ITMI20090905A1 - Composizioni cosmetiche a base di estratti idro- e liposolubili derivati da cellule di rubus in coltura liquida - Google Patents

Description

“Composizioni cosmetiche a base di estratti idro- e liposolubili derivati da cellule di Rubus in coltura liquidaâ€

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La presente invenzione si riferisce all’uso in campo cosmetico di estratti cellulari derivati da cellule vegetali del genere Rubus in coltura liquida, al metodo per la produzione di detti estratti e alle relative composizioni comprendenti detti estratti per l’uso in dermocosmesi.

E’ noto che l'abilità di tutte le cellule di proliferare e svolgere le loro funzioni vitali dipende interamente dalla loro capacità di proteggere l'integrità del DNA e ripararlo da eventuali danni che sono stati arrecati da agenti mutageni ed ossidanti.

I cromosomi sono certamente i componenti cellulari più difficili da mantenere integri attraverso i vari cicli di divisioni cellulari in quanto mutazioni e rotture alle catene di DNA tendono ad accumularsi molto velocemente. Questi danni, causati prevalentemente da fattori ambientali di stress, come raggi UV, radicali liberi, agenti ossidanti, polveri sottili e altri materiali inquinanti, portano spesso alla perdita della funzionalità di geni importanti per la cellula, minacciandone la salute e accelerando il processo di “aging†o invecchiamento cellulare.

La pelle à ̈ certamente l'organo più esposto ai fattori di stress che determinano tutta una serie di conseguenze a livello cutaneo, come la riduzione dello spessore del derma (tessuto connettivale sottostante l’epidermide), composto da una popolazione cellulare di fibroblasti dispersa in una matrice intercellulare. I fibroblasti sono preposti alla sintesi delle fibre di collagene ed elastina: le prime hanno funzione di sostegno e resistenza, le seconde assicurano elasticità alla cute. In seguito a questi danni, la pelle perde tono e elasticità, e diventa più debole e quindi più soggetta a patologie.

Studi recenti hanno dimostrato che nel complesso scenario dei meccanismi che la cellula attiva per proteggersi da fattori di stress, ci sono degli elementi che giocano un ruolo chiave nel garantire il corretto funzionamento del ciclo cellulare e nel mantenere il DNA nucleare integro. Tra questi elementi, la famiglia delle proteine GADD45 esercita una funzione essenziale nell'evitare la trasmissione alle successive generazioni cellulari di eventuali mutazioni al DNA causate da stress di varia natura. Queste proteine, agendo da sensori di stress, sono in grado di mediare un gran numero di interazioni tra diverse componenti cellulari, innescando meccanismi di riparo dei danni al DNA e garantendo il corretto svolgimento del ciclo cellulare (Hoffman e Liebermann, 2009).

Le proteine GADD45 rappresentano una famiglia di proteine eucariotiche piuttosto conservate durante l'evoluzione tra i diversi organismi e sono principalmente localizzate nel nucleo. Tra tutti i membri della famiglia, la proteina GADD45α à ̈ senza dubbio quella più specificamente coinvolta nella risposta della cellula allo stress. Attraverso l'interazione con numerosi altri componenti, GADD45α coordina le vie di trasduzione che portano alla protezione del DNA, al completamento del ciclo cellulare e alla senescenza. Aumenti intracellulari del livello di GADD45α garantiscono una maggior protezione della cellula da agenti che provocano rotture e mutazioni al DNA nucleare (Takekawa et al., 1998).

Altri fattori importanti sono sicuramente le sirtuine, regolatori della longevità cellulare. Le sirtuine sono proteine presenti in tutti gli organismi pluricellulari e regolano l'attività di un’ampia varietà di fattori di trascrizione e altre proteine che legano il DNA, agendo così da fattori di protezione della stabilità del nucleo.

Diversi approcci farmacologici hanno evidenziato che la presenza di alti livelli di queste proteine nella cellula ne promuovono la longevità (Lavu et al., 2008).

Negli ultimi anni, infatti, sono stati pubblicati diversi studi che mostrano come la proteina SIRT1, sicuramente la più studiata e caratterizzata nella famiglia delle sirtuine, sia in grado di regolare la longevità della cellule umane e il loro metabolismo interno (Zschoernig & Mahlknecht, 2008).

Alcuni composti che hanno un elevato potere antiossidante, oltre a proteggere le cellule della pelle dallo stress ossidativo che causa danni al DNA, sono in grado di stimolare anche l'idratazione delle cellule, favorendo l'ingresso di acqua mediante speciali proteine-canale deputate a questo ruolo.

Le proteine della famiglia delle acquaporine sono molto importanti nel garantire il corretto bilancio idrico in tutte le cellule dell'organismo (Benga et al., 2009). In particolare, la proteina acquaporina-3 (AQP3) à ̈ stata a lungo studiata per il suo coinvolgimento nella protezione da stress osmotico, disidratazione e riparo di ferite nei tessuti della pelle (Hara-Chikuma & Verkman, 2008). L'analisi del livello di espressione di AQP3 fornisce informazioni sulla capacità di un composto, estratto o miscela di favorire il processo di idratazione e proteggere le cellule dagli stress che causano perdita di acqua.

Ad oggi esistono in commercio alcuni prodotti cosmetici che agiscono sulle componenti sopra indicate, e mirano a ridurre i segni dell’invecchiamento cellulare della pelle, ma ciascuno attiva uno specifico meccanismo di difesa cellulare dallo stress:

1) Longevicell (Silab) à ̈ un prodotto a base di un idrolizzato da foglie della pianta Myrtus communis usato per il suo effetto di aumento della longevità cellulare;

2) Orsirtine GL (Vincience actives) Ã ̈ un prodotto a base di un estratto di riso Oryza sativa usato per il suo effetto di protezione del DNA;

3) Swiss Stem Cell Plant Complex (Mibelle AG) Ã ̈ un prodotto a base di un estratto di cellule del frutto di mela cresciute in coltura liquida;

4) BC Resveratrol Ferment (BC Research Co.) à ̈ una materia prima a base di resveratrolo, uno dei più potenti antiossidanti presenti nell’uva e nelle more selvatiche.

