ITMI951214A1 - Metodo di stabilizzazione di composti organici durante trattamenti fisici - Google Patents

Description

Domanda di brevetto per Invenzione Industriale dal titolo: "Metodo di stabilizzazione di composti organici durante trattamenti fisici."

CAMPO DELL'INVENZIONE

La presente invenzione si riferisce ad un metodo di protezione e stabilizzazione di composti organici, in particolare di molecole proteiche, durante trattamenti fisici, che prevede il trattamento di un sistema contenente detti composti organici in associazione con una miscela di isomalto ed inulina. Le preparazioni cosi ottenute allo stato secco presentano elevata stabilità durante la conservazione .

STATO DALLA TECNICA

La maggior parte delle molecole organiche, di interesse biologico, medico, farmacologico, diagnostico o di ricerca, presenta una notevole labilità a trattamenti fisici quali la liofilizzazione e l'essiccazione, oltre ad una breve durata del periodo di conservazione, sia allo stato solido che in soluzione. Molto spesso durante i suddetti trattamenti si osserva una drastica perdita di attività o di funzionalità delle molecole trattate, che riduce significativamente l'efficacia delle procedure di purificazione e limita la durata di conservazione del prodotto.

In particolare, nelle sostanze a carattere proteico, quali ad esempio enzimi, anticorpi, antigeni ecc., le catene polipeptidiche si ritrovano comunemente in natura con particolari strutture terziarie; spesso l'attività di tali sostanze dipende dalla struttura terziaria e viene ridotta drasticamente se tale struttura viene alterata, nonostante il fatto che la composizione chimica e la sequenza amminoacidica rimangano inalterate.

La specificità della struttura terziaria necessaria per l'attività crea dei seri problemi nei casi in cui sia necessario disporre della sostanza allo stato secco, oltre che durante la conservazione. Molti processi fisici per l'ottenimento del prodotto finale secco causano infatti la denaturazione irreversibile delle molecole proteiche, che si manifesta ad esempio in una variazione della solubilità dei prodotti, in fenomeni di aggregazione, nella perdita di attività testata con opportuni saggi immunologie! e, nel caso di enzimi, nella perdita di attività catalitica. In particolare, in seguito a procedimenti di liofilizzazione, raramente si ottengono composti proteici costituiti da proteine pure e ciò è dovuto all'instabilità sia durante lo stadio di congelamento che durante il successivo stadio di essiccazione.

Sono già noti nello stato della tecnica dei metodi per la protezione e la stabilizzazione delle molecole biologiche durante l'essiccazione e la liofilizzazione, sia nella fase di congelamento che in quella di sublimazione dell’acqua. Tali metodi prevedono la miscelazione della sostanza labile da proteggere con opportuni additivi, generalmente in concentrazioni elevate; la miscela così ottenuta viene quindi sottoposta a liofilizzazione o essiccazione, senza che la sostanza labile subisca rilevanti alterazioni e denaturazioni.

In passato il trealosio, un disaccaride non riducente, ha trovato largo consenso come additivo di protezione per molecole biologiche ed in genere organiche, come descritto nel brevetto inglese GB 2187191. Tuttavia tale disaccaride presenta lo svantaggio di non essere facilmente ottenibile industrialmente ad un opportuno grado di purezza ed è quindi disponibile ad un costo molto elevato. Inoltre il trealosio, anche se solo in particolari condizioni, può cristallizzare durante il processo di essiccazione, non esercitando più allo stato cristallino alcuna azione protettiva nei confronti del composto labile a cui è associato; ciò porta a dei risultati non sempre ottimali per quanto riguarda il mantenimento della funzionalità della molecola da proteggere.

I problemi derivanti dall'elevato costo e dalle prestazioni tecniche non sempre efficienti del trealosio vengono parzialmente risolti con il metodo descritto nella domanda di brevetto WO 91/18091i che rivendica un procedimento per la protezione di materiale biologico e composti organici labili mediante l'aggiunta di un agente stabilizzante, quale zucchero od un suo derivato, in grado di proteggere le biomolecole allo stato solido e/o ad elevate temperature e/o quando sottoposte a radiazioni, non in associazione con altri prodotti.

