ITMI20070307U1

ITMI20070307U1 - Analisi diagnostica chde richiede un piccolo campione di fluido biologico

Info

Publication number: ITMI20070307U1
Application number: IT000307U
Authority: IT
Inventors: Robert G Hiltibran; Tung-Ming Huang; Sie Ting Wong
Original assignee: Abbott Lab
Priority date: 1998-06-10
Filing date: 2007-09-14
Publication date: 2008-12-11
Also published as: AU4414599A; AU766762B2; ES2187165T3; WO1999064620A3; CA2334269C; JP2003534526A; DE29924971U1; CA2334269A1; DE69903954T2; WO1999064620A2; DE69903954D1; US6077660A; EP1102991A2; ATE227848T1; EP1102991B1

Description

DESCRIZIONE

Il presente trovato riguarda il campo del controllo della quantità di un analita, per esempio glucosio, colesterolo, in un fluido corporeo. Più in particolare il presente trovato fornisce un articolo e un metodo che controlla la quantità di analita in un fluido corporeo mediante una prova che impiega soltanto un piccolo volume di fluido biologi co.

La prevalenza del diabete sta notevolmente aumentando nel mondo. Attualmente, i diabetici diagnosticati rappresentano circa il 3% della popolazione degli Stati Uniti. Si crede che l'effettivo numero totale dì diabetici negli Stati Uniti sia oltre 16.000.000. Il diabete può portare a numerose complicazioni come per esempio retinopatia, nefropatia e neuropatia.

Il fattore più importante per ridurre le complicazioni associate al diabete è il mantenimento di un appropriato livello di glucosio nella corrente sanguigna. Il mantenimento del livello appropriato di glucosio nella corrente sanguigna può prevenire e anche invertire parecchi degli effetti del diabete.

I dispositivi di controllo del glucosio della tecnica nota hanno operato sul principio di prelevare il sangue da un indivìduo mediante vari metodi, come mediante un ago o una lancetta. Un individuo applica poi una striscia di carta che trasporta il prodotto chimico con il sangue e infine inserisce la striscia imbevuta con il sangue in un dispositivo per la misurazione del glucosio nel sangue per misurare la concentrazione del glucosio in base alla determinazione della variazione della riflettanza.

Vi sono numerosi dispositivi attualmente disponibili ai diabetici per controllare il livello di glucosio nel sangue. Il migliore di detti dispositivi richiede che il diabetico si punga un dito e raccolga una goccia di sangue per posizionarla su una striscia che viene inserita in un monitor che determini il livello di glucosio nel sangue. Pungersi un dito tende ad essere doloroso. Inoltre, il dispositivo di puntura, tipicamente una lancetta o un ago, produce una ferita relativamente ampia. E' noto che il dolore che deriva dalla puntura del dito è un deterrente per i diabetici per quello che riguarda l'osservanza del regime di monitoraggio. La mancanza di osservanza fa aumentare il rischio di complicazioni dovute al diabete. Quindi vi è la necessità di un mezzo meno doloroso e meno traumatico per la raccolta di campioni biologici per il controllo del livello di glucosio nel sangue. Parecchi brevetti hanno proposto che il livello di glucosio nel sangue possa essere controllato misurando il livello di glucosio nel fluido interstiziale. Al fine di ottenere campioni di fluido interstiziale, deve essere superata la funzione di barriera dello strato corneo. Jacques, brevetto USA No. 4.775.361, descrive un metodo per asportare lo strato corneo di una regione della pelle di un paziente usando una luce laser a impulsi con una lunghezza d'onda, una durata dell'impulso, un'energia dell'impulso, un numero di impulsi e una velocità di ripetizione degli impulsi sufficienti ad eliminare lo strato corneo senza danneggiare in modo significativo l'epidermide sottostante. Questo brevetto descrive l'uso di luce laser che ha una lunghezza d'onda di 193 nm o 2.940 nm. La luce laser che ha lunghezze d'onda di 193 nm o 2940 nm può essere fornita da una fonte luminosa a eccimeri o Er.YAG, rispettivamente, entrambe le quali sono estremamente costose,

Tankovich, brevetto U.S.A. No. 5.423.803 descrive un procedimento per la rimozione delle cellule superficiali dell'epidermide nella pelle umana. Alla superficie della pelle viene applicato topicamente un contaminante che ha un elevato assorbimento ad almeno una lunghezza d'onda della luce. Una certa quantità del contaminante viene forzata ad infiltrarsi negli spazi fra le cellule epidermiche superficiali. La sezione di pelle viene illuminata con impulsi laser brevi, almeno uno degli impulsi avendo un'energia sufficiente a far si che alcune delle particelle esplodano lacerando le cellule epidermiche superficiali.

Zahrov, WO 94/09713, descrive un metodo per perforare la pelle che comprende le fasi di (a) focalizzare un fascio laser nella forma di un ellisse alla superficie della pelle con una intensità di energia sufficiente a creare un foro profondo almeno come lo strato di cheratina e profondo al massimo come lo strato di capillari; e (b) creare almeno un foro, ciascun foro avendo un'ampiezza fra 0,05 e 0,5 mm e una lunghezza uguale o inferiore a 2,5 mm.

Si deve notare che è desiderabile che un dispositivo diagnostico per il controllo del glucosio dia un risultato rapidamente. La maggior parte dei dispositivi disponibili in commercio forniscono un risultato in meno di 1 minuto. Questo periodo di 1 minuto trascorre dal momento del posizionamento del dito alla visualizzazione del risultato sul dispositivo di misurazione. Quando come campione si usa il fluido interstiziale, lo scopo di un periodo di esame di 1 minuto è difficile da raggiungere, in quanto i metodi per ottenere il fluido interstiziale forniscono tipicamente campioni di meno di 1 μl per minuto. Al fine di determinare la quantità di glucosio in un campione di fluido interstiziale, si devono impiegare metodi di rivelazione sensibili. E' ben noto che un metodo comune per fare aumentare la sensibilità di un'analisi è di fare aumentare la dimensione del campione biologico. Tuttavia, l'aumento della dimensione di un campione di alcuni fluidi biologici come il fluido interstiziale è risultato essere difficile.

