ITMI20111065A1 - Procedimento di idrolisi regio selettiva di monosaccaridi - Google Patents
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Description
Titolo: "Procedimento di idrolisi regio selettiva di monosaccaridi"
DESCRIZIONE
[0001] Forma oggetto della presente invenzione un processo per l’idrolisi regioselettiva di monosaccaridi che presentano in posizione anomerica un gruppo tiocianometile (-SCH2CN).
[0002] La possibilità di ottenere disaccaridi e/o polisaccaridi attivati in posizione anomerica à ̈ il passaggio chiave per poter effettuare la semisintesi di glicoproteine mediante glicosilazione di gruppi reattivi, quali gli aminogruppi liberi di lisina (neo-glicoproteine).
La sintesi del solo monosaccaride, cianometil-1-tio-α-D-mannopiranoside acetilato à ̈ stata descritta da Y. C. Lee (Lee Biochemistry 15, 1976 3956-3962).
In particolare, la prima fase consiste nella diretta acetilazione e bromurazione in posizione anomerica (C-1) di α-D-mannopiranoside. La sostituzione dell’alogeno con tiourea e successiva reazione con cloroacetonitrile permette l’ottenimento del
corrispondente cianometil 2,3,4,6-tetra-O-acetil-1-tio-α-D-mannopiranoside.
La stessa procedura sintetica à ̈ riportata in US 2007/0253942 e US 2008/0069802. Questi documenti descrivono la preparazione e rivendicano l’applicazione di diversi monosaccaridi attivati in C-1 con uno specifico linker, 2-imino-2-metossietil, (IME-tioglicosidi) per la glicosilazione di biomolecole. In US 2007/0253942, questi composti sono stati coniugati alla naringinasi wild type deglicosilata per ottenere glicoconiugati potenzialmente utili come siti di riconoscimento di proteine di membrana specifiche come le lectine. In US 2008/0069802, tioglicosidi attivati in C-1 sono coniugati a gruppi amminici di residui di lisine superficiali del capside dell’adenovirus per alterare il tropismo cellulare del virus.
La sintesi IME-tiomannopiranoside viene riportata in WO 2010/087612 secondo la metodica sopra citata. Il monosaccaride così attivato à ̈ coniugato all’albumina da siero umano in ambiente acquoso a temperatura ambiente per 1,5 ore. Lo stesso autore descrive l’applicazione del glicoconiugato ottenuto in campo radiofarmaceutico.
In letteratura non à ̈ stata riportata la
preparazione di oligomannani attivati con il gruppo IME o con il suo precursore tiocianometile. In generale, non sono stati riportati in letteratura che pochi approcci chimici efficienti per la preparazione di disaccaridi recanti in posizione anomerica il gruppo IME necessario per la glicosilazione di proteine. E’ riportato un esempio in cui la lattosamina attivata con gruppo IME à ̈ preparata attraverso la protezione del gruppo ossidrilico primario della glucosamina recante in posizione anomerica il gruppo tiocianometile con terbutildimetilsililcloruro. Il prodotto ottenuto e recante due ossidrilici liberi (in posizione C3 e C4) à ̈ glicosilato in posizione C4 per ottenere la corrispondente lattosamina protetta con rese del 40% circa (van Kasteren et al. PNAS January 6, 2009; vol.
106 no.1; 18-23). La lattosamina ottenuta, dopo de protezione e trasformazione del gruppo tiocianometile in IME, Ã ̈ impiegata per glicosilare amino gruppi di nano particelle.
[0003] La scarsità di metodi per la preparazione di oligosaccaridi attivati in posizione anomerica con il gruppo IME o con il suo precursore tiocianometile à ̈ imputabile al fatto che le metodiche di protezione e deprotezione mediante approcci chimici classici non
sono compatibili con la stabilità del gruppo tiocianometile o IME in posizione anomerica.
Con lo scopo di ottenere metodiche semplici ed efficienti per ottenere zuccheri protetti recanti un solo ossidrile libero, lipasi ed altre idrolasi sono state precedentemente utilizzate nella idrolisi di monosaccaridi completamente protetti con gruppi acetilici o recanti in posizione anomerica un gruppo alchilico. La regioselettività di questi enzimi risulta molto influenzata dal tipo di sostituente presente in posizione anomerica.
