IT202000021994A1 - Uso cosmetico di estratti derivati da colture cellulari appartenenti alla specie oenothera biennis e composizioni cosmetiche che contengono tali estratti - Google Patents
Uso cosmetico di estratti derivati da colture cellulari appartenenti alla specie oenothera biennis e composizioni cosmetiche che contengono tali estratti Download PDFInfo
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Description
DESCRIZIONE
Campo di applicazione
La presente invenzione si riferisce all?uso in campo cosmetico di estratti derivati da colture cellulari appartenenti alla specie Oenothera biennis per il trattamento e la prevenzione dell?invecchiamento della pelle, al metodo per la produzione di detti estratti e alle composizioni comprendenti tali estratti per l?uso in dermocosmesi.
Arte nota
Durante l'invecchiamento la pelle perde progressivamente le sue propriet? meccaniche, a causa sia di una diminuzione della sintesi dei vari componenti della matrice extra-cellulare sia di una contemporanea alterazione delle forze di contrazione della matrice.
Le componenti principali della matrice sono le proteine - in particolare il collagene, elastina e fibronectina - acido ialuronico e proteoglicani; la quantit? relativa di ciascun componente, oltre che la loro interazione, svolge un ruolo fondamentale nel garantire la corretta architettura e consistenza del derma della pelle.
Le forze contrattili della pelle sono invece principalmente esercitate dai fibroblasti, le pi? importanti e abbondanti cellule immerse nella matrice dermica; interagendo con le componenti della matrice, essi ne stabiliscono il posizionamento e determinano la corretta tensione, responsabile della compattezza e resistenza del derma.
La fonte primaria di queste forze ? quindi proprio il citoscheletro cellulare, in particolare l?interazione tra due principali proteine polimeriche, actina e miosina, che consente ai fibroblasti di muoversi, cambiare forma e rendere pi? compatto il tessuto, avvicinando le fibre come fossero dei piccoli tensori. E? proprio questa tensione esercitata dai fibroblasti che garantisce lo sviluppo di un tessuto sano e compatto, ed evita che le fibre si disgreghino portando alla formazione di rughe.
Tuttavia questa capacit? dei fibroblasti di contrarre e tendere le fibre dermiche si perde durante l'invecchiamento della pelle, proprio perch? le cellule invecchiate non sono pi? in grado di svolgere questa funzione in modo corretto e completo. I fibroblasti non sono in grado di agganciarsi in modo efficace alle componenti della matrice a causa di una ridotta forza meccanica, e quindi passano da una morfologia allungata ad una pi? arrotondata e collassata.
In un recente studio ? stato osservato che nelle cellule invecchiate il livello di espressione genica di una proteina chiamata MYLK (MYosin Light chain Kinase) diminuisce in maniera significativa. MYLK ? un enzima ad attivit? chinasica, attivata dalla Calcio/calmodulina, che fosforila la catena leggera regolatoria della miosina, al fine di facilitarne il legame con l'actina e quindi favorire la contrattilit? cellulare (Fujimura et al., 2011). ? stato infatti osservato che una riduzione dell'attivit? di MYLK ? associata a un parallelo aumento della depolimerizzazione dell?actina e una ridotta espressione del recettore TGF ?-II (T ?RII), che a sua volta inibisce la sintesi di importanti proteine della matrice dermica, quali il collagene I e il Tissue Growth Factor connettivale, CCN2 (Chen and Lau, 2009; Qin et al., 2017; Konstantinidis et al., 2011) con conseguente fragilit? della pelle, riduzione della capacit? di guarire le ferite ed alterazione funzionale dei vasi sanguigni e altre appendici della pelle.
La maggior parte di ingredienti ad uso cosmetico attualmente presenti sul mercato sono proposti per la loro azione di stimolare la sintesi delle componenti della matrice dermica, ma non agiscono sui fattori chiave responsabili del mantenimento della corretta tensione dei tessuti e che quindi garantiscono il giusto livello di compattezza tra le fibre, in particolare quelle di collagene, elastina e acido ialuronico.
? noto che estratti derivati dalla specie Oenothera biennis, nota anche ?enotera? o ?enagra comune? e appartenente alla famiglia delle Onagraceae, sono stati impiegati nel trattamento di diverse condizioni patologiche della pelle, grazie al loro contenuto di acidi grassi e composti fenolici (Timoszuk, 2018).
Tuttavia, la produzione di tali estratti presenta diversi svantaggi.
Infatti, poich? tali estratti sono ottenuti da piante coltivate, essi possono essere contaminati da sostanze tossiche, quali ad esempio pesticidi e/o fertilizzanti, a cui le piante vengono esposte durante la loro crescita. Inoltre, gli estratti possono contenere degli agenti patogeni che vivono nella pianta, che possono ridurre la qualit? dell?estratto finale, rendendo necessari ulteriori passaggi di purificazione per ottenere il prodotto finale adatto all?applicazione sulla pelle.
Un ulteriore aspetto negativo risiede nel fatto che le piante sono soggette a variabili condizioni ambientali e stagionali che possono comprometterne la crescita e la produzione di metaboliti secondari, riducendo cos? la qualit? dell?estratto vegetale. Tali variazioni ambientali possono anche variare la resa di produzione di metaboliti secondari nel tempo; in questo modo, si rischia di ottenere estratti vegetali con un contenuto variabile di metaboliti secondari.
Il problema tecnico oggettivo alla base della presente invenzione ? quello di mettere a disposizione un estratto vegetale ricco di metaboliti secondari, in grado di rallentare l?invecchiamento delle cellule della pelle e che sia sostanzialmente privo degli svantaggi degli estratti vegetali dell?arte nota succitata.
Sommario dell'invenzione
Gli autori della presente invenzione hanno ora individuato tre tipi di estratti derivati da colture di cellule vegetali di Oenothera biennis, in grado di agire sia singolarmente che sinergicamente mediante meccanismi molecolari in grado di prevenire e rallentare il fenomeno dell?invecchiamento delle cellule della pelle, stimolando in particolare la sintesi delle componenti principali della matrice extracellulare.
In un suo aspetto, la presente invenzione si riferisce dunque all? uso cosmetico di almeno un estratto derivato da colture di cellule vegetali di Oenothera biennis per la prevenzione e il trattamento di inestetismi dovuti all?invecchiamento cutaneo.
