ITCH20080021A1 - Usi in diagnosi e terapia dei tumori di un rna di fusione tra ciclina d1 e trop2 - Google Patents

Description

MODULO DI DESCRIZIONE DI INVENZIONE INDUSTRIALE<1>

DESCRIZIONE dell’invenzione industriale dal titolo "Usi in diagnosi e terapia di tumori di un RNA di fusione tra Ciclina D1 e Trop2”

Stato dell’ arte

La maturazione post-trascrizionale dell’ RNA gioca un ruolo fondamentale nel controllo dell’ espressione proteica. Uno degli eventi chiave di questa maturazione è il processo di splicing, ossia l’ eliminazione degli introni (regioni non codificanti per proteina) e la giunzione degli esoni (regioni codificanti ed estremità non tradotte), per formare una molecola continua di RNA messaggero (mRNA). Circa il 70% dei geni umani va normalmente incontro a splicing alternativo [1], cioè a variazioni nella scelta degli esoni che vanno a formare l’mRNA maturo. Questo rende possibile la creazione di diversi registri di lettura della sequenza codificante a partire dalla stessa sequenza nucleotidica o la modulazione dell’ espressione del gene, se gli esoni alternativi comprendono le regioni regolatorie non tradotte al 5’ e al 3’ dell’ RNA. Diversi tipi di sequenze possono essere utilizzate per lo splicing: tra le più usate vi sono i dinucleotidi GT e AG all’ inizio e alla fine delle sequenze introniche, che vengono in questo modo riconosciute e rimosse dall’ apparato di splicing. Difetti in questo processo, causati ad esempio da mutazioni nelle sequenze nucleotidiche che lo regolano o nell’ apparato di splicing, sono frequenti e causano molte malattie ereditarie [2, 3]. Si ritrovano spesso anche nei tumori umani, dove possono avere un ruolo causale ed essere associati ad una maggiore aggressività della malattia tumorale [4, 5].

La maturazione dell’ mRNA può avvenire anche tramite la giunzione tra due RNA indipendenti (trans-splicing), con la produzione di RNA di fusione (chimerici) senza che vi sia ricombinazione a livello di DNA, una lesione quest’ ultima frequentemente presente nei tumori umani. Nel protozoo tripanosoma tutti gli mRNA presentano una sequenza comune iniziale che deriva da un processo di trans-splicing [6]. Un processo di maturazione dell’ RNA simile a questo è stato descritto in varie altre specie ([7], e riferimenti inclusi), anche di mammifero ([8], e riferimenti inclusi). Anche nel transsplicing possono venire utilizzate sequenze diverse per segnalare i punti di giunzione [9-11].

1 Documento da allegare obbligatoriamente al modulo di domanda. E’ facoltativa la traduzione in inglese del medesimo documento

Abbiamo dimostrato l’ esistenza di un mRNA chimerico derivante dalla fusione tra i trascritti della CICLINA D1 e di TROP2 (Figura 1, A) nelle linee cellulari tumorali MCF7 e OVCA432, mediante sequenziamento del DNA-copia (cDNA) ed esperimenti di protezione dall’ RNAsi (Figura 2). La Ciclina D1 è una molecola regolatoria del ciclo cellulare, in grado di stimolare la crescita tumorale se iperespressa. L’ iperespressione della Ciclina D1 è frequente nei tumori umani, ed è causata generalmente da riarrangiamenti a livello del DNA. Un secondo meccanismo è l’ amplificazione genica, molto frequente nei carcinomi umani, ad esempio nei cancri della mammella, testa e collo, vescica, ovaio ed esofago [12, 13], che causa un aumento del numero di copie del gene della Ciclina D1. Un terzo meccanismo è rappresentato da inversioni o delezioni del gene della Ciclina D1, ad esempio negli adenomi delle paratiroidi; questo provoca la trascrizione di una versione corta dell’ mRNA corrispondente, priva della maggior parte della regione non tradotta al 3’, che è responsabile dell’ induzione della degradazione dell’ mRNA stesso [14]. Questo mRNA (CICLINA CORTA) è quindi più stabile della forma lunga e diventa un oncogene (gene che causa il cancro) [15-17]. Va notato che questo avviene senza cambiamenti / mutazioni della proteina corrispondente, Ciclina D1. Trop-2 (gene TACSTD2) [18-21] è una glicoproteina transmembrana che trasduce un segnale di aumento del calcio citoplasmatico [22] ed è coinvolta nell’ adesione cellula-cellula e cellula-substrato in tessuti epiteliali. Anche Trop-2 è iperespresso nella maggior parte dei cancri umani [19, 23], ed è un potente stimolatore della crescita tumorale. Questa capacità stimolatoria dipende dalla presenza di un sito di fosforilazione per la protein-kinasi C (PKC) in corrispondenza della serina 303 nella regione citoplasmatica di Trop-2 e dal funzionamento della via di segnale intracellulare della PKC [24].

Nell’ mRNA chimerico (chimera) CICLINA D1/TROP2 da noi isolato la forma corta della CICLINA D1 è fusa con l’ intero trascritto di TROP2. Entrambi gli elementi hanno sequenza normale, senza mutazioni nucleotidiche, e comprendono l’ intera sequenza codificante. Abbiamo confermato sperimentalmente mediante analisi al citofluorimetro e di Western di linee cellulari esprimenti la chimera che che la chimera dà origine a due polipeptidi indipendenti corrispondenti alle proteine normali Ciclina D1 e Trop-2 (Figura 3).

Poichè il gene della Ciclina D1 è frequentemente ricombinato nei tumori, come descritto in precedenza, abbiamo investigato la presenza di riarrangiamenti a livello di DNA che giustapponessero CICLINA D1 e TROP2 sullo stesso cromosoma in una singola unità di trascrizione. Analisi mediante reazione a catena della polimerasi (Polymerase Chain Reaction, PCR), Southern blot e ibridazione in situ fluorescente (Fluorescence In Situ Hybridisation, FISH) condotte su line cellulari esprimenti la chimera hanno evidenziato l’ assenza di traslocazioni e ricombinazioni a livello genico (Figura 4). La chimera CICLINA D1/TROP2 deriva pertanto da un evento di trans-splicing che unisce molecole di mRNA originate indipendentemente dai due geni. Poichè le sequenze intorno al punto di giunzione sono diverse da quelle comunemente usate dal trans-splicing, il meccanismo di generazione della chimera è nuovo ed è importante per regolare l’ espressione genica in particolare di cellule tumorali.

Potenziale oncogenico della chimera CICLINA D1/TROP2

Poichè la chimera CICLINA D1/TROP2 è stata isolata da linee cellulari derivanti da tumori umani, e sia la Ciclina D1 che Trop-2 hanno la capacità di indurre proliferazione, abbiamo investigato la capacità della chimera di stimolare la crescita cellulare (Figura 5). A questo scopo abbiamo introdotto la chimera CICLINA D1/TROP2 insieme all’ oncogene RAS mutato in cellule BRK, prelevate da ratti neonati. Normalmente queste cellule in coltura hanno una capacità di crescita limitata e muoiono dopo pochi mesi; uguale comportamento è stato osservato in cellule BRK che esprimevano il solo RAS mutato. Al contrario, quando a questo veniva aggiunta la chimera CICLINA D1/TROP2 le cellule BRK diventavano capaci di crescere in modo continuo, sia in piastra, sia in sospensione (agar soffice), caratteristiche tipicamente associate a trasformazione tumorale [25-27]. Cosa ancora più importante, le cellule BRK trasformate dalla chimera CICLINA D1/TROP2 danno origine a tumori in animali da esperimento (topi nudi atimici). La chimera CICLINA D1/TROP2 quindi non solo è in grado di stimolare la crescita, ma ha le proprietà di un oncogene, trasformando le cellule che la esprimono in cellule tumorali. Questa capacità trasformante dipende dalla grande stabilità dell’ mRNA chimerico, maggiore di circa 90 volte rispetto all’ mRNA della CICLINA D1 (Figura 6). Di interesse, l’ mRNA chimerico è molte volte più stabile anche rispetto alla CICLINA CORTA descritta in precedenza. Un altro cofattore di trasformazione è rappresentato dall’ espressione addizionale di Trop-2.