In particolare 1'agente stabilizzante può essere un glicoside non riducente di un composto poliossidrilico oppure un oligosaccaride non riducente scelto tra raffinosio, stachiosio e melizitosio. Tra i glicosidi non riducenti di composti poliossidrilici , 1'isomalto, reperibile sul mercato con la denominazione commerciale di Palatinit (gì è in grado di esplicare una buona attività protettiva nei confronti di proteine, lipidi, anticorpi e sostanze biologiche di diversa natura.

Attualmente 1'isomalto trova largo uso come dolcificante a basso contenuto calorico (Schiweck H. et al., Carbohydrate as organic rati)materials, Lichtenthaler F.W. Ed., VCH 1991* 57~94).

La domanda di brevetto WO 93/00807 descrive un metodo per la stabilizzazione di biomateriale durante i procedimenti di liofilizzazione mediante l'uso di un additivo a due componenti. Il primo componente, costituito da un materiale polimerico quale polietilenglicol , polivinilpirrolidone, amido idrossietilico, destrano e ficoll® , svolge il ruolo di crio-protezione, ossia mantiene la funzionalità delle biomolecole durante lo stadio di congelamento. Il secondo componente, costituito da uno zucchero, Ulteriore oggetto della presente invenzione è costituito da formulazioni ad elevata stabilità alla conservazione, comprendenti almeno un composto organico in associazione con una miscela di isomalto ed inulina, eventualmente in combinazione con adatti eccipienti e/o diluenti, particolarmente utili per uso farmaceutico.

DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL'INVENZIONE

Le caratteristiche ed i vantaggi del metodo di stabilizzazione di composti organici e delle formulazioni ad elevata stabilità alla conservazione che li contengono secondo la presente invenzione saranno maggiormente illustrati nel corso della seguente descrizione dettagliata.

L'isomalto è una miscela equimolare di 6-0-(a-D-glucopiranosil)-D-sorbitolo e l-0-(a-D-glucopiranosil)-D-mannitolo; tale miscela viene comunemente ottenuta per idrogenazione dell'isomaltulosio (6-0- (α-D-glucopiranosil )-D-fruttofuranosio ), a sua volta prodotto per modificazione enzimatica del saccarosio.

L'inulina è un polisaccaride presente in molte piante della famiglia delle Compositae, costituito da unità di fruttosio unite tra loro mediante legami β (2-1). Ε' mediamente costituita da catene di 30-35 monosaccaridi ed ha un peso molecolare medio pari circa a 5000 (Schiweck H. et al., riferimento già citato). L'inulina e più in generale i fruttani stanno assumendo una crescente rilevanza commerciale soprattutto per le proprietà associate alla loro natura di fibre alimentari solubili; un alcol poliossidrilico , un amminoacido o una metilammina, svolge un’attività di protezione durante il successivo stadio di sublimazione dell'acqua. Dati sperimentali dimostrano una diversa capacità di stabilizzazione da parte dei due tipi di agenti di protezione utilizzati, specifica per uno solo dei due stadi previsti dalla liofilizzazione; si osserva la totale mancanza di efficacia qualora gli agenti di protezione vengano impiegati singolarmente nel ciclo di liofilizzazione completo, comprendente sia lo stadio di congelamento che quello di sublimazione.

SOMMARIO

La Richiedente ha ora sorprendentemente trovato che l'aggiunta di una miscela di isomalto ed inulina a composti organici, in particolare a molecole a carattere proteico, è particolarmente efficace come additivo di protezione, sia durante trattamenti fisici, quali l'essiccazione o la liofilizzazione, che durante la conservazione.

La presente invenzione si riferisce pertanto ad un metodo di stabilizzazione e protezione di composti organici durante trattamenti fisici, comprendente il trattamento di un sistema, sia acquoso che non acquoso, di detti composti in presenza di una miscela di isomalto ed inulina. Tale miscela è in grado di esplicare sinergicamente un'azione protettiva superiore rispetto a quella evidenziata dai due componenti della miscela impiegati singolarmente, anche a concentrazioni totali inferiori rispetto a quelle dei singoli agenti stabilizzanti.

suscitano inoltre un particolare interesse per gli effetti di regolarizzazione che esplicano sulla flora batterica intestinale. Tuttavia non è sinora noto nello stato della tecnica l'uso dell'inulina come additivo nella protezione di sostanze biologiche soggette ad inattivazione o denaturazione, durante i processi di essiccazione o liofilizzazione.