Con l?espressione ?inestetismi dovuti all?invecchiamento cutaneo?, come qui utilizzata, si intendono le pi? comuni modificazioni dei diversi strati della pelle che tipicamente insorgono durante l?invecchiamento. Esempi non limitativi di detti inestetismi della pelle comprendono: rughe cornee (ovvero rughe superficiali), strato corneo della pelle ispessito e ruvido, presenza di macchie, riduzione dell?acido ialuronico, elastina e collagene dovuta ad un eccesso di stress ossidativo indotto da radicali liberi fino alla perdita di tono della pelle, ipersecrezione sebacea, e rughe dovute a prolungata esposizione a raggi solari.
In un altro suo aspetto, la presente invenzione riguarda un procedimento per la preparazione di almeno un estratto da colture di cellule vegetali di Oenothera biennis, comprendente le fasi di:
a) omogeneizzare colture di cellule vegetali di Oenothera biennis in una soluzione acquosa salina, ottenendo un omogenato;
b) separare la parte solida di detto omogenato dalla parte liquida, che costituisce un estratto idrosolubile.
Preferibilmente, le suddette colture di cellule vegetali di Oenothera biennis sono ottenute prelevando tessuto vegetale da piante di Oenothera biennis, inducendo la formazione di calli da detto tessuto su un substrato solido, prelevando detti calli e allestendo colture liquide da essi.
Preferibilmente, la fase b) di separare la parte solida di detto omogenato dalla parte liquida ? eseguita mediante centrifugazione, sedimentazione o filtrazione.
Preferibilmente, il suddetto procedimento comprende la fase ulteriore di estrarre detta parte solida con un solvente lipofilo, ottenendo un estratto liposolubile.
Alternativamente, il procedimento secondo l?invenzione pu? comprendere la fase ulteriore di trattare la suddetta parte solida con enzimi proteolitici in soluzione acida, ottenendo un estratto ricco in peptidi e zuccheri.
In un suo ulteriore aspetto, la presente invenzione si riferisce all?uso cosmetico come sopra definito, in cui il suddetto almeno un estratto ? un estratto idrosolubile ottenuto mediante il procedimento sopra descritto.
In un suo ulteriore aspetto, la presente invenzione si riferisce all?uso cosmetico come sopra definito, in cui il suddetto almeno un estratto ? un estratto liposolubile ottenuto mediante il procedimento sopra descritto.
In un suo ancora ulteriore aspetto, la presente invenzione si riferisce all?uso cosmetico come sopra definito, in cui il suddetto almeno un estratto ? un estratto ricco in peptidi e zuccheri ottenuto mediante il procedimento sopra descritto.
In un suo ulteriore aspetto, la presente invenzione si riferisce all?uso cosmetico come sopra definito, in cui il suddetto almeno un estratto comprende almeno due dei tre estratti summenzionati e preferibilmente tutti e tre.
In un suo ulteriore aspetto, la presente invenzione riguarda una composizione comprendente un estratto idrosolubile ottenuto mediante il procedimento sopra descritto e/o un estratto liposolubile ottenuto mediante il procedimento sopra descritto e/o un estratto ricco in peptidi e zuccheri ottenuto mediante il procedimento sopra descritto.
Preferibilmente, la composizione contiene, per una parte in peso di suddetto estratto idrosolubile, da 0,01 a 100, pi? preferibilmente 1, parti in peso di suddetto estratto liposolubile e, indipendentemente, da 0,01 a 100, pi? preferibilmente 0,1, parti in peso di suddetto estratto ricco in peptidi e zuccheri.
Preferibilmente, la composizione contiene, per una parte in peso di suddetto estratto idrosolubile, una parte in peso di suddetto estratto liposolubile e 0,1 parti in peso di suddetto estratto ricco in peptidi e zuccheri.
Preferibilmente, la composizione comprende ulteriormente almeno un solvente idrofilo scelto dal gruppo comprendente acqua, soluzioni acquose saline, solventi organici, pi? preferibilmente oli, alcoli, glicerolo, acidi organici, ammidi, ammine, aldeidi e chetoni.
Inoltre, la presente invenzione si riferisce all?uso cosmetico della composizione come sopra descritta per la prevenzione e il trattamento di inestetismi dovuti all?invecchiamento cutaneo.
In un altro suo aspetto, la presente invenzione riguarda altres? una formulazione cosmetica comprendente almeno un estratto come sopra definiti (estratto idrosolubile, estratto liposolubile, estratto ricco in peptidi e zuccheri) o una composizione come sopra definita e un veicolo cosmeticamente accettabile. Tale formulazione cosmetica pu? essere ad esempio in forma di crema, gel, lozione per applicazione cutanea oppure emulsioni per uso in rossetti, fondotinta e altri prodotti per make-up.
Inoltre, la presente invenzione riguarda l?uso della suddetta formulazione per la prevenzione e il trattamento di inestetismi dovuti all?invecchiamento cutaneo.
Gli estratti derivati da colture di cellule vegetali di Oenothera biennis della presente invenzione, come sopra definiti, presentano inattese e sorprendenti capacit? di prevenire e trattare gli inestetismi della pelle correlati con l?invecchiamento cutaneo e, per questo motivo, sono particolarmente interessanti nel settore della cosmesi.
Vantaggiosamente, gli estratti della presente invenzione sono ottenuti da colture di cellule vegetali.
A differenza degli estratti ottenuti dalle piante, gli estratti ottenuti da colture di cellule vegetali presentano numerosi vantaggi perch? sono privi di sostanze contaminanti tossiche (quali ad esempio, pesticidi e fertilizzanti) o potenziali agenti patogeni ambientali, in quanto crescono in condizioni controllate di laboratorio.
Inoltre, essi derivano da processi di produzione standardizzati, e la loro composizione e attivit? non dipendono dalle stagioni e condizioni ambientali, garantendo sempre le stesse caratteristiche qualitative del prodotto ottenuto.
Vantaggiosamente, gli estratti da colture cellulari di Oenothera biennis della presente invenzione sono in grado di stimolare la contrazione della matrice di collagene e la produzione di pro-collagene I in cellule di fibroblasti umani.
Inoltre, essi mostrano di essere in grado di promuovere la polimerizzazione dell?actina e di aumentare la sintesi di proteine quali MYLK, periostina e tropoelastina, tutte componenti della matrice extracellulare che, insieme al collagene, sono fondamentali per mantenere l?architettura di una pelle giovane e sana.
Tali effetti di stimolazione di produzione delle suddette proteine favoriscono la contrazione del derma, rallentando cos? l?invecchiamento cutaneo.
