ITBO960037A1 - Composizione e procedimento per la sterilizzazione di substrati di coltura - Google Patents

Abstract

Si propone una composizione per la sterilizzazione di substrati di coltura che permette di eliminare completamente l'impiego di autoclavi e filtri e che riduce drasticamente l'uso di cappe sterili. La nuova composizione utilizza l'azione del cloro allo stato gassoso o liquido e non richiede tecniche laboriose e personale altamente specializzato.

Description

D E S C R I Z I O N E

annessa a domanda di brevetto per INVENZIONE INDUSTRIALE dal titolo: COMPOSIZIONE E PROCEDIMENTO PER LA STERILIZZAZIONE DI SUBSTRATI DI COLTURA.

D E S C R I Z I O N E D E L T R O V A T O

La presente invenzione ha per oggetto una composizione per sterilizzare substrati di coltura. Più in particolare, la presente invenzione ha per oggetto una composizione sterilizzante a base di cloro attivo ed il suo impiego, nonché un procedimento per sterilizzare substrati di coltura con detta composizione.

Nella tecnica della micropropagazione in vitro si pone particolare importanza alla sterilizzazione del substrato di coltura, in quanto esso va soggetto molto facilmente a contaminazioni batteriche e fungine essendo composto principalmente da zuccheri, proteine ed aminoacidi. Tale substrato è allo stato liquido a temperatura ambiente, e quando scaldato a 90°C e poi lasciato raffreddare si trasforma in gel.

Per sterilizzare il substrato si effettua in genere un passaggio in autoclave a 120°C per 20 minuti nel caso di quantità inferiori a 500 cc, mentre per quantitativi superiori si possono richiedere anche 25-30 minuti. Se si supera questo limite, il substrato tende a degradarsi. Per mantenere poi la sua sterilità, i vasi che lo contengono vengono normalmente avvolti con pellicole di materiale plastico.

Un metodo alternativo al trattamento in autoclave è la filtrazione del substrato su membrane di acetato o nitrato di cellulosa, che sono capaci di trattenere particelle molto piccole e quindi anche batteri e spore fungine.Questo metodo alternativo è lungo e dispendioso e viene utilizzato solo quando si devono aggiungere al substrato sostanze termolabili.

Il substrato sterilizzato deve essere mantenuto tale nelle operazioni successive, per cui l'introduzione ad esempio di germogli deve essere eseguita in condizioni di assoluta asepsi sotto cappa a flusso laminare sterile impiegando pinzette e bisturi chirurgici preventivamente e ripetutamente sterilizzati alla fiamma.

Era scopo della presente invenzione eliminare tutte le operazioni laboriose menzionate sopra e fornire un metodo semplice ed efficace in grado di sterilizzare substrati di coltura risparmiando tempo e manodopera con semplificazione delle operazioni, e ottenere maggiori produttività con minor consumo energetico senza ricorrere a personale altamente specializzato e senza impiegare autoclavi, filtri e cappe sterili.

E' stato trovato che tutti gli scopi menzionati possono essere raggiunti se come sterilizzante si impiega cloro attivo. Come "cloro", nell'ambito della presente invenzione si può utilizzare sia cloro gassoso che liquido, oppure lo si può generare in situ per opportuno trattamento di composti in grado di cedere cloro. Questa ultima procedura è la più preferita, in quanto consente di eliminare gli svantaggi e i rischi collegati all'impiego del cloro libero.

La presente invenzione ha quindi per oggetto una composizione per sterilizzare substrati di coltura comprendente:

a) una soluzione contenente un composto in grado di cedere cloro ad una concentrazione che arriva sino al 5%, e

b) una soluzione di un acido forte o debole ad una concentrazione che arriva sino al 10% nel caso di un acido forte e sino al 20% nel caso di un acido debole.

Nell'impiego in accordo con l'invenzione, le due soluzioni vengono mescolate nel rapporto compreso tra 1:0,5 e 1:1 e la miscela viene aggiunta immediatamente al substrato ancora caldo e lasciata agire.

