ITMI960663A1 - Uso di acido yohimbinico e di suoi analoghi strutturali come agenti antimetastatici - Google Patents

Description

Descrizione dell’invenzióne industriale avente per titolo:

“USO DI ACIDO YOHIMBINICO E DI SUOI ANALOGHI STRUTTURALI COME AGENTI ANTIMETASTATICI

La presente invenzione riguarda l’uso dell’acido yohimbinico e di suoi analoghi strutturali pentaciclici per la preparazione di composizioni farmaceutiche aventi proprietà antimetastatiche.

Le cellule di tumori metastatizzanti sono in grado di migrare dal tumore originario verso altri organi bersaglio per mezzo di un procedimento che prevede la penetrazione attraverso le pareti dei capillari sanguigni, l’ingresso delle cellule tumorali nel flusso sanguigno, seguito da un successivo riattraversamento delle pareti dei vasi fino a raggiungere l’organo bersaglio.

La penetrazione attraverso il tessuto connettivo dei vasi avviene grazie alla degradazione della matrice extra cellulare ad opera di metalloproteinasi rilasciate da cellule del tessuto connettivo residente ed attivate dalle cellule tumorali Tale meccanismo, comune anche ai tessuti non tumorali, è però normalmente in equilibrio dinamico con la rigenerazione del tessuto connettivo, mentre si manifesta in maniera non controllata nelle cellule invadenti quali appunto le cellule tumorali o infiammatorie ed è coinvolto in numerose altre patologie quali artrite reumatoide, osteoartrite, artrite settica, ulcerazioni della cornea, epidermiche o gastriche, trombosi coronarica, proteinuria (WO 95/13289).

In detti processi sono coinvolti tre tipi di metallo protemasi: collagenasi, gelatinasi e stromelisine. In condizioni normali il loro rilascio e la loro attività sono strettamente regolati da inibitori delle protemasi endogeni, come ad esempio armacroglobuhna.

Inibitori di metalloproteinasi possono quindi essere utili nella cura delle condizioni patologiche sopra descritte nonché delle conseguenze patologiche di traumi o anche come agenti contraccettivi, in quanto le metallo protemasi sono implicate nei fenomeni di ovulazione e del successivo impianto dell’ovulo sulla parete uterina. In particolare, rinìbizione della metastasi tumorale ad opera di inibitori delle metalloproteinasi è descritta in Matrisian et aL, PNAS USA, 83, 9413-7 (1986); Wilhelm et aL, PNAS USA, 84, 6725-29 (1987); Werb et al, J. Cell Biol, 109, 872-89 (1989); Liotta et aL, Lab. Invest., 49, 636-49 (1983).

Inibitori di metallo protemasi sono descritti in US 4,511,504, US 4,568,666, US 4,771,037, WO 95/13289.

L’acido yohimbinico (o yohimbico) corrisponde alla seguente formula:

Il suo metil estere, la yohimbina, è un bloccante del recettore α2-adrenergico. La medesima attività hanno altri analoghi strutturali, quali la rauwolscina.

Composti ad essi correlati, quali ad esempio la reserpina, la rescinnamina, la sirosingopma sono descritti avere attività antiipertensiva (The Merck Index, tenth ed., 1983).

Tutte queste molecole Hanno in comune il seguente scheletro atomico:

in cui R è idrogeno o (Cl-C4)alchile, caratterizzato dalla presenza di un sistema pentaatomico portante un gruppo carbossilato come mostrato in figura. Al cimi composti, come l’acido yohimbinico ad esempio, portano un gruppo ossidrile nella posizione a rispetto al gruppo carbossilico. Altri sostituenti possono essere presenti, specialmente sull’anello che porta il gruppo carbossilico, ma anche sugli anelli indolici

Per nessuna delle molecole rispondenti a tale struttura è descritta un’attività antimetastatica.

Abbiamo sorprendentemente trovato che l’acido yohimbinico ed alcuni suoi analoghi strutturali sono dotati di una notevole attività di inibizione del processo metastatico.

Oggetto della presente invenzione è l’uso di acido yohimbinico e dei suoi analoghi strutturali, aventi come scheletro atomico base la struttura di formula (I), come agenti antimetastatici ed inibitori del processo di invasione tumorale.