[0004] Non à ̈ stato ancora descritto, tuttavia, un processo efficiente per la preparazione di di- e polisaccaridi a partire da monosaccaridi recanti in posizione anomerica un gruppo tiocianometile.
RIASSUNTO DELL’INVENZIONE
[0005] E’ stato sorprendentemente trovato che alcune idrolasi, in particolare la acetil esterasi da Bacillus pumilus, à ̈ in grado di idrolizzare selettivamente il gruppo protettivo acilico in posizione primaria di unità monosaccaridiche portanti un gruppo tiocianometile in posizione anomerica.
OGGETTO DELL’INVENZIONE
[0006] Un primo oggetto della presente invenzione,
pertanto, à ̈ rappresentato da un processo per l’idrolisi enzimatica stereoselettiva in posizione C6 di un monosaccaride protetto con gruppi acilici e recante in posizione anomerica un gruppo tiocianometile.
In particolare, tale monosaccaride à ̈ la glucosamina.
[0007] Secondo un ulteriore oggetto, à ̈ descritto un processo per la preparazione di di- e polisaccaridi a partire dal residuo monosaccaridico ottenuto secondo il processo enzimatico dell’invenzione.
BREVE DESCRIZIONE DELLE FIGURE
[0008] La Figura 1 illustra la reazione di idrolisi del composto 2-acetamido-2-deossi-3,4,6-O-acetil-1-tio-β-D-glucopiranoside secondo la presente invenzione.
DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL’INVENZIONE
[0009] Come sopra detto, un primo oggetto della presente invenzione à ̈ rappresentato da un processo di idrolisi regioselettiva in posizione C6 di un monosaccaride protetto con gruppi acilici e portante in posizione anomerica un gruppo tiocianometile (-SCH2CN).
In particolare, detto monosaccaride à ̈ la
glucosamina.
[0010] La reazione di idrolisi può essere schematizzata pertanto come segue:
OR OH
RO O N N
RO S ROORO S
AcHN AcHN
in cui R rappresenta un gruppo protettivo.
[0011] Secondo un aspetto preferito, la glucosamina à ̈ protetta ai gruppi 3, 4 e 6 idrossile con un gruppo R=acile (cioà ̈ il 3,4,6-tetra-O-acilglucosamina).
In particolare, il gruppo acile à ̈ preferibilmente rappresentato dal gruppo acetile.
[0012] Secondo il processo descritto l’idrolisi à ̈ operata mediante l’impiego di opportuni enzimi, in particolare di idrolasi come, ad esempio, esterasi e lipasi.
Secondo un aspetto preferito dell’invenzione, l’esterasi à ̈ la acetil xilan esterasi da Bacillus pumilus (AXE) (ACS Dobfar) avente un’attività pari a 97 U/g di supporto.
Tale enzima à ̈ descritto in letteratura (Ivet Krastanova et al Biochimica et Biophysica Acta 1748 (2005) 222– 230; Anders. Rise Mohen and Thorleif
Anthonsen, Biocatalysis and Biotransformation 2009, 27,226-236; Giuliano Degrassi et al, Microbiology (2000), 146, 1585–1591).
Lipasi che possono essere impiegate per gli scopi della presente invenzione, invece, sono rappresentate, ad esempio, dalla lipasi da Candida rugosa (CRL) (Sigma-Aldrich srl, Milano, Italia) avente un’attività specifica pari a 2,3 U/mg (116 U/g di supporto per l’enzima immobilizzato).
[0013] In un aspetto dell’invenzione, gli enzimi possono essere precedentemente immobilizzati su di un opportuno carrier solido.