Sulla base di quanto sopra esposto appare evidente l’esigenza di disporre di nuove composizioni cosmetiche da impiegarsi vantaggiosamente per il trattamento e la prevenzione dell’invecchiamento cutaneo, a base di principi attivi in grado di garantire una più completa ed efficace protezione della pelle da agenti mutageni e di stress ambientali agendo in sinergia su diversi meccanismi di difesa delle cellule allo stress.

Gli autori della presente invenzione hanno ora messo a punto un metodo di estrazione da cellule di Rubus in coltura liquida, e così individuato due estratti capaci di agire sia singolarmente che sinergicamente mediante meccanismi molecolari diversi, innalzando la risposta di difesa e protezione del DNA da stress. Le composizioni cosmetiche a base di questi estratti hanno mostrato un effetto antiossidante e di stimolazione genica delle miscele superiore a diversi prodotti ad oggi in commercio.

Forma pertanto oggetto della presente invenzione un metodo per l’estrazione di una miscela di sostanze idrosolubile e di una miscela di sostanze liposolubile da cellule di Rubus in coltura liquida, comprendente le seguenti fasi a)-g):

a) dedifferenziamento su substrato solido delle cellule del tessuto vegetale di Rubus prelevato da pianta in calli;

b) prelievo dei calli e allestimento delle colture liquide;

c) crescita di cellule vegetali di Rubus in coltura liquida;

d) separazione delle cellule vegetali dal mezzo di crescita;

e) omogeneizzazione delle cellule vegetali;

f) centrifugazione dell'omogenato per isolare l'estratto idrosolubile, rappresentato dal sopranatante e risospensione;

g) trattamento del pellet ottenuto dalla centrifugazione con solvente organico apolare (preferibilmente scelto tra alcoli, acetone, etere, steroli), centrifugazione della sospensione così ottenuta per isolare l'estratto liposolubile, rappresentato dal sopranatante e risospensione.

La prima centrifugazione in fase f) consente di ottenere già l'estratto idrosolubile. La fase g) prevede il trattamento della frazione non idrosolubile con solventi organici al fine di estrarre tutti i composti liposolubili. La seconda centrifugazione in fase g) consente di ottenere l'estratto liposolubile.

Ai sensi della presente invenzione con cellule di Rubus si intendono cellule totipotenti derivate dallo sdifferenziamento e proliferazione di cellule prelevate da diversi tessuti della pianta (preferibilmente da cellule della foglia).

Secondo una forma preferita di realizzazione di tale metodo di estrazione, l’omogeneizzazione della fase e) avviene in un mortaio con PBS 1X e sabbia di silice per facilitare la rottura delle cellule.

Preferibilmente, le fasi a) – g) sono realizzate secondo le seguenti modalità e condizioni:

a) Allestimento delle colture cellulari: foglie intere vengono prelevate da piante del genere Rubus e sterilizzate in etanolo 70% (15 minuti) e 1% ipoclorito di sodio (15 minuti). Le foglie, dopo essere state lavate per 3 volte in acqua per rimuovere l'alcol e l'ipoclorito, vengono tagliate in porzioni di circa 0.5 cm<2>ciascuno con una lama sterile. Tutti i frammenti di foglia vengono posti su un mezzo solido B5 Gamborg medium contenente: plant agar 7.5 mg/L, mio-inositolo 500 mg/L, saccarosio 30 mg/L, 2,4D 1 mg/L, kinetina 0.1 mg/L, adenina 1 mg/L, pH 5,7. Dopo circa 5 settimane di incubazione a 20<o>C al buio, si ottengono i calli per dedifferenziamento e proliferazione delle cellule della foglia. I calli vengono escissi e trasferiti su mezzo di coltura fresco ogni 3-4 settimane.

b) Quando i calli hanno raggiunto un diametro di circa 1 cm (peso di circa 50 mg), essi vengono prelevati e dispersi in beute contenenti 50 ml di mezzo di coltura AB1 liquido (stessa composizione del mezzo solido ma senza agar). Le beute vengono poste al buio su uno shaker con agitazione orbitale di 100 rpm. Dopo circa 10 giorni, i calli si sono disgregati, a formare singole cellule o aggregati di cellule più piccoli, e le cellule sono proliferate in modo da formare una coltura densa.

c) Crescita delle cellule di Rubus in coltura liquida: la crescita delle cellule ottenute da espianti di tessuto vegetale può essere condotta inoculando 100 ml di una coltura densa di cellule in 1 L di mezzo di coltura AB1. Secondo una forma preferita di realizzazione del metodo secondo l’invenzione, le cellule possono essere sottoposte a trattamenti fisici (calore, freddo, UV) o trattate con composti chimici (proteine, lipidi, zuccheri, sali, piccole molecole organiche, fattori fisici) per indurre l'espressione di maggiori quantità di metaboliti secondari con proprietà antiossidanti.

d) Separazione delle cellule: può essere effettuata mediante centrifugazione a 2000 g o sedimentazione delle cellule per rimuovere il loro mezzo di coltura. Le cellule vengono poi congelate a -80<o>C.

e) Omogeneizzazione delle cellule: una volta scongelate le cellule vengono lavate velocemente in acqua o PBS e asciugate su un filtro Miracloth. L’omogeneizzazione delle cellule avviene in presenza di PBS 1X (NaCl 136 mM, KCl 2.7 mM, NaH2PO412 mM, KH2PO41.76 mM, pH 7.4), in rapporto di 2:1 volume/peso, in presenza di sabbia di silice, e può essere effettuata in un contenitore idoneo quale un mortaio di ceramica e con un pestello anch’esso di ceramica, precedentemente raffreddati. Per volumi maggiori si possono utilizzare recipienti più grandi, anche metallici, dove le cellule possono essere omogeneizzate con lame metalliche, utilizzando sia omogeneizzatori da laboratorio o industriali, che presse.

f) Ottenimento dell'estratto idrosolubile: una volta ottenuto un lisato cellulare omogeneo tramite omogeneizzazione, il campione di cellule viene centrifugato, ad esempio a 8,500 rpm per circa 15 minuti a 4<o>C, per precipitare le componenti insolubili. Il sopranatante ottenuto dalla centrifugazione viene prelevato: esso costituisce l'estratto idrosolubile. g) Ottenimento dell'estratto liposolubile: il pellet ottenuto da centrifugazione viene trattato con un solvente organico (alcol, acetone, etere o altri solventi apolari) e vortexato a lungo per estrarre le componenti liposolubili. Dopo ulteriore centrifugazione a 6000 rpm per 15 min a 4<o>C, la fase liquida viene prelevata: essa costituisce l'estratto liposolubile.