Espressione della chimera nei tumori umani

Considerato il potere oncogenico della chimera, ne abbiamo studiato l’ espressione in tessuti umani normali e in tumori di vario tipo. Quaranta tumori di varia origine ( stomaco, colon, mammella, endometrio, rene, polmone, ovaio) sono stati analizzati mediante Northern blot e/o PCR del cDNA, con sonde e oligonucleotidi specifici per la chimera (Figure 7 e 8). Le nostre analisi hanno dimostrato che la chimera CICLINA D1/TROP2 è espressa frequentemente nei tumori umani (Tabella 1 e 2). Un esempio eclatante è quello dei tumori dello stomaco di tipo intestinale, che esprimono la chimera CICLINA D1/TROP2 in tutti i casi analizzati (5 su 5). L’ espressione della chimera non dipende dai livelli di espressione dei singoli mRNA CICLINA D1 e TROP2 ; diversi tumori esprimono la chimera in presenza di quantità appena rilevabili dei due mRNA (ad esempio tumori dello stomaco), mentre altri tumori non esprimono la chimera pur presentando livelli molto alti di entrambi gli mRNA (ad esempio tumori della mammella). Questo suggerisce che la generazione della chimera CICLINA D1/TROP2 sia un fenomeno regolato.

In parallelo abbiamo analizzato una serie di tessuti umani normali, provenienti da colon, rene, polmone, pancreas, placenta, prostata, stomaco, utero e pelle. Nessuno dei tessuti normali analizzati esprime la chimera, con la sola eccezione dei cheratinociti della pelle, tessuto ad altissima capacità di replicazione e che esprime alti livelli di Trop-2.

Il potere oncogenico della chimera CICLINA D1/TROP2 e l’ espressione in gran parte esclusiva per i tumori rendono la chimera stessa uno strumento diagnostico ed un bersaglio terapeutico importante per applicazioni in oncologia.

Problema tecnico

Rivelazione/quantificazione

Poichè la chimera è una fusione a livello di RNA, senza che vi sia ricombinazione nel DNA nei loci genomici interessati, il metodo di rivelazione della chimera deve partire dall’ RNA della cellula/tessuto, che è una molecola molto più labile e prona alla degradazione rispetto al DNA. Le biopsie tumorali fissate in formalina tamponata ed incluse in paraffina, come di routine in anatomia patologica, possono essere utilizzate per l’ estrazione degli acidi nucleici. La qualità degli acidi nucleici estratti da questi campioni è variabile, ed influenza le analisi successive.

Per quanto riguarda la rivelazione di trascritti specifici, i metodi classici utilizzati nel laboratorio di ricerca, quali analisi di Northern e protezione dall’ RNAsi, presentano una serie di aspetti che non li rendono utlizzabili in analisi di medio-alta processività in ambito clinico, a partire da quantità di materiale (tessuti umani) limitate. Questi metodi infatti richiedono grandi quantità di RNA intatto (dell’ ordine di decine di microgrammi), necessitano di una messa a punto accurata, utilizzano il radioisotopo [<32>P] per raggiungere la necessaria sensibilità di rivelazione.

Vi era quindi l’ esigenza di fornire un metodo di analisi per la rivelazione della chimera CICLINA D1/TROP2 che fosse sensibile, robusto, quantitativo e potenzialmente ad alta processività.

Inibizione dell’ espressione.

Nelle cellule/tessuti che esprimono l’ mRNA di fusione nè il DNA, nè i singoli mRNA, nè i prodotti proteici corrispondenti alla Ciclina D1 e a Trop-2 risultano in alcun modo alterati. Inoltre entrambe le molecole sono presenti ed importanti nei tessuti normali. Importante è anche il fatto che la chimera CICLINA D1/TROP2 esercita la sua azione pro-oncogenica già a livelli di espressione bassi.

Vi era quindi l’ esigenza di fornire un metodo per l’ inibizione dell’ espressione della chimera CICLINA D1/TROP2 dotato di altra efficacia, che fosse in grado di abbattere i livelli di espressione della chimera praticamente a zero, ed altamente specifico verso la molecola di RNA di fusione, con effetti minimi o nulli nei confronti dei due partner presi singolarmente.

Terapia anti-tumorale attraverso l’ eliminazione della chimera CICLINA D1/TROP2.

Per studiare ed utilizzare a scopo terapeutico l’ effetto di una inibizione efficace e specifica della chimera CICLINA D1/TROP2 sulla crescita cellulare erano necessari metodi che fossero in grado di trasportare l’ agente inibente all’ interno di cellule e tessuti e di farlo esprimere in maniera efficiente. Vi era quindi l’ esigenza di sviluppare vettori plasmidici e lentivirali e sistemi di trasfezione e trasduzione adatti a questo scopo e che minimizzasero effetti tossici e secondari.

Soluzione al problema tecnico

Rivelazione/quantificazione

Abbiamo messo a punto un metodo di analisi per PCR del cDNA (RT-PCR) quantitativa che fosse in grado di rivelare l’ espressione della chimera CICLINA D1/TROP2 in cellule e tessuti. A questo scopo abbiamo disegnato una serie di inneschi specifici per la sintesi del DNA (primer) che amplificassero la regione della chimera corrispondente al punto di giunzione. Le condizioni di reazione (enzima, tampone, temperatura di appaiamento) per ciascuna coppia di primer sono state ottimizzate mediante PCR su cDNA preparato da RNA totale estratto da cellule esprimenti la chimera.

Le reazioni di PCR sono state effettuate in un termociclatore a gradiente di temperatura, per testare diverse temperature di appaiamento dei primer. Per aumentare la sensibilità del metodo sono state effettuate anche riamplificazioni di prodotti di PCR con almeno uno dei due primer interno al frammento sintetizzato. I prodotti finali delle reazioni di PCR sono stati corsi su gel di agarosio e colorati con bromuro d’ etidio; le bande singole di peso molecolare atteso sono state sequenziate e la loro sequenza è stata confrontata con quella attesa della chimera CICLINA D1/TROP2. Questo ha permesso di selezionare tre coppie di primer e relative condizioni di amplificazione, con possibilità di utilizzo in PCR singole o multiple: PRAD1.F3 e T2.F5c (94 °C, 1 min; 68 °C, 1 min; 72 °C, 1 min; 35 cicli); PRAD1.F4 e T2.F5tris (94 °C, 1 min; 59 °C, 1 min; 72 °C, 1 min; 35 cicli); PRAD1.F5 e T2.F5tris (94 °C, 1 min; 64 °C, 1 min; 72 °C, 1 min; 35 cicli). Le sequenze dei primer sono riportate in Figura 1, B.

La coppia di primer PRAD1.F4 e T2.F5tris, in grado di amplificare la chimera in maniera efficiente e specifica (presenza di banda singola), è stata successivamente testata in PCR quantitativa in tempo reale in presenza di Sybr Green, su cDNA di cellule che esprimessero la chimera. Il ciclo di amplificazione è stato il seguente: 94 °C, 30 sec; 60 °C, 30 sec; 72 °C, 30 sec; 45 cicli. L’ emissione di fluorescenza è stata quantificata nel corso della reazione, ed una curva di dissociazione del prodotto di PCR è stata eseguita al termine della reazione (Figura 9). La presenza di un singolo picco, in corrispondenza della temperatura in cui si ha la dissociazione del 50% del prodotto di PCR, ha confermato la specificità della reazione. L’ analisi di PCR quantitativa in tempo reale da noi ottimizzata si presenta quindi come metodo di analisi in grado di rivelare in maniera specifica e quantifcare la presenza della chimera in cellule e tessuti, a partire da ridotte quantità di materiale (1 µg di RNA totale). Abbiamo dimostrato che un’ alternativa migliore rispetto alla fissazione in formalina per rivelare la chimera CICLINA D1/TROP2 nei campioni tumorali è costituito dal congelamento rapido del tessuto al momento del prelievo seguito da conservazione a bassa temperatura (-80°C), un metodo che può essere utilizzato già oggi in centri di raccolta dedicati. La procedura descritta è inoltre facilmente trasferibile a media-alta processività, ad esempio tramite l’ uso di una stazione robotizzata per il processamento dei campioni e l’ assemblaggio delle reazioni. Robot di questo tipo sono già disponibili sul mercato (es. TECAN, Svizzera).