I brevetti USA No. 5.161.532? 5.508,200; 5.202.261 descrivono l’uso di fluidi biologici per determinare la concentrazione di glucosio nel sangue. Il brevetto U.S.A. No. 5.161,532 descrive un sensore per il fluido interstiziale. Il sensore viene applicato alla pelle di una persona o animale per rivelare i componenti chimici del fluido interstiziale. Il sensore comprende un substrato di materiale poroso che permette il passaggio del fluido interstiziale attraverso di esso. Sono previsti almeno due elettrodi. Uno degli elettrodi ha due lati, con un lato montato sul substrato. Questo elettrodo è anche di un materiale poroso per il passaggio del fluido interstiziale da un lato a contatto con il substrato fino al secondo lato, che è generalmente opposto al primo lato. Sul secondo lato, vi è uno strato di prodotto chimico. Lo strato comprende un prodotto chimico per la reazione con un componente del fluido interstiziale. Il prodotto chimico viene miscelato in un agente di mediazione. Gli elettrodi producono una risposta alla reazione di un componente del fluido interstiziale con il composto chimico. Un rivelatore riceve il segnale elettrico generato dagli elettrodi e genera una visualizzazione indicativa della quantità di quel componente nel fluido interstiziale. Secondo questo brevetto, ad una velocità di campionamento di circa 4,5 μl/minuto/cm<2>, gli interi elettrodi possono essere bagnati in meno di 2 secondi.

Il brevetto USA N. 5.508.200 descrive un sistema per un'analisi chimica automatizzata a prestazione elevata che include un fotometro di videocamera con una ruota di filtri a interferenza controllata da un computer. Un sistema fluido eroga un ultramicro campione e volumi di reagente nell'intervallo da 0,05 a 5,0 μl ad un mezzo analitico di supporto. Il mezzo è posizionato in modo preciso rispetto al fotometro mediante un dispositivo di tenuta del mezzo di reazione ad assi X-Y capace di posizionare in modo accurato e preciso le ultramicro macchie di reazione. Il mezzo di reazione può essere costituito da un campione di cellulosa assorbente/strisce di reazione o pozzetti multipli di dimensioni microscopiche. Il sistema dati e di riduzione, controlla reazioni simultanee multiple entro un'area in esame comune del mezzo analitico per fornire rapporti quantitativi finali. Il metodo per effettuare analisi chimiche multiple comporta il posizionamento di piccoli volumi di combinazioni di campione/reagente in posizioni distinte in un'area di esame comune sul mezzo analitico e la misurazione simultanea delle variazioni ottiche risultanti in ciascuna posizione distinta.

Il brevetto USA N. 5.202.261 descrive un dispositivo diagnostico che include un sensore dell'analita conduttivo che comprende una zona di reazione e una zona di rivelazione, in cui la zona di rivelazione include un polimero conduttivo e un assemblaggio di microelettrodi. Il sensore conduttivo permette la rivelazione e la misurazione di un analita predetermi-nato in un campione in esame liquido in cui l'analita predeterminato viene analizzato mediante un'interazione con ossidasi. Un'interazione fra l'analita predeterminato e un enzima ossidasi avviene nella zona di reazione del sensore conduttivo producendo, direttamente o indirettamente un composto dopante che migra alla zona di rivelazione del sensore. La zona di rivelazione del dispositivo è in contatto laminare con la zona di reazione e include uno strato o pellicola di polimero conduttivo che viene ossidato dal composto dopante. Perciò la conduttività del polimero conduttivo, viene cambiata, e la variazione di conduttività dello strato di polimero conduttivo viene rivelata e misurata all’assemblaggio di microelettrodi e viene correlata con la concentrazione dell'analita predeterminato nel campione. Il dispositivo può utilizzare un campione in esame che ha un volume da circa 0,1 μl a circa 5 μl e usualmente inferiore a 1 μl di sangue intero.

EP-A-0422 708 descrive un dispositivo di analisi per analizzare otticamente un analita che comprende una cavità per il campione che viene riempita per capillarità. Il dispositivo viene costruito fissando assieme due lastre trasparenti {almeno una di esse agente come una guida d'onda per la trasmissione della luce) in relazione opposta e distanziata usando tracce di unione costituite da una resina adesiva. Dette tracce di unione hanno due aperture, una per introdurre il campione nella cavità e l'altra per permettere l'uscita dell'aria quando il campione viene caricato nella cella.

Sarebbe desiderabile fornire un mezzo per rivelare la concentrazione del glucosio in piccoli volumi di fluido interstiziale, preferibilmente con un sistema di lettura ottico, in quanto un tale sistema è più sensibile rispetto a un sistema di lettura elettrochimico

Il presente trovato fornisce un articolo e un metodo per controllare la concentrazione del glucosio nel sangue. In un aspetto il presente trovato riguarda un articolo che comprende un elemento a strati multipii che utilizza reagenti capaci di reagire con un analita che interessa. In una forma di realizzazione, l'elemento comprende:

(a) uno strato di base che ha due superiici principali, lo strato di base avendo inoltre un'apertura, un canale di flusso e una camera di lettura ottica, un'estremità del quale canale di flusso comunica con l'apertura nello strato di base e l'altra estremità del quale canale di flusso comunica con la camera di lettura ottica; e

(b) uno strato di rivestimento in contatto faccia a faccia con la superficie principale dello strato di base che contiene l'apertura, lo strato di rivestimento avendo un'apertura in esso per sfiatare l'elemento.

In questa forma di realizzazione, la camera di lettura ottica non si estende completamente attraverso lo strato di base. Il campione viene introdotto nell'apertura dello strato di base e poi fluisce, attraverso il canale dì flusso, nella camera di lettura ottica. I reagenti con cui l'analita nel campione reagisce per formare un prodotto di reazione rivelabile otticamente possono essere disposti nella camera di lettura ottica o possono essere aggiunti al campione prima che il campione entri nella camera di lettura ottica

In una forma di realizzazione preferita, l'elemento comprende

(a) uno strato di nucleo che ha due superfici principali, lo strato di nucleo avendo inoltre un'apertura, un canale di flusso e una camera di lettura ottica, un'estremità del quale canale di flusso comunica con l'apertura nello strato di nucleo e l’altra estremità del quale canale di flusso comunica con la camera di lettura ottica; e (b) uno strato di base a contatto faccia a faccia con una superficie principale dello strato di nucleo; e

(c) uno strato di rivestimento a contatto faccia a faccia con l'altra superficie principale dello strato di nucleo, detto strato di rivestimento avendo un'apertura in esso per sfiatare l'elemento.