Entrambi gli estratti ottenuti nella fasi f)-g) possono essere portati a secco in un liofilizzatore o una camera di essiccazione o spray-dryer per eliminare il solvente. La polvere ottenuta viene risospesa in acqua (frazione idrosolubile) o in solventi organici (frazione liposolubile) alla concentrazione desiderata. Entrambe le soluzioni ottenute possono essere diluite in un appropriato volume di glicerolo o di altro solvente (squalene, miritolo, isoacetil-alcol, steroli) in modo da avere da 10 a 1 mg di prodotto ogni ml di solvente (soluzioni 10-1 %). Queste soluzioni rappresentano la materia prima che può essere ulteriormente diluita per la fabbricazione dei prodotti cosmetici pronti per le applicazioni.

Costituiscono oggetto ulteriore della presente invenzione l’estratto idrosolubile ottenibile mediante il metodo a)-f) e l’estratto liposolubile ottenibile mediante il metodo a)-g). Inoltre, l’invenzione si riferisce anche ad estratti arricchiti derivanti dalle suddette cellule che sono state precedentemente indotte da specifici trattamenti e condizioni di crescita, e quindi producono maggiori quantità di composti ad azione antiossidante o benefica su cellule della pelle.

Formano altresì oggetto dell’invenzione composizioni cosmetiche comprendenti l’estratto idrosolubile o l’estratto liposolubile o entrambi (in rapporti variabili da 1:1 fino a 1:99 a seconda delle applicazioni) ottenibili mediante il metodo precedentemente descritto insieme a veicoli, eccipienti e/o adiuvanti cosmeticamente accettabili. Tali composizioni possono essere sotto forma di creme, gel, lozioni cosmetiche per l’applicazione cutanea, nonché rossetti, fondotinta e trucchi. I veicoli che possono essere impiegati sono liposomi, preferibilmente liposomi multilamellari, ciclodestrine, silicati.

Infine, l’invenzione si riferisce all’uso in campo cosmetico di uno degli estratti (idro- e liposolubile), di una loro combinazione o delle composizioni cosmetiche a base di detti estratti o loro combinazione, in particolare come antiossidanti, ad esempio nel trattamento per la protezione della pelle da stress ossidativi, nel trattamento o la prevenzione dell’invecchiamento cutaneo (anti-aging) o per aumentare l'idratazione.

Infine, l’invenzione si riferisce ad un metodo di trattamento cosmetico per la prevenzione ed il trattamento dell’invecchiamento cutaneo comprendente l’applicazione sulla cute in necessità di trattamento di una quantità cosmeticamente efficace di una composizione come sopra descritta.

La presente invenzione verrà ora descritta a titolo illustrativo, ma non limitativo, secondo sue forme preferite di realizzazione con particolare riferimento alle figure dei disegni allegati, in cui: - la figura 1 riporta il grafico del Saggio MTT che mostra come entrambi gli estratti idro- e liposolubile non abbiano effetto tossico sulle cellule a concentrazioni uguali o inferiori a 0.0125% (0.125 mg/ml). In ordinata à ̈ riportato il numero di cellule vitali espresso in valore percentuale rispetto al controllo, uguale a 100%.

- la figura 2 mostra la totale capacità antiossidante degli estratti, calcolata con i due diversi metodi: Total Antioxidant Capacity (TAC) assay e Oxygen Radical Absorbance Capacity (ORAC) assay, descritti nella sezione dei materiali e metodi. Per il saggio TAC sono state confrontate tre dosi di entrambi gli estratti con dosi analoghe di un altro prodotto concorrente usato in cosmetica (BC Resveratrol Ferment, BC Research Co.) noto per le sue elevate proprietà antiossidanti. Per il saggio ORAC à ̈ riportata, per semplicità, una sola dose (0.0007%) dei due estratti, sempre a confronto con il prodotto concorrente.

- la figura 3 mostra la produzione di Specie Reattive dell’Ossigeno (ROS), citoplasmatiche e di membrana, in cellule trattate con H2O2150uM in assenza ed in presenza delle miscele idro- e liposolubili; sull’asse delle Y del grafico à ̈ riportata la produzione di ROS espressa in percentuale rispetto ad un controllo non trattato (stabilito arbitrariamente come 100%). I valori sono stati calcolati a partire da misure di fluorescenza emessa e misurata a 535 nm;

- la figura 4 mostra alcune foto relative all'analisi dei danni al DNA prodotti da stress ossidativo e l'azione protettiva esercitata dalle miscele idro- e liposolubili ottenute dalle cellule di Rubus. L'analisi à ̈ stata condotta con la tecnica del “saggio Comet†che permette di visualizzare e quantificare la frammentazione dei nuclei delle cellule in base alla lunghezza della scia prodotta. La foto A mostra i nuclei di cellule non stressate e non trattate con gli estratti; la foto B mostra invece cellule stressate con H2O2e non trattate con gli estratti. Le foto C e D mostrano nuclei di cellule stressate con H2O2e trattate rispettivamente con l'estratto idrosolubile e liposolubile di cellule di Rubus. Nella stessa figura à ̈ riportato anche il grafico a barre che mostra le lunghezze medie delle scie dei campioni di cellule non trattate o trattate con le miscele.

- la figura 5 mostra l’analisi dell’espressione di GADD45α dopo sei ore dal trattamento con i due estratti e di ascorbato (usato come controllo positivo per le sue proprietà antiossidanti), sia in assenza che in presenza dell'agente ossidante H2O2, rispetto ad un campione di controllo non pretrattato; i valori riportati nel grafico sono espressi come percentuali rispetto al campione di controllo non trattato (stabilito arbitrariamente come 100%).