Infine, gli estratti ottenuti dalle cellule della presente invenzione sono privi di sostanze allergizzanti o irritanti (come ad esempio gli alcaloidi, presenti nelle foglie e semi di numerose piante) e presentano un potenziale rischio di reazione allergica negli individui molto basso.
Breve descrizione delle figure
La Figura 1 mostra un grafico a barre che mostra l?effetto dei differenti estratti (idrosolubile, liposolubile e peptidico) di Oenothera biennis secondo la presente invenzione, ciascuno usato a due diverse concentrazioni, sulla produzione di pro-collagene I in fibroblasti umani (HDF). La misura ? stata effettuata mediante saggio ELISA, utilizzando un anticorpo specifico contro il pro-collagene I. Come controllo positivo ? stato usato il TGF- ?, fattore noto per le sue propriet? di stimolare la produzione di collagene. Le barre rappresentano le deviazioni standard mentre gli asterischi indicano variazioni significative (*p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001).
La Figura 2 mostra un grafico a barre che riporta l?effetto dell?estratto idrosolubile di Oenothera biennis secondo la presente invenzione sull?espressione del gene Mylk, che codifica per l?enzima chinasi responsabile della fosforilazione della catena leggera della miosina, uno dei componenti del citoscheletro cellulare. Il fattore TGF- ? ? stato utilizzato come controllo positivo. Le barre rappresentano le deviazioni standard mentre gli asterischi indicano variazioni significative.
La Figura 3 mostra un grafico a barre che riporta la capacit? dell?estratto idrosolubile di Oenothera biennis della presente invenzione, usato a due diverse concentrazioni, di promuovere la polimerizzazione dell?actina in fibroblasti umani HDF, sia in presenza che in assenza di ML7 (25 ?M), inibitore dell?attivit? dell?enzima MYLK. Come controllo positivo ? stato usato il TGF-?, coinvolto nella regolazione dei filamenti di actina. La Citocalasina B, una micotossina nota per le sue funzioni di inibire la polimerizzazione dei filamenti di actina, ? stata utilizzata per inibire la polimerizzazione dell?actina in tutte le cellule. Le barre rappresentano le deviazioni standard mentre gli asterischi indicano variazioni significative.
La Figura 4 mostra un grafico a barre che riporta la capacit? di fibroblasti umani di contrarre un dischetto di gel a base di collagene bovino, in seguito al trattamento con l?estratto idrosolubile di Oenothera biennis della presente invenzione, sia in presenza che assenza di ML7 25 ?M. Come controllo positivo ? stato usato il TGF- ?. Le barre rappresentano le deviazioni standard mentre gli asterischi indicano variazioni significative.
La Figura 5 mostra un grafico a barre che riporta l?effetto dell?estratto idrosolubile di Oenothera biennis della presente invenzione, usato a due diverse concentrazioni, sulla produzione di periostina e tropo-elastina in fibroblasti umani HDF. La misura ? stata effettuata mediante saggio ELISA, utilizzando un anticorpo specifico rispettivamente contro la periostina e tropo-elastina. Come controllo positivo ? stato usato il TGF- ?. Le barre rappresentano le deviazioni standard mentre gli asterischi indicano variazioni significative.
La Figura 6A e la Figura 6B mostrano grafici a barre che riportano l?effetto dell?estratto idrosolubile di Oenothera biennis della presente invenzione, testato a diverse concentrazioni, sulla capacit? di aumentare la produzione di MYLK (Fig. A) e tropo-elastina (Fig. B) in espianti di pelle umana, ottenuti da pazienti di sesso femminile e di et? compresa tra i 44 e 47 anni; la quantizzazione di MYLK e tropo-elastina ? stata effettuata mediante rivelazione con anticorpo marcato con fluoroforo.
La Figura 6C e la Figura 6D mostrano fotografie di sezioni di pelle in cui sono state marcate con anticorpo specifico le proteine MYLK e tropo-elastina, sia prima che dopo il trattamento con l?estratto di Oenothera alle 2 diverse concentrazioni. La sigla ?merge? indica la sovrapposizione delle fotografie dove si evidenzia la fluorescenza della proteina specifica con quelle in cui i nuclei sono stati colorati con 4',6-diamidin-2-fenilindolo (Dapi). Gli espianti vengono manipolati in accordo con le Dichiarazioni di Helsinki e dietro rilascio del consenso informato delle pazienti sottoposte all?intervento.
Descrizione dettagliata
La Richiedente ha trovato di particolare interesse per il campo cosmetico degli estratti da colture di cellule vegetali della specie Oenothera biennis, in particolare un estratto idrosolubile, un estratto liposolubile e un estratto ricco di peptidi e zuccheri, che si sono dimostrati essere sorprendentemente attivi nel promuovere la produzione di componenti della matrice extracellulare della pelle e nello stimolare la capacit? contrattile delle cellule, con un conseguente potenziale rallentamento del processo di invecchiamento cutaneo.
In particolare, quando testati sulle cellule della pelle, gli estratti di O. biennis della presente invenzione hanno determinato un aumento dell'espressione e della produzione di MYLK.
Con particolare riferimento all?estratto idrosolubile derivato dalle colture cellulari secondo la presente invenzione, le Richiedenti hanno trovato che esso ? vantaggiosamente in grado di stimolare la polimerizzazione dell'actina, di aumentare la produzione di fattori regolati dalla via di T?RII, come CCN2, collagene I e III, tropoelastina e periostina, suggerendo che questo estratto sia in grado di indurre la sintesi delle proteine della matrice cellulare aumentando la capacit? di contrazione cellulare.
Inoltre, l?estratto idrosolubile ha sorprendentemente mostrato un effetto anti-invecchiamento su espianti di pelle umana, mediante studi ex vivo di ImmunoHistoFluorescence, come mostrato negli Esempi.
In particolare, gli estratti di Oenothera biennis della presente invenzione presentano un?azione di stimolazione della sintesi delle componenti della matrice extra-cellulare (la cosiddetta azione ?matrix boosting?) che li rende vantaggiosamente adatti nella dermocosmesi per la prevenzione e il trattamento degli inestetismi della pelle dovuti all?invecchiamento.
Dopo aver ottenuto le cellule indifferenziate sottoforma di ?callo? da tessuti fogliari, sono state ottenute colture di cellule in mezzo liquido, le quali sono state processate al fine di ottenere tre diversi tipi di estratti: idrosolubile, liposolubile e frazione di zuccheri/peptidi dalle pareti cellulari
Vantaggiosamente, le colture cellulari dell?invenzione, ottenute mediate la tecnica ?plant tissue culture? discussa di seguito, possiedono un?elevata capacit? biosintetica di classi di metaboliti secondari ad elevato potere antiossidante e benefico per la pelle.