In questa forma di realizzazione la camera di lettura ottica si estende completamente attraverso lo strato di nucleo. Il campione viene introdotto nell'apertura nello strato di nucleo e poi fluisce attraverso il canale di flusso, nella camera di lettura ottica. I reagenti con cui l’analita nel campione reagisce per formare un prodotto di reazione rivelabile otticamente possono essere disposti nella camera di lettura ottica o possono essere aggiunti al campione prima che il campione entri nella camera di lettura ottica.

In un altro aspetto il presente trovato riguarda un metodo che comprende le fasi di:

(a) introdurre un campione di fluido biologico, per esempio fluido interstiziale ottenuto dal corpo di un paziente in un articolo che comprende un elemento a strati multipli che ha una camera di lettura ottica come rivendicato nelle rivendicazioni 1 e 13;

(b) lasciare reagire i reagenti con un analita di interesse nel campione; e

(c) misurare la concentrazione dell'analita nel campione mediante uno strumento ottico.

I reagenti possono essere fatti reagire con il campione in una di numerose vie. Si preferisce che i reagenti vengano depositati nella camera di lettura ottica dell’elemento a strati multipli. In alternativa i reagenti possono essere miscelati con il campione, e la miscela di reazione risultante può essere introdotta nell'elemento a strati multipli. Come un'altra alternativa si può introdurre un reagente liquido nell'elemento a strati multipli e poi si può introdurre il campione nell'elemento a strati multipli. L'articolo e il procedimento del presente trovato permettono l'uso di campioni di volume estremamente basso per fornire risultati dell'analisi estremamente sensibili. L'articolo e il procedimento del presente trovato non richiedono l'uso di un'apparecchiatura di erogazione complicata, per esempio pipette di precisione. L'articolo del presente trovato si auto-riempie e può essere riempito con una quantità precisa di campione.

E' stato mostrato che l'articolo fornisce risultati accurati e riproducibili con campioni che hanno un volume così basso come circa 0,25 μl.

La figura 1 è una vista in prospettiva di una forma di realizzazione di un articolo adatto per l'uso nel presente trovato.

La figura 2 è una vista in prospettiva della forma di realizzazione rappresentata in figura 1 con strati presentati staccati.

La figura 3 è una vista parziale in prospettiva di una forma di realizzazione preferita dì un articolo adatto per l'uso nel presente trovato. La vista illustra la porzione funzionale dell'articolo.

La figura 4 è una vista parziale in prospettiva della forma di realizzazione rappresentata in figura 3, con gli strati presentati distaccati. La vista illustra la porzione funzionale dell’articolo.

La figura 5 è una vista dal piano superiore parziale dell'articolo rappresentato nelle figure 3 e 4. La vista illustra la porzione funzionale dell'articolo.

La figura 6 è una vista sul piano di fondo parziale dell'articolo rappresentato nelle figure 3 e 4. La vista illustra la porzione funzionale dell’articolo.

La figura 7 è una vista in sezione trasversale parziale dell’articolo rappresentato nelle figure 3 e 4. La vista illustra la porzione funzionale dell'articolo.

La figura 8 è una vista in prospettiva parziale di un'altra forma di realizzazione di un articolo adatto per l'uso nel presente trovato, con gli strati mostrati distaccati. La vista illustra la porzione funzionale dell'articolo.

La figura 9 è una vista in sezione trasversale parziale dell'articolo rappresentato in figura 8, La vista illustra la porzione funzionale dell'articolo.

La figura 10 è un grafico che illustra l’assorbanza a 515 nm di una soluzione di glucosio come funzione della concentrazione del glucosio.

La figura 11 è un grafico che illustra l'assorbanza a 640 nm di una soluzione di glucosio come una funzione della concentrazione del glucosio.

La figura 12 è un grafico che illustra l'assorbanza a 640 nm di una soluzione di glucosio come una funzione della concentrazione del glucosio.

La figura 13 è un grafico che illustra l'assorbanza a 640 nm di una soluzione di glucosio come una funzione della concentrazione del glucosio.

La figura 14 è un grafico che illustra l'assorbanza a 640 nm di una soluzione di glucosio come una funzione di concentrazione del glucosio.

La figura 15 è un grafico che illustra l'assorbanza a 640 nm di una soluzione di glucosio come una funzione della concentrazione del glucosio.

La figura 16 è un diagramma schematico di uno strumento adatto per leggere le proprietà ottiche dell'articolo del presente trovato

Il presente trovato fornisce un articolo e un metodo per controllare la concentrazione di un analita, per esempio glucosio, nel sangue. In un aspetto ilpresente trovato riguarda un articolo che comprende un elemento a strati multipli che utilizza reagenti capaci.di reagire con un analita di interesse. In un altro aspetto il presente trovato riguarda un metodo per controllare la concentrazione di un analita nel sangue usando l'articolo.

Facendo riferimento ora alle figure 1 e 2, l'articolo 10 comprende uno strato di base 12, sovrastante lo strato di base 12 uno strato di nucleo 14, e sovrastante lo strato di nucleo 14 uno strato di rivestimento 16. Lo strato di nucleo 14 ha una prima superficie principale 17 e una seconda superficie principale 18. Lo strato di nucleo 14 comprende un sito di applicazione 20 che comunica con una prima estremità 22 di un canale di flusso 24. Il canale di flusso 24 ha una seconda estremità 26, che comunica con una camera di lettura ottica 28, Lo strato di rivestimento 16 ha un'apertura 30 che serve come sfiato. Questa forma di realizzazione richiede uno strato di base 12 al di sotto dello strato di nucleo 14, in quanto la camera di lettura ottica 28 si estende attraverso tutto lo strato di nucleo 14. La prima superficie principale 38 dello strato di rivestimento 16 è a contatto faccia a faccia con la superficie principale 17 delio strato di nucleo 14. Una prima superficie principale 40 dello strato di base 12, è a contatto faccia a faccia con la superficie principale 18 dello strato di nucleo 14

Facendo ora riferimento alle figure 3, 4, 5, 6 e 7, l'articolo 100 comprende uno strato di base 102, sovrastante lo strato di base 102 uno strato di nucleo 112 e sovrastante lo strato di nucleo 112 uno strato di rivestimento 114. Lo strato di nucleo 112 ha una prima superficie principale 116 e una seconda superficie principale 118. Lo strato di nucleo 112 comprende un sito di applicazione 120 che comunica con una prima estremità 122 di un canale di flusso 124. Il canale di flusso 124 ha una seconda estremità 126 che comunica con una camera di lettura ottica 128. Lo strato di rivestimento 114 ha un'apertura 130 che serve come sfiato. Un canale di sfiato 132 che ha una prima estremità 134 che comunica con la camera di lettura ottica 128 e una seconda estremità 136 che comunica con l'apertura 130 è realizzato nello strato di nucleo 112, Questa forma di realÌ22azione richiede uno strato di base 102 al di sotto dello strato di nucleo 112, in quanto la camera di lettura ottica 128 si estende attraverso tutto lo strato di nucleo 112, Una prima superficie principale 138 dello strato di rivestimento 114, è in contatto faccia a faccia con la superficie principale 116 dello strato di nucleo 112. Una prima superficie principale 140 dello strato di base 102 è a contatto faccia a faccia con la superficie principale 118 dello strato di nucleo 112.