Un risultato importante dei saggi effettuati per la messa a punto di questa tecnica diagnostica è stato la validazione delle sequenze dei primer che permettono l’ amplificazione specifica della regione di giunzione della chimera CICLINA D1/TROP2.

Inibizione dell’ espressione ed utilizzo terapeutico.

Abbiamo messo a punto un sistema innovativo per l’ inibizione dell’ espressione della chimera CICLINA D1/TROP2 efficace ed altamente specifico. Per questo abbiamo sfruttato il meccanismo del silenziamento dell’ RNA, sintetizzando un RNA silenziatore (siRNA) con sequenza complementare al punto di giunzione della chimera. Questo siRNA è stato sottoclonato come RNA a forcina (small hairpin RNA, shRNA) in vettori appropriati (plasmidici e lentivirali). Parallelamente è stato sintetizzato e sottoclonato un shRNA (shRNA-MM) contenente due nucleotidi mutati (uno nella parte derivante dalla CICLINA D1 e uno nella parte derivante da TROP2) che si appaia in maniera imcompleta alla sequenza bersaglio e che abbiamo utilizzato come controllo negativo. Le sequenze delle coppie di oligonucleotidi corrispondenti a ciascun shRNA sono riportate in Figura 1, C.

I vettori contenenti questi shRNA sono stati inseriti in cellule esprimenti la chimera. I livelli di chimera in queste cellule sono stati misurati con il metodo messo a punto precedentemente (PCR quantitativa in tempo reale sul cDNA). Parallelamente abbiamo misurato con metodo analogo anche i livelli di espressione degli RNA dei due partner, CICLINA D1 e TROP2, e dell’ RNA 28S come controllo di quantità. In queste stesse cellule abbiamo anche monitorato la crescita nel corso del tempo (Figura 10). Il silenziamento della chimera CICLINA D1/TROP2 è risultato essere estremamente efficiente e specifico. L’ espressione della chimera è stata annullata dall’ shRNA specifico, mentre i livelli di CICLINA D1 e di TROP2 sono rimasti inalterati, uguali a quelli delle cellule originarie (e ai controlli tecnici usati comunemente, in particolare cellule transfettate con vettore vuoto). Parallelamente all’ inibizione del’ espressione della chimera CICLINA D1/TROP2 la crescita cellulare è risultata fortemente inibita.

Descrizione della presente invenzione

Oggetto della presente invenzione sono i metodi di rivelazione e quantificazione della chimera CICLINA D1/TROP2 e di altri RNA chimerici in cellule e tessuti normali e tumorali. Questo include i procedimenti per la preparazione dell’ RNA chimerico e suoi derivati da cellule che lo esprimano. Questo include anche l’ analisi in PCR ed in PCR quantitativa in tempo reale di cDNA ottenuto da cellule e tessuti.

Un altro oggetto della presente invenzione è l’ utilizzo della chimera CICLINA D1/TROP2 e di altri RNA chimerici come bersaglio di terapia antitumorale. L’ invenzione riguarda gli acidi nucleici (siRNA e shRNA) in grado di inibire in maniera efficace e specifica l’ espressione della chimera CICLINA D1/TROP2 e di altri RNA chimerici. Questo include inoltre le modificazioni ed i derivati di tali acidi nucleici, inclusi i vettori plasmidici e lentivirali che li contengono. L’ invenzione riguarda inoltre le modalità di generazione e di utilizzo di tali vettori in vitro ed in vivo.

L’ invenzione riguarda il bersaglio dei siRNA e shRNA descritti sopra, in particolare include la molecola di RNA chimerico CICLINA D1/TROP2 come elemento diagnostico, indicatore prognostico e bersaglio terapeutico. Questo include anche altri RNA chimerici espressi dai tumori umani.

L’ invenzione riguarda le vie di generazione della chimera CICLINA D1/TROP2 come bersaglio terapeutico.

Oggetto della presente invenzione sono cellule che contengono ed eventualmente esprimono molecole di acido nucleico facenti oggetto dell’ invenzione.

Oggetto della presente invenzione sono i procedimenti per la preparazione di siRNA e shRNA e loro derivati da cellule che li esprimano.

Oggetto della presente invenzione sono i metodi per la diagnosi di malattie neoplastiche e non, che contengano molecole bersaglio degli siRNA e shRNA e loro derivati.

Un’ altra rivendicazione della presente invenzione è un farmaco per terapia dei tumori, basato su siRNA e shRNA contro la chimera CICLINA D1/TROP2 o qualsivoglia loro derivato, e che possa essere somministrato ad un paziente portatore di un tumore che esprima la chimera CICLINA D1/TROP2. Oggetto della presente invenzione è un metodo per trattare un tumore, che esprima la chimera CICLINA D1/TROP2, attraverso la somministrazione di agenti antineoplastici quali siRNA e shRNA, o loro derivati, da soli o in combinazione con altre modalità terapeutiche.

Un’ altra rivendicazione della presente invenzione è un farmaco per terapia dei tumori, basato su siRNA e shRNA contro RNA chimerici o qualsivoglia loro derivato, e che possa essere somministrato ad un paziente portatore di un tumore che esprima l’ RNA chimerico bersaglio. Oggetto della presente invenzione è un metodo per trattare un tumore, che esprima mRNA chimerici, attraverso la somministrazione di agenti antineoplastici quali siRNA e shRNA, o loro derivati, da soli o in combinazione con altre modalità terapeutiche.

Oggetto della presente invenzione sono le modalità di utilizzo in terapia, in particolare le modalità di somministrazione degli siRNA e shRNA e dei loro derivati, per via sistemica o loco-regionale, es. intraperitoneo, intra-arteria epatica o intra-tumorale. Una lista esemplificativa e non esaustiva di bersagli per terapie basate su siRNA e shRNA contro la chimera CICLINA D1/TROP2 include tumori dello stomaco, colon, mammella, endometrio, rene e ovaio.

Oggetto della presente invenzione sono anche le composizioni terapeutiche che contengono un siRNA o shRNA o un loro derivato, vettori lentivirali inclusi. Questi possono essere forniti sotto forma di una composizione o di un agente veicolante o di un macro/ micro/ o nanocontenitore o nanostruttura e un elemento portante o un diluente farmaceuticamente accettabile. La composizione terapeutica può essere usata per il trattamento di malattie in mammiferi quale un essere umano. In particolare, l’ agente silenziante sarà formulato adeguatamente nelle composizioni farmaceutiche o in corredi diagnostici come fatto normalmente in questo campo tecnico.

Il contenitore specifico, in particolare sotto forma di una fiala adatta ad iniezione, contenente l’ agente silenziante è un altro oggetto di presente invenzione.

Attività inventiva

Hanno carattere di novità, a titolo di principi, applicazioni e modi d’ uso, come descritto in questo brevetto:

• l’ uso della chimera CICLINA D1/TROP2 come nuovo marcatore tumorale e bersaglio terapeutico in terapia anticancro;

• l’ uso di altri mRNA chimerici che vengano espressi nei tumori umani come bersaglio di terapia antitumorale;

• le sequenze nucleotidiche della chimera CICLINA D1/TROP2 e di altri RNA chimerici e loro derivati, i vettori contenenti tali sequenze e le cellule procariotiche ed eucariotiche in cui questi vettori sono stati trasformati/trasfettati/trasdotti e possibilmente espressi;

• il meccanismo cellulare di generazione della chimera CICLINA D1/TROP2 e di altri RNA chimerici simili;

• le molecole, le reazioni enzimatiche e le vie di segnale coinvolte in tali meccanismi;

• i metodi per la rivelazione della chimera CICLINA D1/TROP2 nelle cellule, nei tessuti e nei tumori umani, comprese le sequenze dei primer utilizzati;

• i metodi per la rivelazione di altri RNA chimerici nelle cellule, nei tessuti e nei tumori umani, comprese le sequenze dei primer utilizzati;

• i metodi per inibire l’ espressione della chimera CICLINA D1/TROP2 in vitro;

• i metodi per inibire l’ espressione della chimera CICLINA D1/TROP2 vivo;

• le sequenze dei siRNA e shRNA con attività inibitoria nei confronti della la chimera CICLINA D1/TROP2, i vettori plasmidici e lentivirali contenenti tali sequenze e le cellule procariotiche ed eucariotiche in cui questi vettori sono stati trasformati/trasfettati/trasdotti e possibilmente espressi; • le formulazioni contenenti siRNA e shRNA specifici per la chimera CICLINA D1/TROP2 e loro derivati per gli scopi indicati;

• l’ uso di siRNA e shRNA specifici per la chimera CICLINA D1/TROP2 e dei loro derivati nella terapia di tumori o di altre malattie non tumorali;

• le modalità di utilizzo di siRNA e shRNA specifici per la chimera CICLINA D1/TROP2 e dei loro derivati nella terapia di tumori o di altre malattie non tumorali;.