[0014] Supporti che possono essere impiegati comprendono gel ottil agaroso (Octyl Sepharose<®>CL-4B) o resine a base polimetacrilica e a carattere butilico (Sepabeads FP-BU) o decaottilico (Sepabeads EC-OD/S), completamente derivatizzate con gruppi idrofobici, (rispettivamente catene butiliche e decaottiliche). Alternativamente, l’immobilizzazione può avvenire su una matrice macroporosa di silice o silicati, su una matrice formata da resine adsorbenti di tipo acrilico, eventualmente reticolate
<® ®>(Amberlite XAD-8 o Lewatit E 2001/85), da un supporto anfifilo contenente catene lipofile, su una matrice di stirene e divinilbenzene eventualmente
contenente gruppi epossidici (Lewatit<®>R 259 K o R 260 K oppure Diaion<®>HP-40), su una resina poliacrilica contenente gruppi epossidici (FP 4000)oppure, ancora, su una resina polimetacrilica contenente gruppi epossidici (Sepabeads<®>FP-EP o Eupergit<®>C) opportunamente derivatizzata con gruppi idrofobici.
[0015] La fase di immobilizzazione dell’esterasi sul supporto epossidico à ̈ condotta secondo metodologie standard note al tecnico del settore.
[0016] Per quanto concerne le condizioni della reazione di idrolisi, questa à ̈ condotta in ambiente acquoso, eventualmente tamponato ad un pH compreso fra circa 3 e 6 e, preferibilmente, fra circa 4 e 5.
[0017] I tamponi che possono essere utilmente impiegati includono il tampone TRIS ed il tampone fosfato (soluzione di KH2PO410-100 mM, preferibilmente 50 mM) o altri tamponi comunemente utilizzati.
[0018] Inoltre, à ̈ possibile l’impiego di un cosolvente organico, scelto preferibilmente fra aceto nitrile ed acetone.
Preferibilmente, il co-solvente può essere aggiunto alla miscela di reazione fino al 50% e, preferibilmente, à ̈ compreso in percentuale del 10%-
30% circa (v/v miscela di reazione).
[0019] Nel corso della reazione, la temperatura à ̈ preferibilmente mantenuta costante nell’intervallo compreso fra 0-25°C.
[0020] Nel realizzare la presente invenzione, sono state effettuate diverse prove variando la concentrazione del substrato.
[0021] La tabella seguente riporta i risultati ottenuti dai saggi condotti su AXE e su CRL.
[0022] In particolare, per l’esecuzione di queste prove à ̈ stato impiegato acetonitrile al 20% come cosolvente.
Conc. Enzima pH Tempo Velocità Conversione<1>Resa %<2>
(h) di idrolisi % (prodotto) (mM) (µmoli/minuto)
5 AXE 5 24 0,21 100 80 5 CRL-OAg 5 24 0,01 24 14 5 CRL-ECOD 5 48 0,04 92 55 10 AXE 5 24 0,17 97 86 50 AXE 5 24 0,17 90 70 OAg=ottilagarosio (Octyl Sepharose<®>CL-4B) ECOD=decaottil sepabeads (Sepabeads EC-OD/S)
<1>Conversione % = Percentuale di substrato
trasformato
<2>Resa % (6-OH) = Percentuale di prodotto (2) idrolizzato in posizione C-6 ottenuta in HPLC
[0023] Secondo un altro aspetto dell’invenzione, à ̈ descritto un processo per la preparazione di di- e poli- saccaridi a partire dalla glucosamina deprotetta selettivamente in posizione C6 e portante
in posizione anomerica un gruppo tiocianometile (-SCH2CN).
In particolare, la glucosamina ottenuta dalla reazione di idrolisi stereoselettiva può essere coniugata con un residuo saccaridico opportunamente protetto ed attivato in posizione anomerica, ad esempio con un gruppo tiocloroacetamide.
La reazione di coniugazione à ̈ condotta secondo metodologie note al tecnico del settore ed à ̈ seguita da opportune fasi di isolamento e purificazione del di- o poli-saccaride ottenuto.
[0024] Il di- o poli-saccaride così ottenuto può essere successivamente impiegato nella coniugazione con opportuni gruppi proteici, come ad esempio i gruppi aminici di residui della lisina.