Facendo ora riferimento alle figure 8 e 9, l'articolo 210 comprende uno strato di base 212 che ha una prima superficie principale 214 e una seconda superficie principale 216. Sovrastante lo strato di base 212 e a contatto faccia a faccia con la superficie principale 214 vi è uno strato di rivestimento 218. Lo strato dì base 212 comprende un sito di applicazione 220 che comunica con una prima estremità 222 del canale di flusso 224. Il canale di flusso 224 ha una seconda estremità 226 che comunica con una camera di lettura ottica 228. Lo strato di rivestimento 218 ha un'apertura 230 che serve come sfiato. Un canale di sfiato 232 che ha una prima estremità 234 che comunica con la camera di lettura ottica 228 e una seconda estremità 236 che comunica con l'apertura 230 è realizzata nello strato di base 212. Questa forma di realizzazione non richiede un terzo strato a contatto faccia a faccia con la superficie principale 216 dello strato dì base 212 in quanto il sito di applicazione 220, il canale di flusso 224, e la camera di lettura ottica 228 sono sopraelevati dalla superficie principale 16 dello strato di base 212. La forma di realizzazione rappresentata nelle figure 3, 4, 5, 6 e 7 viene preferita in quanto è più facile da preparare in quantità in massa.

Indipendentemente da quale forma di realizzazione si usa, le dimensioni superficiali di ciascuno strato non sono critiche, eccetto per il fatto che le dimensioni devono essere scelte in modo tale che l'articolo si adatti appropriatamente in un dispositivo ottico di misurazione. Un esempio di dimensioni superficiali adatte per Un articolo del presente trovato che ha una superficie rettangolare sono una lunghezza di 30 mm e una larghezza di 20 mm. Per quello che riguarda la forma di realizzazione preferita, un esempio dello spessore dell’articolo è 0,3 mm Un esempio dello spessore dello strato di base 102, è 0,1 mm. Un esempio dello spessore dello strato di rivestimento 114 è 0,1 mm. Un esempio dello spessore dello strato di nucleo 112 è 0,3 mm.

La porzione dello strato di rivestimento e la porzione dello strato di base in registro con la sommità e il fondo della camera di lettura ottica devono essere in grado di trasmettere luce così che la luce trasmessa attraverso l’articolo non sia ostruita dal prodotto di reazione. Nella forma di realizzazione che impiega uno strato di nucleo, non è necessario che lo strato di nucleo sia capace di trasmettere luce.

Almeno uno dello strato di base e dello strato di rivestimento deve essere idrofilo. Lo strato di nucleo non deve essere capace di assorbire liquido. Materiali che sono adatti per preparare lo strato di nucleo includono vetro e materiali polimerici.

Si deve notare che ciascuno degli strati nominati, cioè lo strato di base, lo strato di nucleo e lo strato di rivestimento, possono comprendere un singolo strato di materiale o, in alternativa, due o più strati di materiale uniti assieme, per 'esempio mediante un adesivo, mediante termosaldatura o mediante qualche altro mezzo di laminazione. Tuttavia si preferisce che ciascuno degli strati comprenda un singolo strato di materiale a causa di considerazioni di costo, a meno che uno strato composito fornisca una prestazione migliorata rispetto a qualche parametro.

La camera di lettura ottica è capace di servire a tre funzioni: dosaggio del campione, conservazione del reagente e misurazione ottica. Il volume della camera di lettura ottica deve essere sufficientemente grande così che si possa effettuare una misurazione ottica accurata della concentrazione dell'analita. Il volume della camera di lettura ottica deve essere sufficientemente piccolo così che il volume del campione richiesto per la misurazione possa essere estremamente piccolo. Si preferisce che il volume della camera di lettura ottica sia inferiore a circa 0,1 μl, così che sia sufficiente un piccolo volume dì campione. La forma della camera di lettura ottica non è critica, tuttavia si preferisce che la camera di lettura ottica abbia una forma cilindrica per realizzare proprietà di flusso migliorate e la riduzione della quantità di campione richiesta. Si possono usare altre forme, per esempio rettangolari, della camera di lettura ottica. Si preferisce che l'area letta della camera di lettura ottica abbia una forma simile all'area della fonte luminosa. Per esempio se la fonte luminosa ha forma circolare, sì preferisce che la camera di lettura ottica abbia forma cilindrica. Si preferisce che la profondità della camera di lettura ottica venga scelta in modo che la quantità di campione richiesta possa essere resa minima.

Il canale di flusso ha preferìbilmente una sezione trasversale rettangolare, principalmente a causa della facilità di produzione. La sezione trasversale del canale di flusso deve avere una dimensione sufficiente così che una quantità sufficiente di fluido possa fluire ad una velocità di flusso sufficiente anche se nel canale di flusso sono presenti difetti casuali di produzione. Si preferisce che le dimensioni della sezione trasversale del canale di flusso vengano scelte in modo tale che la profondità del canale di flusso sia sostanzialmente uguale alla profondità della camera di lettura ottica. Se la profondità del canale di flusso è sostanzialmente superiore alla profondità della camera di lettura ottica, per effettuare un'analisi può essere richiesto un volume più grande di campione. Se la profondità del canale di flusso è sostanzialmente più piccola della profondità della camera di lettura ottica, difetti di produzione ridurrebbero in modo significativo la velocità di flusso del campione. La larghezza del canale dì flusso viene scelta in modo tale che la quantità di campione richiesta possa essere resa minima. La lunghezza del canale di flusso viene scelta in modo tale che la quantità di campione richiesta possa essere resa minima. Altri fattori da prendere in considerazione nella scelta delle dimensioni del canale di flusso includono problemi di produzione e la probabilità di evaporazione del campione.