Il metodo di stabilizzazione secondo la presente invenzione prevede l'attuazione di un trattamento fisico ad un sistema, sia acquoso che non acquoso, contenente almeno un composto organico labile, in associazione con un'opportuna miscela di isomalto ed inulina.

Detto trattamento fisico può essere la liofilizzazione, in cui il secondo stadio di sublimazione può essere condotto anche a temperature superiori a quella di congelamento del sistema acquoso; l'essiccazione, sia a temperatura ambiente che a temperature superiori o inferiori, sia a pressione atmosferica che ridotta; lo spray-drying; la centrifugazione sotto vuoto o l'essiccazione a letto fluido.

Nel caso in cui detto trattamento fisico sia la liofilizzazione, il sistema trattato, contenente un composto organico labile in associazione con una miscela di isomalto ed inulina, è un sistema acquoso, eventualmente contenente opportuni sali o sistemi tampone; inoltre il metodo di stabilizzazione dell'invenzione è in grado di agire vantaggiosamente sia durante la fase di congelamento che durante la fase di sublimazione.

Anche i singoli componenti della miscela stabilizzante dell'invenzione, ossia isomalto ed inulina, sono in grado di esplicare un'attività di stabilizzazione durante l'intero ciclo di liofilizzazione, sia durante lo stadio di congelamento che durante la sublimazione dell'acqua. Tuttavia l'associazione dei due composti evidenzia un'effetto sinergico, esplicando una maggiore attività rispetto a quella dei singoli componenti, anche a concentrazioni totali inferiori rispetto a quelle dei singoli componenti .

Nel caso in cui invece venga applicato uno degli altri trattamenti fisici sopra elencati, il sistema trattato, contenente un composto organico labile in associazione con una miscela di isomalto ed inulina, può essere sia acquoso che non acquoso .

Secondo il metodo di stabilizzazione dell'invenzione, isomalto ed inulina vengono disciolti in opportune quantità in una soluzione o sospensione, acquosa o non acquosa, contenente almeno un composto organico labile ed il sistema cosi ottenuto viene sottoposto ad un trattamento fisico, quale ad esempio liofilizzazione o essiccazione. In detto sistema, il rapporto ponderale tra isomalto ed inulina è compreso preferibilmente tra 0,1 e 10, ed ancora più preferibilmente tra 1 e 3: il rapporto ponderale tra 1’isomalto e detto composto organico è preferibilmente compreso tra 0,1 e 10, ed ancora più preferibilmente tra 0,5 e 2; infine il rapporto ponderale tra l'inulina e la molecola biologica è preferibilmente compreso tra 0,05 e 5, ed ancora più preferibilmente tra 0,2 e 2.

Inoltre, nel suddetto sistema, la concentrazione di isomalto è compresa preferibilmente tra 0,1 e 10# in peso, ed ancora più preferibilmente è pari all’ 1#, mentre la concentrazione di inulina può variare preferibilmente tra 0,05 e 5# in peso, ed ancora più preferibilmente è 0,5# in peso.

Il suddetto metodo di stabilizzazione è anche in grado di migliorare e prolungare il tempo di conservazione di composti organici labili. Sfruttando le proprietà protettive date dall'associazione della miscela di isomalto ed inulina secondo la presente invenzione, ogni composto organico non sufficientemente stabile in soluzione acquosa può venire conservato allo stato secco previa liofilizzazione o trattamenti fisici alternativi, come sopra indicato.

Pertanto, costituiscono ulteriore oggetto della presente invenzione delle formulazioni ad elevata stabilità alla conservazione, comprendenti almeno un composto organico labile in associazione con una miscela di isomalto ed inulina nei rapporti precedentemente indicati, eventualmente in associazione con opportuni eccipienti e/o diluenti. Tali formulazioni, sono particolarmente adatte per uso farmaceutico, oltre che nella conservazione di molecole labili per uso medico, biologico, diagnostico 0 di ricerca.