- la figura 6 mostra l'analisi dell'espressione dei geni di SIRT1, proteina della famiglia delle sirtuine, e di AQP3, proteina della famiglia delle acquaporine. In questo caso i campioni di cellule sono stati pretrattati con gli estratti in assenza e presenza di H2O2o NaCl, e l’espressione genica analizzata dopo 3 e 6 ore e paragonata a quella di campioni di cellule di controllo non trattati o trattati con il solo agente di stress. I valori riportati nel grafico sono espressi come percentuali rispetto al campione di controllo non trattato (stabilito arbitrariamente come 100%).

- la figura 7 mostra la capacità antiossidante totale, calcolata con il saggio TAC, di tre diverse dosi di estratti idro- e liposolubili di cellule di Rubus che sono state pretrattate durante la fase di crescita con sale NaCl e una miscela 50:50 di zuccheri mannosio e glucosio.

A titolo esemplificativo, ma non limitativo della presente invenzione, si riportano di seguito alcuni esempi relativi alla preparazione degli estratti idroe liposolubili ottenute da cellule di Rubus, ed alla loro attività biologica in campo cosmetico.

ESEMPIO 1: Preparazione degli estratti idrosolubile e liposolubile ottenuti da cellule di Rubus e saggio della capacità antiossidante degli estratti.

MATERIALI E METODI

Estrazione della miscele idro e liposolubili dalle cellule di Rubus:

100 g di cellule di Rubus in coltura liquida sono state sedimentate per centrifugazione e lavate in PBS 1X (NaCl 136 mM, KCl 2.7 mM, NaH2PO412 mM, KH2PO41.76 mM, pH 7.4).

Tutto il supernatante à ̈ stato eliminato per aspirazione ed il pellet di cellule à ̈ stato congelato a –80°C fino al suo utilizzo. Le cellule una volta scongelate sono state asciugate su un filtro Miracloth ed omogeneizzate in un mortaio con 200 ml di PBS contenente sabbia di silice, che favorisce la rottura delle cellule. L’omogeneizzato à ̈ stato centrifugato a 8500 rpm per 15 min a 4<o>C e il sopranatante prelevato e conservato a –80°C. Il pellet contenente la frazione non solubile in acqua à ̈ stato trattato con 2 volumi di solvente organico apolare (acetone, alcol, etere, steroli). La sospensione à ̈ stata centrifugata a 6000 rpm e il sopranatante prelevato e conservato a -20°C. L'estratto idrosolubile à ̈ stato liofilizzato per circa 3 giorni in modo da ottenere una polvere, mentre l'estratto liposolubile à ̈ stato portato a secco in una camera di essiccamento oppure non trattato nel caso in cui il solvente utilizzato per l'estrazione risultasse compatibile con le emulsioni base usate per le formulazioni cosmetiche. Le polveri ottenute (4g totali di estratto idro- e 1,6g totali di quello lipo-: significa circa 40mg e 16 mg, rispettivamente, per ogni grammo di cellule di partenza) sono state risospese in acqua (estratto idrosolubile) o in solvente organico (estratto liposolubile) alla concentrazione variabile tra 10 e 1% per eseguire i saggi biologici.

Gli estratti idro- e liposolubili sono stati testati su cellule NIH3T3 (linea di fibroblasti di topo) per stabilirne le dosi di utilizzo, per verificarne il ruolo come antiossidante e di protezione nei confronti dello stress ossidativo, e per misurarne gli effetti sulla protezione dai danni al DNA. Per valutare l'effetto degli estratti sull'espressione di geni coinvolti nella difesa e nell'idratazione cellulare sono state utilizzate sia fibroblasti NIH3T3, che cheratinociti della linea HaCaT.

Saggio di citotossicità

Questo saggio si basa sull'uso del MTT [3-(4,5-dimetiltiazolil)-2,5-difeniltetrazoliobromuro]descritto da Mosmann nel 1983 per la prima volta. E’ basato sulla capacità dell'enzima deidrogenasi mitocondriale delle cellule vitali di idrolizzare l'anello tetrazolico del MTT (di colore giallo chiaro) e formare cristalli di formazano (di colore blue scuro). Tali cristalli sono impermeabili alle membrane cellulari e si accumulano nel citoplasma delle cellule metabolicamente attive. Il numero di cellule vive e sane à ̈ così direttamente proporzionale al livello di formazan prodotto.

Cellule NIH3T3, in numero iniziale di 1,3 x 10<4>per pozzetto, sono state cresciute in piastre da 96 pozzetti in mezzo di coltura DMEM (Lonza), supplementato con il 10% di Fetal Calf Serum, per circa 20 ore. Dopo il trattamento con le diverse concentrazioni della miscela per 3 ore, le cellule sono state lavate in PBS ed incubate con 100 ul/pozzetto di “tampone di reazione†contenente: 10 mM di Hepes, 1.3 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, 5 mM di glucosio e 0.5 mg/ml di substrato colorimetrico MTT in tampone PBS a pH 7.4. Dopo 3 ore di incubazione a 37°C, 5% CO2, ad ogni pozzetto sono stati aggiunti 100 ul di soluzione solubilizzante contenente 10% di Tritonx100, 0.1 N di HCl in isopropanolo assoluto. Dopo 30 minuti, la reazione colorimetrica à ̈ stata misurata a 595 nm con il lettore di piastre Victor3.

Saggi TAC e ORAC

Entrambi i saggi sono utilizzati per misurare il potere anti-ossidante totale dei composti mediante una reazione “in vitro†.

Il saggio TAC (Total Antioxidant Capacity) si basa su una reazione di ossido-riduzione tra il composto da saggiare e il Cu(II)(rame due). Se il composto da saggiare ha potere riducente, il Cu(II) à ̈ subito convertito in Cu(I)(rame uno) che può essere misurato con l'aggiunta di un cromoforo, il bathocuproine (BATO) (Yildiz et al., 2008). 50 µl delle diverse diluizioni di campione dei due estratti di Rubus sono stati divisi in aliquote e deposti in piastre da 96 pozzetti. Successivamente sono stati aggiunti 50 µl di una soluzione di BATO 720 µM e la piastra à ̈ stata incubata a temperatura ambiente per 5 minuti.