Le colture cellulari sono ottenute a partire da dischi fogliari di Oenothera biennis mediante induzione della formazione dei calli su substrato solido.
Le cellule cos? ottenute vengono allestite e fatte crescere in colture liquide che possono essere sottoposte a trattamenti con composti chimici (ad esempio, sali, zuccheri, vitamine, sostanze ad azione ossidante, fito-ormoni) e/o fattori fisici (ad esempio, irradiazioni UV, calore, freddo, stress osmotico) per stimolare la produzione di metaboliti secondari di interesse e aumentare l?efficacia cosmetica degli estratti derivati.
Le cellule delle colture cos? ottenute vengono quindi sottoposte a rottura meccanica tramite omogeneizzazione in una soluzione acquosa salina, cos? da ottenere un omogenato.
Con il termine ?omogeneizzazione? si intende un trattamento di frammentazione del materiale vegetale, che avviene in un contenitore idoneo quale un mortaio di ceramica mediante un pestello anch?esso di ceramica, precedentemente raffreddati, o per volumi maggiori si possono utilizzare recipienti pi? grandi anche metallici dove il materiale pu? essere omogeneizzato con lame metalliche, utilizzando sia frullatori da laboratorio o industriali sia presse.
L?omogenato viene quindi separato in una parte liquida e un residuo solido mediante centrifugazione dell?omogenato per precipitare le componenti insolubili.
Il sopranatante ottenuto dalla centrifugazione viene prelevato: esso costituisce l'estratto idrosolubile.
Met? del residuo insolubile ottenuto in seguito alla suddetta fase di centrifugazione ? risospeso in un solvente lipofilo (come trigliceridi, oli, alcoli, esteri); La sospensione viene centrifugata per allontanare il materiale non disciolto e il sopranatante prelevato: esso costituisce l?estratto lipofilo.
L?altra met? del pellet viene prima trattato con EDTA, risospeso in una soluzione acida (confermate?) e poi bollito, allo scopo di idrolizzare e portare in soluzione tutti gli zuccheri delle glicoproteine delle pareti cellulari. Dopo digestione enzimatica, la sospensione viene centrifugata in modo da ottenere una soluzione trasparente: essa costituisce l?estratto idrofilo ricco di peptidi e zuccheri derivati dalle pareti cellulari.
Gli estratti suddetti idrosolubile, liposolubile e quello ricco in zuccheri e peptidi sono portati a secco in un liofilizzatore, un rotoevaporatore, una camera di essiccazione o uno spray-dryer per eliminare il solvente. La polvere o la pasta semisolida ottenuta viene risospesa in acqua (frazione idrosolubile e frazione ricca in peptidi/zuccheri) o in solventi organici compatibili con le formulazioni cosmetiche (frazione liposolubile) alla concentrazione desiderata.
Formano altres? oggetto dell?invenzione composizioni cosmetiche comprendenti l?estratto della presente invenzione ed eventualmente veicoli, solventi, eccipienti e/o adiuvanti cosmeticamente accettabili. Tali composizioni possono essere in forma di gel, creme, lozioni cosmetiche per l?applicazione cutanea.
Preferibilmente, il solvente ? un solvente idrofilo, preferibilmente scelto tra acqua e soluzioni acquose saline, oppure uno o pi? solventi organici compatibili con le formulazioni cosmetiche, pi? preferibilmente scelto tra alcoli, glicerolo, acidi organici, ammidi, ammine, aldeidi o chetoni, o una combinazione dei due tipi di solvente, se miscibili fra loro.
La presente invenzione si riferisce altres? all?uso cosmetico della composizione succitata per il trattamento degli inestetismi dovuti all?invecchiamento cutaneo e per produrre un effetto di ringiovanimento dei tessuti della pelle.
Queste composizioni rappresentano la materia prima che viene aggiunta ai formulati per la fabbricazione dei prodotti cosmetici o dermatologici pronti per le applicazioni.
A titolo esemplificativo e non limitativo della presente invenzione, si riportano di seguito alcuni esempi relativi alla preparazione delle colture di cellule vegetali della specie Oenothera biennis. Inoltre, si riporta un esempio di preparazione di un estratto secondo la presente invenzione, ed esperimenti che dimostrano l?attivit? biologica di tale estratto in campo cosmetico.
ESEMPI ESEMPIO 1 - Metodo per la preparazione degli estratti derivati da colture di cellule vegetali della specie Oenothera biennis secondo la presente invenzione.
Vengono di seguito riportare le fasi del metodo per la preparazione dell?estratto idrosolubile, liposolubile e quello ricco di peptidi e zuccheri, derivati da colture di cellule vegetali della specie Oenothera biennis secondo la presente invenzione.
Allestimento delle colture cellulari.
A partire da pezzi di foglia di piantine giovani appartenenti alle specie Oenothera biennis sono state allestite colture di calli vegetali su mezzo solido.
In particolare, le foglie intere di Oenothera biennis sono state sterilizzate con etanolo al 70% (in acqua v/v) per 15 minuti, e 1% ipoclorito di sodio (in acqua v/v), per altri 15 minuti. Dopo essere state lavate per 3 volte in acqua per rimuovere l?alcol e l?ipoclorito, le foglie sono state tagliate in pezzi di dimensioni 5 mm x 5 mm che sono stati posti su substrato solido ?B5 Gamborg medium?, contenente ?plant agar? (7,5 mg/L), mio-inositolo (500 mg/L), saccarosio (30 g/L) e portato a pH 5,7 mediante l?utilizzo di KOH (0,1 N). Il mezzo di coltura sterilizzato mediante autoclave ? stato poi addizionato con acido 2,4 Diclorofenossiacetico (1 mg/L), adenina (1 mg/L) e kinetina (0,01 mg/L). Dopo circa 5 settimane di incubazione a 20?C al buio, sono stati ottenuti i calli che sono stati poi trasferiti in mezzo liquido per ottenere le colture.
Crescita delle colture liquide.
Calli del diametro di circa 1 cm e del peso di circa 50 mg ciascuno sono stati prelevati e dispersi in beute contenenti 50 ml dello stesso mezzo sopra descritto ma senza agar e con una concentrazione di kinetina pari 0,1 mg/L. Le beute sono state poste al buio su uno shaker con agitazione orbitale di 120 rpm e dopo circa 10 giorni i calli hanno iniziato a disgregarsi e formare colture cellulari omogenee, cio? comprendenti cellule singole o piccoli aggregati di cellule.