• le vie di somministrazione di siRNA e shRNA specifici per la chimera CICLINA D1/TROP2 e dei loro derivati

• le conoscenze sul meccanismo cellulare di generazione della chimera CICLINA D1/TROP2 e/o di altri mRNA chimerici per identificare bersagli nuovi di terapia anti-tumorale.

Applicazione industriale e forme di attuazione 

Un metodo di realizzazione della presente invenzione è attraverso metodi per la rilevazione o la diagnostica di malattie neoplastiche, pre-neoplastiche e non, esprimenti gli RNA chimerici oggetto della presente invenzione, che ne permettano l’ identificazione e quantificazione. Gli acidi nucleici, ed in particolare l’ RNA, possono essere estratti e purificati a partire da cellule e tessuti freschi e congelati da ricercatori esperti nell’ arte applicando tecniche note. Kit e strumentazione per estrazione e purificazione possono essere acquisiti da fonti commerciali (per esempio Qiagen, Olanda; Applied Biosystems, California).

La rivelazione e quantificazione degli RNA chimerici attraverso sintesi del cDNA a partire dall’ RNA (RT) e PCR quantitativa in tempo reale, come descritto nella presente invenzione, possono essere effettuate secondo tecniche note nell’ arte. Reagenti e strumentazione per RT-PCR quantitativa in tempo reale sono disponibili sul mercato (per esempio Applied Biosystems; Roche, Svizzera) .

Una processività più alta nella fase di rivelazione della presenza degli RNA chimerici può essere raggiunta mediante l’ utilizzo di stazioni robotizzate presenti sul mercato (per esempio TECAN, Svizzera).

Una molecola di acido nucleico che codifichi per gli RNA chimerici o loro derivati o per gli RNA inibitori corrispondenti, oggetto della presente invenzione, può essere generata da un esperto nell’ arte usando tecnologie note, es. sintesi di oligonucleotidi o amplificazione per PCR. La molecola di acido nucleico, una volta sintetizzata, può essere clonata in un vettore plasmidico o virale come noto nell’ arte. Vettori che sono stati usati con successo per il silenziamento di mRNA specifici mediati da shRNA sono il pSUPER [28] ed i vettori lentivirali PLKO.1 [29] e pGIPZ (Open BioSystems, Alabama); in quest’ ultimo l’ shRNA è inserito all’ interno della sequenza di un microRNA, e può venire processato in maniera più efficace dall’ apparato cellulare. Questi vettori possono essere inseriti nelle cellule per mezzo di metodi noti nell’ arte, es. per trasfezione o trasduzione nel caso di particelle virali. Kit per la trasfezione e per la preparazione e la trasduzione di particelle lentivirali possono essere acquistati da fonti commerciali (ad esempio Addgene, Massachusetts ; Open Biosystems, Alabama; Invitrogen, California). Per impedire la formazione di virus in grado di replicarsi, e renderne quindi sicuro l’ utilizzo, la preparazione di particelle virali viene effettuata tipicamente mediante la complementazione di proteine prodotte da plasmidi diversi (fisicamente disgiunti tra loro), che forniscono ciascuno solamente una parte del corredo proteico necessario per la ricostituzione della particella in grado di infettare la cellula bersaglio.

Un altro metodo di realizzazione dell’ invenzione è la somministrazione ai pazienti con malattia neoplastica di acidi nucleici in grado di silenziare la chimera CICLINA D1/TROP2 come terapia anti-tumorale, ad esempio facendo uso di vettori lentivirali. I metodi per realizzare queste modalità terapeutiche sono conosciuti in arte (vedi ad esempio [30, 31]). Un altro modo di realizzazione della presente invenzione è focalizzato sull’ utilizzo delle molecole, delle reazioni enzimatiche e delle vie di segnale coinvolte nella generazione della chimera CICLINA D1/TROP2 e di altri RNA chimerici come bersaglio terapeutico.

Materiale e metodi

Colture cellulari. Le line cellulari OVCA-432, Ovcar-3 e MCF-7 sono state fatte crescere in terreno RPMI 1640 (GibcoBRL, Paisley, Scotland). Le cellule L sono state fatte crescere in DMEM. Ai terreni è stato aggiunto il 10% di siero fetale bovino (GibcoBRL, Paisley, Scotland). Le cellule BRK (Baby Rat Kidney) sono state preparate a partire dai reni di ratti Sprague-Dawley di 8 giorni come descritto [16]. I linfociti normali (peripheral blood leukocytes, PBL) sono stati ottenuti mediante centrifugazione di sangue eparinizzato su gradiente di densità (Ficoll-Hypaque). I cheratinociti sono stati ottenuti da biopsie di cute (due casi) immediatamente dopo il prelievo chirurgico, mediante trattamento con collagenasi di tipo IV.

Transfezioni Le transfezioni sono state eseguite come descritto in [32] o per lipofezione (Gibco-BRL, USA).

Misurazione dela crescita di cellule in coltura. Cellule MCF-7 trasfettate con l’ shRNA per la chimera CICLINA D1/TROP2 o con il vettore vuoto di controllo sono state seminate in quantità pari a 4 x 10<3>cellule/pozzetto in piastre a 96 pozzetti (sei pozzetti replicati per ciascun punto sperimentale). Il numero di cellule a ciascun tempo è stato misurato tramite colorazione con cristal violetto, come descritto [33].

Crescita in agar soffice. La crescita delle cellule BRK trasformate in agar soffice è stata misurata come descritto in precedenza [34]. Brevemente, 3x10<4>, 7x10<4>or 10<5>cellule BRK normali o trasfettate sono state seminate in piastre di 3.5 cm di diametro. Colonie visibili, originate da cellule in crescita, sono state contate ogni settimana dopo colorazione con blu di metilene.

Modelli in vivo: allotrapianti in topi nudi atimici. Le cellule BRK transfettate con la chimera CICLINA D1/TROP2 o con la CICLINA CORTA sono state iniettate sottocute in gruppi di topi nudi C57/Bl68 di 8 settimane (10 topi per gruppo). In tutti i gruppi lo sviluppo del tumore è stato misurato settimanalmente essenzialmente come indicato [35].

L’ utilizzo degli animali di laboratorio è avvenuto nel rispetto delle linee guida istituzionali, secondo i regolamenti e le leggi nazionali (D.L. No.116, G.U., Suppl. 40, Feb.18, 1992; circolare No. 8, G.U., July, 1994) e internazionali (EEC Council Directive 86/609, OJ L 358. 1, Dec.12, 1987; “Guide for the Care and Use of Laboratory Animals”, United States National Research Council, 1996).

Analisi statistica. La significatività statistica delle differenze tra il numero di foci nei diversi gruppi sperimentali nel saggio di trasformazione in vitro è stata verificata applicando i test del χ<2>e della t di Student. La significatività statistica delle differenze tra le diverse percentuali di espressione della chimera nei vari istotipi tumorali è stata verificata applicando il test esatto di Fisher.

Plasmidi. Il vettore pBJI-neo è stato fornito dal Dr. M. Davis (Stanford University, CA). Il vettore di espressione pUHD tet-off [36] è stato fornito dal Dr. H. Bujard. I plasmidi pPL-8 e pD1-1 contenenti la CICLINA D1 e il vettore Rc/CMV [16] sono stati forniti dal Dr. P. Hinds (Harvard University, MA).