Il canale di sfiato ha preferibilmente una sezione trasversale rettangolare, principalmente a causa della facilità di produzione. Il canale di sfiato deve avere una lunghezza sufficiente così che l'evaporazione del campione nel canale di sfiato non influenzi sfavorevolmente la camera di lettura ottica. Un esempio di un tale effetto sfavorevole è la presenza di una bolla d'aria nella camera di lettura ottica, che dà come risultato letture di assorbanza erronee. Il volume del canale dì sfiato viene reso preferibilmente il più piccolo possibile al fine di ridurre il volume del campione. Il volume del canale di sfiato deve essere sufficientemente grande cosi che nella camera dì lettura ottica non si formino bolle dì aria. La profondità del canale di sfiato e la larghezza del canale di sfiato vengono scelte in modo tale che nella camera di lettura ottica non si formino bolle di aria.

Esempi rappresentativi di dimensioni di altre caratteristiche dell'articolo della forma di realizzazione preferita (figure 3, 4, 5, 6 e 7) sono come segue:

La rivelazione di un analita viene effettuata misurando la variazione di una proprietà ottica del materiale nella camera di lettura ottica e deriva da una o più reazioni che coinvolgono l'analita con uno o più reagenti, per cui mediante uno strumento ottico si possono osservare variazioni di assorbanza. Nel caso della determinazione del glucosio, i reagenti includono tipicamente almeno urn enzima e almeno un colorante.

In un sistema di analisi per determinare la concentrazione del glucosio, il glucosio nel campione viene ossidato dal glucosio ossidasi formando acido gluconico e H2O2. La quantità di H2O2prodotta viene poi misurata quantitativamente mediante la reazione {1} o la reazione (2).

Nella reazione (1), l'enzima perossidasi (per esempio rafano perossidasi, microperossidasi) catalizza l'ossidazione del colorante o converte H2O2in H2O. L'intensità del colore è direttamente proporzionale alla concentrazione del glucosio nel campione. Esempi rappresentativi di coloranti che sono stati usati includono o-dianisidina, 4-amminoantipirina e 3,5-dicloro-2-idrossìbenzensolfonato.

Nella reazione (2),H2O2ossida il Fe a Fe . Fe si chela poi con il colorante producendo un picco di assorbimento specifico. Esempi rappresentativi di sale ferroso includono solfato ferroso e ferrocianuro di potassio. Esempi rappresentativi del colorante includono arancio xilenolo. La quantità di complesso Fe -colorante che si forma è proporzionale alla quantità di glucosio nel campione.

In un altro sistema di analisi per determinare la concentrazione del glucosio, che è preferito per il presente trovato, l'enzima glucosio deidrogenasi reagisce specificamente con il glucosio nel campione in presenza del co-enzima beta-nicotinammide adenina dinucleotide (β-NAD) formando NADH, la forma ridotta di β-NAD. NADH reagisce con un colorante che accetta elettroni, per esempio bromuro di 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2 ,5-difeniltetrazolio (MTT), reazione catalizzata dall'enzima diaforasi formando un colore rosso scuro-rossiccio. L'intensità del colore misurata a 640 nm è direttamente proporzionale alla concentrazione del glucosio nel campione.

In entrambi i sistemi, la rivelazione viene effettuata mediante misurazione ottica. La misurazione può essere quella dell'assorbanza, rìflettanza o trasmittanza. Si preferisce impiegare l'assorbanza. I campioni adatti per il metodo includono, ma non sono limitati a, sangue, plasma, siero, fluido intestiziale, urina.

Operazione

Si possono ottenere campioni di fluido intestiziale da un paziente mediante qualsiasi di vari metodi che sono ben noti a chi possiede un’usuale esperienza nel campo. Tali metodi includono, ma non sono limitati a, quelli descritti nei brevetti USA N. 4.775.361; 5.423.803; WO 94/09713; e WO 97/07734.

L'elemento a strati multipli contiene preferibilmente un reagente essiccato nella camera di lettura ottica 128. Il campione ottenuto dal paziente viene introdotto nell'elemento a strati multipli in corrispondenza del sito di applicazione 120. Dopo l'introduzione dell'elemento, il campione liquido fluisce, attraverso il canale di flusso 124, nella camera di lettura ottica 128 e dalla camera di lettura ottica 128 all'estremità del canale di sfiato 132. Il fluido cessa di fluire quando raggiunge l'apertura 130. Il campione liquido reidrata il reagente essiccato nella camera di lettura ottica, che poi reagisce con l'analita di interesse. La reazione avviene nella camera di lettura ottica, il flusso attraverso il canale di flusso 124 può essere caratterizzato come flusso capillare, cioè flusso che è guidato dall'attrazione capillare, che può essere definita come la forza che deriva dalla maggiore adesione di un liquido ad una superficie solida rispetto alla coesione interna del liquido stesso, inalternativa, se l’elemento a strati multipli non contiene un reagente essiccato nella camera di lettura ottica, il campione ottenuto dal paziente può essere miscelato con il reagente, e la miscela risultante può essere introdotta nell'elemento a strati multi in corrispondenza del sito di applicazione 120. Dopo l'introduzione nell'elemento, la miscela di reazione fluisce attraverso il canale 124, mediante flusso capillare nella camera di lettura ottica 128 e dalla camera di lettura ottica 128 all'estremità del canale di sfiato 132. La miscela di reazione cessa di fluire quando raggiunge l'apertura 130. La reazione avviene prima dell’entrata della miscela di reazione nella camera di lettura ottica.