Come composti in grado di cedere cloro si possono utilizzare tutti i composti capaci di cedere cloro a patto che la concentrazione della loro soluzione sia come massimo del 5%, in quanto concentrazioni superiori potrebbero bruciare i germogli. Si è rivelata anche opportuna una concentrazione non inferiore al 3%, dato che in un simile caso la sua efficacia risulta troppo bassa o addirittura nulla. Composti in grado di cedere cloro sono gli ipocloriti dei metalli alcalini e alcalino-terrosi, come ad esempio ipoclorito di calcio e sodio, le cloroamine, gli isoclorocianurati, i composti clorurati fosfatici, gli acidi isoclorocianidrici e così via.

Come acidi si possono utilizzare gli acidi forti, come ad esempio acido cloridrico, solforico, nitrico e gli acidi deboli come acido acetico, citrico, ossalico.Al posto degli acidi si possono utilizzare anche i loro sali di ammonio quaternario in concentrazioni oscillanti tra il 5 e il 15%.

Nel caso degli acidi forti si sono rivelate vantaggiose concentrazioni delle soluzioni comprese tra il 6 e il 9%, mentre nel caso degli acidi deboli concentrazioni oscillanti tra il 12 e il 20%. Logicamente l'invenzione non è ristretta o limitata a particolari acidi e composti capaci di cedere cloro, in quanto la loro scelta dipende unicamente dalla disponibilità degli stessi e dalla facilità con la quale possono essere ottenuti.

Come ricordato sopra, la sterilizzazione può essere anche effettuata aggiungendo direttamente al substrato cloro gas alla concentrazione del 3,5-4%, oppure cloro liquido ad una concentrazione compresa tra il 3 e il 5%.

In un esempio di una realizzazione preferita in accordo con l'invenzione, si sono mescolati 1,3 mi della soluzione di a) con 0,7 mi della soluzione b) facendo attenzione a non respirare i vapori di cloro che si liberano, e la miscela così ottenuta viene subito aggiunta al substrato ancora caldo (50-60°C) prima della determinazione del pH finale, che, nel caso presente, deve oscillare tra 5,5 e 5,7. Logicamente il valore del pH dipenderà sempre dalle pianticelle che devono poi essere seminate. La miscela, nella misura di 2 mi, viene versata nel caso in oggetto in 11 di substrato, dove anche qui il rapporto tra miscela e substrato dipende dalla quantità di agar presente nel substrato stesso.

Il trattamento così eseguito ha rivelato la totale assenza di muffe, batteri o di altri agenti in grado di pregiudicare la sterilità del substrato.

Claims (8)

1. R IV E N D ICA Z IO N I 1. Composizione per la sterilizzazione di substrati di coltura comprendente: a) una soluzione contenente un composto in grado di cedere cloro ad una concentrazione che arriva sino al 5%, e b) una soluzione di un acido forte o debole ad una concentrazione che arriva sino al 10% nel caso di un acido forte e sino al 20% nel caso di un acido debole, in cui il rapporto tra a) e b) oscilla tra 1:0,5 e 1:1.
2. 2. Composizione secondo la rivendicazione 1, caratterizzata dal fatto che la concentrazione della solu zione a) va dal 3 al 5%.
3. 3. Composizione secondo la rivendicazione 1, caratterizzata dal fatto che la concentrazione della solu zione b) è compresa tra il 6 e il 10% quando l'acido è un acido forte.
4. 4. Composizione secondo la rivendicazione 1, caratterizzata dal fatto che la concentrazione della solu zione b) è compresa tra il 12 e il 20% quando l'acido è un acido debole.
5. 5. Composizione secondo la rivendicazione 1, caratterizzata dal fatto che al posto della soluzione dell'acido si può utilizzare una soluzione del cor- rispondente sale di ammonio quaternario ad una concentrazione compresa tra il 5 e il 15%.
6. 6. Procedimento per la sterilizzazione di substrati di coltura, caratterizzato dal fatto che sul substrato da sterilizzare si fa agire una composizione secondo ciascuna delle rivendicazioni da 1 a 5.
7. 7. Procedimento per la sterilizzazione di substrati di coltura, caratterizzato dal fatto che sul substrato da sterilizzare si fa agire direttamente cloro gas o liquido.
8. 8. Procedimento secondo la rivendicazione 7, caratterizzato dal fatto che la concentrazione del cloro gas o liquido oscilla tra il 3 e il 5%.