) lavado por diafiltración con agua destilada de la dispersión de la etapa d);

f) esterilización o secado por congelación del producto obtenido en la etapa e).

2. Composición farmacéutica según la reivindicación 1, caracterizada porque la cantidad de colesteril butirato contenida en las nanoesferas está comprendida entre 25 y 42% en peso, consistiendo el residuo en fosfatidilcolina y/o fosfolípidos.

3. Composición farmacéutica según la reivindicación 1, caracterizada porque dicho surfactivo de la etapa a) se selecciona del grupo formado por fosfatidilcolina de soja, fosfatidilcolina de huevo, fosfolípidos y mezclas de los mismos.

4. Composición farmacéutica según la reivindicación 1, caracterizada porque dicho cosurfactivo de la etapa b) se selecciona del grupo formado por butanol, ácido butírico, ácido hexanoico, taurocolato sódico y glicocolato sódico.

5. Composición farmacéutica según la reivindicación 1, caracterizada porque dicha sustancia lípidica se encuentra en dicha microemulsión de la etapa c) en una cantidad comprendida entre 5 y 18% en peso con respecto al peso total.

6. Composición farmacéutica según la reivindicación 1, caracterizada porque la cantidad de agua, que contiene la microemulsión de la etapa c), está comprendida entre 44 y 70% en peso con respecto al peso total.

7. Composición farmacéutica según la reivindicación 1, caracterizada porque la cantidad de surfactivos, que se encuentran en la microemulsión de la etapa c), está comprendida entre 10 y 20% en peso con respecto al peso total.

8. Composición farmacéutica según la reivindicación 1, caracterizada porque la cantidad de cosurfactivos, que se encuentran en la microemulsión de la etapa c), está comprendida entre 12 y 18% en peso con respecto al peso total de la microemulsión.

9. Composición farmacéutica según la reivindicación 1, caracterizada porque dicha dispersión de la etapa d) se realiza en agua enfriada a 2-10ºC en una cantidad comprendida entre 10:1 y 80:1 partes en volumen con respecto al volumen de la mezcla de la etapa c).

10. Procedimiento para la preparación de nanoesferas lipídicas sólidas que presentan un diámetro medio inferior a 300 nm y un índice de polidispersión de 0,10 a 0,50, comprendiendo dichas nanoesferas una sustancia lípídica que consta de colesteril butirato y posiblemente otra o varias otras sustancias activas seleccionadas del grupo formado por taxol, idarubiceno y doxorubiceno, constando el procedimiento de las siguientes etapas:

a) calentamiento de una mezcla, que comprende una sustancia lipídica que consiste en colesteril butirato e incluye posiblemente otra o varias otras sustancias activas seleccionadas del grupo formado por taxol, idarubiceno y doxorubiceno, y uno o varios surfactivos, a la temperatura a la que se funde dicha mezcla;

b) calentamiento de una mezcla de agua y uno o varios cosurfactivos a la temperatura de la etapa a);

11. Utilización de la composición farmacéutica según la reivindicación 1 en la preparación de formulaciones para el tratamiento de patologías tumorales y de la talasemia \beta.

12. Utilización según la reivindicación 11 caracterizado porque dicha formulación comprende excipientes y/o diluyentes farmacológicamente aceptables.