Indipendentemente da come il campione e i reagenti vengono introdotti nell’artìcolo, le letture ottiche vengono effettuate quando il prodotto di reazione, cioè il prodotto della reazione fra il reagente e l'analita, è alla fine situato nella camera di lettura ottica. La lettura ottica è tipicamente una lettura di assorbanza. La figura 16 mostra un'apparecchiatura adatta per misurare l'assorbanza, L'apparecchiatura 300 comprende una fonte di luce 302 e un rivelatore 304. L'elemento a sfrati multipli 306 è disposto fra la fonte di luce 302 e il rivelatore 304. La camera di lettura ottica 308 nell'elemento a strati multipli 304 è allineata con la luce della fonte di luce 302 e il rivelatore 304 così che la luce della fonte di luce 302 viene trasmessa attraverso la camera di lettura ottica 308 e viene rivelata dal rivelatore 304. La fonte di luce 302 ha preferibilmente una lunghezza d'onda da circa 500 nm a circa 700 nm. Una fonte preferita di luce è un diodo che emette luce. Il rivelatore 304 è preferibilmente un fotorivelatore e le letture sono usualmente riportate in volt. L'elemento del presente trovato fornisce parecchi vantaggi significativi. In primo luogo, per effettuare l'analisi è richiesto soltanto un volume molto basso di campione. In secondo luogo, il trasferimento di fluido non richiede una pipettatura di precisione. Inoltre, i risultati dell'analisi possono essere letti otticamente. La lettura ottica può fornire risultati più accurati rispetto ai risultati letti elettronicamente. Inoltre l’articolo può essere costruito in modo tale che l'evaporazione del campione possa essere resa minima. I particolari reagenti che vengono usati nell'artìcolo e nel metodo del presente trovato sono capaci di reagire in condizioni a basso contenuto di ossigeno, con il risultato che i risultati sono accurati, sensibili e riproducibili.

L'utilizzazione del flusso capillare per il riempimento della camera di lettura ottica, permette l'eliminazione della necessità di una forza esterna per riempire la camera di lettura ottica, eliminando così la necessità di pompe, motori, tubicini e simili.

L'articolo e il metodo del presente trovato possono essere adattati per misurare la concentrazione di analiti diversi dal glucosio. Tali analiti includono per esempio colesterolo, acido urico, BUN (azoto dell'urea nel sangue) e creatinina.

Gli esempi non limitativi che seguono sono previsti per illustrare ulteriormente il presente trovato.

ESEMPI

ESEMPIO 1

Questo esempio dimostra la fattibilità di un'analisi del glucosio in cui la dimensione del campione era inferiore a 25 μl.

I seguenti materiali furono acquistati dalla

glucosio ossidasi

rafano perossidasi

4-amminoantipirina

acido 3,5-dicloro-2-idrossi-benzensolfonico

fosfato di sodio

Il glucosio venne acquistato da ,

L’assorbanza del prodotto della reazione venne letta a 515 nm in uno spettrofotometro a file di diodi della Hewlett Packard {modello 8452A). Gli elementi a strati multipli 400 usati in questo esempio erano del tipo rappresentato nelle figure 1 e 2, L'elemento rappresentato nelle figure 1 e 2 è sostanzialmente simile a quello rappresentato nelle figure 3, 4, 5, 6 e 7 con le eccezioni che la camera di lettura ottica ha una dimensione differente e una forma geometrica differente. Lo strato di nucleo 14 dell'elemento a strati multipli 10 era spesso 0,33 mm. Lo strato di rive stimento 16 e lo strato di base 12 dell'elemento a strati multipli 400 erano spessi 0,11 mm. Lo strato di rivestimento 16 e lo strato di base 12 erano stati fatti aderire a superfici principali opposte dello strato di nucleo 14 mediante un adesivo. Lo strato di rivestimento 16 e lo strato di base 12 dell’elemento a strati multipli 10 erano fatti di policarbonato. Lo strato di nucleo 14 dell'elemento a strati multipli 10 era fatto di poliestere. Le dimensioni della superficie dell'elemento erano 10 mm di larghezza per 30 mm dì lunghezza. Le dimensioni della camera di lettura ottica 28 erano 7,7 mm x 9,6 mm 0,33 mm. Il volume della camera di lettura ottica 28 era circa 24,4 μl.

I reagenti usati nell'analisi vennero preparati come segue:

Tampone: fosfato 50 mM, pH 7,0

Soluzione di enzima: rafano perossidasi {2 unità/μl) e glucosio ossidasi (2 unità/μl) vennero sciolte in fosfato 50 mM, pH 7,0 (soluzione madre) Soluzione di colorante: una miscela di 0,5 M dì 4-amminoantìpìrina e 3,5-dicloro-2-idrossi-benzensolfonato 0,5 M in tampone di fosfato 50 mM, pH 7,0 (soluzione madre)

Soluzione di glucosio: soluzioni di glucosio che contenevano 0,

31,1, 62,2, 125, 250 mg/dl preparate in tampone di fosfato 50 mM, pH 7,0

Alla soluzione di glucosio (1,0 mi) si aggiunsero la soluzione di enzima (20 μl) e la soluzione di colorante (50 μl). La reazione venne effettuata a temperatura ambiente per 2 minuti. La miscela di reazione venne poi fatta arrivare nella camera di lettura ottica mediante attrazione capillare e l'assorbanza della miscela di reazione venne letta a 515 nm. La tabella che segue riporta l'assorbanza della miscela di reazione a varie concentrazioni di glucosio.

TABELLA 1

La figura 10 illustra la curva dose-risposta per questo esempio. Dai dati in tabella 1 e dalla curva dose-risposta si può vedere che l'articolo e il metodo di questo esempio forniscono una risposta lineare. Si preferisce una dose-risposta lineare in quanto una tale risposta semplifica il calcolo della concentrazione dell'analita.

ESEMPIO 2

Questo esempio dimostra la fattibilità di un'analisi del glucosio utilizzando un piccolo volume di campione.

I seguenti materiali furono acquistati dalla S ny.

Tampone di tris (idrossimetil) amminometano (qui di seguito tampone Tris")

MgCl2*6H2O

Adenosina 5'-trifosfato (ATP)

B-nicotinammide adenina dinucleotide (β-NAD)

Bromuro di 3-[ 4 ,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazolìo (MTT)

Esochinasi

Glucosio 6-fosfato deidrogenasi (G-6-PDH)

Diaforasi

Il glucosio venne acquistato da E es.

I seguenti composti vennero pesati e sciolti in 1,3 ml di tampone iniziale Tris 0,2 M, pH 7,0:

MgCl2*6H2O 0,0276 g

ATP 0,0165 g

β-NAD 0,0189 g

MTT 0,030 g

Esochinasi 75 unità

G-6-PDH 75 unità

Diaforasi 75 unità

Il reagente venne preparato nel seguente modo. Si sciolse dapprima MTT nel tampone Tris. Alla soluzione si aggiunsero poi β-NAD e ATP e si sciolsero. Il pH della soluzione risultante venne poi regolato di nuovo a 7,0 mediante una soluzione dì Tris 1,0 M. Vennero poi aggiunti i componenti restanti e si miscelò la miscela risultante.