Raccolta delle cellule.
Al raggiungimento di una coltura con densit? di circa 150 g/L in beuta da 2 L, le cellule sono state allontanate dal mezzo di coltura mediante filtrazione (filtri con porosit? di 80-100 ?m), lavate con acqua distillata e subito congelate a -80?C.
Preparazione dell?estratto idrosolubile.
200g di cellule congelate di Oenothera biennis sono state omogeneizzate mediante l?utilizzo dell?omogeneizzatore metallico Grindomix (Retsch) con 200 ml di tampone PBS (Phosphate Buffer Saline) concentrato 3x. Il lisato cellulare omogeneo cos? ottenuto ? stato centrifugato a 5000 rpm per 10 minuti a 4?C e il sopranatante, che costituisce l?estratto idrosolubile, ? stato filtrato utilizzando un filtro di cellulosa con porosit? 80-100 ?m e verificando il pH, che deve essere compreso tra 6 e 7. L?estratto cos? ottenuto ? stato congelato a -80?C e successivamente liofilizzato per circa 3 giorni in modo da ottenere una polvere fine. La polvere ottenuta (resa di circa 1,8%) ? stata sciolta in acqua distillata sterile alla concentrazione del 10%, e poi ulteriormente diluita alla concentrazione richiesta da ogni tipo di saggio biologico.
Preparazione dell?estratto liposolubile.
Il residuo solido ottenuto dopo centrifugazione del lisato cellulare (pellet) ? stato diviso in 2 parti: una met? ? stato estratto nel solvente lipofilo ?Caprylic/Capric Triglyceride? (nome commerciale Myritol, CAS 73398-61-5) in un rapporto 1:10 (peso/volume), ad una temperatura di 70?C, per un tempo di 2 ore in continua agitazione. La sospensione ? stata trattata con filtri di porosit? 80-100 ?m per eliminare la parte corpuscolare: il filtrato ha costituito l?estratto lipofilo.
Preparazione dell?estratto di peptidi e zuccheri.
L?altra met? del pellet (contenente le pareti cellulari) ? stato trattato con 2 volumi di una soluzione di EDTA 2 mM e portato a 100?C per 20 minuti. Dopo raffreddamento, l?estratto ? stato filtrato attraverso filtri di cellulosa con porosit? 80-100 ?m, lavato e nuovamente filtrato per eliminare l?EDTA. Il pellet ? risospeso in 2 volumi di una soluzione di HCl 0,1 N e poi bollito (100?C) per 1 ora, allo scopo di idrolizzare e portare in soluzione tutti gli zuccheri delle glicoproteine delle pareti cellulari.
Dopo la bollitura, il campione ? stato raffreddato (in ghiaccio) e poi digerito enzimaticamente in 2 volumi di HCl 0,1 N a 37?C per 16 ore con pepsina. Al termine della digestione enzimatica, la sospensione ? stata centrifugata in modo da ottenere una soluzione trasparente e portata a pH 6.5 con NaOH 10 N. Questa ha costituito l?estratto ricco di peptidi e zuccheri derivati dalle pareti cellulari.
ESEMPIO 2 - Saggio di citotossicit?.
Allo scopo di determinare le concentrazioni degli estratti idrosolubile, lipofilo e quello ricco di zuccheri e peptidi della presente invenzione da utilizzare per i successivi saggi, ? stato condotto un saggio di citotossicit? per determinare l?intervallo di concentrazioni in cui i suddetti estratti risultassero non dannosi alle cellule in fase di crescita.
Questo saggio di citotossicit? si basa sull?uso del composto MTT [3-(4,5-dimetiltiazolil)-2,5-difeniltetrazolio-bromuro], descritto per la prima volta da Mosman nel 1983. Esso ? basato sulla capacit? dell?enzima deidrogenasi mitocondriale delle cellule vitali di idrolizzare l?anello tetrazolico dell?MTT (di colore giallo chiaro) e formare cristalli di formazano (di colore blu scuro). Tali cristalli sono impermeabili alle membrane cellulari e si accumulano nel citoplasma delle cellule metabolicamente attive. Il numero di cellule vive e sane ? cos? direttamente proporzionale alla quantit? di formazano prodotto.
Cellule HDF (fibroblasti umani adulti), in numero iniziale di 1 x 10<4 >per pozzetto, sono state cresciute in piastre da 96 pozzetti nel mezzo di coltura DMEM (Dulbecco?s Modified Eagle Medium) (Lonza), completato con il 10% di siero bovino fetale, per circa 8 ore. Dopo il trattamento con concentrazioni crescenti degli estratti comprese tra 0,05% e 0,0004% (500 ?g/ml e 4 ?g/ml) per circa 48 ore, le cellule sono state lavate in PBS ed incubate con 100 ?l/pozzetto di ?tampone di reazione? contenente: 10 mM di Hepes, 1,3 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, 5 mM di glucosio e 0,5 mg/ml di substrato colorimetrico MTT in tampone PBS a pH 7,4. Dopo 3 ore di incubazione a 37?C, 5% CO2, ad ogni pozzetto sono stati aggiunti 100 ?l di soluzione solubilizzante contenente 10% di Triton-X100, 0,1 N di HCl in isopropanolo assoluto. Dopo un periodo di incubazione di 16 ore, la reazione colorimetrica ? stata misurata a 595nm con il lettore di piastre Victor3. I risultati del MTT hanno indicato che concentrazioni di estratto uguali o inferiori a 0,01%, 0,1% e 0,03%, rispettivamente per l?estratto idrosolubile, liposolubile e quello di peptidi/zuccheri, non hanno causato nessuna tossicit? sulle cellule.
ESEMPIO 3 - Analisi della sintesi del pro-collagene I.
8 x 10<3 >di cellule HDF per pozzetto sono state cresciute in piastre da 96 pozzetti in mezzo di coltura DMEM con FBS al 10%. Il giorno successivo ? stato aggiunto DMEM fresco con FBS al 2% con due diverse concentrazioni dell?estratto di Oenothera biennis (0,002% e 0,006%) e con TGF- ?, fattore noto per le sue propriet? di stimolare la produzione di collagene.
Le concentrazioni testate sono state: 0,002% e 0,006% per l?estratto idrosolubile (idro); 0,02% e 0,06% per quello liposolubile (lipo) e 0,0002% e 0,0006% per quello ricco di peptidi e zuccheri (pept/zuccheri).