Il messaggio di fusione completo per la chimera CICLINA D1-TROP2 è stato costruito inserendo i frammenti Eco RI/Hind III proveniente dal pPL-8 e il frammento Hind III/Xba I contenente il cDNA della chimera nel vettore CDM8 [37].

I geni per Ha-RAS normale e mutato erano costrutti genomici comprendenti il promotore endogeno (pUC-EJ e pUC-EC) [16].

TROP2, CICLINA D1 completa, CICLINA CORTA e chimera CICLINA D1-TROP2 sono stati espressi nei vettori pBJI-neo (espressione guidata dal promotore HTLV-1) [38], pRC (promotore CMV) [16], pUHD (promotore chimerico tetO-CMV) [36] o pEYFP (promotore CMV) (Clontech, Palo Alto, CA).

Sequenziamento del DNA. Il DNA è stato sequenziato secondo il metodo di Sanger [39]. Le sequenze di DNA sono state analizzate per mezzo del pacchetto di programmi del Genetics Computer Group [40].

Analisi di Southern e Northern blot. Gli acidi nucleici (DNA e RNA) sono stati estratti ed analizzati come descritto [39].

Gli enzimi di restrizione sono stati acquistati dalla New England Biolabs (Beverly, MA). I filtri su cui erano stati trasferiti gli acidi nucleic sono stati ibridizzati ad alta stringenza con sonde radioattive marcate come descritto [41] costiuite dai cDNA per TROP2 o per la CICLINA D1.

Per rivelare la chimera nei tumori è stata utilizzata una sonda di 307 bp comprendente il punto di giunzione tra CICLINA D1 e TROP2. Questa sonda contiene 123 bp di CICLINA D1 e le 183 bp all’ estremità 5’ di of TROP2 [18] ed è stata ottenuta mediante amplificazione della chimera con i primer PRAD1.F4/T5.F5tris. La sonda è stata marcata con fosforo radioattivo utilizzando la procedura descritta in [41] modificata sostituendo ai primer casuali i due primer specifici che l’ hanno generata. I filtri sono stati ibridizzati a 58-62 °C in 0.5 M Na2P047% SDS e lavati in 50 mM Na2P041% SDS a temperatura ambiente. La temperatura di ibridizzazione più alta e un lavaggio di 1 ora sono stati utilizati per rivelare solamente il messaggio chimerico; la temperatura di ibridizzazione più bassa ha rivelato anche i messaggeri per TROP2 e per la CICLINA D1 (Figura 7C).

Analisi di Western blot. Le analisi di Western blot sono state eseguite come descritto [19]. In breve, i lisati cellulari sono stati analizzati mediante elettroforesi su gel di poliacrilamide (SDS-PAGE) ed elettrotrasferiti su filtri di nitrocellulosa. I filtri sono stati incubati con anticorpi policlonali anti- Trop-2 or anti-Ciclina D1 per 1 ora a temperatura ambiente. Il legame con l’ anticorpo è stato rivelato in chemioluminescenza (ECL; Amersham, Aylesbury, UK) utilizzando un anticorpo secondario anti-coniglio coniugato a perossidasi (Calbiochem, La Jolla, CA).

Analisi di PCR. L’ RNA è stato estratto da cellule in coltura con Trizol (Invitrogen) o come descritto in [42] da tessuti congelati subito dopo il prelievo e polverizzati in azoto liquido. L’ RNA totale o la frazione poly-A+ è stato retrotrascritto nel corrispondente cDNA secondo protocolli standard (Pharmacia) e analizzato per PCR (Termociclatore 9600 Perkin-Elmer, Foster City, CA; termociclatore a gradiente Mastercycler – Gradient, Eppendorf, Hamburg, Germany) [39]. I due primer per le reazioni di PCR sono stati scelti da ciascuno dei seguenti gruppi: senso (complementari alla CICLINA D1): PRAD1.F2, CCCAGCTGCCCAGGAAGAGC, PRAD1.F3, CTGGCCGCAATGACCCCGCA; PRAD1.F4, AAGGGAAAGCTTCATTCT; PRAD1.F5, CCTTGTTGTTGGTTGTTT. Antisenso: (complementari a TROP2): T2.F4bis, ATCGTTGTCCACGAGCGCGT; T2.F5bis, TTGGTGGGACACGTGCAGTT; T2.F5c, GGCGGAGGAACGCGGACCGG; T2.F5tris, GAGGCGCGGGGACTCGTCGG. Reazioni di PCR condotte utilizzando varie coppie di primer posizionate ad intervalli di 200 bp sulla chimera hanno rivelato che sia la zona al 5’ di TROP2 sia la zona intorno al punto di giunzione CICLINA D1-TROP2 si amplificano con difficoltà, indipendentemente dalla coppia di primer utilizzata, probabilmente a causa della presenza in queste zone di strutture secondarie stabili. Infatti l’ efficienza di amplificazione è migliorata utilizzando temperature di appaiamento elevate (68-72 °C), e reagenti specifici , quali il dimetilsulfossido al 10% nel tampone di reazione utilizzato insieme al “Perfect Match” (Stratagene, California) e all’ Amplitaq Gold (Applied Biosystems, California), o i tamponi H o I del kit “Failsafe” (Epicentre, Madison, WI) con relativa Taq polimerasi. I migliori risultati sono stati ottenuti con questi ultimi reagenti, che sono stati quindi utilizzati per tutte le amplificazioni successive.

L’ amplificazione con la coppia di primer PRAD1.F4/T2.F5tris (94 °C, 1 min; 59 °C, 1 min; 72 °C, 1 min; 35 cycles) era in grado di rivelare la presenza dell’ mRNA chimerico nei tumori. Al contrario l’ amplificazione della chimera dalle linee cellulari richiedeva due reazioni di PCR consecutive: la prima amplificazione con la coppia di primer PRAD1.F3/T2.F5c (94 °C, 1 min; 68 °C, 1 min; 72 °C, 1 min; 35 cycles), seguita da riamplificazione del prodotto con la coppia PRAD1.F4/T2.F5tris e le condizioni di ciclo descritte sopra.

L’ mRNA della CICLINA D1 è stato rivelato con i primer SUF (senso, 5' ACAAACAGATCATCCGCAAACAC 3') and SUR (antisenso, 5' TGTTGGGGCTCCTCAGGTTC 3') come descritto [43]. L’ mRNA di TROP2 è stato rivelato con la coppia di primer T2.R3quad (senso, GCAGGACAACTGCACGTGTC) e T2.F4bis (antisenso, ATCGTTGTCCACGAGCGCGT). Le reazioni di PCR sono state interrotte dopo 20, 25, 30 e 35 ccicli, e i prodotti di reazione sono stati analizzati su gel di agarosio colorato con bromuro d’ etidio. L’ RNA ribosomiale 28 S è stato amplificato in parallelo, come controllo interno, con i primer 28SF (senso, 5' TTGAAAATCCGGGGGAGAG 3') e 28SR (antisenso, 5' ACATTGTTCCAACATGCCAG 3') [44].

Il DNA genomico delle cellule OVCA-432 e MCF-7 è stato analizzato per PCR con due coppie di primer a cavallo del punto di giunzione della chimera per rivelare una possible ricombinazione tra i loci della CICLINA D1 e TROP2. Gli inneschi utilizzati sono i seguenti: T2.R2t, senso, GACTGCCTCCGGGCCTGCCA; T2.R2IV, senso, TCCTTTGCTCTTTCCCCCTT; T2.F5c e T2.F5tris come antisenso.

L’ amplificazione della chimera CICLINA D1-TROP2 è stata ottenuta in maniera riproducibile a partire da 7 preparazioni indipendenti di cDNA di cellule OVCA-432 in più di 100 esperimenti diversi, e da 3 preparazioni indipendenti di cDNA di cellule MCF7 in più di 40 esperimenti. Tutti i prodotti di PCR avevano sequenza identica a quella attesa. Cellule L di controllo o esperimenti di ricostituzione in cui l’ RNA della ciclina venisse mescolato con l’ RNA di TROP2 in provetta, prima della sintesi del cDNA, non hanno mai prodotto la chimera. Questo, insieme alle analisi di protezione dell’ RNA e di Northern blot, dimostra che la chimera non deriva da artefatti sperimentali.