Dopo l'aggiunta di 25 µl di CuSO4500uM ad ogni pozzetto, la piastra à ̈ stata incubata per ulteriori 30 minuti a temperatura ambiente. Al termine, l'assorbanza di ogni campione à ̈ stata determinata a 490 nm mediante un lettore di piastre Victor3 (PerkinElmer). Come standard di riferimento, sono state usate diluizioni scalari di CuCl, tra 10 mM e 0.15 mM.

Il saggio ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity) à ̈ basato sulla capacità di un composto di inibire l'ossidazione di un fluoroforo, generalmente la fluoresceina, da parte di un potente ossidante, 2,2'-azobis(2-amidinopropano) diidrocloruro (AAPH) (Huang et al., 2002). 25 µl di diluizioni degli estratti in tampone fosfato 75 mM, pH 7.4, sono stati divisi in aliquote in piastre da 96 pozzetti e 150 µl di soluzione di fluoresceina (8.5 nM in tampone fosfato) sono stati aggiunti ad ogni campione. Dopo un incubazione di 15 minuti a 37°C, 25 µl di una soluzione di AAPH (152 mM in tampone fosfato) sono stati aggiunti ad ogni pozzetto e la reazione di ossidazione della fluoresceina à ̈ stata monitorata a 535 nm per 50 minuti mediante un lettore di piastre EnVision (PerkinElmer).

Il potere antiossidante dei campioni à ̈ stato calcolato seguendo la procedura descritta da Huang et al., 2002. L'area sotto la curva (Area Under Curve, AUC) di ciascun campione e dello standard Trolox (un derivato della vitamina E che ha un forte potere riducente) à ̈ stata calcolata utilizzando uno dei software dello strumento. Dopo aver calcolato la curva che mette in relazione i valori di concentrazione di Trolox con quelli delle AUC corrispondenti, i valori di AUC calcolati per ciascun campione sono stati convertiti in “micromoli di Trolox equivalenti†per litro.

Saggio ROS

1,3 x 10<4>cellule NIH3T3 sono state poste in piastre da 96 pozzetti e mantenute in coltura per 20 ore. Le cellule sono state trattate per 3 ore con diverse concentrazioni di estratti di Rubus, e con acido ascorbico 250 µM o con vitamina E, usati come controlli positivi. In seguito al trattamento le cellule sono state lavate con PBS ed incubate a 37°C per 30 minuti con il colorante CM-DCFDA (5-(e-6)-clorometil-2’,7’-dicloro diidrofluoresceina diacetato) (Invitrogen), per l'analisi dei ROS intracellulari, o con C11-BODIPY (Invitrogen), per quella dei ROS di membrana. Dopo essere state lavate nuovamente con PBS, le cellule sono state trattate con H2O2150 µM ed incubate per altri 30’. Prima dell’aggiunta dell’H2O2e poi dopo 30’ fino a 2h dall'aggiunta di H2O2à ̈ stata misurata la fluorescenza a 535 nm, utilizzando il lettore di piastre EnVision (PerkinElmer).

Analisi dell'espressione dei geni GADD45α, SIRT1 e AQP3 in cellule trattate con gli estratti

Per l’analisi dell’espressione dei geni Gadd45α e Sirt-1 sono state utilizzate cellule NIH3T3 mentre per il gene AQP3 sono state utilizzate cellule HaCaT.

Cellule NIH3T3 o cellule HaCaT, in numero iniziale di 1,5 x 10<5>per pozzetto, sono state cresciute in piastre da 6 pozzetti in mezzo di coltura DMEM (Lonza), supplementato con il 10% di Fetal Calf Serum per le NIH o Fetal Bovine Serum per le HaCaT, per 24 ore.

Le cellule sono state poi incubate con diverse concentrazioni di estratto o di altri composti utilizzati come controlli per 2 ore. Per l’analisi dell’espressione di Gadd45α e SIRT1 le cellule sono state trattate per 2 ore con H2O2150 µM e raccolte dopo rispettivamente 6 o 3 ore. Per l’analisi dell’espressione di AQP3 le cellule sono state trattate con NaCl 50 mM e raccolte dopo 6 ore di trattamento.

Per l’estrazione dell’RNA dai campioni di cellule à ̈ stato utilizzato un kit acquistato dalla Sigma. Dopo i trattamenti indicati, le cellule sono state lavate con PBS, staccate in buffer di lisi e sottoposte alla procedura di estrazione come da protocollo del kit. I campioni di RNA sono stati sottoposti ad un trattamento con DNasi I (Ambion) per eliminare il DNA genomico contaminante. 2 µl di ciascun campione sono stati caricati su gel di agarosio 1% in presenza di “loading dye†denaturante e quantizzati utilizzando come riferimento uno specifico marker per RNA (Fermentas). Per la quantificazione à ̈ stato usato il software Gene tools (Perkin Elmer). 300 ng di RNA totale à ̈ stato retrotrascritto usando l’enzima Trascrittasi Inversa (Fermentas).

Le reazioni di RT-PCR semiquantitativa sono state condotte utilizzando come standard interni la coppia di primer universali 18S primer/competimer (Ambion) in rapporto 4:6. I prodotti di PCR sono stati separati su gel d’agarosio 1.5%, visualizzati utilizzando lo strumento Geliance (Perkin Elmer) ed analizzati densitometricamente utilizzando il software Genetools. I valori riportati nei grafici rappresentano il rapporto tra l’intensità della banda relativa al gene in analisi e quella della banda relativa allo standard di riferimento 18S, in modo da avere un valore correlato alla reale espressione di quel gene e non dipendente dalla quantità di RNA o di reagenti di PCR presenti in quel campione.