La presenza di isomalto ed inulina nelle formulazioni dell'invenzione non produce effetti indesiderati sulle proprietà chimico-fisiche e biologiche dei composti organici trattati, tranne nei rarissimi casi in cui ad esempio il composto proteico da stabilizzare sia un enzima in grado di metabolizzare 1'isomalto o l'inulina.

Il composto organico allo stato secco secondo la presente invenzione, oltre a poter essere conservato più a lungo, può venire facilmente riattivato quando richiesto per l'uso, come ad esempio nel caso di kits diagnostici per saggi immunologie!, in cui gli enzimi conservati allo stato secco possono venire facilmente riattivati per addizione di acqua o di un opportuno tampone, con totale ritenzione dell’attività iniziale.

L'effetto stabilizzante della miscela dell'invenzione può essere efficacemente impiegato in tutti i settori che prevedono l'utilizzo di sostanze organiche facilmente inattivabili in seguito a trattamenti fisici. Tali sostanze organiche possono appartenere a diverse classi, quali proteine, enzimi, fattori di crescita, ormoni, anticorpi sia immobilizzati che liberi, antigeni, fattori della coagulazione, proteine strutturali, fattori del complemento, ficobiliproteine , vaccini, virus e batteri. Tali sostanze organiche possono inoltre essere utilizzate sia allo stato grezzo che allo stato puro, dopo purificazione secondo metodologie convenzionali, note nello stato della tecnica.

Più specificamente, tra gli enzimi stabilizzati secondo il metodo dell'invenzione vi sono la deossiribonucleasi, la subtilisina, la fibrinolisina e loro miscele.

In particolare la subtilisina, una proteasi batterica, viene vantaggiosamente utilizzata per impieghi farmacologici quale agente detergente di detriti cellulari nel trattamento di ferite, piaghe ed ustioni, in quanto facilita la rimozione del tessuto necrotico. Questo enzima è commercializzato sotto forma di unguento in cui la matrice è di tipo paraffinico, quindi non miscibile con acqua. L'utilizzo della miscela stabilizzante secondo la presente invenzione fornisce invece, dopo liofilizzazione, delle preparazioni in polvere totalmente solubili in acqua in tempi rapidi.

Esempi non limitativi delle proteine efficacemente stabilizzate e protette secondo il metodo dell'invenzione sono Eritropoietina, Fattore Vili,,fattori Stimolatori delle Colonie (G-GSF e GM-CSF), Antitrombina III, Insulina, Fattore di Crescita Epidermica, fattori di Crescita dei Fibroblasti (forma acida e forma basica), Interleuchine (IL 1 alfa, IL 1 beta, IL 2, IL 3. IL 4, IL 5. IL 6, IL 7. IL 8, IL 9 ed IL 10), fattore di Necrosi Tumorale alfa, Fattore di Necrosi Tumorale beta, Interferone-alfa, Interferonegamma, Urochinasi, Streptochinasi, Perossidasi, RNA Polimerasi, T7 DNA Polimerasi, Fibrinogeno, Trombina, Alcool Deidrogenasi, Fosfatasi alcalina. Arginasi, Ascorbato-ossidasi, Colesteroloesterasi, Colinesterasi , Collagenasi, DNasi I, DNasi II, Enterochinasi , Glucosio-6-fosfato deidrogenasi. Glucosio ossidasi, Glucosio isomerasi, Glutammato deidrogenasi, Gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi, Esochinasi, Lattato deidrogenasi, Malato deidrogenasi, PEP carbossilasi, RNasi A, Ureasi, Xantina ossidasi, Superossido dismutasi, Fibronectina, Endonucleasi di restrizione, Trascriptasi inversa-AMV, trascriptasi inversa-MMuLV, Anticorpi monoclonali (0KT3, HA-IA, BMA 031. CAMPATH-I, anti-TAC ecc.), Anticorpo policlonali, IgG umana ed IgM umana.