PCR quantitativa. L’ RNA totale dale line cellular indicate è stato estratto in Trizol (Invitrogen) seguendo le istruzioni del produttore. RNA proveniente da 9 tessuti umani normali (ciascuno da almeno due individui) è stato acquistato da BD Biosciences-Clontech (Palo Alto, Ca), e trattato con DNAsi I (Ambion) prima della sintesi del cDNA mediante trascrizione inversa. Un microgrammo di RNA è stato utilizzato per ciascuna reazione di trascrizione inversa, effettuata con l’ enzima ImProm-II Reverse Transcriptase (Promega) secondo il protocollo standard. Il cDNA ottenuto in ciascuna reazione è stato quantificato misurando l’ emissione di fluorescenza dopo aggiunta di bromuro d’ etidio in soluzione [45]. Le reazioni di PCR quantitativa sono state condotte nell’ ABI-PRISM 7900HT Sequence Detection System (PE Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) in presenza del colorante fluorescente SYBR-green (Power Sybr Green PCR Master Mix, Applied Biosystems), secondo le istruzioni del produttore. I primer utilizzati earno stati ottimizzati per efficienza e specificità in precedenti reazioni di PCR. Per le amplificazioni quantitative la concentrazione di ciascun innesco è stata ottimizzata a 200nM, in un volume finale di reazione di 30 µl. L’ rRNA 28S è stato usato come standard interno. Gli inneschi utilizzati erano PRAD1.F4 e T2.F5tris per la chimera; T2.R3quad e T2.F4bis per Trop2; SUF e SUR [43] per la CICLINA D1; 28SF e 28SR [44] per il 28S. Alla fine di ciascuna amplificazione sono state controllate le curve di dissociazione dei prodotti, per confermare la specificità della reazione.

Protezione dall’ RNAsi. Le analisi di protezione dall’ RNAsi sono state condotte su mRNA

poly-A estratto da cellule OVCA-432, MCF-7 e L. Una sonda ad RNA a singolo filamento corrispondente alla regione della chimera CICLINA D1-TROP2 compresa tra i siti di restrizione Hind III e Not I è stata trascritta in vitro in presenza di [32P]-UTP (Promega Corporation, Madison, WI).

La sonda radioattiva così ottenuta è stata appaiata a 20 µg of poly-A mRNA di ciascuna linea cellulare a 55 °C per tutta la notte. L’RNA è stato poi digerito con RNAsi A e T1 secondo le istruzioni del produttore (Ambion Inc., Austin, TX) e sottoposto ad elettroforesi in gel di poliacrilamide al 5%.

Analisi FISH. Cellule OVCA-432, MCF-7 e linfociti normali di controllo sono stati analizzati mediante FISH a due colori [21] utilizzando sonde genomiche di 15 kb specifiche per TROP2 and CICLINA D1. Le sonde sono state marcate [39] utlizzando digossigenina-dUTP per TROP2 e biotinadUTP per la CICLINA D1. Le sonde marcate sono state mescolate a DNA umano frammentato ed ibridizzate con i nuclei delle cellule da analizzare. L’ ibridzzazione di TROP2 è stata rivelata con anticorpi anti-digossigenina coniugati con un fluoroforo verde, l’ ibridizzazione della CICLINA D1 è stata rivelata con avidina coniugata ad un fluoroforo rosso.

Silenziamento dell’ RNA. Il silenziamento dell’ RNA è stato effettuato utilizzando sequenze codificanti per RNA a forcina (shRNA) [46], specifiche per il punto di giunzione dell’mRNA chimerico CICLINA D1/TROP2, clonate nel vettore pSUPER come descritto [28]. I plasmidi con le sequenze silenzianti ed i relativi contolli sono stati trasfettati in cellule MCF7 seguendo questa procedura: le cellule sono state seminate in piaster a 96 pozzetti a 4000 cellule per pozzetto, con 6 pozzetti in replicato per ciascuna misurazione; 4 ore dopo la semina le cellule sono state trasfettate con 250ng di DNA and 0.25 µl di Lipofectamine 2000 (Invitrogen) per pozzetto in 100 µl di DMEM, secondo le istruzioni del produttore; la prima misurazione del numero di cellule ( tempo 0 della curva di crescita) è stata effettuata 8 ore dopo la trasfezione, e successivamente ai tempi indicati.

Analisi in immunofluorescenza. Le cellule sono state colorate con gli anticorpi anti-Trop-2162-46.2 e T16 come descritto [18]. Anticorpi policlonali anti-Ciclina D1 umana sono stati forniti dalla Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA). L’ analisi della fluorescenza è stata condotta mediante citometria a flusso (Vantage, Becton Dickinson, Sunnyvale, CA).

Analisi istopatologiche e immunoistochimiche dei tumori. I campioni tumorali sono stati congelati rapidamente in azoto liquido subito dopo il prelievo chirurgico e conservati a -80 °C. I tumori sono stati caratterizzati per quanto riguarda lo stadio, il grado, la frazione di cellule proliferanti (KI-67), la ploidia, la neovascolarizzazione (CD34) e l’ espressione di p53, Her-2, Bcl-2 [47]. La stadiazione è stata condotta secondo le classificazioni TNM o FIGO [47], dove T indica il diametro del tumore (crescente da T1 a T4), N indica l’ invasione linfonodale (da N0 a N2) e M indica la metastatizzazione a distanza (M0 o M1). L’ analisi immunoistochimica dei tessuti normali e neoplastici è stata effettuata come descritto [47], su sezioni dello spessore di 5 micron. L’ attività perossidasica endogena è stata eliminata con trattamento con H2O2al 3% per 5 minutes. Le sezioni sono state poi incubate per 30 minuti con l’ anticorpo specifico biotinilato, e il legame con l’ anticorpo è stato rivelato mediante avidina-perossidasi e diamminobenzidina come cromogeno (DAKO, Glostrup, Denmark): l’ avidina si lega alla biotina, la perossidasi reagisce con la diamminobenzidina formando un composto colorato.

abbondanti, rispettivamente, al 25° ciclo di amplificazione. I tumori che esprimono la chimera CICLINA D1/TROP2 sono evidenziati in grigio.

Tabella 2

Caratteristiche clinico-patologiche dei tumori analizzati per l’ espressione della chimera CICLINA D1/TROP2

N° Organo Diagnosi Stadio Grado DNA1 DNA2 %S1 %S2 p53 Her-2 CD34 Ki-67 Bcl-2 1 Stomaco Adk intestinale T2N1 G2 1.74 *** neg ** *** * neg 2 Stomaco Adk intestinale T2N0 G2 1.88 ** * neg *** * neg 3 Stomaco Adk diffuso T2N0 1 ** * * *** ** neg 4 Stomaco Adk intestinale T1N0 G2 1.44 ** * neg neg * neg 5 Stomaco Adk intestinale T2N1 G2 1.28 1.65 nv *** neg ** *** ** neg 6 Stomaco Adk intestinale T2N1 G2 1.41 **

7 Stomaco Adk diffuso T2N1 1 Neg * neg ** ** neg 8 Sigma Adk T3N0 G2 1 ** neg neg ** ** neg 9 Ileo-ceco Adk T4N0 G3

10 Colon destro Adk T4N1M1 G2 1 ** ** ** ** ** * 11 Ileo-ceco Adk T3N0 G2 1 ** ** * * ** * 12 Colon sinistro Adk T3N0 G2 1.07 1.69 ** * ** * ** neg 13 Colon sinistro Adk T2N0 G2 1.9 *** *** * ** *** * 14 Colon sinistro Adk T3N2 G2 1.77 ** *** * * ** ** 15 Colon sinistro Adk T2N0 G2 1 ** neg * ** ** neg 16 Mammella CDI T3N0 G3 1.09 * neg ** * neg 17 Mammella CDI T1N1 G3 1.05 neg ** ** ** ** 18 Mammella CDI T2N0 G2 1 Neg neg * * * *** 19 Mammella CDI T2N0 G3 1.61 1.77 * 7.4 *** * ** ** * 20 Mammella CDI T1N0 G2 neg *** ** * *** 21 Mammella CDI T2N1 G3 1.43 2.89 ** 37 *** *** ** ** neg 22 Endometrio Adk 1C G3 1 *** * neg ** ** neg 23 Endometriu Adk 1B 1 * neg ** * *** 24 Rene CCC T2N0 G2 1.39 2.02 *** 22