Elettroforesi su cellule singole o “Saggio Comet†Cellule NIH3T3, in numero iniziale di 1,5 x 10<5>per pozzetto, sono state cresciute in piastre da 6 pozzetti in mezzo di coltura DMEM (Lonza), supplementato con il 10% di Fetal Calf Serum, per 24 ore. Dopo un trattamento “over-night†con gli estratti di Rubus e altri composti di controllo, le cellule sono state trattate con H2O2150uM per 2.5 ore. Al termine, le cellule sono state staccate dalla piastra usando 1 ml/pozzetto di soluzione Sigma non-enzimatica e trasferite in provette eppendorf per essere centrifugate a 15,000 rpm per 5 minuti. Le cellule sono state lavate in PBS 1X e risospese in circa 10-20 ul di PBS, a seconda della quantità di cellule recuperate. Alle cellule à ̈ stato aggiunto un volume di 80 ul di “Low Melting point Agarose†(LPMA) 0.5% in PBS, equilibrato a 37°C. Le cellule così disperse sono state poste su un vetrino precedentemente ricoperto di un sottile strato di “Normal Melting Agarose†(NMA). Un vetrino copri-oggetto à ̈ stato posto sopra la goccia di cellule, facendo attenzione a non romperle, e i vetrini sono stati poi posti in frigo a 4°C fino a quando lo strato di agarosio con le cellule si solidifica completamente (10-15 min). I copri-oggetto sono stati gentilmente rimossi dall'agarosio, e i vetrini posti in una soluzione di lisi fredda (2.5 M NaCl, 100 mM EDTA, 10 mM Trizma Base pH 8.5, 1% TritonX100) e lasciati per circa 2 ore a 4°C. Dopo aver rimosso i vetrini dalla soluzione, sono stati immersi in una camera elettroforetica contenente un tampone di corsa (300mM NaOH, 1 mM EDTA, pH > 13). Dopo 10 minuti, un alimentatore di corrente collegato alla camera à ̈ stato acceso ed il potenziale regolato a 24V. I vetrini, dopo essere stati sottoposti ad elettroforesi per 20 minuti, sono stati trasferiti in tampone di neutralizzazione (0.4 M Tris-HCl, pH 7.5) per almeno 10 min. Dopo aver asciugato i vetrini, le cellule in agarosio sono state trattate con una soluzione di 10 ug/ml di Bromuro di Etidio, allo scopo di evidenziarne i nuclei in fluorescenza, e coperte con vetrini copri-oggetto per essere osservate al microscopio a fluorescenza.

RISULTATI

Studio della citotossicità degli estratti di cellule di Rubus

Allo scopo di determinare le concentrazioni degli estratti da utilizzare per tutti i successivi saggi, sono stati condotti esperimenti per determinare il “range†di concentrazioni in cui i prodotti risultassero non dannosi alle cellule in fase di crescita. Sono state quindi saggiate diverse concentrazioni sia dell'estratto idrosolubile, sia di quello liposolubile, comprese tra 0.0125% e 0,0001% (125 µg/ml-1 µg/ml) su fibroblasti NIH3T3. Come mostrato nella Figura 1, nessuna delle dosi saggiate ha prodotto un significativo effetto tossico sulle cellule.

Studio delle proprietà antiossidanti degli estratti cellulari di Rubus

Per misurare il potere antiossidante totale di entrambi gli estratti, sono stati condotti due saggi in vitro, saggio TAC e ORAC, e un saggio sulle cellule in vivo, saggio ROS.

Il potere antiossidante di un composto o di una miscela di composti dipende dalla sua capacità riducente, dalla sua abilità di penetrare nelle cellule attraverso le membrane plasmatiche, e dalla sua capacità di attivare segnali di trasduzione che portano alla produzione di composti antiossidanti intracellulari che hanno lo scopo di proteggere la cellula dallo stress ossidativo.

I saggi TAC e ORAC misurano il potenziale riducente dei composti, però essi non forniscono nessuna informazione sulla capacità che questi composti hanno di indurre la produzione di antiossidanti nelle cellule epidermiche. Al contrario, il saggio ROS misura la quantità di “specie reattive dell’ossigeno†(ROS) prodotte nelle cellule epidermiche in coltura. Inoltre, in condizioni di stress ossidativo, il saggio fornisce anche informazioni circa l'effetto protettivo di un determinato prodotto, in base alla sua capacità di mantenere i livelli di ROS bassi all'interno della cellula. Entrambi i tipi di saggio sono stati utilizzati per valutare l'attività anti-ossidante degli estratti di Rubus.

Differenti concentrazioni degli estratti sono state mescolate con una soluzione 100 µM di Cu(II) e BATO. Dopo 30 minuti, la quantità di Cu(I) prodotto à ̈ stato misurato mediante analisi spettrofotometrica a 490 nm. I risultati sono riportati nella Figura 2.

Il saggio ORAC ha confermato che entrambi gli estratti hanno un buon potere antiossidante in-vitro, quello liposolubile superiore a quello idrosolubile (ben 10-12 volte nel TAC, e circa 1.7 volte nell'ORAC).

Sebbene l'ORAC sia basato su un principio differente rispetto al TAC, anch’esso misura il potere riducente totale di un composto. Diverse diluizioni degli estratti di Rubus sono stati mescolati con la fluoresceina e la reazione iniziata con l'aggiunta dell'AAPH. Come mostra la stessa figura 2, i valori dell'attività riducente degli estratti, espressa come Trolox equivalenti, indica che entrambi gli estratti possiedono buona capacità antiossidante e per questo sono utilizzabili come agenti protettivi da stress sulle cellule epidermiche. Inoltre, la capacità antiossidante totale dei due estratti à ̈ stata confrontata con quella prodotta da un altro prodotto già utilizzato in formulazioni cosmetiche, il BC Resveratrol Ferment (BC Research Co). Il prodotto di confronto à ̈ stato scelto in quanto contiene resveratrolo, un composto ad elevata azione antiossidante e principalmente prodotto nei frutti di bosco, e soprattutto piante di lampone, che fanno parte del genere Rubus. Gli estratti derivati da cellule di Rubus, contengono resveratrolo, insieme a molte altre sostanze antiossidanti. La misurazione della capacità antiossidante di entrambi gli estratti di Rubus, effettuata con i due saggi descritti, si à ̈ infatti rivelata superiore a quella del BC Resveratrol Ferment.