Dopo 24 ore, le cellule sono state lavate con PBS e poi fissate in paraformaldeide 4% per 10 minuti. Le cellule sono state lavate con ?wash buffer? (PBS 1x, 0,5 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 0,1% Triton) per 3 volte e incubate con ?blocking buffer? con una soluzione di 3% di siero albumina bovina (BSA) in ?wash buffer? per 30 minuti in agitazione. Dopo un lavaggio in ?wash buffer?, le cellule sono state incubate con l?anticorpo primario monoclonale di topo anti-procollagene di tipo I (sc-166572, Santa-Cruz Biotechnology) 1:100 in ?wash buffer? contenente BSA 1%. Dopo 2 ore in agitazione, le piastre sono state lavate per 3 volte con ?wash buffer? ed incubate con l?anticorpo secondario anti-topo marcato con perossidasi (170-6516, Biorad) 1:1000 in ?wash buffer? contenente BSA 1%. Dopo 1 ora di incubazione, la piastra ? stata lavata con ?wash buffer? per 3 volte. La reazione colorimetrica ? stata sviluppata aggiungendo 100 ?l di una soluzione acquosa di OPD (O-fenilendiammina) 0,35 mg/ml in buffer citrato 50mM e perossido di idrogeno (H2O2) 0,012%. Dopo 30 minuti, ? stata misurata l?assorbanza a 490 nm.
Come mostrato nella Figura 1, i trattamenti con gli estratti secondo la presente invenzione hanno indotto la produzione di collagene I, in particolare la concentrazione pi? bassa di ogni estratto ha prodotto un aumento nella produzione di collagene di circa 66%, 45% e 22% rispettivamente.
In particolare, l?estratto idrosolubile della presente invenzione ? stato quello che ha mostrato la migliore capacit? di stimolazione della produzione di pro-collagene I.
ESEMPIO 4 - Analisi dell?espressione del gene Mylk in fibroblasti umani.
L?estratto idrosolubile di Oenothera (Ob-idro), che ? risultato pi? efficace nell?induzione del collagene I, ? stato analizzato nei successivi esperimenti su colture cellulari ed espianti di pelle.
1 x 10<5 >di cellule HDF per pozzetto sono state cresciute in piastre da 6 pozzetti in mezzo di coltura DMEM (Gibco), supplementato con 10% di Siero Bovino Fetale (FBS) per 20 ore. Il giorno dopo il mezzo ? stato sostituito con DMEM al 2% FBS per 24 ore. Il terzo giorno sono stati aggiunti i trattamenti in mezzo con 0,5% FBS e con le diverse concentrazioni (0,002% e 0,006%) dell?estratto idrosolubile di Oenothera biennis e il TGF-? 2,5 ng/ml utilizzato come controllo positivo, seguita da un?incubazione di 2 ore.
Per l?estrazione dell?RNA dai campioni di cellule ? stato utilizzato il kit ?GenElute? Total RNA Purification? acquistato dalla ditta Merck. Dopo i trattamenti indicati, le cellule sono state lavate con PBS, raccolte in buffer di lisi e sottoposte alla procedura di estrazione come da protocollo del kit. I campioni sono stati sottoposti al trattamento con DNasi I (Ambion) a 37?C per 30 minuti, per rimuovere il DNA genomico contaminante. 2 ?l di ciascun campione sono stati caricati su gel di agarosio 1% in presenza di ?loading dye? denaturante allo scopo di quantizzare la quantit? di RNA in riferimento ad uno specifico marker per RNA (ThermoScientific). Per la quantizzazione ? stato usato il software GeneTools (PerkinElmer).
300ng di RNA totale ? stato retro-trascritto usando l?enzima Trascrittasi inversa (ThermoScientific). Le reazioni di RT-PCR semiquantitativa sono state condotte utilizzando come standard interni la coppia di primer universali 18S primer/competimer (Ambion) in rapporto 3:7. I prodotti di PCR sono stati separati su gel d?agarosio 1,5%, visualizzati utilizzando lo strumento Geliance (PerkinElmer) ed analizzati per via densitometrica utilizzando il software Genetools. I valori riportati nei grafici rappresentano il rapporto tra l?intensit? della banda relativa al gene in analisi e quella della banda relativa allo standard di riferimento 18S, in modo da avere un valore normalizzato per ciascun trattamento. I valori sono stati poi convertiti in percentuale (%), fissando il valore ottenuto dal controllo non trattato come 100%. Le sequenze dei primers usati per l?amplificazione erano le seguenti:
Hs Mylk diretto (for): SEQ ID NO 1
Hs Mylk inverso (rev): SEQ ID NO 2
I risultati mostrati in Figura 2 mostrano che il trattamento delle cellule HDF con l?estratto idrosolubile della presente invenzione, ad entrambe le concentrazioni utilizzate, ha prodotto un aumento dell?espressione genica del fattore MYLK di circa il 50%.
ESEMPIO 5 - Analisi del grado di polimerizzazione dell?actina. I risultati ottenuti nell?Esempio 4 hanno spinto le Richiedenti ad investigare sulla capacit? dell?estratto idrosolubile della presente invenzione di stimolare la polimerizzazione dell?actina, importante componente del citoscheletro cellulare e coinvolto nei processi di contrazione.
1,5 x 10<5 >di cellule HDF per pozzetto sono state cresciute in una piastra da 24 pozzetti in mezzo di coltura DMEM addizionato con 10% FBS. Il giorno successivo, ? stato aggiunto DMEM con 2% FBS e la Citocalasina B 2 ?M per 30 minuti; la Citocalasina B un potente inibitore della polimerizzazione dell?actina ed ? stato utilizzato nel presente test allo scopo di promuovere un?inibizione momentanea della polimerizzazione di actina in tutti i pozzetti. Trascorsi i 30 minuti, le cellule sono state lavate con PBS e aggiunti i trattamenti contenenti le diverse concentrazioni (0,002% e 0,006%) dell?estratto idrosolubile di Oenothera biennis, il TGF- ? 2,5 ng/ml, utilizzato come controllo positivo, e ML7 25 ?M con e senza i trattamenti, come controllo negativo dell?enzima MYLK. Dopo 30 minuti dal trattamento, le cellule sono state lavate con PBS freddo e fissate con 4% paraformaldeide (PFA) in buffer fosfato per 30 minuti in ghiaccio. Le cellule sono state lavate con PBS e permeabilizzate con una soluzione di buffer fosfato e Triton-X100 allo 0,2% per 30 minuti. Successivamente, le cellule sono state lavate con PBS e incubate con una soluzione di buffer fosfato e 0,4 ?M di falloidina coniugata con la rodamina (Santa-Cruz Biotechnology) per 1 ora al buio.