25 Rene CCC T1N0 G2 1 Neg neg * *** * ** 26 Rene oncocitoma 1.00 Neg neg *** *** neg **

Legenda: N°: la numerazione è la stessa di Tabella 1 e Figura 6 e 7. Adk: adenocarcinoma; CDI:

carcinoma duttale infiltrante; CCC carcinoma a cellule chiare. DNA1: indice di DNA della popolazione cellulare principale, dove 1 indica diploidia; DNA2: indice di DNA della popolazione cellulare secondaria. %S: percentuale di cellule tumorali nella fase S del ciclo cellular, nella popolazione principale (%S1) e secondaria (%S2); nv: non valutabile. p53: cellule che esprimonoi p53 nel nucleo, Ki-67: cellule in mitosi, ER: recettore per gli estrogeni, PgR: recettore per il progesterone; neg: <5%; *: 5-33%, **: 34-66%, *** 67-100% di marcatura con anticorpo specifico. CD-34: ***: alta, **: media, * bassa densità neo-vascolare; neg.: colorazione non rilevabile;. Il tumore N° 10 presentava metastasi al fegato. I tumori che esprimono la chimera CICLINA D1/TROP2 sono evidenziati in grigio.

Legende alle figure

Figura 1. Principali sequenze oggetto dell’ invenzione (A) Sequenza della fusione CICLINA D1-TROP2. La barra verticale indica il punto di giunzione tra CICLINA D1 e TROP2. (B) Primers utilizzati per rivelare l’ mRNA chimerico CICLINA D1/TROP2 mediante PCR quantitativa. (C) Sequenze codificanti per gli shRNA in grado di silenziare l’ espressione dell’ mRNA chimerico CICLINA D1/TROP, e per gli shRNA inefficaci di controllo (shRNA-MM).

Figura 2. Espressione dell’ mRNA chimerico CICLINA D1-TROP2 in linee cellulari tumorali umane (A) Protezione dall’ RNAsi. L’ RNA estratto dalle linee cellulari umane MCF7 (da tumore della mammella) e OVCA-432 (da tumore dell’ ovaio), e dalle cellule L (da fibrosarcoma murino – controllo negativo), è stato ibridizzato ad una sonda di RNA antisenso marcato con [<32>P] corrispondente al punto di giunzione della chimera CICLINA D1-TROP2. L’ RNA è stato successivamente digerito con RNAsi specifiche, che degradano solo l’ RNA non ibridizzato, a singolo filamento, e corso su gel. Le bande corrispondono a mRNA complementari alla sonda, che formano ibridi a doppio filamento e vengono quindi protetti dall’ RNAsi. La freccia indica la banda corrispondente alla chimera CICLINA D1-TROP2; le teste di freccia indicano le bande corrispondenti agli mRNA per TROP2 e CICLINA D. Sonda digerita: controllo negativo, senza RNA cellulare.

(B) RT-PCR. Il cDNA sintetizzato dalle line cellulari indicate è stato amplificato con inneschi a monte e a valle del punto di giunzione della chimera CICLINA D1-TROP2. I prodotti di PCR sono stati corsi su gel di agarosio ed analizzati mediante Southern blotting con due sonde marcate con [<32>P] specifiche per la CICLINA D1 e per TROP2. Le teste di freccia indicano le bande corrispondenti alla chimera CICLINA D1-TROP2. L/TROP2: cellule L trasfettate con TROP2 umano. Mix: RNA dalle cellule L trasfettate con TROP2 umano mescolato con RNA dalla linea cellulare umana Ovcar-3, che esprime la CICLINA D1 ma non TROP2; l’ assenza di banda in questo campione indica che la mera copresenza dei due trascritti, in assenza di fattori cellulari, non è sufficiente per la produzione dell’ mRNA chimerico.

Figura 3. Espressione delle proteine Ciclina D1 e Trop-2 a partire dall’ mRNA chimerico CICLINA D1/TROP2. (A) Cellule BRK trasfettate con la chimera CICLINA D1/TROP2 sono state colorate con un anticorpo fluorescente anti- Trop-2 e analizzate al citofluorimetro. (B) Estratti proteici da questi trasfettanti sono stati analizzati mediante Western blot con un anticorpo anti- Ciclina D1. Cellule BRK di controllo trasfettate con la CICLINA CORTA o non trasfettate sono state analizzate in parallelo.

Figura 4. Assenza di ricombinazione tra i geni di CICLINA D1 e TROP2. (A) Struttura dell’ mRNA. Mappa di restrizione dell’ mRNA chimerico CICLINA D1-TROP2 e delle regioni corrispondenti dei geni CICLINA D1 e TROP2; barra verticale: punto di giunzione tra la CICLINA D1 e TROP2 nella chimera; stella: posizione corrispondente nei due geni normali. Alla base dello schema è indicata la posizione delle sonde usate per l’ analisi di Southern blot. (B) Struttura genomica. Analisi di Southern blot del DNA estratto da cellule OVCA-432 (OVCA) e da linfociti umani normali (Peripheral Blood Leukocytes, PBL), digerito con gli enzimi di restrizione Pst I o Hind III, ibridizzato con due sonde specifiche per CICLINA D1 e TROP2. Le posizioni dei vari pesi molecolari sono indicate sulla sinistra. Se l’ mRNA chimerico provenisse da una fusione di DNA, l’ analisi di Southern del DNA delle OVCA-432 dovrebbe rivelare delle bande di identico peso molecolare con entrambe le sonde per CICLINA D1 e TROP2.

(C) Analisi FISH. Nuclei di cellule OVCA-432 e MCF-7 e di PBL di controllo sono stati ibridizzati con sonde genomiche specifiche per la CICLINA D1 e TROP2. Le teste di freccia indicano l’ ibridizzazione con la CICLINA D1, le frecce l’ ibridizzazione con TROP2. Le cellule OVCA-432 hanno da tre a quattro copie di CICLINA D1 e due copie di TROP2 per cellula. Le cellule MCF-7 hanno quattro copie di CICLINA D1 e due copie di TROP2 per cellula. I linfociti normali di controllo hanno due copie di ciascun gene per cellula, come atteso. In tutti i casi analizzati le ibridizzazioni per i due geni sono separate; se l’ mRNA chimerico provenisse da una fusione di DNA, i segnali relativi ai due geni dovrebbero invece sovrapporsi nelle cellule che esprimono la chimera.

Figura 5. Potenziale oncogenico della chimera CICLINA D1/TROP2. (A) Cellule BRK trasfettate con la chimera CICLINA D1/TROP2 insieme all’ oncogene RAS mutato. Bassi livelli di espressione della chimera (in alto a sinistra) inducono proliferazione cellulare; cellule BRK di controllo che non esprimono la chimera (vettore e non trasfettate) restano quiescenti. Le frecce indicano gruppi di cellule proliferanti (in alto a sinistra) o cellule singole quiescenti, a morfologia arrotondata. Livelli di espressione della chimera più alti (a destra) rendono le cellule BRK capaci di crescere in coltura in modo continuo; tre diverse morfolgie di cellule BRK in attiva crescita sono mostrate: disperse, epitelioidi e fibroblastoidi. Le immagini sono microfotografie in contrasto di fase, con obiettivo 40x. (B) Colonie in agar soffice formate dalla crescita di cellule BRK trasfettate con la CICLINA CORTA o con la chimera CICLINA D1/TROP2, insieme a RAS mutato. Cellule BRK non trasfettate sono state utilizzate come controllo negativo. (C) Curve di crescita dei tumori generati in topi nudi atimici da cellule BRK trasfettate con la CICLINA CORTA o con la chimera CICLINA D1/TROP2, insieme a RAS mutato; ciascuna curva corrisponde ad un tumore. All’ analisi istopatologica (D) questi tumori presentano alta densità cellulare con aspetto di fibrosarcoma polimorfico e palizzate di cellule fusiformi, con presenza di pseudocapsula.