Quando i fibroblasti in coltura sono stati trattati con gli estratti di Rubus, à ̈ stata osservata una riduzione della produzione di ROS rispetto al campione di cellule non trattato e usato come controllo (Figura 3). In seguito allo stress ossidativo prodotto da H2O2, l'estratto idrosolubile mostra un effetto protettivo di riduzione dei ROS intracellulari, mentre quello liposolubile à ̈ efficace nella protezione dei ROS che si formano dai danni ai lipidi di membrana. Questi due effetti osservati sono in accordo con le proprietà chimiche differenti che i due estratti hanno: le componenti presenti nell'estratto idrosolubile tendono ad interagire maggiormente con le molecole solubili contenute nel citoplasma cellulare, a differenza dell'estratto liposolubile che tenderà a diffondere principalmente nelle membrane fosfolipidiche, esercitando il suo effetto protettivo. Inoltre, l'effetto prodotto da entrambi gli estratti à ̈ confrontabile a quello osservato in seguito al trattamento con l'ascorbato (a concentrazione di 250 uM = 44 microgrammi/ml), o con la vitamina E (100 µM), noti agenti protettivi da stress ossidativo.

Una volta dimostrato l'effetto protettivo da stress ossidativo sia dell'estratto idrosolubile, che di quello liposolubile, abbiamo voluto verificare se il trattamento con questi estratti producesse un reale effetto di protezione del DNA nucleare. Questo effetto può essere visualizzato mediante il saggio Comet (il cui protocollo à ̈ stato descritto in precedenza nella sezione materiali e metodi) che serve per valutare il livello di frammentazione del DNA genomico mediante osservazione delle cellule al microscopio ottico. Come si può vedere dalle foto in Figura 4, il trattamento con gli estratti ha prodotto un chiaro effetto protettivo al DNA dai danni prodotti da H2O2. La lunghezza della scia dei nuclei cellulari, indice della frammentazione del DNA, à ̈ significativamente inferiore nelle cellule trattate con gli estratti/H2O2(foto C e D) rispetto a quelle trattate con sola H2O2(foto B), quindi più simile alle cellule controllo che non hanno subito alcun trattamento (foto A). Per quantizzare questo effetto, la lunghezza di 100 scie dei nuclei cellulari à ̈ stata misurata ed à ̈ stato calcolato un valore medio. Nella stessa figura in alto, à ̈ riportato il grafico a colonne che mette a confronto i valori medi di lunghezza (espressi in micron) misurati in cellule non trattate, e in cellule trattate con H2O2in assenza ed in presenza degli estratti. Nello stesso esperimento, à ̈ stato valutato anche l'effetto di protezione di un altro prodotto cosmetico, già utilizzato per le sua proprietà di ridurre la frammentazione del DNA nucleare, Orsirtine GL (Vincience). L'Orsirtine ha prodotto una riduzione dei danni al DNA genomico del 25%, in accordo a quanto dichiarato dal produttore che nei suoi esperimenti ha ottenuto un 22% di riduzione della frammentazione nucleare indotta da H2O2quando il prodotto à ̈ usato ad una concentrazione dell’1%.

Studio dell'effetto degli estratti di Rubus sui geni responsabili della protezione del DNA

Sulla base dell’attività antiossidante e di protezione dai danni al DNA esercitata dai due estratti, à ̈ stato valutato mediante RT-PCR se gli stessi prodotti potessero avere effetto sull’espressione di geni coinvolti nella protezione del DNA da danni ossidativi.

Per i motivi spiegati in precedenza, sono stati selezionati: il gene GADD45α, membro della famiglia GADD45, che comprende fattori di trascrizione coinvolti nel riparo e nella replicazione del DNA (Takekawa and Saito, 1998), e il gene SIRT-1, appartenente alla famiglia delle sirtuine, proteine con attività di deacetilasi dipendenti da NAD (Oberdoerffer et al., 2008).

Per l’analisi dell’espressione di GADD45, le cellule sono state trattate con ciascuno degli estratti (ad una concentrazione pari a 0,0005% = 5 µg/ml) e con ascorbato, usato come controllo positivo, sia in assenza che in presenza di H2O2, alla concentrazione 150 µM. Dopo i trattamenti, le cellule sono state raccolte, l’RNA estratto e l’espressione genica analizzata mediante RT-PCR.

Come si evince dalla Figura 5, il trattamento con l'estratto idrosolubile e liposolubile ha indotto una significativa espressione del gene GADD45α in assenza di H2O2. In presenza di H2O2, laddove l’espressione del gene à ̈ comunque significativamente più alta, l'effetto induttivo degli estratti à ̈ più evidente rispetto alle cellule trattate con sola H2O2ed à ̈ superiore rispetto a quello prodotto dall'ascorbato. Questi risultati suggeriscono che il trattamento con gli estratti potenzia l’induzione del gene GADD45α esercitata da H2O2rivelando un’azione protettiva nei confronti dei danni al DNA provocati dall’agente ossidante.

Analizzando l'espressione di SIRT1, à ̈ emerso che l'estratto idrosolubile di Rubus ha un’azione induttiva specifica nei confronti di questo gene di quasi il 60% (Figura 6). In presenza dell'agente stressante H2O2, che in questo caso ha un azione inibitoria sull'espressione dei SIRT, il trattamento con l'estratto idrosolubile ha prodotto un'attenuazione dell'effetto inibitorio esercitato da H2O2, confermando il suo effetto protettivo nei confronti dei danni al DNA genomico. Inoltre, il livello di induzione genica osservato à ̈ significativamente superiore a quello prodotto da un altro tipo di estratto usato in cosmetica, il Longevicell (Silab), di cui à ̈ stato dimostrato lo specifico effetto induttivo su SIRT1 (intorno al 36%).