Le cellule sono state lavate 3 volte con PBS e aggiunti 300 ?l di metanolo assoluto. Al tempo 0 e dopo 18h, ? stata misurata la fluorescenza 540/570 nm mediante il lettore di piastra Victor3 (PerkinElmer). I valori riportati nel grafico rappresentano il rapporto tra l?intensit? di fluorescenza dei vari trattamenti rispetto al controllo non trattato e convertiti in percentuale, attribuendo un valore di 100% al suddetto controllo non trattato.
Il trattamento con l?estratto idrosolubile della presente invenzione, ad entrambe le concentrazioni testate, ha prodotto un aumento della quantit? di actina polimerica di circa 50%, rispetto al 33% del TGF-?, usato come controllo positivo nel test.
L?aggiunta di ML7, inibitore dell?attivit? di MYLK, ha annullato questo aumento, sia quello prodotto dall?estratto della presente invenzione sia quello prodotto da TGF-?, suggerendo un coinvolgimento di MYLK nella polimerizzazione dei filamenti di actina (Figura 3).
ESEMPIO 6 - Analisi della capacit? di contrazione di una matrice di collagene.
Questo protocollo permette di valutare l?attivit? di composti o estratti di aumentare la capacit? contrattile delle fibre di collagene, utilizzando dischetti formati da gel di collagene (Jin et al., 2015). 2,0 x 10<5 >di cellule HDF sono state risospese in mezzo di crescita DMEM 5x (Gibco) in una piastra da 24 pozzetti, e una soluzione 2 mg/ml di collagene, proveniente da pelle bovina (Sigma-Aldrich), ? stata aggiunta a ciascun pozzetto. Il pH della soluzione ? stato aggiustato a 7,2 con NaOH 0,5 N. La piastra ? stata incubata a 37?C per 45 minuti, per permettere la solidificazione del gel di collagene. Successivamente ? stato aggiunto DMEM addizionato con 10% FBS e/o ML7 25 ?M, inibitore della proteina MYLK. Al mattino successivo, ? stato eliminato ML7 e sono stati aggiunti in DMEM con 2%FBS le due concentrazioni (0,002% e 0,006%) dell?estratto idrosolubile di Oenothera biennis o TGF- ? 2,5 ng/ml, utilizzato come controllo positivo. Il dischetto di collagene formatosi ? stato immediatamente staccato dal pozzetto mediante l?utilizzo di una microspatula sterile allo scopo di promuoverne la contrazione. Le aree del dischetto di ciascun trattamento sono state misurate al tempo 0 e a 5 ore ed analizzate utilizzando il software ImageJ. I valori riportati in grafico rappresentano il rapporto tra il tempo 0 e il tempo a 5 ore. Essi sono stati poi convertiti in percentuale (%), fissando il valore ottenuto dal controllo non trattato come 100%.
Come mostrato in Figura 4, l?estratto idrosolubile, alla concentrazione pi? bassa, ha indotto un significativo aumento della contrazione del disco di collagene, suggerendo un potenziale effetto di aumento della compattezza della pelle. Anche in questo caso il trattamento con l?inibitore ML7 ha annullato tale aumento, indicando che sia l?estratto testato che il TGF-? agiscono attraverso MYLK per la contrazione del dischetto di collagene.
ESEMPIO 7 - Analisi della sintesi di periostina e tropoelastina. ? stato valutato se l?estratto idrosolubile della presente invenzione era in grado di stimolare anche altre importanti componenti della matrice dermica da parte dei fibroblasti, come periostina e tropoelastina.
8 x 10<3 >di cellule HDF per pozzetto sono state cresciute in piastre da 96 pozzetti in mezzo di coltura DMEM con FBS al 10%. Il giorno successivo ? stato aggiunto DMEM fresco con FBS al 2% e le due dosi (0,002% e 0,006%) dell?estratto idrosolubile di Oenothera biennis o TGF-??2,5 ng/ml, utilizzato come controllo positivo.
Dopo 24 ore, i surnatanti delle cellule sono stati prelevati e trasferiti in un?altra piastra da 96 pozzetti. Per l?analisi della tropoelastina ? stato aggiunto Hepes 30mM a tutti i pozzetti e incubati a 37?C per 3 ore. Dopo un?ulteriore incubazione per una notte a 4?C di tutti i pozzetti per permettere alle proteine di attaccarsi alla piastra, il surnatante ? stato eliminato e le proteine sono state lavate con PBS 1x e 0,1% Tween20 e incubate con l?anticorpo primario di topo anti-periostina (sc-398631, Santa-Cruz Biotechnology) 1:200 in PBS e 0,1% Tween20 oppure con l?anticorpo primario di coniglio anti-tropoelastina (ab21600, Abcam) 1:1000 in PBS e 0,1% Tween20 per 2 ore a 37?C. Le piastre sono state lavate per 3 volte con PBS e 0,1% Tween20 per 3 volte ed incubate con l?anticorpo secondario anti-topo marcato con perossidasi (170-6516, Biorad) 1:1000 in PBS e 0,1% Tween20 oppure con l?anticorpo secondario anti-coniglio marcato con perossidasi (170-6515, Biorad) 1:1000 in PBS e 0,1% Tween20. Dopo 1 ora di incubazione, la piastra ? stata lavata con PBS e 0,1% Tween20 per 3 volte. La reazione colorimetrica ? stata sviluppata aggiungendo 100 ?l di una soluzione acquosa di OPD (O-fenilendiammina) 0,35 mg/ml in buffer citrato 50mM e perossido di idrogeno (H2O2) 0,012%. Dopo 30 minuti, ? stata misurata l?assorbanza a 490nm.
Come mostrato in Figura 5, il trattamento delle cellule con l?estratto idrosolubile della presente invenzione, alle due concentrazioni testate, ha indotto la produzione sia di periostina che tropoelastina, analogamente al fattore TGF-?, usato come controllo positivo nell?esperimento.
ESEMPIO 8 - Analisi di MYLK e tropo-elastina in espianti di pelle.
Espianti di pelle umana sono stati ottenuti da interventi di chirurgia estetica (mastoplastica o addomino-plastica) di pazienti, di sesso femminile e di et? compresa tra i 44 e 47 anni. Tutte le pazienti hanno rilasciato il consenso informato al trattamento degli espianti per scopi di ricerca.