Claims (22)

1. RIVENDICAZIONI 1. Metodo di stabilizzazione di uno o più composti organici durante trattamenti fisici, comprendente l'applicazione di detti trattamenti fisici ad un sistema acquoso o non acquoso di detti composti organici in presenza di una miscela di isomalto ed inulina .
2. 2. Metodo di stabilizzazione secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che detti composti organici sono scelti nel gruppo costituito da proteine, enzimi, fattori di crescita, ormoni, anticorpi, antigeni, fattori della coagulazione, proteine strutturali e fattori del complemento.
3. 3· Metodo di stabilizzazione secondo la rivendicazione 2, caratterizzato dal fatto che detti enzimi sono scelti nel gruppo costituito da deossiribonucleasi, subtilisina, fibrinolisina e loro miscele.
4. 4. Metodo di stabilizzazione secondo la rivendicazione 2, caratterizzato dal fatto che dette proteine sono scelte nel gruppo costituito da Eritropoietina, Fattore Vili, fattori G-CSF e GM-CSF, Antitrombina III, Insulina, Fattore di Crescita Epidermica, forma acida e forma basica di fattori di Crescita dei Fibroblasti. Interleuchina IL 1 alfa, IL 1 beta, IL 2, IL 3, IL 4, IL 5i IL 6, IL 7. IL 8, IL 9. IL 10, fattore di Necrosi Tumorale alfa. Fattore di Necrosi Tumorale beta. Interferonealfa, Interferone-gamma, Urochinasi, Streptochinasi, Perossidasi, RNA Polimerasi, T7 DNA Polimerasi, Fibrinogeno, Trombina, Alcool Deidrogenasi, Fosfatasi alcalina, Arginasi, Ascorbato-ossidasi, Colesterolo-esterasi , Colinesterasi, Collagenasi, DNasi I, DNasi II, Enterochinasi, Glucosio-6-fosfato deidrogenasi, Glucosio ossidasi, Glucosio isomerasi, Glutammato deidrogenasi, Gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi, Esochinasi, Lattato deidrogenasi. Malato deidrogenasi, PEP carbossilasi, RNasi A, Ureasi, Xantina ossidasi, Superossido dismutasi, Fibronectina, Endonucleasi di restrizione, Trascriptasi inversa-AMV, trascriptasi inversa-MMuLV, Anticorpi monoclonali 0KT3, HA-IA, BMA 031. CAMPATH-I, anti-TAC, Anticorpo policlonali, IgG umana ed IgM umana.
5. 5. Metodo di stabilizzazione secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che in detto sistema la concentrazione di isomalto è compresa tra 0,1 e 10% in peso e la concentrazione di inulina è compresa tra 0,05 e 5% in peso.
6. 6. Metodo di stabilizzazione secondo la rivendicazione 5» caratterizzato dal fatto che la concentrazione di isomalto è pari a 1% in peso.
7. 7. Metodo di stabilizzazione secondo la rivendicazione 5. caratterizzato dal fatto che la concentrazione di inulina è pari a 0,3% in peso.
8. 8. Metodo di stabilizzazione secondo la rivendicazione 1. caratterizzato dal fatto che il rapporto ponderale tra isomalto ed inulina è compreso tra 0,1 e 10, il rapporto ponderale tra isomalto e detto composto organico è compreso tra 0,1 e 10 e il rapporto ponderale tra inulina e detto composto organico è compreso tra 0,005 e 5·
9. 9. Metodo di stabilizzazione secondo la rivendicazione 8, caratterizzato dal fatto che il rapporto ponderale tra isomalto ed inulina è compreso tra 1 e 3·
10. 10. Metodo di stabilizzazione secondo la rivendicazione 8, caratterizzato dal fatto che il rapporto ponderale tra isomalto e detto composto organico è compreso tra 0,5 e 2.
11. 11. Metodo di stabilizzazione secondo la rivendicazione 8, caratterizzato dal fatto che il rapporto ponderale tra inulina e detto composto organico è compreso tra 0,2 e 2.