Studio dell'effetto dell’estratto liposolubile di Rubus sul gene di AQP3, coinvolto nella protezione da stress idrico

Considerato il forte potere antiossidante dimostrato in vitro dall'estratto liposolubile e la sua capacità di proteggere l'ossidazione delle membrane cellulari, à ̈ stata valutata anche la capacità di questo estratto di favorire il processo di idratazione cellulare, meccanismo anch'esso collegato con la funzionalità di proteine canale presenti sulla membrana plasmatica. In una serie di esperimenti à ̈ stato quindi valutato l'effetto induttivo sull'espressione del gene dell'acquaporina-3 (AQP3), principalmente coinvolta nella protezione da stress osmotico e disidratazione (Benga, 2009).

I risultati degli esperimenti, riportati in Figura 6, hanno evidenziato che l'estratto liposolubile esercita un chiaro e significativo effetto induttivo sul gene AQP3, sia in assenza sia in presenza dell'agente stressante NaCl, confermando il suo ruolo di protezione delle cellule da danni osmotici, più specificatamente associati alle funzioni delle membrane cellulari, e di favorire il processo di idratazione cellulare.

Trattamento delle cellule con composti chimici e verifica delle proprietà antiossidanti degli estratti Per aumentare le proprietà antiossidanti e quindi di protezione delle cellule da stress ossidativi e da danni al DNA, le cellule sono state trattate con diversi composti naturali e gli estratti idro- e liposolubili sono stati preparati come descritto in precedenza.

Dopo aver incubato le cellule di Rubus per 24-48 ore con una miscela di glucosio e mannosio 300 ppm e con NaCl 150 mM, gli estratti ottenuti sono stati saggiati per verificarne il potere antiossidante. Come mostrato nella Figura 7, sia l'estratto idrosolubile, sia quello liposolubile derivati da cellule trattate con la miscela di zuccheri e con NaCl mostrano un potete antiossidante misurato mediante il saggio TAC significativamente superiore a quello derivato dalle stesse cellule cresciute in assenza di composti aggiuntivi.

Sulla base di questi risultati, la presente invenzione à ̈ volta anche agli estratti derivanti da colture cellulari cresciute in presenza di composti, quali sali, zuccheri, proteine, lipidi e piccole molecole organiche, che attivando il metabolismo cellulare o altre vie biosintetiche, consentano di ottenere estratti più arricchiti in sostanze antiossidanti benefiche e quindi ancora più efficaci per le varie applicazioni cosmetiche.

BIBLIOGRAFIA

- Benga G. (2009). IUBMB Life, 61(2):112-33.

- Hara-Chikuma M & Verkman AS (2008). Jour. Invest. Dermatol., 128: 2145-2151.

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- Zschoernig B. & Mahlknecht U. (2008). Biochem Biophys Res Comm 376: 251-255.

Claims (13)

1. RIVENDICAZIONI 1. Metodo per l’estrazione di una miscela di sostanze idrosolubile e di una miscela di sostanze liposolubile da cellule di Rubus in coltura liquida, comprendente le seguenti fasi: a) de-differenziamento su substrato solido delle cellule del tessuto vegetale di specie di Rubus prelevato da pianta in calli; b) prelievo dei calli e allestimento delle colture liquide; c) crescita di cellule vegetali di Rubus in coltura liquida; d) separazione delle cellule vegetali dal mezzo di crescita; e) omogeneizzazione delle cellule vegetali; f) centrifugazione dell'omogenato per isolare l'estratto idrosolubile, rappresentato dal sopranatante; g) trattamento del pellet ottenuto dalla centrifugazione con solvente organico apolare, centrifugazione della sospensione così ottenuta per isolare l'estratto liposolubile, rappresentato dal sopranatante.
2. 2. Metodo secondo la rivendicazione 1, in cui detto solvente apolare à ̈ scelto tra alcoli, acetone, etere, cloroformio, steroli, oli.
3. 3. Metodo secondo ognuna delle rivendicazioni 1-2, in cui detta fase e) di omogeneizzazione avviene in un mortaio con PBS 1X e sabbia di silice.
4. 4. Metodo secondo ognuna delle rivendicazioni 1-3, in cui prima o durante la fase c) di crescita le cellule vegetali di Rubus vengono sottoposte ad un trattamento fisico scelto tra trattamento al calore, al freddo, irradiazione UV, o ad un trattamento chimico con zuccheri, sali, proteine, lipidi, piccole molecole organiche, o loro combinazioni.
5. 5. Metodo secondo la rivendicazione 4 in cui detto zucchero à ̈ mannosio o glucosio e detto sale à ̈ NaCl.
6. 6. Estratto idrosolubile da cellule di Rubus ottenibile mediante le fasi a)-f) del metodo secondo ognuna delle rivendicazioni precedenti.
7. 7. Estratto liposolubile da cellule di Rubus ottenibile mediante le fasi a)-g) del metodo secondo ognuna delle rivendicazioni precedenti.
8. 8. Composizione cosmetica comprendente almeno uno degli estratti come definiti secondo ognuna delle rivendicazioni 6-7 o una loro combinazione, in un veicolo cosmeticamente accettabile e/o insieme ad adiuvanti ed eccipienti accettabili in dermocosmesi.
9. 9. Composizione cosmetica secondo la rivendicazione 8, in forma di una crema, gel, lozione cosmetica, rossetto, fondotinta per l’applicazione cutanea.
10. 10. Composizione cosmetica secondo ognuna delle rivendicazioni 8-9, in cui detto veicolo cosmeticamente accettabile à ̈ scelto tra liposomi multilamellari, ciclodestrine, silicati.
11. 11. Uso della composizione cosmetica secondo ognuna delle rivendicazioni 8-10 o degli estratti secondo ognuna delle rivendicazioni 6-7, come antiossidante.
12. 12. Uso della composizione cosmetica secondo ognuna delle rivendicazioni 8-10 o degli estratti secondo ognuna le rivendicazioni 6-7, per la protezione della pelle da stress ossidativi o per il trattamento e la prevenzione dell’invecchiamento cutaneo o per aumentare l'idratazione.
13. 13. Metodo di trattamento cosmetico per la prevenzione ed il trattamento dell’invecchiamento cutaneo comprendente l’applicazione sulla cute in necessità di trattamento di una quantità cosmeticamente efficace di una composizione cosmetica come definita secondo ognuna delle rivendicazioni 8-10.