Sono compresi nella presente invenzione anche gli enantiomeri, i racematì ed i diastereoisomeri dei composti di formula (I), nonché i loro sali con acidi o basi farmaceuticamente accettabili. Come detto, lo scheletro atomico di formula (I) deve essere inteso come gruppo farmacoforo minimo indispensabile al manifestarsi dell’attività farmacologica, in quanto permette alla molecola di legarsi al recettore delle metallo protemasi, svolgendo quindi la sua funzione di inibizione. Altri gruppi possono essere presenti sulla molecola, specialmente sull’anello portante il gruppo carbossilico e sull’anello indolico. Ad esempio, l’acido yohimbinico e i suoi analoghi hanno generalmente un gruppo ossidrile , eventualmente a sua volta funzionalizzato, in a al carbonile. La bromo-yohimbina ha anche un atomo di bromo sullo stesso anello. La reserpina ha invece sul medesimo anello sia un gruppo metossi che un gruppo 3,4,5-trimetossifenilcarbossi, nonché un gruppo metossi sull’anello indolico.

Esempi di derivati dell’acido yohimbinico compresi nella presente invenzione sono: yohimbina, alloyohimbina, yohimbina estere solforico, bromo-yohimbina, rauwolscina, raunormina, corinantina, reserpina, rescinnamina, sirosingopina, (-)-isoreserpina, metilreserpato.

I composti compresi nella presente invenzione sono composti noti e sono disponibili in commercio o possono essere ottenuti per estrazione da matrici vegetali o sintetizzati secondo metodi riportati in letteratura (vedi ad esempio J. Am. Chem. Soc., 91. 7315 (1969); J. Am. Chem. Soc., 94, 5109 (1972); Chem. Fharm. Bull 24, 2500 (1976); J. Am. Chem. Soc., 100, 4894 (1978); ); J. Am. Chem. Soc., 104, 2244 (1982); ); J. Am. Chem. Soc., 101, 5370 (1979); Heterocycles, 14, 631 (1980); J. Org Chem., 38, 2496 (1973)). I composti della presente invenzione sono stati saggiati in un test farmacologico “in vitro” di inibizione della gelatinasi B. I test prevede la determinazione per fluorescenza dell’inibizione dell’attività di degradazione di un substrato fluorescente (DNP-Pro-Leu-Gly-Leu-Trp-Ala-D-Arg-NH2, MI 855 Bachem) ad opera del dominio catalitico (92 kDa) della gelatinasi B.

Reagenti.

1) DNP- substrato = DNP-Pro-Leu-Gly-Leu-Trp-Ala-D-Arg-NH2 (MI 855 Bachem), P.M.

977. 1 g/mol, concentrazione 25 μΜ in DMSO; 2) tampone di misurazione = 50 mM TRIS / 100 mM NaCl / 10 mM aggiustato a pH 7.6 con acido clorìdrico. 3) Enzima -gelatinasi B, dominio catalitico 92 kDa, concentrazione 0.055 mg/ml in tampone TRIS. Substrato ed enzima sono mantenuti a 0°C con ghiaccio.

Prava di inibizione:

Volume totale = 1 ml di soluzione mantenuto sotto agitazione in una divetta.

Controllo 0.98 ml DMSO

0.01 ml di DNP-substrato

0.01 ml di enzima

Esperimento: 0.98 ml DMSO

0.01 ml DNP-substrato

0.01 ml enzima

0.01 ml inibitore (10 μg/ml)

Viane misurata la fluorescenza a 346 nm sia della soluzione di controllo (senza inibitore) che della soluzione contenente l’inibitore. L’inibizione dell’attività catalitica della gelatinasi B provoca una diminuzione della lisi di DNP-substrato, con conseguente diminuzione della fluorescenza.

La percentuale di inibizione viene espressa dalla seguente formula:

Ripetendo l’esperimento a varie concentrazioni di inibitore è possibile calcolarne la rispettiva IC50-La tabella mostra i dati di inibizione enzimatica per alcuni composti rappresentativi dell’invenzione.