Figura 6. Stabilità dell’ mRNA chimerico CICLINA D1-TROP2. Cellule BRK trasfettate con la chimera CICLINA D1-TROP2, la CICLINA D1 o la CICLINA CORTA, insieme a RAS mutato, sono state trattate al tempo 0 con actinomicina D ( inibitore della neosintesi di RNA). I rispettivi mRNA sono stati quantificati a diversi tempi dall’ inizio del trattamento mediante Northern blot con una sonda radioattiva specifica per la CICLINA D1 (nel riquadro); i valori sono stati normalizzati (la quantità al tempo 0 è uguale al 100%) e riportati in grafico. Questo ha permesso di calcolare l’ emivita (t1/2), di ciascun mRNA cioè il tempo necessario per il dimezzamento della quantità di mRNA presente nella cellula in assenza di neosintesi, che è una misura diretta della sua stabilità. L’ emivita dell’ mRNA chimerico CICLINA D1-TROP2 è risultato pari a 23 ore, mentre quella della CICLINA D1 è di 15 minuti e quella della CICLINA CORTA è di 5 ore.

Figura 7. Espressione dell’ mRNA chimerico CICLINA D1-TROP2 nei tumori umani. (A) Tumori ovarici. (in alto) Analisi di Southern della PCR del cDNA copia con degli inneschi specifici per la chimera. (in mezzo e in basso) Livelli di espressione degli mRNA di CICLINA D1 e TROP2 determinati per mezzo di PCR (è mostrato il 25° ciclo di PCR). (B) Espressione della chimera CICLINA D1-TROP2 nei tumori e nelle linee cellulari, misurata tramite PCR sul cDNA. I prodotti della PCR al 35° ciclo sono stati corsi su gel di agarosio e colorati con bromuro di etidio. L’RNA ribosomiale 28S è stato quantificato in parallelo in ciascun campione, come controllo (C) Espressione della chimera CICLINA D1-TROP2 nei tumori umani, misurata per Northern blot con una sonda radioattiva corrispondente al punto di giunzione. L’ ibridizzazione in condizioni di bassa stringenza rivela sia l’ mRNA chimerico che i messaggeri per i singoli trascritti. L’ organo di provenienza del tumore è indicato; i numeri sono come in Tabella 1. Endomet.: endometrio. I simboli e – indicano la presenza o l’ assenza dell’ mRNA chimerico.

Figura 8. Caratteristiche istopatologiche dei tumori umani analizzati per l’ espressione dellla chimera CICLINA D1/TROP2.

Pannelli 1-7: Adenocarcinomi dello stomaco (1, 2, 4-6: di tipo intestinale; 3, 7: di tipo infiltrante); pannelli 1 and 2: moderatamente differenziati con infiltrato infiammatorio; 3: infiltrato neoplastico perineurale.

Pannelli 8-15: Adenocarcinomi del colon-retto; 8, 10-13: adenocarcinomi moderatamente differenziati; cripte intestinali normali con infiltrato infiammatorio (13, in basso); 9: adenocarcinoma scarsamente differenziato. Pannelli 16-21: carcinomi duttali infiltranti della mammella; 18, 21: adenocarcinomi moderatamente differenziati; 16, 17, 19: forme scarsamente differenziate 20: forma maggiormente differenziata con formazioni tubulari.

Pannelli 22-23: Adenocarcinomi dell’ endometrio; 22: tumore scarsamente differenziato con aree necrotiche.

Pannelli 24-26: Carcinomi del rene; 24, 26: oncocitomi renali con cellule tumorali isomorfiche; 25: carcinoma renale a cellule chiare.

Pannello 27: carcinoma del polmone a cellule squamose ben differenziato (in basso) con epitelio mucociliato normale di rivestimento (in alto).

Pannelli 28-32: carcinomi ovarici; 28, 31, 32: cistoadenocarcinomi sierosi con marcata componente stromale; uno psammoma è visibile nel pannello 28 (a destra in alto); 31 scarsamente differenziato, 32 moderatamente differentiato; 29: carcinoma mucinoso ben differenziato; 30: tipo endometrioide. I tumori che esprimono la chimera CICLINA D1/TROP2 sono indicati con *. Le fotografie sono state scattate con un obiettivo 40x, tranne quelle nei pannelli 4, 5, 13, 25, 29, 30, che sono state scattate con un obietivo 20x.

Figura 9. Analisi della specificità delle reazioni di PCR quantitativa

I prodotti di amplificazione della chimera CICLINA D1/TROP2, di TROP2 e della CICLINA D1, ottenuti in diverse reazioni di PCR in presenza di Sybr Green, sono stati sottoposti ad analisi del profilo di dissociazione. Il calo di fluorescenza è stato registrato all’ aumentare della temperatura (il grafico riporta in ordinata la derivata di tale calo, come viene normalmente visualizzato in questo tipo di analisi). La presenza di un solo picco ad una temperatura caratteristica per ciascuna reazione segnala la presenza di un prodotto di PCR unico e specifico.

Figura 10. Inibizione delle crescita di cellule tumorali per mezzo del silenziamento dell’ mRNA chimerico CICLINA D1-TROP2.

(A) Curva di crescita di cellule tumorali MCF7 trasfettate con un vettore che esprime l’ shRNA specifico per il silenziamento della chimera (linea spessa). La crescita di MCF7 di controllo (trasfettate con il vettore vuoto) è stata misurata in parallelo (linea sottile). Le barre corrispondono all’ errore standard della media del numero di cellule di ciascun punto. (B) Livelli degli mRNA di CICLINA D1, TROP2 e chimera CICLINA D1-TROP2 nelle MCF7 trasfettate con l’ shRNA diretto contro la chimera, misurati mediante PCR quantitativa in tempo reale in presenza di Sybr Green, un colorante che emette fluorescenza quando si lega al DNA a doppio filamento prodotto dalla reazione di PCR. Il grafico riporta l’ intensità della fluorescenza emessa all’ aumentare del numero dei cicli di PCR di cDNA preparato dai trasfettanti con l’ shRNA contro la chimera(♦) o con il vettore vuoto (×). I livelli dell’ RNA ribosomiale 28S sono stati usati come standard di quantità interno.

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Claims (10)

1. RIVENDICAZIONI 1. L'uso della chimera CICLINA Dl/TROP2 in campo diagnostico e prognostico e come bersaglio terapeutico.
2. 2. L'uso di altri mRNA chimerici nella diagnosi e prognosi dei tumori e come bersaglio terapeutico.
3. 3. Vettori, in particolare vettori di espressione, contenenti sequenze corrispondenti alla chimera CICLINA Dl/TROP2 e suoi derivati o ad altri mRNA chimerici espressi nei tumori umani.
4. 4. Una cellula trasfettata o trasformata con un qualsivoglia costrutto di cui al punto 3.
5. 5. Il meccanismo cellulare di generazione della chimera CICLINA Dl/TROP2 e di altri RNA chimerici, in particolare in quanto bersaglio di nuovi approcci terapeutici.
6. 6. I metodi per la rivelazione e quantificazione della chimera CICLINA Dl/TROP2 e di altri RNA chimerici nelle cellule, nei tessuti e nei tumori umani, comprese le sequenze dei primer utilizzati.
7. 7. I metodi per inibire l'espressione della chimera CICLINA Dl/TROP2 e di altri RNA chimerici.
8. 8. Le sequenze di siRNA e shRNA inibitrici dell' espressione della chimera CICLINA Dl/TROP2, inclusi i vettori plasmidici e virali che le contengono, ed il loro uso in terapia, in particolare anticancro.
9. 9. Le composizioni farmaceutiche contenenti vettori di cui al punto 8 o loro derivati e diluenti o carrier relativi, accettabili per uso farmaceutico, incluse le modalità di somministrazione delle stesse.
10. 10. Kit comprendenti componenti di cui ai punti 3, 4 e 6.