L'elemento a strati multipli usato in questo esempio era del tipo rappresentato nelle figure 3, 4, 5, 6 e 7, Le caratteristiche dell'elemento a strati multipli erano con le seguenti dimensioni:

TABELLA 2

Il reagente (0,3 μl) venne introdotto nell’elemento a strati multipli in corrispondenza del sito di applicazione mediante attrazione capillare. La soluzione di glucosio (0,3 μl, 250 mg/dl) venne poi introdotta nell'elemento a strati multipli in corrispondenza del sito di applicazione mediante attrazione capillare. Il volume di reazione finale era 0,582 pi. La velocità di reazione venne controllata in uno spettrofotometro a file di diodi della Hewlett Packard (modello 8452A) a 640 am. La reazione era completa in circa 2 minuti a temperatura ambiente. La figura 11 illustra l'assorbenza come funzione del tempo. Si può vedere che la velocità di variazione dell'assorbanza come funzione del tempo diminuisce dopo circa 15 secondi.

- ESEMPIO 3

Questo esempio dimostra la natura della risposta alla dose di un'analisi del glucosio utilizzando un elemento a strati multipli che ha le stesse dimensioni dell'elemento descritto nell'esempio 2. Il reagen impiegato era lo stesso di quello descritto nell’esempio 2.

Il risultato di ciascuna reazione venne letto dopo 2 minuti. Si usarono soluzioni standard di glucosio. Si ottenne una curva lineare di risposta relativamente al glucosio.

La figura 12 illustra l'assorbenza 640 nm come una funzione della concentrazione del glucosio. Dalla figura 12 si può vedere che l'articolo e il metodo di questo esempio forniscono una dose-risposta lineare.

ESEMPIO 4

L'esempio dimostra un'analisi del glucosio che utilizza un piccolo volume di campione e un volume della camera di lettura ottica di 0,251 μl.

Si impiegarono i materiali e l'elemento a strati multipli del tipo descritto nell'esempio 2. Le dimensioni della camera di lettura ottica erano un diametro di 1,5 mm, una profondità di 0,10 mm. Il canale di flusso e il canale di sfiato erano larghi 0,5 mm, lunghi 0,5 mm e profondi 0,1 mm.

Il reagente (10 μl) (dall’esempio 2) venne miscelato con la soluzione di glucosio (10 μl). La miscela risultante venne introdotta nell'elemento in corrispondenza del sito di applicazione del campione mediante attrazione capillare. Le letture dell'assorbanza a 640 nm vennero prese dopo 2 minuti. Si effettuarono prove sufficienti a preparare una curva dose-risposta.

Si ottenne una curva dose di glucosio-risposta lineare. La curva descritta dalla formula y = 3 , 003x 179 , 24 ; r = 0, 9887. Il sistema esochinasi/G-6-PDH/diaforasì/MTT dava una sensibilità di rivelazione di circa 3 mA/mg/dl di glucosio. La riproducibilità dell'elemento a strati multiplì venne sperimentata mediante la lettura dell'assorbanza della miscela di reazione della stessa soluzione di glucosio in sei elementi differenti. Come si può vedere dalla tabella 3, si ottenne un valore di CV di 7,02 a circa 173 mg/dl di glucosio.

TABELLA 3

Media = 173

D.S. = 12,14

CV, % = 7,02

La figura 13 illustra che si era ottenuta una curva dose-risposta lineare. Dai dati di questo esempio si può vedere che vi era una bassa variazione da campione a campióne.

ESEMPIO 5

Questo esempio dimostra un ' analisi del glucosio che utilizza un piecolo volume di campione e elementi a strati multipli che contengono il reagente in uno stato essiccato. Si usarono elementi del tipo descritto nell'esempio 2. Tuttavia, in ciascun elemento, soltanto lo strato di base era stato laminato con una superficie principale dello strato di nucleo. L'altra superficie principale dello strato di nucleo era stata lasciata scoperta così che il reagente potesse essere depositato nella camera di lettura ottica.

Il reagente venne preparato come descritto nell’esempio 2. Il reagente (0,5 μl) venne trasferito, mediante una pipetta, nella camera di lettura ottica di ciascun elemento a strati multipli. Il reagente venne lasciato essiccare a temperatura ambiente. La superficie principale restante dello strato di nucleo venne poi laminata con una superficie principale dello strato di rivestimento. Lo strato di rivestimento conteneva una piccola apertura per lo sfiato. Gli elementi a strati multipli così formati vennero poi conservati in un contenitore che conteneva silice.

Per effettuare l’analisi, si introdusse la soluzione di glucosio nell'elemento a strati multipli in corrispondenza del sito di applicazione mediante attrazione capillare. Il volume di ciascun campione era 0,25 μl, Quando il fluido raggiungeva l'apertura di sfiato, il flusso di fluido cessava. I risultati della reazione vennero letti a 640 nm a temperatura ambiente, dopo 1 minuto. Si effettuarono prove sufficienti a preparare una curva dose-risposta.

La figura 14 illustra la corrente (il segnale di assorbenza) come una funzione della concentrazione del glucosio. I dati in figura 14 mostrano che l'articolo e il metodo di questo esempio forniscono una curva dose-risposta lineare.

ESEMPIO 6

Questo esempio dimostra la fattibilità di un'analisi del glucosio utilizzando un piccolo volume di campione con un sistema enzimatico che comprende glucosio deìdrogenasi e diaforasi.

I seguenti materiali vennero acquistati dalla Si ny:

Tampone Tris

MgCl2*6H2O

β-nìcotinammide adenina dinucleotìde (β-NAD)

Bromuro di 3-f4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio {MTT)

Glucosio deidrogenasi

Diaforasi

Il glucosio venne ottenuto da E s.

II sistema enzimatico venne preparato nel seguente modo. Si sciolse MTT (3 mg) in tampone iniziale Tris 100 mM {200 μl), pH 7,0.Si aggiunse poi β-NAD {12 mg) alla soluzione e si lasciò sciogliere. A questa miscela si aggiunse MgCl2*6H2O 1,0 M (2 μl). Il pH della soluzione venne regolato a 7,0 mediante tampone Tris 1,0 M. A questa miscela si aggiunsero poi glucosio deidrogenasi (5 mg, 75 unità/mg) e 15 unità di diaforasi.