Gli espianti sono stati tagliati uniformemente con curette da 8mm e cresciuti in DMEM con il 10% FBS, penicillina/streptomicina (100U/ml e 100?g/ml, rispettivamente) e gentamicina/amfotericina B (25?g/ml e 250ng/ml, rispettivamente) in piastre da 24 pozzetti. I dischetti cos? ottenuti sono stati trattati con 0,002% e 0,006% di estratto idrosolubile di Oenothera biennis per 24 ore. I dischetti sono stati lavati in PBS e incubati in 15% saccarosio, poi in 30% saccarosio e infine congelati in O.C.T. (mezzo di inclusione per il congelamento). Sezioni da 10 ?m sono state ottenute utilizzando il criostato CM1520 (Leica Microsystems). I vetrini con le criosezioni sono stati idratati per 30 minuti in PBS e messi in una soluzione di ?blocking? (6%BSA, 5% siero, 20mM MgCl2, 0,2% Tween) per 1 ora. Le criosezioni sono state incubate con l?anticorpo primario di coniglio anti-MYLK (1:100, GeneTex) e l?anticorpo primario di coniglio anti-tropoelastina (1:1000 ab21600, Abcam) per 16 ore a 4?C. I vetrini sono stati lavati con PBS per 30 minuti e poi incubati con l?anticorpo secondario Alexa-Fluor 546 anti-coniglio (1:1000; A11035 ThermoFisher) per 1 ora. I nuclei sono stati colorati con DAPI (4?,6-diamidino-2-phenylindole) 1?g/ml in PBS per 10min. Le immagini sono state acquisite con microscopio a fluorescenza ed analizzate con il software ImageJ.
Come evidenziato dai grafici riportati alle Figure 6A e 6B, nonch? nelle relative fotografie riportate alle figure 6C e 6D, l?estratto idrosolubile della presente invenzione ha prodotto un aumento significativo della produzione sia del fattore MYLK (Fig. 6A e 6C) che di tropoelastina (Fig. 6B e 6D), suggerendo un potenziale effetto antiinvecchiamento dell?estratto testato sulla pelle, particolarmente efficace nell?aumentare la compattezza della pelle agendo sulle componenti proteiche della matrice dermica.
Claims (17)
1. Uso cosmetico di almeno un estratto derivato da colture di cellule vegetali di Oenothera biennis per la prevenzione e il trattamento di inestetismi dovuti all?invecchiamento cutaneo.
2. Procedimento per la preparazione di almeno un estratto da colture di cellule vegetali di Oenothera biennis, comprendente le fasi di:
a) omogeneizzare colture di cellule vegetali di Oenothera biennis in una soluzione acquosa salina, ottenendo un omogenato;
b) separare la parte solida di detto omogenato dalla parte liquida, che costituisce un estratto idrosolubile.
3. Procedimento secondo la rivendicazione 2, in cui dette colture di cellule vegetali di Oenothera biennis sono ottenute prelevando tessuto vegetale da piante di Oenothera biennis, inducendo la formazione di calli da detto tessuto su un substrato solido, prelevando detti calli e allestendo colture liquide da essi.
4. Procedimento secondo la rivendicazione 2 o 3, in cui detta fase b) di separare la parte solida di detto omogenato dalla parte liquida ? eseguita mediante centrifugazione, sedimentazione o filtrazione.
5. Procedimento secondo una qualunque delle rivendicazioni 2-4, comprendente la fase ulteriore di estrarre detta parte solida con un solvente lipofilo, ottenendo un estratto liposolubile.
6. Procedimento secondo una qualunque delle rivendicazioni 2-4, comprendente la fase ulteriore di trattare detta parte solida con enzimi proteolitici in soluzione acida, ottenendo un estratto ricco in peptidi e zuccheri.
7. Uso secondo la rivendicazione 1, in cui detto almeno un estratto ? un estratto idrosolubile ottenuto mediante il procedimento secondo una qualunque delle rivendicazioni 2-4.
8. Uso secondo la rivendicazione 1, in cui detto almeno un estratto ? un estratto liposolubile ottenuto mediante il procedimento secondo la rivendicazione 5.
9. Uso secondo la rivendicazione 1, in cui detto almeno un estratto ? un estratto ricco in peptidi e zuccheri ottenuto mediante il procedimento secondo la rivendicazione 6.
10. Uso secondo la rivendicazione 1, in cui detto almeno un estratto comprende almeno due dei tre estratti definiti nelle rivendicazioni 7-9 e preferibilmente tutti e tre.
11. Composizione comprendente un estratto idrosolubile ottenuto mediante il procedimento secondo una qualunque delle rivendicazioni 2-4 e/o un estratto liposolubile ottenuto mediante il procedimento secondo la rivendicazione 5 e/o un estratto ricco in peptidi e zuccheri ottenuto mediante il procedimento secondo la rivendicazione 6.
12. Composizione secondo la rivendicazione 11, contenente, per una parte in peso di detto estratto idrosolubile, da 0,01 a 100, preferibilmente 1, parti in peso di detto estratto liposolubile e, indipendentemente, da 0,01 a 100, preferibilmente 0,1, parti in peso di detto estratto ricco in peptidi e zuccheri.
13. Composizione secondo la rivendicazione 12, contenente, per una parte in peso di detto estratto idrosolubile, una parte in peso di detto estratto liposolubile e 0,1 parti in peso di detto estratto ricco in peptidi e zuccheri.
14. Composizione secondo una qualunque delle rivendicazioni 11-13, comprendente ulteriormente almeno un solvente idrofilo scelto dal gruppo comprendente acqua, soluzioni acquose saline, solventi organici, preferibilmente oli, alcoli, glicerolo, acidi organici, ammidi, ammine, aldeidi e chetoni.
15. Uso cosmetico di una composizione secondo una qualunque delle rivendicazioni 11-14 per la prevenzione e il trattamento di inestetismi dovuti all?invecchiamento cutaneo.
16. Formulazione cosmetica comprendente almeno un estratto come definito in una qualunque delle rivendicazioni 1, 7-10 o una composizione secondo una qualunque delle rivendicazioni 11-14 e un veicolo cosmeticamente accettabile.
17. Uso cosmetico di una formulazione secondo la rivendicazione 16 per la prevenzione e il trattamento di inestetismi dovuti all?invecchiamento cutaneo.
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