[0025] Per poter effettuare la coniugazione, il di- o poli-saccaride ottenuto secondo la presente invenzione, protetto e funzionalizzato in posizione anomerica con il gruppo tiocianometile, deve essere sbloccato dai gruppi protettivi e attivato in posizione C1. Comunemente, questa operazione à ̈ effettuata in un unico step con NaOMe/NaOH così da ottenere l’IME-tioglicoside pronto per la coniugazione alla proteina. Il coupling con la
proteina à ̈ poi condotto in tampone fosfato 20 mM a pH 9 e un rapporto tra proteina e IME-tioglicoside di 1:1. La reazione à ̈ mantenuta sotto agitazione magnetica a temperatura ambiente. La glicoproteina à ̈ in seguito purificata mediante cromatografia ad esclusione molecolare e può essere analizzata con la tecnica MALDI.
ESEMPIO 1
Preparazione di 2-acetamido-2-deossi-3,4-O-acetil-1-tio-β-D-glucopiranoside (5)
Ad una soluzione 50 mM di 2-acetamido-2-deossi-3,4,6-O-acetil-1-tio-β-D-glucopiranoside in tampone fosfato 50 mM contenente 20% di acetonitrile sono stati aggiunti 2,4 g di AXE da Bacillus pumilus immobilizzata su di un supporto epossidico (Sepabeads EC-EP). La soluzione à ̈ stata lasciata sotto agitazione meccanica a temperatura ambiente controllandone il decorso mediante HPLC, mentre il pH à ̈ stato mantenuto costante a un valore di 5 mediante titolazione automatica. Dopo 24 ore di incubazione si à ̈ osservata la conversione del 70% del substrato. L’enzima à ̈ stato rimosso mediante filtrazione, il 2-acetamido-2-deossi-3,4-O-acetil-1-tio-β-D-glucopiranoside così ottenuto à ̈ stato isolato secondo
i metodi convenzionali eliminando l’eventuale solvente organico. Il prodotto à ̈ stato estratto dalla soluzione acquosa con acetato d’etile. Dopo evaporazione a pressione ridotta degli estratti organici riuniti, il residuo à ̈ stato purificato mediante colonna cromatografica di gel di silice usando come eluente una miscela (diclorometano -metanolo 90:10) ottenendo così il 2-acetamido-2-deossi-3,4-O-acetil-1-tio-β-D-glucopiranoside con una resa globale del 70%.
Il prodotto purificato à ̈ stato identificato tramite analisi<1>H-NMR e COSY 2D NMR registrate in CDCl3(Î ́=ppm) utilizzando come strumentazione un Bruker AMX 400.
[0026] Dalla descrizione sopra fornita del processo di idrolisi stereoselettiva in posizione C6 della glucosamina portante in posizione anomerica un gruppo tiocianometile, la persona esperta, allo scopo di soddisfare esigenze contingenti specifiche, potrà apportare numerose modifiche, aggiunte o sostituzioni di elementi con altri funzionalmente equivalenti, senza tuttavia uscire dall’ambito delle annesse rivendicazioni. Ognuna delle caratteristiche
descritte come appartenenti ad una possibile forma di realizzazione può essere realizzata indipendentemente dalle altre forme di realizzazione descritte.
Claims (20)
- RIVENDICAZIONI: 1. Processo per idrolizzare selettivamente il gruppo acile in posizione C6 di un monosaccaride portante in posizione anomerica un gruppo tiocianometile comprendente l’impiego di acetil xilan esterasi da Bacillus pumilus.
- 2. Processo secondo la rivendicazione 1, in cui detto monosaccaride à ̈ la galattosamina.
- 3. Processo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 o 2, in cui detto monosaccaride à ̈ il residuo di formula OH N RO O RO S AcHN in cui R à ̈ un gruppo acile.
- 4. Processo secondo la rivendicazione 3, in cui R Ã ̈ un gruppo acetile.
- 5. Processo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui detta esterasi à ̈ immobilizzata su di un supporto epossidico.
- 6. Processo secondo una qualunque delle rivendicazioni precedenti, in cui detta idrolisi à ̈ condotta ad un pH compreso fra 3 e 6.