Tabella

I composti della presente invenzione sono anche risultati attivi in un test “in vivo” di chemoinvasione. Nel test di chemoinvasione delle camere Costar Transwell per coltura cellulare (diametro: 6.5 mm , diametro pori: 8 μm ) sono rivestite sul fondo con 100 μl di collagene tipo IV (soluzione diluita 50 μg/ml, quindi evaporazione per una notte). Con lo stesso procedimento si ricoprono le camere di un secondo strato di collagene tipo IV (100 μΐ di soluzione a concentrazione 50 pg/ml). Prima dell’uso, le camere sono lavate due volte con acqua sterile ed incubate per circa 1 ora a 37°C in un mezzo (DMEM) privato di siero. Le cellule HT1080 sono raccolte per trattamento con tripsina-EDTA, lavate con DMEM 10% FCS ed incubate per almeno 30 minuti a 37°C nello stesso mezzo. Le cellule sono qundi lavate con DMEM privato di siero e risospese in DMEM privato di siero addizionato di 0.1% BSA (frazione V), contate e diluite fino ad ottenere ima densità finale di 3x10<5 >cellue/mL

Dalle camere preincubate viene rimosso per aspirazione il mezzo privo di siero. Il comparto inferiore delle camere è riempoto con 600 μl di DMEM 20% FCS 1% BSA (frazione V) composto da testare. 200 μl di sospensione cellulare (6x10<4 >cellule) contenenti il composto da testare sono aggiunti nel comparto superiore e le camere sono incubate a 37°C in atmosfera umida con CO2. Dopo una prima incubazione di 24 ore i mezzi dei comparti inferiore e superiore sono rimpiazzati con sospensioni fresche e le camere sono incubate per altre 24 ore.

I filtri incubati sono quindi lavati con PBS, le cellule sono fissate per 15 minuti in paraforaldeide 4%, permebilizzate in metanolo ( 10 minuti, -20°C) e colorate con May-Grunwald-Giemsa. Le cellule che aderiscono alla faccia superiore dei filtri sono rimosse con un tampone di cotone, i filtri vengono staccati dal fondo delle camere ed analizzate al microscopio per determinare il numero di cellule sulla faccia inferiore dei filtri.

In un esperimento di controllo, in assenza di inibitore di metallo proteinasi, le cellule HT1080, che iper-esprimono collagena si A e B, sono in grado di degradare il collagene tipo IV e di migrare sulla faccia inferiore dei filtri Nell’esperimento con Γ inibitore invece l’attività delle collagena si è parzialmente o totalmente inibita, con un conseguente minor numero di cellule che migrano sulla fàccia inferiore dei filtri. La lettura dell’esperimento consiste quindi nella determinazione della differenza tra cellule contate sulla faccia inferiore del filtro nell’esperimento di controllo e nell’esperimento con l'inibitore

Da quanto detto sopra è evidente che i composti dell’invenzione possono anche essere usati nella cura di tutte le condizioni associate all’azione delle matrice-metallo proteinasi, quali artrite reumatoide, osteoartrite, artrite settica, ulcerazioni della cornea, epidermiche o gastriche, trombosi coronarica, proteinuria, conseguenze patologiche di traumi o anche come agenti contraccettivi

I composti della presente invenzione possono essere somministrati in quantità variabili tra 0.01 mg e 0.4 g per chilogrammo di peso corporeo al giorno. Un regime di dosaggio preferito al fine di ottenere risultati ottimali è quello die prevede l’uso da circa 1 mg a circa 50 mg per chilogrammo di peso corporeo al giorno, impiegando dosi unitarie cosi da somministrare da circa 70 mg a circa 3.5 g del composto attivo ad un soggetto di circa 70 kg di peso corporeo in un periodo di 24 ore. Questo regime di dosaggio può essere regolato per fornire la risposta terapeutica ottimale. Per esempio, possono essere somministrate dosi suddivise a seconda delle esigenze della situazione terapeutica. D composto attivo può essere somministrato per via orale, endovenosa, intramuscolare o sottocutanea.

Le composizioni farmaceutiche cui la presente invenzione fa riferimento contengono almeno un composto dell’invenzione in quantità terapeuticamente efficaci in miscela con eccipienti farmaceuticamente compatibili.