12. 12. Metodo di stabilizzazione secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che detto trattamento fisico è scelto nel gruppo costituito da liofilizzazione, essiccazione, spraydrying, centrifugazione sotto vuoto ed essiccazione a letto fluido.
13. 13. Metodo di stabilizzazione secondo le rivendicazioni 1 e 12, caratterizzato dal fatto che, quando il trattamento fisico è la liofilizzazione, detto sistema è acquoso.
14. 14 . Formulazioni ad elevata stabilità alla conservazione, comprendenti almeno un composto organico in associazione con una miscela di isomalto ed inulina, eventualmente in combinazione con adatti eccipienti e/o diluenti.
15. 15. Formulazioni ad elevata stabilità secondo la rivendicazione 14, caratterizzate dal fatto che il rapporto ponderale tra isomalto ed inulina è compreso tra 0,1 e 10, il rapporto ponderale tra isomalto e detto composto organico è compreso tra 0,1 e 10 e il rapporto ponderale tra inulina e detto composto organico è compreso tra 0,005 e 5·
16. 16. Formulazioni ad elevata stabilità secondo la rivendicazione 15, caratterizzate dal fatto che il rapporto ponderale tra isomalto ed inulina è compreso tra 1 e 3-
17. 17. Formulazioni ad elevata stabilità secondo la rivendicazione 15. caratterizzate dal fatto che il rapporto ponderale tra isomalto e detto composto organico è compreso tra 0,5 e 2.
18. 18. Formulazioni ad elevata stabilità secondo la rivendicazione 15. caratterizzate dal fatto che il rapporto ponderale tra inulina e detto composto organico è compreso tra 0,2 e 2.
19. 19. Formulazioni ad elevata stabilità secondo la rivendicazione l4, caratterizzate dal fatto che detto composto organico è scelto nel gruppo costituito da proteine, enzimi, fattori di crescita, ormoni, anticorpi, antigeni, fattori della coagulazione, proteine strutturali e fattori del complemento.
20. 20. Formulazioni ad elevata stabilità secondo la rivendicazione 19. caratterizzate dal fatto che detti enzimi sono scelti nel gruppo costituito da deossiribonucleasi , subtilisina, fibrinolisina e loro miscele.
21. 21. Formulazioni ad elevata stabilità secondo la rivendicazione 19, caratterizzate dal fatto che dette proteine sono scelte nel gruppo costituito da Eritropoietina, Fattore Vili, fattori G-CSF e GM-CSF, Antitrombina III, Insulina, Fattore di Crescita Epidermica, forma acida e forma basica di fattori di Crescita dei Fibroblasti, Interleuchina IL 1 alfa, IL 1 beta, IL 2, IL 3. IL 4, IL 5. IL 6, IL 7, IL 8, IL 9. IL 10, fattore di Necrosi Tumorale alfa. Fattore di Necrosi Tumorale beta, Interferonealfa, Interferone-gamma. Urochinasi, Streptochinasi, Perossidasi, RNA Polimerasi, T7 DNA Polimerasi, Fibrinogeno, Trombina, Alcool Deidrogenasi, Fosfatasi alcalina. Arginasi, Ascorbato-ossidasi, Colesterolo-esterasi , Colinesterasi, Collagenasi, DNasi I, DNasi II, Enterochinasi , Glucosio-6-fosfato deidrogenasi, Glucosio ossidasi. Glucosio isomerasi , Glutammato deidrogenasi, Gliceraldeide-3-fosf ato deidrogenasi, Esochinasi, Lattato deidrogenasi, Malato deidrogenasi, PEP carbossilasi, RNasi A, Ureasi, Xantina ossidasi, Superossido dismutasi, Fibronectina, Endonucleasi di restrizione, Trascriptasi inversa-AMV, trascriptasi inversa-MMuLV, Anticorpi monoclonali 0KT3, HA-IA, BMA 031, CAMPATH-I, anti-TAC, Anticorpo policlonali, IgG umana ed IgM umana.
22. 22. Formulazioni ad elevata stabilità secondo la rivendicazione 20, per uso farmaceutico. 23- Formulazioni ad elevata stabilità secondo le rivendicazioni 20 e 22, caratterizzate dal fatto che, quando detto enzima è subtilisina, tali formulazioni vengono utilizzate nel trattamento di ulcere cutanee, piaghe e/o ustioni. (REV/lm)