- 7. Processo secondo la rivendicazione 6, in cui il valore di pH Ã ̈ preferibilmente compreso fra 4 e 5.
- 8. Processo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui la concentrazione del substrato monosaccaridico protetto portante in posizione anomerica un gruppo tiocianometile nella miscela di reazione à ̈ compresa fra circa 5 e 50 mM.
- 9. Processo secondo la rivendicazione 8, in cui la concentrazione del substrato monosaccaridico protetto portante in posizione anomerica un gruppo tiocianometile nella miscela di reazione à ̈ compresa preferibilmente fra circa 10 e 50 mM.
- 10. Processo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui l’idrolisi à ̈ condotta in ambiente acquoso, opzionalmente in presenza di un tampone.
- 11. Processo secondo la rivendicazione 10, in cui detto tampone à ̈ scelto nel gruppo che comprende tampone TRIS e tampone fosfato.
- 12. Processo secondo la rivendicazione 10 o 11, in cui detto tampone à ̈ presente nella miscela della reazione di idrolisi in concentrazione compresa fra circa 10-100 mM.
- 13. Processo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui detta miscela di reazione comprende ulteriormente un co-solvente organico scelto fra acetonitrile ed acetone.
- 14. Processo secondo la rivendicazione 13, in cui detto co-solvente à ̈ presente in percentuale fino al 50%.
- 15. Processo secondo la rivendicazione 13 o 14, in cui detto co-solvente à ̈ presente in concentrazione compresa fra circa 10-25% (v/v miscela di reazione).
- 16. Processo secondo una qualunque delle rivendicazioni precedenti, in cui la reazione di idrolisi à ̈ condotta su 2-acetamido-2-deossi-3,4,6-O-acetil-1-tio-β-D-glucopiranoside.
- 17. Un processo per la preparazione di di- e poli- saccaridi che comprende le fasi di: a) idrolizzare selettivamente il gruppo idrossile protetto in posizione C6 della galattosamina portante in posizione anomerica un gruppo tiocianometile; b) coniugare la galattosamina deprotetto in posizione C6 ottenuta dalla fase a) con un residuo mono- o poli-saccaridico portante in posizione anomerica un opportuno gruppo attivatore; in cui la fase a) à ̈ condotta mediante l’impiego di acetil xilan esterasi da Bacillus pumilus.
- 18. Processo secondo la rivendicazione 17, in cui il residuo monosaccaridico della fase a) à ̈ un residuo 2-acetamido-2-deossi-3,4,6-O-acetil-1-tio-β- D-glucopiranoside.
- 19. Processo secondo la rivendicazione 18, in cui il residuo della fase a) Ã ̈ ottenuto secondo il processo di una qualunque delle rivendicazioni da 1 a 16.
- 20. Uso di acetil xilan esterasi da Bacillus pumilus per la deprotezione stereoselettiva di un gruppo idrossile protetto con un gruppo acile, preferibilmente acetile, in posizione 6 della galattosamina portante in posizione anomerica un gruppo tiocianometile (-SCH2CN).
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-
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- 2011-06-13 IT IT001065A patent/ITMI20111065A1/it unknown
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| DEGRASSI G ET AL: "The acetyl xylan esterase of Bacillus pumilus belongs to a family of esterases with broad substrate specificity.", MICROBIOLOGY (READING, ENGLAND) JUL 2000 LNKD- PUBMED:10878123, vol. 146 ( Pt 7), July 2000 (2000-07-01), pages 1585 - 1591, XP002669387, ISSN: 1350-0872 * |
| KRASTANOVA IVET ET AL: "Heterologous expression, purification, crystallization, X-ray analysis and phasing of the acetyl xylan esterase from Bacillus pumilus", BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA (BBA) - PROTEINS & PROTEOMICS, ELSEVIER, NETHERLANDS, vol. 1748, no. 2, 15 May 2005 (2005-05-15), pages 222 - 230, XP002557716, ISSN: 1570-9639, [retrieved on 20050205], DOI: 10.1016/J.BBAPAP.2005.01.003 * |
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