Composizioni per via orale includeranno generalmente un diluente inerte o un carrier edibile. Esse possono essere incluse in capsule di gelatina o compresse in tavolette. Altre forme di somministrazioni orali sono capsule, pillole, elisir, sospensioni o sciroppi.

Le tavolette, pillole, capsule e composizioni similari possono contenere i seguenti ingredienti (in aggiunta al principio attivo): un legante quale cellulosa micro cristallina, gomma adragante o gelatina; un eccipiente quale amido o lattosio; un agente disgregante quale acido alginico, primogel, amido di mais e simili; un lubrificante quale magnesio stearato; un fluidificante quale biossido di silicio colloidale; un agente dolcificante quale sucrosio o saccarina o un agente aromatizzante quale aroma di menta, metil salicilato o aroma di arancio. Quando la composizione scelta è in forma di capsule, essa può contenere in aggiunta un carrier liquido quale un olio grasso. Altre composizioni possono contenere vari materiali che ne alterano la forma fisica, quali agenti ricoprenti (per tavolette e pillole) come zucchero e gommalacca. I materiali usati nella preparazione delle composizioni dovrebbero essere farmaceuticamente puri e non tossici ai dosaggi impiegati.

Per la preparazione di composizioni farmaceutiche per via di somministrazione parenterale, il principio attivo può essere incorporato in soluzioni o sospensioni, che possono includere in aggiunta i seguenti componenti: un diluente sterile come acqua per iniezioni, soluzione salina, oli, glicoli polietilenici, glicerina, glicole propilenico o altri solventi sintetici; agenti antibatterid quale alcool benzilico; antiossidanti quali addo ascorbico o sodio bisolfito; agenti chetanti quale acid etilendiamminotetraacetico; tamponi quali acetati, citrati o fosfati e agenti per aggiustare la tonicità della soluzione quali sodio cloruro o destrosio.

La preparazione parenterale può essere inclusa in ampolle, siringhe mono-uso o fiale in vetro o plastica.

Claims (8)

1. RIVENDICAZIONI: 1. Uso dei composti aventi come scheletro base la struttura di fomula (I):

   in cui R è idrogeno o (Cl-C4)alchile, di loro enantiomeri, racemati, diastereoisomeri e di loro sali con acidi e basi farmaceuticamente accettabili, per la preparazione di una composizione farmaceutica avente attività antimetastatica o di inibizione dell’invasione tumorale.
2. 2. Uso secondo la rivendicazione 1, in cui detti composti sono: acido yohimbinico, yohimbina, alloyohimbina, yohimbina estere solforico, bromo- yohimbina, rauwolscina, raunormina, corinantina, reserpma, rescinnamina, sirosingopma, (-)-ioreserpina, metilreserpato.
3. 3. Uso secondo la rivendicazione 2, in cui il composto attivo è l’acido yohimbinico.
4. 4. Uso dei composti aventi come scheletro base la struttura di fomula (I):

   in cui R è idrogeno o (C 1-C4)alchile, di loro enantiomeri, racemati, diastereoisomeri e di loro sali con acidi e basi farmaceuticamente accettabili, per la preparazione di una composizione farmaceutica per la prevenzione o la cura delle condizioni associate all’azione delle matrice-metallo proteinasi
5. 5. Uso secondo la rivendicazione 4, in cui detti composti sono: acido yohimbmico, yohimbina, alloyohimbina, yohimbina estere solforico, bromo-yohimbina, rauwolscina, raunormina, corinantina, reserpina, rescinnamina, sirosingopina, (-)-isoreserpina, mtilreserpato.
6. 6. Uso secondo la rivendicazione 5, in cui il composto attivo è l’acido yohimbinico.
7. 7. Uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 4-6, in cui la condizione da trattare è selezionata nel gruppo consistente in: artrite reumatoide, osteoartrite, artrite settica, ulcerazioni della cornea, epidermiche o gastriche, trombosi coronarica, proteinuria, conseguenze patologiche di traumi.
8. 8. Uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 4-6, per la prevenzione dell’ovulazione o dell’impianto dell’ovulo nell’utero.