Il reagente (3 μl) miscelato con la soluzione di glucosio (3 μl) venne introdotto mediante attrazione capillare in un elemento del tipo descritto nell'esempio 2. L'assorbanza del prodotto di reazione venne misurata a 650 nm usando lo strumento rappresentato in figura 16. Si effettuarono prove sufficienti per preparare una curva dose-risposta. La figura 15 mostra una curva dose di glucosio-risposta lineare fino a 500 mg/dl con una sensibilità di rivelazione di 35 mg/dl

Claims

RIVENDICAZIONI 1. Articolo adatto per l'uso nella determinazione della presenza o della quantità di un analita in un campione biologico, detto articolo comprendendo un elemento a strati multipli che comprende: (a) uno strato di base che ha due superfici principali, detto strato di base avendo inoltre un'apertura, un canale di flusso e una camera di lettura ottica, una estremità del quale canale di flusso comunica con detta apertura in detto strato di base e l'altra estremità del quale canale di flusso comunica con detta camera di lettura ottica; e (b) uno strato di rivestimento a contatto faccia a faccia con la superficie principale di detto strato di base che contiene detta apertura, detto strato di rivestimento avendo in esso un'apertura per sfiatare detto elemento, 2. Articolo secondo la rivendicazione 1, in cui la camera di lettura ottica non si estende completamente attraverso detto strato di base. 3. Articolo secondo la rivendicazione 1, in cui in detta camera dì lettura ottica si dispone almeno un reagente con cui l'analita nel campione reagisce formando un prodotto di reazione rivelabile otticamente. 4. Articolo secondo la rivendicazione 3, nel cui detto almeno un reagente comprende esochinasi. 5. Articolo secondo la rivendicazione 3, nel cui detto almeno un reagente comprende glucosio deidrogenasi. 6. Articolo secondo la rivendicazione 3, nel cui detto almeno un reagente comprende diaforasi. 7. Articolo secondo la rivendicazione 1, in cui detta seconda apertura comunica con un canale di sfiato. 8. Articolo secondo la rivendicazione 1, in cui detta camera di lettura ottica ha una forma cilindrica. 9. Articolo secondo la rivendicazione 1 in cui detta camera di lettura ottica ha un volume non superiore a circa 1 pi. 10. Articolo secondo la rivendicazione 1 in cui detto strato di rivestimento ha una porzione capace di trasmettere luce in registro con detta camera di lettura ottica. 11. Articolo secondo la rivendicazione 1, in cui detto strato di base ha una porzione capace di trasmettere luce in registro con detta camera di lettura ottica. 12. Articolo secondo la rivendicazione 1 in cui detta seconda apertura non è direttamente sopra detta camera di lettura ottica. 13. Articolo adatto per l'uso nella determinazione della presenza o della quantità di un analita in un campione biologico, detto articolo comprendendo un elemento a strati multipli che comprende: (a) uno strato di nucleo che ha due superfici principali, detto strato di nucleo avendo inoltre un'apertura, un canale di flusso e una camera di lettura ottica, una delle estremità del quale canale di flusso comunica con detta apertura in detto strato di nucleo e l’altra estremità del quale canale di flusso comunica con detta camera di lettura ottica; e (b) uno strato di base in contatto faccia a faccia con una superficie principale di detto strato di nucleo; e {c) uno strato dì rivestimento in contatto faccia a faccia con l'altra superficie principale di detto strato di nucleo, detto strato di rivestimento avendo in esso un'apertura per sfiatare detto elemento. 14. Articolo secondo la rivendicazione 13, in cui detta camera dì lettura ottica si estende completamente attraverso detto strato di nucleo. 15. Artìcolo secondo la rivendicazione 13, in cui in detta camera dì lettura ottica è disposto almeno un reagente con cui detto analita nel campione reagisce formando un prodotto di reazione rivelabile otticamente. 16. Articolo secondo la rivendicazione 15, nel cui detto almeno un reagente comprende esochinasi. 17. Articolo secondo la rivendicazione 15, nel cui detto almeno un reagente comprende glucosio deidrogenasi. 18. Articolo secondo la rivendicazione 15, nel cui detto almeno un reagente comprende diaforasi. 19. Articolo secondo la rivendicazione 13, in cui detta seconda apertura comunica con un canale di sfiato. 20. Articolo secondo la rivendicazione 13, in cui detta camera di lettura ottica ha una forma cilindrica. 21. Articolo secondo la rivendicazione 13, in cui detta camera di lettura ottica ha un volume non superiore a circa 1 pi. 22. Articolo secondo la'rivendicazione 13, in cui detto strato di rivestimento ha una porzione capace di trasmettere luce in registro con detta camera di lettura ottica che è trasparente. 23. Articolo secondo la rivendicazione 13, in cui detto strato di base ha una porzione capace di trasmettere luce in registro con detta camera di lettura ottica. 24. Articolo secondo la rivendicazione 13, in cui detta seconda apertura non è direttamente sopra detta camera di lettura ottica. 25. Metodo per misurare la concentrazione di un analita in un campione che comprende le fasi di: (a) introdurre un campione di fluido biologico ottenuto dal corpo di un paziente nell'articolo secondo la rivendicazione 1; (b) lasciare reagire almeno un reagente nell'articolo con l'analita di interesse nel campione; e (c) misurare la concentrazione dell'analita nel campione mediante uno strumento ottico. 26. Metodo secondo la rivendicazione 25, in cui il fluido biologico è fluido interstiziale. 27. Metodo secondo la rivendicazione 25, nel cui detto almeno un reagente comprende esochinasi. 28. Metodo secondo la rivendicazione 25, nel cui detto almeno un reagente comprende glucosio deidrogenasi. 29. Metodo secondo la rivendicazione 25, nel cui detto almeno un reagente compre diaforasi. 30. Metodo per misurare la concentrazione di un analita in un campione che comprende le fasi di:' (a) introdurre un campione di fluido biologico ottenuto dal corpo di un paziente nell'articolo secondo la rivendicazione 13; (b) lasciare reagire almeno un reagente nell'articolo con l'analita di interesse nel campione; e {c) misurare la concentrazione dell'analita nel campione mediante uno strumento ottico. 31. Metodo secondo la rivendicazione 30, in cui il fluido biologico è fluido interstiziale. 32. Metodo secondo la rivendicazione 30, nel cui detto almeno un reagente comprende esochinasi. 33. Metodo secondo la rivendicazione 30 nel cui detto almeno un reagente comprende glucosio deidrogenasi. 34. Metodo secondo la rivendicazione 30, nel cui detto almeno un reagente comprende diaforasi.